Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль молекулярно-цитогенетической диагностики в генетическом консультировании супружеских пар с нарушением репродуктивной функции

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль молекулярно-цитогенетической диагностики в генетическом консультировании супружеских пар с нарушением репродуктивной функции"

^ХАРЬКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

РОЛЬ МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ДИАГНОСТИКИ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ КОНСУЛЬТИРОВАНИИ СУПРУЖЕСКИХ ПАР С НАРУШЕНИЕМ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ

На правах рукописи

БЕРЕШЕВА Альфия Камиловна

03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Харьков— 1995

Диссертация является рукописью.

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

Научные руководители:

Официальные оппоненты.

Ведущая организация:

доктор биологических наук Светлана Григорьевна Ворсанова

доктор медицинских наук, профессор

Людмила Зиновьевна Казанцева

доктор медицинских наук, профессор, академик УЭАН Елена Яковлевна Гречанина

кандидат биологических наук Елена Михайловна Климова

Киевский институт усовершенствования врачей, кафедра медицинской генетики.

Защита диссертации состоится « » -^¿^СсЫг^_ 1995 г>

в_час._ мин. на заседании Ученого совета К 053.06.07 по

присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Харьковском Государственном Университете (310077, г. Харьков, пл. Свободы 4, аудитория 3—15).

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Харьковского государственного университета.

Автореферат разослан « <2У » -1995 г.

б'ченыи секретарь специализированного Ученого совета кандидат биологических наук

А. В. НЕКРАСОВА

Актуальность исследования. При определении повторного риска рождения больного ребенка и тактики пренатальной диагностики у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции (НРФ) ведущая роль принадлежит патогенетическим методам исследования, необходимым для выявления хромосомных нарушений.

Известно, что традиционные цитогенетические методы не могут обеспечить эффективность выявления и анализа целого ряда патологических состояний, связанных с аномалиями хромосом, в том числе сложных хромосомных перестроек таких, как добавочная (маркерная) хромосома, случаи минимального хромосомного мозаицизма, а также сбалансированные хромосомные аномалии с. точками разрыва в околоцентромерных гетерохроматиновых районах хромосом.

Последнее десятилетие характеризуется появлением принципиально новых подходов к диагностике наследственно обусловленной патологии и, прежде всего, хромосомных нарушений. Это стало возможным на базе использования хромосомоспецифичных ДНК-зондов, которые характерны только для определенных пар хромосом или их участков (Ю.Б.Юров, 1987; R.K.Moygis et al., 1987; U.Muller et al., 1987; G.Muller, W.Schempp, 1989; Yu. B.Yurov et al., 1989). Используя ДНК-зонды, можно более точно и эффективно определить особенности хромосомного набора . без прямого цитогенегического анализа с помощью метода радиоактивной и нерадиоактивной гибридизации нуклеиновых кислот In situ (С.Г.Ворсанова и др., 1989; F.Speleman et al., 1990; P.Fouret, 1991; W.L.Kuo et al., 1991; A.T.Tharapel et al.,1991; E.S.Cantu et al.,1992; Yu.B.Yurov et al.,1993).

Молекулярно-цитогенетическая диагностика в течение ряда лет успешно применялась с целью нре- и поотнатальной идентификации наследственных дефектов у детей с задержкой психи-

ческого развития, наличием множественных врожденных пороков и/или микроаномалий развития(С.Г.Ворсанова и др.,1993).Однако, до настоящего времени не получили достаточного освещения вопросы использования молекулярно-цитогенетических методов для определения тех или иных хромосомных нарушений при генетическом консультировании супружеских пар с НРФ.

Цель исследования: Определить возможности использования молекулярно-цитогенетических подходов к диагностике хромосомных нарушений при генетическом консультировании супружеских пар с НРФ.

