Диагностика и профилактика врожденных и наследственных заболеваний при вспомогательных репродуктивных технологиях

Глинкина, Жанна Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Диагностика и профилактика врожденных и наследственных заболеваний при вспомогательных репродуктивных технологиях
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Диагностика и профилактика врожденных и наследственных заболеваний при вспомогательных репродуктивных технологиях"

На правах рукописи

ГЛИНКИНА ЖАННА ИВАНОВНА

ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА ВРОЖДЕННЫХ II НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПРИ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ

03.00Л5 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

16 окт да

Москва -

2008

003448327

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научный Центр акушерства, гинекологии и иеринатологии имени академика В.И. Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Бахарев Владимир Анатольевич

ФГУ «НЦ АГ и П им В И К\ лакова Росмедтехнологий» Кузьмнчев Леонид Николаевич ФГУ «НЦ АГ и П им В И Кулакова Росмедтехнологий» Лильин Евгений Теодорович ФГУ Российский реабилитационный Центр «Детство» Министерства Здравоохранения и Социального Развития Спицын Виктор Алексеевич ГУ Медико - генетический научный центр РАМН

Щипков Валерий Петрович

ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Московский государственный медико - стоматологический университет Росздрава» _ /

Защита состоится « /и» / 2008 года в часов на заседании Совета по защите

докторских и кандидатских диссертаций Д 212 203 05 при ГОУ ВПО «Российский

университет дружбы народов» по адресу 117198, Москва, ул Миклухо-Маклая. д 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет

дружбы народов» 117198, Москва, \ л Миклухо-Маклая, д 6 /) 7 л" П

Автореферат разослан« к7 » и } 2008г

доктор медицинских на) к, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Академик РАЕН

доктор биотогических наук. профессор

доктор медицинских нау к, профессор

Ученый секретарь

Совета по защите докторских и

кандидатских диссертаций Д 212 203 05

к б н,доцент

Гигани О Б

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Основная цель вспомогательных репродуктивных технологии - наступление беременности и рождение здоровых детей В настоящее время произошел значительный прогресс в лечении ранее неизлечимых форм бесплодия Это стало возможным благодаря развитию микроманииуляционной техники и внедрению новых методов ВРТ, таких как ИКСИ, суррогатное материнство и др. Применение новых технологий позволяет получить потомство даже у супружеских пар с генетическими изменениями и высоким риском рождения ребенка с врожденной и наследственной патологией Единственной в настоящее время возможностью снизить медицинский «груз» у этой группы пациентов является оптимизация программы ЭКО/ИКСИ с разработкой и применением новых профилактических мероприятий, которые должны стать неотъемлемой частью ВРТ

Научно-практическая деятельность отделений ВРТ разных стран показала, что изменения в генотипе среди пациентов с нарушением репродуктивной функции отмечаются значительно чаще, чем в поттяции [Курило ЛФ, 1995, Сашю И, 1999] Нарушение репродуктивной функции обычно обусловлены хромосомными и генными мутациями, наличием наследственной предрасположенности к заболеванию

Мутации у родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным щ тем, могу т передаваться буду щему потомству через гаметы при применении программ ВРТ Все эти данные указывают на необходимость проявлять настороженность при использовании методов ВРТ у пациентов с генетической патоюгией

Несмотря на значительное усовершенствование существующих на сегодняшний день скрининговых программ по выявлению женщин групп высокого риска рождения генетически больного ребенка, они не могут быть в достаточной мере использованы для выявления аномалий у плодов, полученных в программах ВРТ При разработке этих программ не учитывались особенности методов получения (стимуляция с> перовуляции) беременности и ее течения (мощная гормональная поддержка, часто многоплодие) при использовании репродуктивных технологий Новые условия требуют создания новых подходов к разработке профилактики врожденной и наследственной патологии и рождения здорового потомства у пациентов, включенных в программу ВРТ

Новым и исключительно перспективным направлением в клинической практике в

плане исключения рождения генетически больного ребенка должна стать преимплантационная диагностика, большим преимуществом которой является исследование эмбриона до .момента переноса его в организм матери [Harper J, 2005, Munne S , 2005]

Однако, несмотря на наличие технических возможностей проведения ПД, до сих пор неизвестно, как влияет сама эта манипуляция на дальнейшее развитие эмбрионов, какова эффективность данного метода, не разработан алгоритм проведения этой процеду ры, до конца не сформулированы возможности ПД, показания к ее проведению

