Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация тепловым шоком генетических эффектов митотических ядов у разных линий Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Модификация тепловым шоком генетических эффектов митотических ядов у разных линий Drosophila melanogaster"

Санкт-Петедо^ргский Государственный Университет

^ о фЯ ДО®

На правах рукописи

И С А Е Н К О Ольга Александровна

МОДИФИКАЦИЯ ТЕПЛОВЫМ ШОКОМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ МИТОТИЧЕСКИХЯДОВ У РАЗНЫХ ЛИНИЙ ОгоэорМа те1апс^а51ег

Специальность: 03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург, 1998 г.

Работа выполнена на кафедре зоологии Российского государственного педагогического университета им. А.И.Герцена

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор П.Я. Шварцман

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.А.Ревазова,

кандидат биологических наук Л .В.Барабанова

Ведущее учреждение:

Московский Государственн ый Университет им. М.В.Ломоносова

. /У ^ "

Защита диссертации состоится А*- уе-у - ^

1УУ8 г. в - * ч на

заседании Диссертационного совета Д.063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском Государственном Университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке СПбГУ.

Автореферат разо слан " 1998)

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л.А.Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В различных сферах человеческой деятельности в настоящее время используется свыше 60 ООО химических соединений. Немалый удельный вес среди них имеют различные лекарственные препараты, обладающие подчас, наряду с положительным терапевтическим эффектом, и ДНК-повреждающими, мутагенными, канцерогенными и тератогенными свойствами (Александров, 1986; Съяксге, Съяксте, 1991).

Среди множества применяемых ныне лекарственных средств особое положение занимают препараты, обладающие антиканцерогенными и фунгиегатическими свойствами. Действие большинства из них основано на специфичном ингибировании функций митотического аппарата. Результатом действия митотических ядов на живую клетку является не только ингибирование функций аппарата веретена деления, и как следствие, нарушение сегрегации хромосомного материала и индукции анеуплоидии, но и нарушение клеточного транспорта, пролиферативной активности, процессов детерминации и дифференцировки в ходе онтогенеза и системы гомеостаза в целом.

Исследование генетических последствий воздействия различных соединений возможно с использованием модельных организмов, одним из которых является Drosophila melanogaster, проявляющих достаточную чувствительность и характеризующихся разработанностью методов оценки анеугенного действия. Для дрозофилы разработаны и успешно используются генетические методы оценки частоты анеуплоидии как в мейозе, так и в митозе (Liang, Brinkley, ¡985; Galloway, Ivett, 1986; Dellargo et.al., 1986; Graf et.al.,1988). Разрешающая способность этих методов, несомненно, может быть увеличена при использовании линий с нарушением адаптивного ответа и проявляющих, как правило, повышенную чувствительность к действию повреждающих факторов. К таковым относятся, соответственно, мутагенчувствительные, радиочувствительные и термочувствительные мутанты дрозофилы. Использование этих линий дрозофилы также может способствовать выявлению механизмов специфической (генотипической) модификации генетических эффектов тех или иных агентов и взаимодействия различных клеточных систем (в том числе, репарации ДНК, белков теплового шока - БТШ), участвующих в поддержании гомеостаза.

В качестве неспецифического фактора, модифицирующего генотоксический эффект химических соединений, может быть использовано и действие экстремальной температуры. Известно, что действие гипертермии приводит к "запуску" системы стрессовых белков, или белков теплового шока (БТШ), выполняющих поистине

универсальные (в отношении других клеточных систем) стабилизирующие функции и обеспечивающих первичный ответ на действие стрессорного фактора.

Вопрос состоит в том, как связан этот первичный ответ клетки на внешнее воздействие с каскадом адаптивных реакций (репарация повреждений ДНК при действии мутагенов, сборка и разборка цитоскелета, процессы детерминации и дифференцировки в онтогенезе). В связи с этим интригующе взаимодействие, по крайней мере, этих трех генетически детерминированных систем в поддержании гомеостаза и регуляции пролиферативной активности клеток.

Цель и задачи исследования. Целью предлагаемого исследования является изучение генетических эффектов ряда лекарственных препаратов, принадлежащих к группе митотических ядов, и возможности специфической и неспецифической модификации этих эффектов.

В рамках поставленной цеди сформулированы следующие задачи исследования:

1. Анализ тератогенного и мутагенного эффектов митотических ядов у линий дрозофилы с нарушением адаптивного ответа (мутагенчувствительная линия -шиз(2)201°'; термочувствительная линия -1(1)15403).

2. Оценка роли белков теплового шока и репарационных систем в становлении мутагенного и тератогенного эффектов митотических ядов при использовании линий дрозофилы, характеризующихся нарушением б функционировании данных клеточных систем.

3. Изучение возможности модификации генетических эффектов митотических ядов действием гипертермии.

4. Изучение особенностей экспрессии пуффов теплового шока в зависимости от условий функционирования цитоскелета с использованием различных митотических ядов, блокирующих микротубуликовый аппарат.

Научная новизна работы состоит в выявлении новых генетических эффектов митотических ядов (винбластина, колхицина и гризеофульвина), а также модифицирующего эти эффекты действия теплового шока. Обнаруженный в ходе исследования специфический тератогенный и сопряженный мутагенный эффект этих соединений у разных линий дрозофилы, позволяют предположить ведущую роль дестабилизация митотического аппарата в становлении эффектов этих соединений, что подтверждается эффективностью препаратов в индукции эмбриональных леталей и потерь половых хромосом. В то же время, возможность модификации генетических эффектов анеугенов тепловым шоком и. дифференциальная чувствительность различных мутантов дрозофилы, включая мутагенчувсгвительную линию ши5201си и линию 1(1)1$ 403 с дефектом системы белков теплового шока, приводят к мысли о

кооперации систем репарации и белков теплового шока как в ходе нормального морфо - и онтогенеза, так и при воздействии митотических ядов, нарушающих функционирование цитоскелета и процессы клеточной пролиферации.