Научные задачи: I) установить с помощью классических цитогенетических методов частоту хромосомных аномалий и вариантов среда супружеских пар с НРФ; 2) идентифицировать сложные случаи "минимального" хромосомного мозаицизма, когда у одного из супругов выявляется небольшой процент аномальных клеток (до 15%); 3) определить у супружеских пар с НРФ происхождение добавочных(маркерных) или миннхромосом с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот In situ; 4) уточнить точки разрыва в гетерохроматиновых участках аномальных хромосом, вовлеченных в сложные хромосомные нарушения у супружеских пар с НРФ; 5) разработать, на основе проведенных исследований, комплекс информативных показаний для проведения молокулярно-цитогенетичеокой диагностики при генетическом консультировании супружеских пар с НРФ.

Научная новизна. Впервые оценена диагностическая значимость молекулярно-цитогенетических методов при генетическом консультировании супружеских пар с НРФ. Впервые, на основе применения молекулярно-цитогенетических методов, стало возможным выявление у супружеских пар с НРФ случаев хромосомного мозаицизма с небольшим процентом аномальных клеток. Впервые, разработана тактика выявления происхождения маркерных хромосом (определение их генетического состава) у супружес-

1 о

ких пар с НГФ. Впервые, на основе использования молекулярной гибридизации нуклеинов!« кислот in situ, разработан способ молекулярного анализа сбалансированных и несбалансированных

ПврвСТрОвК XpOMOCUM U 'Пенсами ряу.ривс! В ОКОЛОЦеНГроМерИНХ

гетерохроматиновых районах хромосом у супружеских пар с НРФ.

• Научно-практическое значение работы. Разработаны показания для использования жтжулярно-цито генетической диагностики при генетическом консультировании супружеских пяр с КРФ:

1) наличие в семье случаев гоносомного мозаицизма и/или псевдомозаицизма при многоэтапном цитогенетическом аналмке;

2) наличие маркерной хромосомы у яробанда и членов семьи с целью установления ее происхождении (м<uii¡ку.иярти■(> (¡истана).

3)наличие семейной структурной сбалансированной перестройки с точками разрыва в гетерохроматиновом околоцентромерном районе хромосом.

Внедрение молекулярно-цитогенетич«ских методов в практическую медицину будет способствовать большей эффективности генетического консультирования семей и, следовательно, предупреждению распространения наследственной патологии в семье и обществе.

Апробация результатов исследования. Материалы работы доложены на: 2-ой Всесоюзной научно-практической конференции по цитогенетике человека (г. Москва, 1991 г.); 7-м Всесоюзном совещании "Структура и функция хромосом" (г. Пущино, 1991 г.); 2-ой итоговой" конференции НШ медицинской генетики (г. Томск, 1992 г.); 6-ом еьезде общества генетиков и селекционеров (г. Минск, 1992 г.); на симпозиуме по медицинской генетике (г.Прага.ЧСФР, 1992); 3-ей конференции "Геном человека - 93" (г.Черноголовка, 1993 г.), Европейском общество -генетиков человека (г. Барселона, Испания, 1993 г.), на заседаниях проблемной комиссии по генетике: МНМИП и Да МЗ России (г.Москва, I993 г.), лТУ (г.Харьков, I993 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них. 7 в отечественной и 2 в зарубежной печати.

Личный вклад и участие в совместных публикациях заключается в практическом выполнении экспериментальных исследований, анализе и статистической обработке полученных данных, а также в обсуждении результатов эксперимента.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 53 работы отечественные и 172 зарубежные. В тексте диссертации приводится 10 таблиц и 15 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Под наблюдением находилось 210 супружеских пар (420 индивидуумов), обратившихся в медико-генетический центр по поводу генетического прогноза в связи с наличием в анамнезе следующих событий: спонтанные аборты на разных сроках беременности, мертворождения, бесплодие, а также рождение ребенка с хромосомными аномалиями, множественными врожденными пороками и/или микроаномалиями развития. Контрольную группу составили 50 супружеских пар (100 индивидуумов) обративших-, ся, в основном, по поводу проспективного консультирования и не имеющих в анамнезе НРФ. При обследовании супружеских пар был использован клинико-генеалогический метод. Всем 520 индивидуумам обследованной и контрольной групп было проведено онтогенетическое исследование. При наличии сложных видов патологии, когда традиционные онтогенетические метода не могли решить тгроблему идентификации отдельных форм хромосомных нарушений, применялся молекулярно-цитогенетический анализ. Статистическая обработка полученных данных (подсчет зерен серебра) производилась по критерию знаков (В.Ю.Урбах, 1964).