Преимплантационная диагностика может стать альтернативой пренататьной диагностике для тех имеющих высокий риск рождения ребенка с наследственной или врожденной патологией фертильных супружеских пар, которые в случае обнаружения у плода генетической патологии выступают против медицинского аборта по моральным, религиозным или другим мотивам

Несмотря на наличие многочисленных публикаций по данному вопросу, содержающаяся в них информация носит фрагментарный характер До настоящего времени в литературе нет обобщенных данных о лечении и исходах беременностей у пациентов с генетическими мутациями Все вышесказанное указывает на необходимость разработки алгоритма медико-генетического обследования и проведения профилактических мероприятий с помощью медико-генетического консультирования пациентов программы ВРТ

Цель исследования

Изучить особенности генотипа супружеских пар, включенных в программу ВРТ, и разработать алгоритм профилактических мероприятий врожденных и наследственных заболеваний у потомства

Задачи исследования

1) Оценить частоту хромосомных и некоторых моногенных мутаций при различных формах бесплодия,

2) провести исследование генотипов супружеских пар программы ВРТ цитогенетическое обследование, исследование гена CYP 21В, гена трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR - cystic fibrosis transmembrane conducíase regulator), анализ микроделеций в локусе AZF хромосомы Y, антигенов системы HLA (Human Leucocjte Antigens),

3) выявить уровень хромосомных аберраций в сперматозоидах у мужчин, в кариотипе которых отмечаются хромосомные изменения.

4) определить частот) и характер хромосомных аберраций у эмбрионов in vitro, у неразвивающихся плодов, полученных в программе ВРТ,

5) провести анализ результатов программы ВРТ с проведением ПД ) супружеских пар с изменениями в генотипе и без таковых, оптимизировать метод FISH,

6) разработать рекомендации генетического обследования доноров половых клеток.

7) на основании полученных данных разработать алгоритм генетического обследования пациентов и профилактических мероприятий дтя конкретной супр)жеской пары с высоким риском рождения ребенка с генетическим заболеванием в программе ВРТ

Научная новиша

В последнее время значительно возрос интерес как к самим новым методам ВРТ, так и к здоровью зачатых с помощью ВРТ детей Это связано с тем, что в связи с достижениями в области микроманипуляционной техники, биологии, медицины даже у пациентов с генетическими мутациями появилась возможность иметь здоровых детей В данном исследовании впервые проведено комплексное медико-генетическое обследование страдающих бесплодием и включенных в программу ВРТ супружеских пар, определены особенности генотипа, выявлены удельный вес и тип генетических мутаций у этой группы пациентов В диссертации впервые предложен алгоритм комплексного медико-генетического обследования пациентов программы ЭКО и ИКСИ Важным и новым являются разработанные в работе положения, доказывающие необходимость проведения преимплантацнонной диагностики у супружеских пар с генетическими нарушениями, оптимизирован протокол проведения гибридизации in situ и оценена эффективность преимплантационной диагностики FISH методом Определена частота анеуплоидии в ядрах бластомеров у пациентов с генетическими изменениями (хромосомными и генными) Впервые выявлена положительная ассоциация антигенов системы HLA I класса у мужчин славянской популяции с нарушением сперматогенеза Выявлено соотношение клонов с нормальным и аберрантным хромосомным набором в сперматозоидах у мужчин с робертсоновской транслокацией хромосом 13 и 14 в кариотипе Таким образом, данное исследование направлено на повышение эффективности программы ВРТ и профилактику рождения ребенка с генетическими нарушениями у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции, а также у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения потомства с мутациями

Практическая значимость

В данной работе на основе проведенных научных исследований решен ряд важных практических вопросов, направленных на повышение эффективности программы ВРТ и рождения здорового потомства у пациентов этой программы Полученные данные указывают на необходимость комплексного проведения медико-генетического обследования обоих супругов, нуждающихся в лечении бесплодия до их включения в программу ВРТ

Выявленный высокий уровень различных генетических изменений у супружеских пар с бесплодием позволяет разработать рекомендации по формированию группы риска пациентов, у которых в потомстве могут возникать мутации В связи с этим предложена и показана важность оптимизации программы ВРТ для конкретной супружеской пары с генетическими нарушениями (хромосомными и/или генными) с разработкой индивидуального алгоритма лечения бесплодия методами ЭКО, ИКСИ