Практическая ценность работы. Результаты, полученные в ходе проведенного исследования свидетельствуют о выраженной мутагенной и тератогенной активности ряда лекарственных препаратов (винбластина, колхицина и гризеофульвина), принадлежащих к группе митотических ядов и находящих широкое применение в медицинской практике. Обнаружение модифицирующего эффекты этих препаратов действия теплового шока может служить необходимой основой медико-биологических исследований, направленных на определение путей снижения побочных эффектов исследованных соединений в терапевтическом курсе лечения.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены на 1 съезде ВОГиС (Саратов, 1994), 25-й конференции Европейского общества по изучению мутагенов окружающей среды - EEMS (Нидерланды, 1996) и 26-й конференции EH MS (Италия, 1997), Герценовских чтениях РГПУ им. А.И.Герцена, семинаре лаборатории генетики животных СПбГУ.

Объем работы. Диссертация изложена на 161 странице, состоит из введения, 4 глав, выводов и приложения, содержит 18 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 214 наименований, 70 из которых на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Линии дрозофилы. В различных сериях эксперимента использовали следующие линии:

1. Линия с маркером по аутосоме 3 - mwh (multiple wing hairs - множественные крыловые волоски), которая обычно используется в тесте на крыловой соматический мозаицизм в скрещивании с линией ftf/T МЗ, Ser.

2. flrVrtvB, Ser - линия с маркером по аутосоме 3 - Пг3 (flare3 - опаленные крыловые волоски).

3. mus(2)201GI/SM5, Су; mwh. Мутация mus(2)201GI (далее - mus) приводит к нарушению эксцизионной репарации ДНК и повышенной мутагенчувствительности (Лучкина и др., 1982). Линия на основе мутации mus и содержащая маркер mwh выведена нами в лаборатории генетики РГПУ им. А.И.Герцена.

4. mus(2)201 G'/SM-5, Су; ílrVTM3, Ser. Данная линия также выведена нами.

5. I(l)ts403; st; bw. Мутация l(l)ts403 охарактеризована как температуро-чувсгвительная леталь с нарушением синтеза белков теплового шока (Евгеньев, Левин, 1980).

6. Canton-S - стандартная лабораторная линия дикого типа.

7. Тестерная линия с маркерами \VaB.

Препараты. В различных сериях экспериментов были использованы 3 препарата группы "митотическихядов":

1. Винбластин - Вб (Vinblastinum) - лекарственная форма в концентрациях 0,4; I; 2,5; 5; 7,5 мг/л. Вб при действии на веретено деления приводит к кристаллизации и деполимеризации микротубулина (Dustin, 1978).

2. Колхицин - Кх (Colchicinum) - в концентрации 1, 3, 5, 8, 10 мг/л. Кх нарушает полимеризацию микротубулина (Whillson, 1977; Uppuluri, 1993).

3. Гризеофульвин - Гф (Griseofulvinum) - использована лекарственная форма в концентрации - 1, 2, 4, 8 г/л. Гф нарушает взаимодействие микротубулина с белками, ассоциирующимися с микротрубочками (БАМ) (Galloway, Ivett, 1986).

Методика воздействия тепловым шоком. Воздействие тепловым шоком во всех вариантах экспериментов проводили в суховоздушном термостате ТС-80-М-2 при температуре 37°С в течение 45 мин. Проводили обработку как имаго, так и личинок на разных стадиях развития. Обработку изолированных слюнных желез проводили при тех же параметрах в среде С-46 (среда Кокпакова) объемом 1 мл на каждую пару желез с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).

Обработка личинок митотическими ядами

а) В эксперименте по оценке дозовой зависимости получали 24-часовые кладки, вылупившихся личинок переносили на среду, содержащую препарат, на весь период личиночного развития (хроническая обработка). Учитывали частоту куколочкой гибели и хемоморфозов.

б) При оценке стадиоспецифичности действия митотических ядов и влияния теплового шока каждый из препаратов добавляли в питательную среду, которую скармливали хронологически одновозрастным личинкам (± 1ч) на каждой стадии личиночного развития. Дифференцировку стадий личиночного развития осуществляли от момента откладки яиц следующим образом: I стадия - 0-24ч; II стадия - 24-48ч; Ш стадия - 48-96ч. В течение развития личинки содержались при температуре - 22,5°С. Концентрация Вб составляла 1 мг/л, Кх - 8 мг/л, Гф - 4 г/л. Одну часть личинок обрабатывали только препаратами на каждой из стадий развития. Другую же часть личинок либо до, либо по окончании периода обработки препаратом, совпадающего с определенной стадией, подвергали действию теплового шока. В качестве контроля использовали личинок, которых подвергали действию только теплового шока по окончании каждой из стадий развития. Также использовали традиционный контроль.

Всех вылетевших мух, дифференцируя по полу, анализировали, учитывая весь спектр возникающих глазных аномалий.

Приготовление препаратов, анализ крыловой поверхности и классификация пятен в тесте на соматический мозаицизм. Особей с генотипом rmvh+/+flr3, подвергшихся обработке препаратами и тепловым шоком на 3-ей личиночной стадии использовали для приготовления препаратов крыльев и анализа крыловой поверхности в тесте на крыловой соматический мозаицизм (SMART - Somatic Mutation and Recombination Test) в соответствии с традиционной методикой (Graf et.al., 1984), модифицированной в нашей лаборатории.

Обработка самок различных линий при учете частоты нераехождения и потерь половых хромосом и частоты эмбриональных деталей. Перед постановкой эксперимента маточные растворы препаратов разбавляли 10% раствором сахарозы до необходимой концентрации. Затем раствор наносили на поверхность фильтровальной бумаги, на которую помещали 5-6 суточных самок указанных линий. Экспозиция Вб (1мг/л) и Кх (8 мг/л) составила б ч, Гф (4 г/л) - 24 ч.

Самок подвергали обработке либо только митотическими ядами, либо в сочетании с тепловым шоком (соответственно, предшествующее и последующее тепловое воздействие). Другую часть самок подвергали действию только теплового шока при тех же параметрах, но без обработки препаратами, и стандартный контроль. Контрольных и обработанных самок сразу после обработки скрещивали с самцами линии \vaB.