Цитогенетические методы исследования проводились ни препаратах метафазных хромосом, используя культивируемые лимфо-цициты переферической крови. Хромосомы идентифицировали после дифферещиального окрашивания (G,C,Q - методы}. В каждом случае анализировали не менее 11 метафазных пластинок. Отбор метафаз и анализ хромосом осуществляли согласно общепринятым критериям (Н.П.Кулешов, И.В.Лурье, 1984; Н.П.Кулешов, 1991). При обнаружении хромосомных"вариантов применяли метод С-ок-рашивания хромосом (Л. Т. Sumner el, н!., 1971; G. Г. Ворса нова и др.,1989). В случае обнаружения хромосомной нестабильности анализировали по 100 метафаз. Мозаицизм оценивался но мате-матико-статисшческим расчетам (Н.П.Кулешов, 1979,1991).

Молекулярно-цитогенетические методы проводили в случаях, когда традиционный онтогенетический анализ был мало »Фиктивен. Для идентификации хромосом в метафазных или интер])азных клетках, а также для уточнения точек разрыва в аномальных хромосомах использовались клонированные "классические" и альфа-сателлитнне последовательности ДНК, специфичные для хромосом: 15(ДНК-зонд pPD 18), !8(pBRHS 13), 21(альфа R1 6 -X (pYAM 10-40) и Y(pY 96). При определении происхождения маркерных хромосом использовались ДНК-зонды практически на все хромосомы человека, в том числе, pHS05; pBRHS 13; pYAM 10-40; pPD 9.

Молекулярно-цитогенетическая диагностика на метафазных и интерфазных хромосомах проводилась радиоактивным и нерадио-активним методами. Радиоактивная гибридизация клонированных последовательностей ДНК In situ- осуществлялась по ранее описанной методике (J.G.Gail, M.L.Pardue, 1969, 1971; И.Б. Chandler, J.J.Yunls, 1978; Ю.Б.Юров, 1984). После проведенного анализа оценивали потерю или дупликацию хромосомного материала на молекулярном уровне. Нерадиоактивный фнюорес центный метод гибридизации in siUi (FISH) проводился на препаратах интерфазннх. ядер в случаях мозаицизма по методике (Р.R.Langer, D.O. Ward, 1931; D.Pinkel, 1986) с модификациями принятыми в лаборатории цитогенетики человека (рук.д.б.н. Ю.Б.Юров) НЦ психического здоровья РАМН.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Цитогенетические исследования.

В результате анализа кариотипа 210 супружеских пар с нарушением репродуктивной функции у 29 из 420 пациентов (6,9%) были выявлены хромосомные аномалии; у 82 (19,5%) - хромосомные варианты; у 16 (3,8%) - хромосомная нестабильность, у остальных 293 (69,8%) каких-либо кариологических особенностей не наблюдали, т.е. кариотип был нормальным (рисунок I).

В контрольной группе у всех индивидуумов был выявлен нормальный кариотип, в котором не отмечалось каких-либо ци-тогенетических нарушений, вследствии этого в дальнейшем речь будет идти исключительно о супружеских парах с НРФ.