Оптимизирован метод флуоресцентной гибридизации in situ, благодаря чему удалось повысить эффективность проведения ПД методом FISH

Результаты исследования позволяют сделать заключение о высокой эффективности ПД в ряду профилактических мероприятий по рождению здорового потомства в рамках программы ВРТ

Положения, выносимые на защиту

1 Высокая частота хромосомных и генных изменений в генотипе пациентов программы ВРТ обуславливает необходимость проведения медико-генетического консультирования, цитогенетического обследования обоим супругам и по показаниям молекулярно - генетическое обследования до включения их в программу ЭКО/ИКСИ

2 У мужчин с робертсоновской транслокацией хромосом 13, 14 в кариотипе выявляется положительная корреляция между показателями спермограммы и частотой нерасхождения в сперматозоидах вовлеченных в транслокацию хромосом и гоносом При наличии хромосомной аберрации в кариотипе и отклонений в показателях спермограммы в мейозе отмечается высокий уровень нерасхождения хромосом 13,14, а также гоносом

3 Антигены системы HLA I класса могут служить надежными маркерами в прогнозе наличия у мужчин нарушений сперматогенеза Исследование фенотипов HLA I класса мужчин программы ВРТ с отклонениями в показателях спермограммы обнаружило положительные ассоциации между олигоастенотератозооспермией и антигенами HLA В18, В35, Cw4

4 Преимплантационная диагностика является одним из основных этапов в профилактических мероприятиях у пациентов программы ВРТ ПД с помощью FISH анализа

является эффективным методом определсши различных типов анеупловдии в ядрах бласто.меров и может быть рекомендована для применения в клиниках ВРТ как у пациентов с бесплодием, так и у фертильных супружеских пар, имеющих высокий риск рождения ребенка с генетической патологией

Апробация работы

Материалы работы доложены на Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Современные технолог ии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2004), на VII Российском Форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2005), на V международном конгрессе «Актуальные вопросы репродукции человека (проблемы и решения, 2008), межклиническом заседании при ФГУ «НЦ АГ и П им В И Кулакова Росмедтехнологий» (23 Об 2008 г) По материалам диссертации от бликовано 40 работ

Структура и объем диссертации Работа изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций Работа иллюстрирована 45 таблицами и 20 рисунками Библиографический указатель включает 244 литературных источника, из которых 43 работы отечественных и 201 - зарубежных авторов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных супружеских пар

В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ «НЦ АГ и П им В И Кулакова Росмедтехнологий» было обследовано 1898 человек, т е 949 супружеских пар, страдающих бесплодием и включенных в программу ВРТ Все супружеские пары прошли медико-генетическое консультирование Данные о супружеской паре были внесены в специально разработанную карту генетического обследования

Супружеские пары были разделены на 2 группы первая группа состояла из 391 су пружеской пары, у мужей которых отмечали нормозооспермию и планировали проведение программы ЭКО и ПЭ, вторая гру ппа - из 558 супружеских пар, у мужей которых отмечали различные отклонения в показателях сперчограммы и они нуждались в проведении процедуры ИКСИ (внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида в цитоплазму ооцита)

Средний возраст женщин в группе ЭКО составил 34,2 года (от 20 до 51 г ), мужчин - 38 лет (от 24 до 66 лет) Процент женщин старше 35 лет в этой группе составил 50 4% Возраст женщин в группе ИКСИ варьировал от 17 до 49 лет (средний возраст 33 4 г),

мужчин от 24 до 65 лет (средний возраст 39 лет) Женщины старше 35 лет в этой группе составили 34 9 %

Изучение семейного анамнеза супружеских пар программы ЭКО и ПЭ позволило обнаружить у 23% супружеских пар (женщин и мужчин) НРФ у родственников I и II степени родства, в программе ИКСИ - 15 8%, выявленные ПР, хромосомные и моногенные заболевания у родственников пациентов программы ЭКО составили 1%. в программе ИКСИ - 3 6%

Первичное бесплодие у пациентов I группы было отмечено у 162 супружеских пар. у II гру ппы - 309 пар

Первичное МГК выявило у 80 пациентов из 1898 (4 2%) программы ВРТ врожденные пороки развития (ВПР), моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов Дальнейшее генетическое исследование выявило различные генные мутации еще у 97 человек Таким образом, общий уровень данных изменений составил 9.3% (у 177 из 1898 пациентов)