После скрещивания получали 24-часовые кладки в течение 10 суток в каждом варианте эксперимента. Обработку, получение кладок и развитие мух в Fi проводили при температуре 22,5°С. Сразу после получения кладок подсчитывали общее количество отложенных яиц, а через 40 часов - количество неразвившихся яиц. При этом дифференцировали яйца по окраске на 2 типа: ранние эмбриональные летали (РЭЛ - светлая окраска) и поздние эмбриональные летали (ПЭЛ - темная окраска) (Шварцман, Литвинова, 1974), В Fi учитывали появление самцов (ХО) с фенотипом "абрикосовыеглаза Ваг".

Обработка слюнных желез митотическими ядами и методика приготовления препаратов политенных хромосом. Выделенные слюнные железы хронологически одновозрастных личинок поздней третьей стадии (96 ч+1ч) помещали в платы в среду С-46 с добавлением 10% ЭТС, объемом I мл на 1 пару желез. Экспозиция желез со всеми препаратами составляла 1 ч. Использовали Вб в концентрации 20 ng/ml, Кх - 10 |i.g/ml и Гф в концентрации - 0,4 mg/ml.

Часть желез сразу переносили в среду С-46, содержащую препарат. Другую часть желез подвергали" действию как митотических ядов, так и теплового шока (предварительное и последующее тепловое воздействие). Также использовали воздействие только тепловым шоком после 1-ч экспозиции в среде С-46 и контроль.

После обработки выделенные железы фиксировали в растворе ацетоорсеина в течение 45 мин и раздавливали в 55% растворе молочной кислоты. Исследовали локусы политенных хромосом 63В, 67В, 87А, 87С, 93D, 95D, проявляющие пуффинговую активность при тепловом шоке.

Статистическая обработка результатов экспериментов. При статистической обработке результатов экспериментов применяли 3-х и 4-х факторный дисперсионный анализ (пакет программ "Statgraphics" - версия 7.0), ^-преобразование Фишера (угловая трансформация), с использованием поправки Иейтса на непрерывность, критерий Стыодента. Статистический анализ данных в SMART- тесте проведен в соответствии с описанием Frei,Wurgler (1988) и с использованием компьютерной программы, апроксимированной к SMART-анализу и основанной на биноминальном распределении.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генотоксический эффект митотических ядов

Оценку токсического действия трех препаратов группы митотических ядов -проводили по критерию куколочной гибели, частоту которой учитывали после хронической обработки личинок различными дозами препаратов. Результаты, полученные в данной серии эксперимента, свидетельствуют о возрастании частоты куколочной гибели с увеличением дозы всех исследуемых препаратов независимо от генотипического фона.

Поскольку после обработки личинок всеми избранными препаратами у вылетевших мух было отмечено появление специфических модификаций глаз (тератогенный эффект), все вылетевшие особи были проанализированы на предмет возникновения данного рода аномалий. Тератогенный эффект данных соединений у дрозофилы проявляется в редукции омматидий у имаго (фенокопия мутации еу (eyeless -4: 2,0) при скармливании препарата личинкам. Показано, что с увеличением дозы всех соединений происходит увеличение частоты мух с морфозами. Характерно, что увеличение частоты морфозов с возрастанием дозы препарата, находится в прямой корреляции с куколочной гибелью. В целом, на основании трехфакторного

3

стадия

дисперсионного анализа достоверно показано (Р<0,05) влияние дозы каждого из изученных препаратов на выход морфозов.

Принимая во внимание известный механизм действия исследуемых препаратов на уровне микротубулина, можно предположить, что редукция числа фасеток возможна вследствие митотической гибели клеток, обусловленной, например, анеуплоидией. При этом очевидно, что наиболее высокая чувствительность к действию анеугенов должна обнаруживаться в период максимальной пролиферативной активности в глазном имагинальном диске (ИД), что по данным Nothiger (1972) соответствует 48-72ч от момента вылупления личинок. Обнаружено, что наиболее высокую чувствительность к действию данных агентов проявляют личинки 2-го и 3-го возраста всех исследуемых линий (рис. 1). Именно этот период является "критическим периодом" (по терминологии П.Г.Светлова, - 1960) в дифференцировке глазного ИД.

Оценивая генотипические отличия, выявленные в данной серии эксперимента, следует отметить наиболее высокий уровень фенокопий при действии всех агентов у мутагенчувствительной линий (Р<0,01).

В последующих экспериментах были использованы дозы препаратов, эффективные в индукции фенокопий и в то же время не оказывающие сильного токсического действия на личинок. Такими изоэффективными дозами стали считать концентрацию Вб -1 мг/л, Кх - 8 мг/л и Гф - 4 г/л.

Тест на крыловой соматический мозаицизм (SMART - Somatic Mutation and Recombination Test) эффективно позволяет учитывать события различного рода -митотическую рекомбинацию, делеции, нерасхождение и потери хромосом на уровне отдельной клетки (Graf et.al., 1988). Для учета таких событий, мух, обработанных митотическими ядами в предыдущем эксперименте, использовали для приготовления препаратов.

Полученные результаты (табл. 1) свидетельствуют, что все исследованные препараты проявляют активность в индукции мозаичных пятен. При этом следует признать явный позитивный эффект всех трех исследованных препаратов в индукции исключительно малых одиночных пятен. Возрастание частот именно данного типа пятен при действии антимиготических агентов, по мнению Graf et.al. (1988), связано с индукцией анеуплоидных клонов, обладающих пониженной пролиферативной активностью.

Частота эмбриональных леталей при действии митотических ядов

Нарушение процесса расхождения хромосом в мейозе - одна из главных причин возникновения анеуплоидии, приводящая к ранней эмбриональной гибели зигот (см.