Почти у 1/5 супругов 82 случая(1Э,5%) были выявлены хромосомные варианты, связанные с увеличением гетерохроматино-новых районов хромосом. Среди них встречались 1я11+ - в 3,3%; 9я1и- -в 8,3%; - в 1,0%; Уд1г+ - в 2,9% и сочетанные ва-

рианты в 4%. Можно предположить, что экстремальные варианты хромосом 1, 9, 16 и У могут вести к НРФ. Широко обсуждаемый вопрос о том, могут ли экстремальные макро- и микроварианты С-гетерохроматина хромосом 1,9,16, и У вести к НРФ - на сегодняшний день остается не полностью разрешенным.

Рисунок I

Удельный вес хромосомных особенностей у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции.

19,6

уГ'Л

' - "А Vе

хромосомные аномалии

хромосомные варианты

хромосомная нестабильность

нормальный кариотип

Полученные данные з обследуемой группе но выявлению хромосомной нестабильности трудно интерпретировать. В атом направлении необходимо дальнейшее наблюдение с укйличнничм выборки и последующим анализом.

Проведение патогенетического исследования позволило ср*-т супружеских пар с НК» выявить группу 29 индивидуумов (5,92) с хромосомными аномалиями. Большинство наблюдений было представлено гоносомным мозаицизмом выявленным у 14 и» них (3,3%); у 12 (2,9%) - обнаружены сбалансированные транслокации, и в 3 случаях(0,7%) обнаружены маркерные хромосомы.

Молекулярно-цитогенетические исследования.

В 13 из 29 случаях(3 с маркерной хромосомой, 9 - о ги~ носомным мозаицизмом, в том числе изохромосома Хц, и 1 - со сбалансированной транслокацией) проводилось молекулярно-ци-тогенетическое исследование (табл.1).

Клонированные последовательности хромосомоспецифичных ¿[НК-проб почти во всех проанализированных метафазных и ин— терфазннх пластинках интенсивно гибридизовалиоь с околоцеит-ромерными районами хромосом, вовлеченных в хромосомные аномалии.

Для диагностики мозаицизма радиоактивную и нерадиоактивную гибридизацию нуклеиновых кислот In situ использовали на основании метафазного и интер&азного анализа хромосом. Ifa данное исследование было направлено 12 пациентов. В эту группу входили индивидуумы с подозрением на мозаичную форму синдромов, а также лица, у которых цитогенетически был исключен аномальный клон, но в семье был ребенок с гоносомным синдромом. В результате анализа после гибридизации мозамцизм был установлен в 9 из 12 случаев. Среди них 4 синдрома Шере-шевского-Тернера, 3 -трипло-Х, I -(сочетанннй) Шерешевского-Тернера и трипло-Х и 1 -Клайнфельтера. Аномальный клон присутствовал в клетках с частотой от 5 до 15%.

ТАБЛИЦА № I Результаты молекулярно-цитогенетический диагностики супружеских пар с нарушением репродуктивной функции.

ДИАГНОСТИКА

Ч

и л с и л ц о

КАРИОТИП

(хромосомные аномалии)

Молекулярно-цитогенетическая

АНАЛИЗ

мета-

фаз-

ннй

интер фазный

методы

ISH

4

5

6

7

8 9

10 11 12

13

47,XY, + mar

46,XX/

47, XX, + шаг

46,XX/

47,XX, + mar

46.ХХ/45.Х 46,XX/45,X

4 6,XX/45,X

46, XY/45,X

46,XX/47,ХХХ

46,ХХ,1qh+/ 4 7,XXX,1qh+

46,XX/47,XXX

46, XY/47, XXY

46,XX/46,X,i (Xq)(qter->cen-->qter)/45,X

45,XX,die t (15;18)(I5qter-->oen->15p11: 18p1l.321->cen-->18qter>

+ + + + + + + +

Установление происхождения хромосом

der У

der X

der 21 Определение числа аномальных клеток в %

85/15

86/14

обнаружен третий клон 47,XXX - /5 85/10

90/10

90/10

85/15

86/14 86/14

80/15/5

УТОЧНЕНИЕ ТОЧЕК РАЗРЫВА В АЛЬФОИДНОЙ ДНК

(нет потери материала хромосом)