Характеристика сперматогенеза у включенных в обследование мужчин

Исследование эякулята было проведено у всех мужчин, включенных в программу ВРТ. У 294 мужчин из супружеских пар I группы показатели спермограммы находились в пределах нормы, у 97 - на границе нормы У всех мужчин из супружеских пар II группы наблюдали различные отклонения в показателях спермограммы

Методы исследования

С учетом задач исследования были применены следующие методы и исследования

Цитогенетический метод Данный раздел исследования был выполнен сотрудниками лаборатории клинической генетики ФГУ «НЦ АГ и П им В И Кулакова Росмедтехнологий», которым автор выражает признательность

Цитогенетическое исследование было проведено на препаратах метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови в соответствии со стандартной процедурой Для получения препаратов хромосом из ворсин хориона применяли ускоренный «прямой метод»

Молекулярно-цитогенетический метод (FISH) Для молекулярно-цитогенетических исследований препараты клеток эякулята готовили по методу, предложенному в 1997 г Guttenbach М

Преимплантационная диагностика эмбрионов состояла из 2 этапов - биопсии бластомера и молекулярно-цитогенетического исследования ядра бластомера Биопсию бластомеров проводили на 3 день развития эмбриона in vitro Для диагностики и последующего переноса выбирали эмбрионы хорошего качества, те, имеющие 6-10 бластомеров и фрагментацию не более 50%

Биопсию эмбрионов проводили на микроманипуляторе NARISHIGA с применением лазерной пушки фирмы FERTILASE В качестве основы подготовки ядра и гибридизации in situ служил протокол, рекомендуемый фирмой-производителем В ходе исследования данный протокол нами был оптимизирован

Для флуоресцентной гибридизаци in situ использовати зонды и набор фильтров фирмы ABBOT (Vvsis) Микроскопический анализ проводили при увеличении 100X10 с использованием флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы Zeiss и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой Metasystems

Молекулярно-генстический метод Все молекулярно-генетические исследования проводили сотрудники лаборатории ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН, которым автор выражает большую признательность

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов для выделения DNA PreplOO (DIA/oтш) (Россия) по протоколу производителя Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия)

Результаты амплификации, ПДРФ-анатиза и атлель-специфичной лигазной реакции оценивали методом электрофореза в полиакрилачидном гете (ПААГ) Разделение амплификационных фрагментов специфичных ДНК-маркеров проводили на 8% ПААГ

Анмиз и запись изображений полученных гелей проводили с использованием имеджин станции GEL DOC 2000 и пакета программ QUANTITY ONE ® фирмы BIORAD (Италия) Анализ результатов исследования проводили по электрофореграмме

Спермиологический анализ Спермиологический анализ эякулята выполняли дважды для большинства пациентов по методу, рекомендованному ВОЗ (WHO. 1999)

Исследование HLAI класса Фенотип HLA I класса у мужчин определяли по трем локу сам, А, В и С Использовачи гистотипирующу ю панель фирмы «Гисанс» (Санкт-Петербу рг)

Фенотип HLA определяли с помощью стандартного личфоцитотоксического Теста Tarasaki в модификации Daussett

Пол>ченные результаты обрабатывали с помощью статистического определения X2, достоверная значимость которого равнялась 3,77 в программе «Statgraphics» Критерий относительного риска, свидетельствующий о силе ассоциаций антигена и из> чаемой патологии, рассчитывали по формуле (Woolf В 1955)

R _ fa a-fki

fk(i_fn), где

fh - фракция носителей антигена среди обследованных, fk - фракция носителей антигена в контрольной группе Показатели R более двух считали значимыми

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты цитогенетического обследования супружеских пар, эмбрионов и плодов

программы ВРТ

Хромосомные нарушения у супружеских пар с НРФ и профилактика рождения бочьных

детей

Исследование кариотипа у пациентов ВРТ выявило у 7% супружеских пар хромосомные аберрации у пациентов I группы - у 24 женщин и 5 мужчин (7 4% в пересчете на супружескую пару), у пациентов II группы - у 7 женщин и 30 мужчин (6 6% в пересчете на супружескую пару)

Анализ полученных результатов показал, что и у мужчин и у женщин обеих групп нарушения в комплексе половых хромосом занимают первое место, хромосомные транслокации - второе, причем робертсоновская транслокация с вовлечением хромосом 13 и 14 встретилась в 50% наблюдений