Таблица 1 Частота возникновения пятен шиЬ/Пг при действии теплового шока й митотических ядов в тесте на крыловой соматический мозаицгам

Частота пятен на одно крыло

Одиночные пятна Двойные Общее

Вариант Кол-во пятна кол-во

опыта крыльев Малые Большие Всего пятен

(1-2 кл.) (>2кл)

?? пш11+/+Аг

Контроль 175 0,53 0,12 0,65 0,02 0,67

ТШ-48ч 49 0,35 - 0,06 - 0,41 - 0,02 - 0,43 -

ТШ-96ч 57 0,26 - 0,07 - 0,33 - 0,04 - 0,37 -

ТШ-48ч+Вб 109 0,49 - 0,24 + 0,72 - 0,06 - 0,79 -

Вб 30 0,27 - 0,10 - 0,37 - 0,00 - 0,37 -

Вб+ТШ-96ч 149 0,84 + 0,07 - 0,91 + 0,02 - 0,93 +

ТШ-48ч+Гф 148 0,72 + 0,21 + 0,93 + 0,04 - 0,97 +

Гф 52 1,29 ++ 0,27 ++ 1,56 ++ 0,02 - 1,58 ++

Гф+ТШ-96ч 106 0,98 + 0,17 - 1,15 ++ 0,05 - 1,20 ++

Контроль 290 0,17 0,07 0,24 0,01 0,25

ТШ-48ч 27 0,26 - 0,07 - 0,33 - 0,04 0,37 -

ТШ-9бч 43 0,21 - 0,00 - 0,21 - 0,00 0,21 -

ТШ-48ч+Кх 26 0,31 - 0,04 - 0,35 - 0,00 0,35 -

Кх 47 0,55 ++ 0,00 - 0,55 ++ 0,00 0,55 ++

Кх+ТШ-96ч 60 0,50 ++ 0,00 - 0,50 ++ 0,00 0,50 ++

99 тих; т\\Ь+/+Аг

Контроль 153 0,80 0,06 0,86 0,02 0,88

ТШ-48ч 112 2,21 ++ 0,16 ++ 2,37 ++ 0,03 2,40 ++

ТШ-9бч 180 1,01 + 0,05 - 1,06 + 0,00 1,06 -

ТШ-48ч+Вб 65 2,05 ++ 0,17 ++ 2,22 ++ 0,00 2,22 ++

Вб 42 2,21 ++ 0,36 ++ 2,57 ++ 0,05 2,62 ++

Вб+ТШ-96ч 77 1,94++ 0,08 - 2,01 ++ 0,00 2,01 ++

ТШ-48ч+Гф 48 0.75 - 0,13 - 0,87 - 0,00 - 0,87 -

Гф 265 1,43++ 0,20 ++ 1,64 ++ 0,06 - 1,69 ++

Гф+ТШ-9бч 55 1,49++ 0,20 ++ 1,69 ++ 0,02 - 1,71 ++

ТШ-48ч+Кх 40 0,25 + 0,00 - 0,25 + 0,00 0,25 +

Кх 48 1,94 ++ 0,08 - 2,02 ++ 0,02 2,04 ++

Кх+ТШ-96ч 80 4,13 + 0,25 ++ 4,37 + 0,00 4,37 +

Примечание-, достоверность отличий от контроля: ++ Р<0,01; + Р<0,05; - Р>0,05. Достоверные отличия между вариантами комбинированной обработки и обработки только препаратом подчеркнуты сплошной чертой (Р<0,05).

обзор Liang, Brinkley, 1985), что априорно в случае воздействия антимитотических агентов. В соответствии с этим учет эмбриональных деталей является достаточно информативным методом, позволяющим учесть случаи эмбриональной анеуплоидии.

Применение трехфакторного дисперсионного анализа для оценки общей эффективности препаратов в индукции доминантных эмбриональных деталей (ДЛ) показало позитивный эффект всех изученных соединений в увеличении частот данных событий (рис.2). Наиболее высокий выход ДЛ отмечен в течение З-б суточных кладок, что соответствует обработке ооцитов, наход ящихся на стадии 7-10.

Интересна и специфика препаратов в индукции летальных событий в зависимости от стадии эмбриогенеза. Так, Вб эффективно индуцирует ПЭЛ, тогда как два других препарата приводят к более раннему проявлению их эффекта, и соответственно, к преобладанию ЮЛ. Таким образом, нарушения в функционировании клеточных систем при действии Kx и Гф элиминируются как эмбриональные летали в самые ранние сроки.

В той же серии эксперимента нами проведен учет исключительных самцов для анализа эффективности исследуемых препаратов в индукции нерасхождения и потерь половых хромосом в оогенезе.

Частота нерасхождений и потерь полоны* хромосом (НППХ) при действии антимитотических агентов

Результаты эксперимента свидетельствуют, что при обработке самок различных линий только Вб эффективен в индукции исключительных самцов у всех исследованных линий. Частота появления таких мух достоверно выше у термочувствительной линии, что свидетельствует о большей ее чувств ительносги к действию данного митостат ика.

Частота появления исключительных особей при обработке Кх и Гф не отличается от контрольных значений. Вместе с тем, частота ДЛ в случае обработки данными препаратами существенно превышает частоту ДЛ, индуцированных Вб. Кроме того, выход РЭЛ, в случае действия Кх и Гф, доминирует. Очевидно, что на ранних стадиях элиминируется та часть особей, которая получила наибольшие повреждения (возможно, анеуплоиды по 2-й и 3-й аугосомам); соответственно, в данном варианте нами и не фиксируется увеличение выхода НППХ, как в случае Вб.

Эффективность препаратов в индукции НППХ подтверждает и тот факт, что при обработке всеми препаратами, в случае наличия эффекта, наиболее высокие частоты появления "исключительных" самцов (равно как и ДЛ) зафиксированы на 3-6 сутки, что соответствует обработке незрелых ооцитов (стадии развития ооцита 7-10, соответственно), находящихся на стадии профазы мейоза I (Koch et.al., 1970). Именно в

Рис. 2 Частота эмбриональных леталей при действии митотических ядов и теплового шока у разных линий дрозофилы

этот период нормальное функционирование аппарата микротрубочек определяет будущую полноценность и жизнеспособность зигот. Выявленная закономерность неоднозначно коррелирует с данными, полученными при обработке ооцитов таким классическим мутагеном, как этиленимин (Литвинова, 1976; Шварцман и др., 1985), где показано возрастание частоты НППХ в течение 1-2 суток после обработки мутагеном.