*

1

+-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

* TSTt - in Ritai гибридизация (изотопный метод)

НТ'И - флюоресцентная in ailu гибридизация (нирадиоактишнй

метод)

Учитывая то, что на основе малого объема материала можно быстро и точно определить и установить "скрытый" мозаицизм, диагностика подобных случаев осуществлялась, в основном, им интерравных ядрах послы гибридизации .La «Ни. Данный интьр-фазного анализа были параллельно проведены и подтверждены на метафазных клетках в трех случаях, где процент аномальных клеток был также низким (до \Г>%). Мозаицизм у 7 индиьидуумоь был представлен двумя клонами клеток, в двух случаях ьнив.инн аномальный третий клон в Я% клеток (том. Г).

При использовании алы^ждиой ДШ-пробы pYAM KMC), котирую метили радиоактивно, были диагностированы синдромы Шири-шевского-Териера, Клайн^льтора и тринло-Х. Для ,ни:-пч1>»-тики синдрома Шерешевского-Тнрн^ра применяли этот жн ДНК-^ч.д PYAM 10-40 меченый биотипом, т.е. использоиялои метод FTSI1-флюоресцентной in situ гибридизации (табл.!). Одной пациент ке с данным синдромом, у которой.наблюдался аномальный клон но изохромосоме Xq, проводили радиоактивную гибридизации I»> situ . Данная патология была обнаружена также у ее рвЛенкя.

Известно, что у носителей изохромоеомы по длинному плечу X,i(Xq) развивается синдром Шерешевского-Тернера, поскольку аномальная хромосома всегда инактиьирована и -активной остается только одна нормальная хромосома - X. 13 данной ситуации у женщины с изохромосомой Xq не отмечались признаки синдрома Шерешевского-Тернера, но при этом присутствовал аномальный клон 4G,X,l(Xq) (qtex'->ceri->qter) в низком проценте 15®,

а также в Ъ% клеток клон 45,X. При количественном анализ^ полученных данных было установлено, что изохромосома Xq содержала два неизмененных длинных плеча, большую часть около-центромерного гетерохроматина обеих хромосом, а два коротких плеча были полностью утрачены. Результаты свидетельствовали о том, что количество зерен серебра в 1,5 раза больше над изохромосомой Xq, чем над нормальной хромосомой X. При статистической обработке произведено сравнение по критерию знаков, где р 0,001.

to

Исходя ИЗ наложенного, можно считать, что одним из показаний к проведению молекулярно-цитогенетической диагностики у супружеских пар с НРФ служит наличие гоносомного мозаициз-ма в семье и/или псевдомозаицизма при многоэтапном цитогене-тическом анализе.

Анализ кариотипа и определение происхождения маркерных хромосом ггроводился радиоактивным методом гибридизации in situ у 3-х пациентов. Во всех случаях, как видно из рисунка 2, маркерные хромосомы идентифицированы, как дериват хромосом 21, X и Y. При количественном анализе числа зерен серебра над гомологами хромосом (21, X , Y) и маркерными хромосомами оказалось, что интенсивность гибридизации одинакова, т.к. число зерен серебра над маркерными и нормальными хромосомами существенно не различалось. Учитывая результаты цито-генетического и молекулярно-цитогенетического анализа клеток пациентов, кариотипы были следующими: 47,XY,+mar(cler Y); 46,ХХ/47ХХ,+таг(йег X) и 46,XX/47,XX,+mar(der 21)(табл.1). Полученные данные позволяют более эффективно проводить своевременную пренатальную диагностику. Следует отметить, что при обнаружении маркерной хромосомы у плода, идентичной фенотипичаски здоровым членам семьи беременность, по-видимому, необходимо сохранить. При определении происхождения маркерной хромосомы отличной от семейной, беременность вероятно следует прервать.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наличие маркерной хромосомы, как у супружеских пар, так и их детей, является необходимым показанием для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики.