Проведенные многочисленные исследования кариотипа пациентов с НРФ показали высокий уровень хромосомных аберраций как у женщин, так и у мужчин Уровень хромосомных аберраций у пациентов с НРФ может варьировать от 1 8% до 8% [Курило JI Ф , 1995, Causio F, 1999] При этом хромосомные изменения в общей популяции сравнительно редки и встречаются с частотой от 0 1% до 0 5% [Jacobs Р А , 1974, Nielsen J, 1991]

Следует обратить внимание на тот факт, что и в I и во II группах хромосомные аберрации были выявлены как у мужчин, так и у женщин Это указывает на необходимость проведения цитогенетического исследования лимфоцитов периферической крови обоим супругам программы ВРТ Данная группа супружеских пар составляет основную группу пациентов с высоким риском невынашивания беременности и рождения детей с наследственной патологией в рамках программы ВРТ Это связано с тем, что у такой группы пациентов в процессе мейоза формируются половые клетки с несбалансированным хромосомным набором, которые при оплодотворении вносят свой вклад в аномальное

развитие плода

В связи с этим мужчинам с изменениями в кариотипе в ряде случаев мы рекомендовали исследование ядер сперматозоидов для выявления уровня анеуплоидии, проведение преимплантационной и/или пренатальной диагностики, а также, в зависимости от ряда обстоятельств (невозможность провести преимплантационую или пренатальную диагностику, отягощенный акушерский анамнез (ОАА), большое количество неудачных попыток и т д), использование в программе ВРТ донорских половых клеток

Изучение процесса сегрецации хромосом в поювых клетках у мужчин, имеющих изменения в кариотипе Нами были исследованы 5 образцов эякулята от мужчин с аналогичной робертсоновской транслокацией хромосом 13 и 14 Из 5 обследуемых пациентов только у одного показатели сперчограммы были в норме, у остальных наблюдали олигоастенотератозооспермию (ОАТ) В качестве группы контроля служили 5 мужчин с нормальным кариотипом и нормозооспермией В группе контроля сперматозоиды с анеуплоидией по хромосомам 13 и 14 встречались не чаще 1 на 1000 (0 1%) анализируемых клеток У пациента с нормозооспермией и транслокацисй в кариотипе анашз показал самый высокий процент сперматозоидов с нормальным набором хромосом 13 и 14 - 83 9% У пациентов с отклонениями в показателях спермограммы он варьироват от 64 до 73%

По частоте встречаемости анеуплоидия хромосомы 14 у мужчин с ОАТ заняла первое место - 17% (сперматозоиды с набором хромосом 14,0 встречались в 11% (среднее значение), а с набором 13,14,14- 6%) Анеуплоидия хромосомы 13 составила 11 6% (сперматозоиды с набором хромосом 13,13, 14-6 5% (среднее значение), а с набором 13,0 -5 1%)

У мужчины с нормозооспермией - уровень анеуплоидии хромосомы 13 составил 4 8%, а хромосомы 14-10 6%

Исследование гоносом в сперматозоидах у пациентов с транслокацией в кариотипе показало у них также высокий уровень клеток с хромосомной патологией - от 0 6% до 1 7% У пациентов с нормааьным кариотипом этот уровень не превышал 0 25%

Полученные данные свидетельствуют о существовании корреляции между хромосомными изменениями в лимфоцитах периферической крови и в половых клетках Исследования некоторых авторов позволили сделать предположение о том, что интерхромосомный эффект может зависеть от конкретной хромосомной аберрации в кариотипе [Blanco J , 2000] Douet-Guilbert N с соавт (2005), используя зонды на 7, 9, 13, 21, X, Y, 18 хромосомы, исследуя у пациентов с транслокациями различных хромосом в

кариотипе мейоз FISH методом, выявили статистически достоверное увеличение частоты дисомии гоносом V пациента с der(13,14)(qlO,qlO), но не у пациента с der(14,21)(ql0,ql0) Повышенный уровень дисомии 21 хромосомы отметили только у одного мужчины из четырех с различными реципрокными транслокациями - с t(9,22)(q21,ql 1 2)

Несмогря на противоречивые данные, все авторы пришли к выводу о важности индивидуального изучения сегрегации хромосом у пациентов с хромосомными аберрациями в кариотипе Это даст достаточное количество информации о процентном соотношении половых клеток со сбалансированным и несбалансированным хромосомным набором у конкретного мужчины, что позволит провести адекватную генетическую консультацию супружеской паре и может сыграть решающую роль в выборе последующей тактики лечения