Особенности генотоксического эффекта митотических ядов при сочетанном действии теплового шока Влияние теплового шока и митотических ядов на экспрессию пуффов теплового шока. В данной серии эксперимента проверена возможность активации других локусов БТШ политенных хромосом при действии избранных нами митотических ядов per se, и при сочетанном их действии с тепловым шоком.

Результаты свидетельствуют об отсутствии индукции пуффов теплового шока при действии всех препаратов, за исключением локуса 93D при действии Кх, что согласуется с данными Lakhotia (1987). Сочетанное действие гипертермии и митотических ядов также не приводит к качественным изменениям в паттерне активности соответствующих локусов, и их активность не отличается от таковой при действии только теплового шока.

Модификация тератогенного и мутагенного эффекта митотических ядов тепловым шоком. В данном эксперименте нами оценивалась возможность модификации эффектов анеугенов тепловым шоком. Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что предварительное тепловое воздействие приводит к снижению выхода фиксируемых событий, тогда как последующее за обработкой митотическими ядами тепловое воздействие, наоборот, приводит к увеличению частоты соматических мутаций и глазных морфозов. Действие на личинок только гипертермии не приводит к индукции глазных морфозов и мозаичных клонов в крыловых имагинальных дисках.

Обнаруженная закономерность согласуется с многочисленными данными о возможности модификации тератогенного/мутагенного эффекта различных химических соединений и радиации предварительным краткосрочным действием гипертермии (Petersen, Young, 1990; Тихомирова, 1991). В случае если наблюдаемая закономерность -следствие участия индуцибельных форм БТШ в "репарации" микротубулина или же сборки его de novo в условиях ингибирования готовых полимеров, следует ожидать, что предварительное тепловое воздействие будет эффективным и в снижении выхода НППХ и эмбриональных деталей, индуцированных митотическими ядами.

Рис. 3 Частота исключительных самцов при действии м1гготических ядов и теплового шока у разных линий дрозофилы

сутки

(2)20 1С1|

ш

сутки

Модификация тепловым шоком генетических эффектов митотических ядов в оогенезе дрозофилы

Влияние теплового шока на частоту эмбриональных деталей, индуцированных действием митотических ядов. При анализе сочетанного действия гипертермии и антимитотических агентов, зафиксировано снижение частоты ДЛ, индуцированных Вб и Гф у линии Canton-S при предварительном действии гипертермии (рис. 2). У линии с нарушением в синтезе БТШ, такой закономерности не обнаружено. Такое отсутствие эффекта теплового шока в снижении частот ДЛ при действии Вб и Гф у линии с нарушением процесса синтеза БТШ может свидетельствовать о вовлечении в процесс восстановления структуры полимерных молекул тубулина БТШ, что подтверждается литературными данными (Landry et.al., 1993; Marchesi , Ngo, 1993). В отличие от Вб и Гф, сочетанное действие Кх и гипертермии, наоборот, увеличивает выход ДЛ (рис.2), что дополнительно подтверждает специфичный механизм действия данного препарата на уровне микротубулиновых димеров (Uppuluri, 1993).

Частота нерасхождения и потерь половых хромосом при сочетанием действии анеугенов и теплового шока. Результаты исследования по анализу частоты НППХ в данной серии эксперимента свидетельствуют, что в случае эффективности агента, в частности Вб, в индукции регистрируемых событий предварительное действие гипертермии достоверно снижает их частоту, тогда как последующее воздействие тепловым шоком, наоборот, приводит к возрастанию соответствующих частот. Описанная закономерность характерна исключительно для линии дикого типа, что, однако, не обнаруживается у линии ts и mus (рис. 3). Наоборот, следующее за обработкой самок различных линий, температурное воздействие существенно увеличивает выход "исключительных" особей.

В связи со слабым эффектом самих препаратов эффект температурного воздействия трудно оценить в случае комбинированного действия гипертермии и Кх, гипертермии и Гф, особенно при предварительном действии высокой температуры. Увеличение же частот появления "исключительных" особей в вариантах, где тепловой шок следовал за обработкой мух Кх и Гф, более о тчетливо.

Таким образом, в данной серии эксперимента также показана эффективность предварительного теплового воздействия в снижении частот событий, причиной которых может служить индукция митотическими ядами эмбриональной анеуплоидии, и наоборот, возрастание соответствующих частот при последующем тепловом шоке.

ВЫВОДЫ:

1. Показан тератогенный эффект лекарственных препаратов, принадлежащих к группе митотических ядов - винбластина, колхицина и гризеофульвина, проявляющийся в редукции омматидий у имаго при скармливании препарата личинкам, и фенокопирующий мутацию eyeless. Тератогенная активность винбластина и гризеофульвина в исследованиях на дрозофиле выявлена впервые.

2. Частота фиксируемых аномалий глаз у дрозофилы зависит от дозы препарата, периода воздействия на личинок и генотипа. Наиболее высокая чувствительность к тератогенному эффекту исследованных соединений отмечена в период высокой пролиферативной активности в имагинальных дисках глаз (2-я и 3-я стадии личиночного развития). Линии дрозофилы с нарушением адаптивного ответа (репарации ДНК - линия mus(2)201QI и функционирования системы белков теплового шока - линия l(l)ts403) характеризуются высокой чувствительностью к действию данных агентов.

3. Продемонстрирована эффективность митотических ядов в индукции малых одиночных пятен в тесте на крыловой соматический мозаицизм (SMART - Somatic Mutation and Recombination Test). Наиболее высокий выход маркерных клонов отмечен для мутагенчувствительной линии mus(2)201ai, характеризующейся нарушением функций системы эксцизионной репарации ДНК.

4. Выявлена эффективность исследованных препаратов в индукции эмбриональных легален. Наиболее высокая чувствительность ооцитов к ингибиторам микротубулинового аппарата отмечена в период формирования веретена деления -незрелые ооциты на 7-10 стадия развития.