о т

Н 0,2

О

С

И

Т

Е 0,1

Л

Ь

Н

А

Я

0,3

Ч А С

т о т

А

0,2

3 Е Р Е

Н 0,1

0 Е Р Е Б Р А

0,3 -I

Н А

М

Е 0,2 Т

0,1

8 9 11 13

17

21

mar

т т т т

Т Т I т т т т т

1 3 5 7 9 11 13 17

_Д mar

I

1 9 13 15 2122 Y шаг

номера хромосом Рис. 2 Идентификация дополнительных маркерных хромосом с помощью гибридизации in situ хромосомоспецифичных ДНК-проб. а)маркерная хромосома - der2i (ДНК-зонд альфаШб); ь)маркерная хромосома - <JerX(ДНК-зонд рулм ю-40); с)маркерная хромосома -der Y(ДНК-зонд рУ9Ь).

С целью уточнения онтогенетического диагноза и выяснения точек разрыва в хромосомах, был применен радиоактивный метод молекулярной гибридизации хромос-омоспецифической альфоидной ДНК в одном случае из 12-ти обнаруженных транслокаций,'когда мать являлась носителем сбалансированной транслокации 45, XX,г(15;18). У ее сына онтогенетическими методами выявлена транслокация, предположительно с потерей материала короткого плеча хромосомы 18 : 45.ХУ, И15;18) ^ег->сеп->р1;ег: :р11-> сеп-х^ег). Методика радиоавтографии позволила количественно оценить интенсивность гибридизации путем подсчета зерен серебра (под микроскопом) над соответствующими районами хромосом. При несбалансированной транслокации I Г>;18 у пробанда после молекулярно-цитогенетического исследования обнаружена утрата не- только короткого плеча (как было принято считать после классической онтогенетической диагностики),; но и части околоцентромерного гетерохроматина хромосомы 1'8(рис. 3). У матери пробанда потерю хромосомного материала мы не наблюдали. Число зерен серебра у аномальных и нормальных хромосом 15 (транслокации 15;18) не отличалось, т.е. число копий альфоидной ДНК было одинаково в обоих хромосомах, как у матери, так и у ребенка. Таким образом, в хромосоме 15 потери хромосомного материала не обнаружено.

Из полученных данных следует, что у данной пациентки диагноз сбалансированной транслокации подтвердился, ее кари-отип был следующим: 45,ХХД(15;18)(^1;ег->сеп->15р11::18р1 1.321->cen->18qter), а в кариотипе ребенка наблюдалась потеря материала 18р, соответствующая синдрому 18р-. Кариотип ребенка: 45,ХУД(15;-18)(15цгег->сеп->15р11 ::18р11 (31 )->сеп-> 18д1;ег). Число зерен серебра над нормальной по сравнению с транслоцированной хромосомой 15;18 у пробанда достоверно

. гас. Я а ЫUJlШ^JmrnU-mTШ^JlШ,r¡fl^V^ЛШ лшишо хглпилиош^т и, к->.

Нормальная хромосома

Сбалансированная транслокация у матери

Несбалансированная транслокация у сына

з**»*»•«•V

г«« • «••»•# Н»»»»» »#»•

хромосома 15 ДНК-зонд рРВ 18

чи»»»»»»«

•»»» * мм< 1« •»• • «•>«•

хромосома 18 {-зонд рВШБ 13

кариотип после проведения гибридизации 45,ХХ,г(15;18)15агег-> ' "

оеп->15р11::18р11.321-> ->cen->18qteг

±п вИи 45,XY,t(15;18)15qter-> сеп->15р11::18р11.(31 )-> ->cen->18qter

I *зг

больше» где р<0»С01. Седцуе? отмстить, что у матери н& наблюдалось твкой рьзнкнд щз& сравнении нормальной 18 и транслоцкроз£иясй хромосомой 15;18. Из рисунка 3 вмдао, что при использовании ДНК-зоада рВКНЗ 13 на хромосому 18 наблюдалось достоверное отличив по количеству зерен серебра в околоцентромерном гетерохроматиновом районах транслодиро-ванной хромосомы 15;18 у матери и ггробанда.