Результаты ПДу супружеских пар с хромосомными аберрациями в кариотипе Большинство супружеских пар при обнаружении у них хромосомных изменений чаще соглашаются на программу с донацией половых клеток Пациенты принимают такое решение в связи с тем, что большинство из них уже имели многочисленные неудачные попытки ЭКО/ИКСИ в анамнезе

Во всех случаях биопсию эмбрионов мы проводили на третий день от зачатия, оплодотворение проводили с помощью метода ИКСИ Перенос генетически пригодных эмбрионов осуществляли на 4 сутки после оплодотворения

Всего было проведено 7 циклов ВРТ у пациентов с хромосомными аберрациями у 2-х супружеских пар, где у мужей в кариотипе наблюдали сбалансированные транслокации 13 и 14 хромосом, было проведено 4 цикла, у одной, где у мужа кариотип был представлен дисомией хромосомы Y (47.XYY) - 2 цикла, у одной, где у женщины в кариотипе был выявлен мозаицизм (46, XX [49] / 47,XXX [2])

ПДу пациентов с робертсоновскилш транслокаг/ия ми в кариотипе ПД у супружеских пар, где в обоих случаях носителями транслокации хромосом 13 и 14 являлись мужчины была проведена в 4 циклах ВРТ Возраст мужчин в обеих супружеских парах был - 32 года возраст жен - 32 и 33 года, соответственно В одном наблюдении у мужчины отмечали нормозооспермию. в другом - ОАТ Для ПД и в первом и во втором случаях были пригодны около 70% эмбрионов, остатьные эмбрионы отставали в развитии или имели фрагментацию более 50%. Для FISH исследования ядер эмбрионов использовали зонды на хромосомы 13 и 14

У первой супружеской пары в двух циклах стимуляции из 23 полученных ооцитов развилось 16 пригодных для биопсии эмбрионов (69 6%) Из 16 полученных бластомеров -три оказались без ядер Цитогенетическое исследование в первом наблюдении в 2-х циклах

позволило выявить 62% эмбрионов, пригодных для переноса по генетическим критериям, в 38% - трисомию по изучаемым хромосомам После биопсии на 4 день культивирования у первой супружеской пары в 1-м и 2-м цикле стимуляции в развитии остановились по одному эмбриону

Одноплодная беременность насту пила во втором цикле ВРТ при переносе 2 эмбрионов (в первом цикле было перенесено также 2 эмбриона) и закончилась рождением здоровой девочки Во время беременности женщине было предложено проведение пренатальной диагностики, от которой она отказалась

У второй супружеской пары в двух программах ВРТ не было ни одного эмбриона, пригодного для переноса В двух циклах стимуляции из 14 полученных ооцитов развилось 10 (71 4%), пригодных для биопсии эмбриона Два эмбриона из 10 пригодных для биопсии не удалось проанализировать из-за отсутствия ядер в полученных бластомерах Хромосомные анеуплодии были представлены следующей патологией 37 5% - моносочией хромосом 13 или 14, 62 5%- трисомиячи хромосом 13 или 14Анализ результатов исследования показал, что трисомия хромосомы 13 среди представленной анеуплоидии встретилась в 6 наблюдениях из 13 (46 2%) Интересен тот факт, что, несмотря на то, что у мужчины из первой супружеской пары сперматозоиды с набором хромосом 13,14,14 встречались в 6 8%, а 13,13,14 всего в 2 1% наблюдений, трисомия хромосомы 13 в эмбрионах встречалась чаще, чем хромосомы 14 Можно предположить, что эмбрионы с трисомией хромосомы 13 обладают большим потенциатом развития, чем с трисомией 14

Основываясь на полученных данных, можно сделать заключение о том, что в тех случаях, когда у мужчин с изменениями в кариотипе отмечается норчозооспермия, шансы на наступление беременности здоровым штодом в таких супружеских парах после ПД в рамках программы ВРТ значительно выше, чем у пар, где у мужей имеется ОАТ

ПДу пациентки с кариотипом 46, XX/ 47,XXX[49][2] ПД пациентке с кариотипом 46, XX/ 47.ХХХ[49][2] была проведена в 3 цикле стимуляции суперовуляции, после того, как у нее был обнаружен мозаичный кариотип Две предыдущие попытки ВРТ не дати положительного результата, после чего было решено провести кариологическое исследование лимфоцитов крови, которое позволило выявить у нее изменения в кариотипе