5. Продемонстрирована возможность модификации индуцированных анеугенами событий (глазные морфозы, соматические мозаицизм, эмбриональные летали) предварительным краткосрочным действием гипертермии. Нарушение функций адаптивного ответа в клетках мутанта l(l)ts403 приводит к отсутствию модифицирующего эффекта теплового шока по критериям доминантных деталей и потерь половых хромосом.

6. Исследованные митотические яды не вызывают нарушений в экспрессии пуффов теплового шока.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Исаенко О.А., Ромашкина Т.Б., Шварцман П.Я., Шеломова Л.Ф. Анализ мутагенного и тератогенного эффекта гризеофульвина у мутагенчувствительной линии mus(2)20101 Drosophila melanogaster// Генетика. - 1994. - Т.ЗО, №6. - С. 796-800.

2. Исаенко О. А. Модификация тератогенного эффекта гризеофульвина тепловым шоком у Drosophila melanogaster// Материалы 1-го съезда ВОГиС. - Генетика. - 1994. -Т.ЗО. Приложение. - С. 61.

3. Исаенко О.А., Шварцман П.Я. Модификация тератогенного эффекта гризеофульвина тепловым шоком у Drosophila melanogaster. // Генетика. - 1995. - Т. 31, № 4. - С. 583-585.

4. Issaenko О.А., Shvartsman P.Ya. Mutagenic and teratogenic effects of Griseofulvin. // Abstract book of 25th Annual Meeting of the EEMS. - Noordwijkerhout, The Netherlands, 1995.-P. 117.

5. Issaenko O.A., Shvartsman P.Ya. Mitotic poisons, heat-shock proteins and their effects on the chromosome segregation. // Abstract book of 26th Annual Meeting of the EEMS. - Rome, Italy, 1996. - P. 220.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаенко, Ольга Александровна, Санкт-Петербург

Vе V'" * ' ■ ;

/

САНКТ - ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ИСАЕНКО ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

МОДИФИКАЦИЯ ТЕПЛОВЫМ ШОКОМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ МИТОТИЧЕСКИХ ЯДОВ У РАЗНЫХ ЛИНИЙ Вго$орЫ1а melanogaster

Специальность 03.00.15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук П.Я. Шварцман

Санкт-Петербург, 1998 г.

16

19

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 5

Список сокращений 9

Глава I. Обзор литературы

§ 1. Основные эффекты митотических ядов 10

1.1. Влияние колхицина на живую клетку и механизм его действия 11

1.2. Механизм действия и эффект винбластина в клетках живых организмов

1.3. Эффект гризеофульвина в живых клетках и возможный механизм действия

§ 2. Специфика и возможные механизмы тератогенного эффекта в глазных имагинальных дисках ОговорЫ1а melanogaster 25

§ 3. Возможные пути и механизмы модификации генотоксического эффекта действием высокой температуры 36

§ 4. Цитоскелет: особенности организации и функционирования в норме и в условиях генотоксического стресса

4.1. Действие гипертермии 40

4.2. Роль белков теплового шока в функционировании цитоскелета 43

Глава П. Материалы и методы

§ 1. Линии дрозофилы 50

§ 2. Препараты 51 § 3. Обработка препаратами и методика воздействия тепловым шоком

3.1. Методика воздействия тепловым шоком 52

3.2. Обработка личинок в эксперименте по анализу мутагенного

и тератогенного эффектов препаратов 52

3.3. Обработка самок различных линий при учете частоты нерасхождения и потерь половых хромосом и частоты эмбриональных леталей 54

§ 4. Приготовление препаратов, анализ крыловой поверхности

и классификация пятен в тесте на соматический мозаицизм 55

§ 5. Обработка слюнных желез митотическими ядами и методика приготовления препаратов политенных хромосом

5.1. Обработка слюнных желез митотическими ядами 56

5.2. Методика приготовления препаратов политенных хромосом 57 §6. Статистическая обработка результатов экспериментов 58

Глава Ш. Результаты экспериментов

§ 1. Генотоксический эффект митотических ядов

1.1. Анализ токсического действия препаратов 60

1.2. Анализ тератогенного эффекта митотических ядов 62

1.3. Мутагенное действие антимитотических агентов 70 § 2. Частота эмбриональных леталей при действии митотических ядов 75 § 3. Частота нерасхождения и потерь половых хромосом

при действии антимитотических агентов 79

§ 4. Особенности генотоксического эффекта при сочетанном действии митотических ядов и теплового шока

4.1. Влияние теплового шока и митотических ядов на транскрипционную активность генов белков теплового шока 85

4.2. Модификация тератогенного и мутагенного эффекта

митотических ядов тепловым шоком 86

4.3. Влияние теплового шока на частоту эмбриональных

деталей, индуцированных действием митотических ядов 90

4.4. Частота нерасхождения и потерь половых хромосом при сочетанном действии анеугенов и теплового шока 93

Глава IV. Обсуждение результатов экспериментов

§ 1. Специфика генетических эффектов микротубулиновых ядов в митотических и мейотических клетках ОговорЬйа melanogaster 96

1.1. Причины и механизмы сопряженного мутагенного и тератогенного эффекта микротубулиновых ядов в соматических клетках 97

1.2. Специфика чувствительности к действию ингибиторов микротубулина в течение оогенеза ВгозорЬПа melanogaster 100

§ 2. Возможные пути и механизм модификации генетических

эффектов микротубулиновых ядов 105

2.1. Модификация тератогенного и мутагенного эффекта

митотических ядов действием гипертермии 109

2.2. Модификация тепловым шоком частоты эмбриональной

гибели и нерасхождения и потерь половых хромосом. 112

2.3. Генотипическая модификация эффектов анеугенов 113 Заключение 116 Выводы: 118 Список литературы 120 Приложение 143

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В различных сферах человеческой деятельности в настоящее время используется свыше 60 ООО химических соединений. Немалый удельный вес среди них имеют различные лекарственные препараты, обладающие подчас, наряду с положительным терапевтическим эффектом, и ДНК-повреждающими, мутагенными, канцерогенными и тератогенными свойствами (см. обзоры: Александров, 1986; Съяксте, 1991).