Таким образом, в случаях структурных перестроек с точками разрыва в гетерохроматине околоцентромерных участков хромосом, для уточнения диагноза (точек разрыва и воссоединения на аномальных хромосомах), показано проведение молекулярно-цитогенетической диагностики, как супружеским парам с нарушением репродуктивной функции, так и их детям.

Полученные данные позволяют отметить, что молекулярно-цитогенетические методы необходимо применять, как с целью уточнения или подтверждения диагноза, так и для молекулярного изучения хромосомных аномалий.

Проведенные исследования позволили доказать целесообразность и высокую эффективность использования молекулярно-ци-тогенетических методов диагностики в генетическом консультировании семей с НРФ.

ВЫВОДЫ

1. Цитогенетическое обследование 210 сулруквских пар с нарушением, репродуктивной функции (420 индивидуумов) позволило установить у 127 индивидуумов (30,2%) - различные хромосомные особенности, в том числе: - у 82 (19,5%) различные хромосомные варианты, у 29 (6,9%) хромосомные аномалии, у 16 (3,8%) хромосомную нестабильность.

2. Структура 29 хромосомных аномалий среди, супружеских пар с нарушением репродуктивной функции представлена мозаи-цизмом аномалий гоносом - у 14, сбалансированными транслока-'циями - у 12 и маркерными хромосомами -у 3,

3. Частота экстремальных хромосомных вариантов, связанных с увеличением околоцентромерных гетерохроматиновых районов хромосом 1, 9, 16 и Y, среди супружеских пар с нарушением репродуктивной функции составила 19,5%, в том числе наблюдались варианты 1qh+ - (3,3%), 9qh+ - (8,3%), 16qh+ (1,0%), Yqh+ - (2,9%), и сочетанные варианты - (4%).

4. Применение молекулярно-цитогенетических методов позволило в 9 (из 12) случаях обследования супружеских пар с нарушением репродуктивной функции выявить "скрытый" хромосомный мозаицизм, обнаруженный при небольшом проценте аномальных клеток (до 15%).

5. Идентифицировано происхождение маркерных хромосом с помощью молекулярно-цитогенетическоро метода у трех индивидуумов из супружеских пар с нарушением репродуктивной функции. Добавочные хромосомы классифицированы, как дериват 21, X и Y, что имеет значение для определения тактики генетического консультирования и пренатальной диагностики.

6. Разработан способ молекулярного анализа сбалансированных и несбалансированных перестроек с точками разрыва в околоцентромерных гетерохроматиновых районах хромосом, на основе использования молекулярной гибридизации —нуклеиновых кислот in situ.

7. Разработаны показания для использования молекулярно-цитогенетической диагностики при генетическом консультировании супружеских пар с нарушением репродуктивной функции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. С.Г.Ворсанова, Л.З.Казанцева, А.К.Верешева, И.А.Демидова, Ю.Б.Юров. Результаты молекулярно-цитогенетической диагностики супружеских пар с нарушением репродуктивной функции при медико-генетическом консультировании.//Сб-к научных трудов "Молекулярная диагностика наследственных болезней и медико-генетическое консультирование". Москва, 1994, 9 стр.

2. С.Г.Ворсанова, Ю.В.Юров, И.А.Демидова, Н.В.Вехова, А.К.Берешева, З.О.Шаронин. . Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий при медико-генетическом консультировании детей с недифференцированными формами умственной отсталости.// Cö-к научных трудов "Молекулярная диагностика наследственных болезней и медико-генетическое консультирование". Москва, 1994, 6 стр.