Возраст женщины был 31 год. мужа - 30 лет Дтя FISH исследования ядер 15 полу ченных эмбрионов использовали зонды на хромосомы X и Y Только 9 эмбрионов были пригодны для биопсии Из них 2 содержали по 2 ядра Нормальный кариотип был определен в 6 ядрах из 9 (66 7%) (4 эмбриона - женского пола, 2 - мужского) Хромосомная патология

была представлена трисомией хромосомы X На 4 день культивирования 2 эмбриона из 6 остановились в развитии (33 3%)

Таким образом, у данной пациентки из 15 полученных эмбрионов только 4 были с нормальным кариотипом и пригодны для переноса (26 7%) В результате переноса 2 эмбрионов (1- женского и 1- мужского) родилась здоровая девочка

ПДу пациента с дисомией хромосомы Y в кариотипе (47JCYY) ПД у супружеской пары, где у мужа наблюдали дисомию хромосомы Y в кариотипе и отмечалась ОАТ, была проведена в 2 циклах ВРТ Возраст мужчины был 33 года, жены 31 год Для FISH исследования ядер эмбрионов использовали зонды на хромосомы X и Y

В ходе стимуляции суперовуляции в 2 циклах ВРТ было получено 29 яйцеклеток (в 1 цикле - 14, во 2-15), из которых получили 22 эмбриона (в 1 цикле - 10, во 2 - 12) Пригодных для диагностики эмбрионов оказалось 17 (в 1 цикле - 6, во 2 - 11, 77 3%) Из 17 полученных в 2 циклах бластомеров в двух оказалось по 2 и 4 ядра, в одном ядре в ходе диагностики не было получено сигналов Таким образом, из 17 биопсируемых бластомеров результат был получен в 14 (82%)

В первом цикле стимуляции из 6 пригодных для биопсии эмбрионов нормальный набор по исследуемым хромосомам был выявлен в 2 эмбрионах (33 3%), во 2 цикле - в 6 из 11 (54 5%) Норматьный набор в 1 цикле был представлен в одном наблюдении женским полом и в одном мужским, во 2 цикле - в 3 набтюдениях женским и в 3- мужским

Хромосомная патология эмбрионов в 1 цикле была представлена в одном наблюдении набором XXY, в другом - моносомией X, во втором цикле - в 3 наблюдениях XXY и в одном - ХХХХ

К сожалению, перенос в двух циклах ВРТ по 2 эмбриона в каждом не дал положительного результата Пациентка планирует последующее проведение программы ВРТ Несмотря на отрицательный результат, данная супружеская пара имеет хороший прогноз для проведения последующих попыток ЭКО, т к пригодных для переноса эмбрионов у них образуется от 20% (в 1 цикле ЭКО) до 60% (во 2 цикле ЭКО) от общего количества полученных и 33 3% и 54 5% от пригодных для биопсии

Таким образом, у пациентов с изменениями в кариотипе уровень пригодных для переноса эмбрионов в программе ВРТ может колебаться от 0% до 62% при робертсоновских транслокациях и от 33 3% до 66 7% при нарушениях в комплексе половых хромосом

Несомненно, в случаях неудачных попыток ВРТ при выборе тактики последующего лечения необходимо учитывать и количество предыдущих циклов стимуляции суперовуляции, а также качество и количество получаемых эмбрионов в предыдущих циклах, и, где возможно, результаты предварительного исследования частоты хромосомных

аберраций в половых клетках Однако, несмотря на вышесказанное, основным критерием для проведения ПД в программе ВРТ все-таки является пожелание самих пациентов участвовать в проведении последующих программ ВРТ