Среди множества применяемых ныне лекарственных средств особое положение имеют препараты, обладающие антиканцерогенными и фунгистатическими свойствами. Действие большинства из них основано на специфичном ингибировании функций митотического аппарата. Результатом действия митотических ядов на живую клетку является не только ингибирование функций аппарата веретена деления, и как следствие нарушение сегрегации хромосомного материала и индукции анеуплоидии, но и нарушение клеточного транспорта, пролиферативной активности, процессов детерминации и дифференцировки в ходе онтогенеза и системы гомеостаза в целом.

Исследование генетических последствий воздействия различных соединений возможно с использованием модельных организмов, одним из которых является Drosophila melanogaster, проявляющих достаточную чувствительность и характеризующихся разработанностью методов оценки анеугенного действия. Для дрозофилы разработаны и успешно используются генетические методы оценки частоты анеуплоидии как в мейозе, так и в митозе (Graf et.al., 1984; Liang, Brinkley, 1985; Galloway, Ivett, 1986; Dellargo et.al., 1986). Разрешающая способность этих методов, несомненно, может быть увеличена при использовании линий с нарушением адаптивного ответа и проявляющих, как правило, повышенную

чувствительность к действию повреждающих факторов. К таковым относятся, соответственно, мутагенчувствительные, радиочувстви-тельные и

термочувствительные мутанты дрозофилы. Использование этих линий дрозофилы также может способствовать выявлению механизмов специфической (генотипической) модификации генетических эффектов тех или иных агентов и взаимодействия различных клеточных систем (в том числе, репарации ДНК, белков теплового шока - БТШ), участвующих в поддержании гомеостаза.

В качестве неспецифического фактора, модифицирующего генотоксический эффект химических соединений, может быть использовано и действие экстремальной температуры. Известно, что действие гипертермии приводит к "запуску" системы стрессовых белков, или белков теплового шока (БТШ), выполняющих поистине универсальные (в отношении других клеточных систем) стабилизирующие функции и обеспечивающих первичный ответ на действие стрессорного фактора.

Вопрос состоит в том, как связан этот первичный ответ клетки на внешнее воздействие с каскадом адаптивных реакций (репарация повреждений ДНК при действии мутагенов, сборка и разборка цитоскелета, процессы детерминации и дифференцировки в онтогенезе). В связи с этим интригующе взаимодействие, по крайней мере, этих трех генетически детерминированных систем в поддержании гомеостаза и регуляции пролиферативной активности клеток.

Цель и задачи исследования. Целью предлагаемого исследования является изучение генетических эффектов ряда лекарственных препаратов, принадлежащих к группе митотических ядов, и возможности специфической и неспецифической модификации этих эффектов.

В рамках поставленной цели сформулированы следующие задачи исследования:

1. Анализ тератогенного и мутагенного эффектов митотических ядов у линий дрозофилы с нарушением адаптивного ответа (мутагенчувствительная линия -ши8(2)201О1; термочувствительная линия -1(1)18403).

2. Оценка роли белков теплового шока и репарационных систем в становлении мутагенного и тератогенного эффектов митотических ядов при использовании линий дрозофилы, характеризующихся нарушением в функционировании данных клеточных систем.

3. Изучение возможности модификации генетических эффектов митотических ядов действием гипертермии.

4. Изучение особенностей экспрессии пуффов теплового шока в зависимости от условий функционирования цитоскелета с использованием различных митотических ядов, блокирующих микротубулиновый аппарат.

Научная новизна работы состоит в выявлении новых генетических эффектов митотических ядов (винбластина, колхицина и гризеофульвина), а также модифицирующего эти эффекты действия теплового шока. Обнаруженный в ходе исследования специфический тератогенный и сопряженный мутагенный эффект этих соединений у разных линий дрозофилы, позволяют предположить ведущую роль дестабилизации митотического аппарата в становлении эффектов этих соединений, что подтверждается эффективностью препаратов в индукции эмбриональных деталей и потерь половых хромосом. В то же время, возможность модификации генетических эффектов анеугенов тепловым шоком и дифференциальная чувствительность различных мутантов дрозофилы, включая

мутагенчувствительную линию ти5201О1 и линию 1(1)1$403 с дефектом системы

белков теплового шока, приводят к мысли о кооперации систем репарации и белков теплового шока как в ходе нормального морфо - и онтогенеза, так и при воздействии митотических ядов, нарушающих функционирование цитоскелета и процессы клеточной пролиферации.

Практическая ценность работы. Результаты, полученные в ходе проведенного исследования свидетельствуют о выраженной мутагенной и тератогенной активности ряда лекарственных препаратов (винбластина, колхицина и гризеофульвина), принадлежащих к группе митотических ядов и находящих широкое применение в медицинской практике. Обнаружение модифицирующего эффекты этих препаратов действия теплового шока может служить необходимой основой медико-биологических исследований, направленных на определение путей снижения побочных эффектов исследованных соединений в терапевтическом' курсе лечения.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были представлены на 1 съезде ВОГиС (Саратов, 1994), 25-й конференции Европейского общества по изучению мутагенов окружающей среды - ЕЕМБ (Нидерланды, 1996) и 26-й конференции ЕЕМЭ (Италия, 1997), Герценовских чтениях РГПУ им. А.И.Герцена, семинаре лаборатории генетики животных СПбГУ.

Объем работы. Диссертация изложена на 161 странице, состоит из введения, 4 глав, выводов и приложения, содержит 18 таблиц и 20 рисунков. Список литературы включает 214 наименований, 70 из которых на русском языке.