3. С.Г.Ворсанова, А.К.Берешева, Л.З.Казанцева, Ю.В.Юров. Хромосомные аномалии у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом по данным молекулярно-цитогенетических исследований. //Материалы 2-ой итоговой конференции НИИ Мед. Генетики "Генетика человека и патология", Издательство Томского Университета, г. Томск, 1992, 2 стр.

4. С.Г.Ворсанова, Л.З.Казанцева, А.К.Берешева, И.А.Демидова, Ю.В.Юров. Молекулярно-цитогенетическан диагностика у супружеских пар с отягощенным акушерским анамнезом.// "Российский вестник перинатологии и педиатрии",~ МоЬква, 1994, 1 стр.

5. S.G.Vorsanova, Yu.B.Yurov, A.K.Beresheva. Molecular analysis of the chromosomal breakpoints In patients with balansed and nonbalansed translocations.//European society of human genetics. 25th annual meeting, Barcelona, Spain, 1993, 1 стр.

6. С.Г.Ворсанова, Ю.В.Юров, И.А.Демидова, А.К.Берешева. Альфоидные и "классические" сателлнтные ДНК-пробы для идентификации маркерных хромосом человека.//Сб-к тезисов 3-ей конференции "Геном человека - 93", Москва, 1993, 1 стр.

7. S.G.Vorsanova, Yu.В.Yuroy, I.A.Bemidova, A.K.Beresheva, N.V.Vechova, V.O.Sharonin. Diagnosis of chromosomal abnormalities In children with mental retardation.// Satellite symposium of Mendel forum "Genetics in medicine", Praque, Czechoslovakia, 1992, 1 стр.

i

8. С.Г.Ворсанова, И.А.Демидова, А.К.Берешева, Н.В.Вехо-ва, В.О.Шаронин. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных аномалий.// Материалы VI съезда общества генетиков и селекционеров им.Н.И.Вавилова, г.Минск, 1992, 1 стр.

9. С.Г.Ворсанова, Ю.Б.Юров, И.А.Демидова, А.К.Берешева, Н.В.Николаева, Т.Н.Бурова, Л.З.Казанцева, П.В.Новиков. Цито-генетическая и молекулярно-цитогенетическая диагностика в республиканском детском центре наследственной .патологии.// Сб-к тезисов 2-ой Всесоюзной научно-практической конференции по цитогенетике человека, Москва, 1991, 1 стр.

Beresheva Alphia Kamilovna. Theme of dissertation: "The role of molecular-cytogenetic diagnosis in genetic consultation of married couples with disorder of reproductive function". Dissertation on competition of academic degree of candidate of biological sciences. Speciality 03.00.15 -Genetics; 1995, manuscript of the dissertation.

In the article the results of cytogenetic and molecular-cytogenetic diagnosis of merried coupls with disorder of reproductive function are observed.

Thes■shows the necessity of molecular diagnosis with aplication of"chromosome-specific DNA probes irr cases of mosaicism with small percent of abnormal cells, balanced translocations with rupture in centromeric heterochromatic region of chromosomes and marker chromosomes.

Берешева Альф1я Кам1л1вна. Роль молекулярно-датогене-тично'1 д!агностики в генетичнсму консультуванн1 подружжя з порушенням репродуктивно! функцИ. Дисертац1я на здобуття вченого ступени кандидата б!олог1чних наук. Спец1альн1сть 03.00.15 - Генетика; 1995, рукопис дисертацП.

В робот! представлен! результата цитогенетичноЧ i моле-кулярно-цитогенетично'1 д!агностики у подружжя з порушениям репродуктивно'I функц!!.

Ключов! слова: (хромосома, моза'1цизм, транслокац!я, маркерна хромосома, ДНК-зонд, г1бридизац!я нукле'1нових кислот In situ, FISH).

Подп. к печати 16-1 199-Э г. ф.п.л. '/¿5 Тираж /УО Типография «Нефтяник» • Зак. № 17