Список сокращений

БАМ- белки, ассоциирующиеся с микротубулином

БТШ - белки теплового шока

Вб- винбластин

Гф- гризеофульвии

дл- доминантные летали

ид- имагинальный диск

Кх- колхицин

ммс- метилметансульфонат

мя- митотические яды

НППХ- нерасхождение и потери половых хромосом

пэл- поздние эмбриональные летали

РЭЛ- ранние эмбриональные летали

ТРДТ- трансдетерминация

тш- тепловой шок

цнс- центральная нервная система

ЦОМТ- центр организации микротрубочек

эи- этиленимин

эл- эмбриональные летали

эмс- этилметансульфонат

FISH- (Fluorescent Immuno Hybridization in situ) - иммунофлюоресцентная

гибридизация in situ

SMART - (Somatic Mutation And Recombination Test) - тест на соматический

мозаицизм

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§1. Основные эффекты митотических ядов

Выявление группы препаратов, избирательно воздействующих на различные элементы цитоскелета (актиновые и промежуточные филаменты, микротубулиновый аппарат) привело не только к возможности изучения функционирования этих элементов per se, но и осуществлять комплекс исследований сопряженного функционирования этих систем и их взаимодействия с другими клеточными системами (такими как система белков теплового шока, система репарации ДНК), осуществляющими свои функции в зависимости от аппарата сигналинга и обеспечивающими клетке первичный ответ на любые стрессовые воздействия, в течение процессов дифференцировки и пролиферативной активности в онтогенезе.

Существует ряд препаратов, избирательно действующих на систему микротрубочек или систему микрофиламентов; они активны in vitro и способны специфически связываться с тубулином или актином в мономерном или полимерном состояниях. При изучении препаратов, действующих на эти две фибриллярные системы выявляется немало параллелей. Так, и для микротрубочек, и для микрофиламентов известны препараты, связывающиеся с мономером и подавляющие сборку полимера; кроме того, для обеих систем существуют препараты, связывающиеся с полимером и увеличивающие его стабильность (Фултон, 1987). Описан также ряд препаратов, нарушающих взаимодействие белков, ассоциирующихся с системой филаментов и обеспечивающих функциональный контакт между всеми компонентами цитоскелета на основе протеин-протеинового взаимодействия. Здесь остановимся на кратком обзоре

особенностей действия препаратов, избирательно ингибирующих микротубулиновый аппарат.

1.1. Влияние колхицина на живую клетку и механизм его действия.

Колхицин (Colchicine) - Кх, является алкалоидом растительного происхождения, выделяется из луковиц безвременника великолепного (Colchicum speciosum) и безвременника осеннего (С. autumnue), оказывает канцеростатическое действие (Перевозчикова, 1976; Машковский,1980).

Химическая формула:

Синонимы: колхамин, омаин.

Применяется при лечении рака пищевода (прием per os по 1-1,5 г в сутки в течение 20-35 дней), также используется при лечении рака кожи в виде мази (омаиновая мазь, 0,5%). Возможные побочные эффекты: при одновременной передозировке - тошнота, рвота, при длительном воздействии возможно угнетение лейко- и лимфопоэза, лейкопения (Перевозчикова, 1976).

Процессы, происходящие в клетке после действия колхицина получили название колхициновый митоз (К-митоз) (Колесников, 1956). Воздействие данным

препаратом вызывает блок клеточных делений и останавливает растительные и животные клетки в метафазе. Первоначальное изучение эффектов Кх было связано с использованием данного агента в селекции растений, за счет высокого полиплоидизирующего эффекта, а также применением в цитологии и цитогенетике как эффективного митостатика.

В опытах Wyrobek и Bruce (1975) на сперматозоидах мышей показана способность колхицина вызывать анормальную морфологию. По результатам этого исследования мутагенная активность колхицина сравнима с активностью таких признанных мутагенов, как ММС (метилметансульфонат) и ЭМС (этил-метансульфонат). Однако в данном случае активность агента объясняется не индукцией хромосомных аберраций (как в случае классических мутагенов), а нарушением функционирования митотического аппарата. Подобный тератогенный эффект препарата подтверждается и в исследованиях на дрозофиле.

Так, Л.И.Дроздовской и И.А.Рапопортом (1988) впервые показано, что при скармливании личинкам питательной среды, содержащей колхицин, у имаго наблюдается модификация глаз, крыльев, оцеллей и других органов. Также была отмечена пониженная жизнеспособность (до 30%) таких особей по сравнению с контролем. Однако, какой-либо интерпретации обнаруженного эффекта Кх в данной работе не представлено.

В исследованиях на дрозофиле также был отмечен эффект аналога Кх -колцемида в индукции полиплоидии и анеуплоидии (Held, 1982), однако подобных исследований с применением Кх проведено не было.

Бурное развитие разнообразных методов и тестов на выявление анеуплоидии (особенно флюоресцентной гибридизации in situ - FISH и теста на индукцию микроядер) в последнее пятилетие привели буквально к шквалу сообщений об

эффектах антимитотических препаратов. Результаты, полученные разными научными группами, хотя и используют разнообразные модификации общепринятой методологии соответствующих тест-систем, в целом дают заключения одного рода - Кх эффективен как в индукции нерасхождения половых хромосом и аутосом, так, в больших дозах, и потерь хромосом, и увеличении числа микроядер в обработанных клетках (Elhajouji, 1995; Marcon et.al., 1995; 1996; Kalweit, 1996; Marshall et.al., 1996; Caria et.al., 1996).

Так, анализ частоты нерасхождения и потерь хромосом (X и 1 аутосомы) с использованием in situ гибридизации с центромерными пробами ДНК при обработке культуры клеток лимфоцитов человека показал эффективность Кх (2,5 -20 ng/ml) в индукции преимущественно нерасхождения как половых хромосом, так и аутосом. При более высоких дозах обнаруживалась незначительная индукция микроядер и потерь соответствующих хромосом. На основании полученных результатов, предполагается, что нерасхождение хромосом - результат ограниченных повреждений митотического аппарата при действии Кх, тогда как более серьезное нарушение микротубулина при высоких дозах приводит к потерям хромосом и индукции микроядер (Marcon et.al., 1995).

Кх - пожалуй, один из первых препаратов, для которых показано их действие на цитоскелет. Первые исследования механизма действия Кх показали, что данный агент образует со свободными димерами тубулина, находящимися в цитоплазме, колхициново-димерный комплекс, который присоединяется к плюс-концу и препятствует дальнейшей полимеризации микротрубочек, а следовательно дезорганизует веретено деления (Margolis, Whillson, 1977). Кх, нокодазол (или онкодазол) и колцемид связываются с одн