ПД является одним из главных звеньев в алгоритме профилактических мероприятий по предотвращению не только рождения больного ребенка у супружеских пар с изменениями в кариотипе. но и исключения у них возникновения беременности больным плодом В литературе уже имеется достаточное количество публикаций о рождении здоровых детей у таких пациентов в рамках программы ВРТ с применением ПД Кроме того, исследования различных авторов показали, что ПД у пациентов с транслокациями в кариотипе позволяет значительно снизить у них уровень спонтанных абортов с 81% до 13% [Мшше 8, 2005] и со 100% до 5 3% [01аш Т, 2006] Исследователи обнаружили низкий уровень пригодных для переноса эмбрионов - 18 3% [01аш Т, 2006] и высокий уровень несбалансированных хромосомных нарушений в эмбрионах 72% - у пациентов с робертсоновскими и 82% - с реципрокными транслокациями [Миппе 8 , 2005] Результаты ПД у супружеских пар с нормальным кариотнпом Частота анеутоидии хромосом 13 и 21 у эмбрионов Профилактика анеуплоидии хромосом 13, 21, а также гоносом имеет большое значение в связи с тем, что данные нарушения занимают превалирующее место среди хромосомной патологии Причем с возрастом пациентов риск рождения у них ребенка с хромосомной аномалией возрастает По нашим данным процент женщин старше 35 лет в I группе пациентов составил 50 4%, во II группе -34 9%

Преимплантационная диагностика эмбрионов на анеуплоидию хромосом 13, 21 была проведена в 19 циклах ВРТ у 15 супружеских пар с бесплодием Показаниями к проведению диагностики были возраст и в ряде случаев желание самих пациенток У одной супружеской пары было проведено 3 цикла ВРТ, еще у одной - 2 Средний возраст пациенток в этой группе составил 36 лет (от 28 до 41 года)

Перенос эмбрионов быт осуществлен в 18 циклах стимуляции суперовуляции Среднее количество пригодных для переноса эмбрионов было 2 У 7 женщин беременность наступила с первой попытки, что составило 36% на цикл или 38% на перенос У одной пациентки при переносе 3-х эмбрионов была получена беременность тройней Однако в 1 триместре беременности один плод саморсду цировался

Из-за отсутствия генетически нормальных эмбрионов у одной пациентки перенос был отменен К настоящему времени 5 беременностей закончились родами детьми без генетических отклонений

Несмотря на проведение диагностики, в одном наблюдении беременность в I триместре была прервана в связи с обнаружением анэмбрионии плода (кариотип абортуса 46,XX) во время ультразву кового исследования В другом наблюдении у плода во втором триместре также во время ультразвукового исследования была обнаружена гипоплазия почек На медицинском консилиуме пациентке было предложено прерывание беременности, от которого она отказалась по моральным мотивам Исход данной беременности неизвестен

В 19 циклах стимуляции суперовуляции при исследовании 74 одноядерных бластомеров результат был получен в 68 (91 9%) При этом нормальный набор по изучаемым хромосомам, был определен в 42 ядрах из 68, что составило 61 8%, а в 26 отмечали различну ю форму анеуплоидии (38 2%)

Нарушение числа хромосомы 21 наблюдали в 11 ядрах из 26 (42 3%), при этом трисомия хромосомы 21 отмечалась в 6 наблюдениях (54 5%)

Анеуплоидия хромосомы 13 была обнаружена в 10 наблюдениях из 26 (38 5%), из них трисомия была представлена в 2 наблюдениях (20%) Одновременное присутствие анеуплоидии хромосом 13 и 21 было выявлено в 5 наблюдениях из 26 (19 2%)

Среди эмбрионов с нормальным набором по изучаемым хромосомам 7 из 42 были плохого качества (16 6%), среди эмбрионов с патологией - 3 из 26 (11 5%) При анализе качества эмбрионов, содержащих более 1 ядра, было выявлено, что только в одном наблюдении из 7 (14 3%) эмбрион был плохого качества Среди эмбрионов со смешанной патологией процент эмбрионов плохого качества составил - 40% (у 2 из 5) Самый высокий уровень эмбрионов плохого качества был отмечен среди эмбрионов, где в бластомерах не было получено ядер - 47 4% (9 из 19)

Возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, был 28, 30. 31, 31, 41 г (средний 32 2 г) У одной женщины 31 года было выявлено 2 эмбриона с данной трисомией Обеим пациенткам, у которых была выявлена трисомия хромосомы 13, было по 35 лет Следует отметить, что 5 из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21 только один эмбрион был плохого качества (16 7%) Оба эмбриона с трисомией хромосомы 13 были хорошего качества

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для переноса эмбрионов наблюдали в 83% случаев

Частота анеуплоидии хромосом X, Г, 21 у эмбрионов Исследование эмбрионов на анеуплоидии хромосом X, У и 21 было проведено в 22 циклах ВРТ у супружеских пар с бесплодием Средний возраст пациенток в этой группе составил 34 7 лет (от 22 до 45 лет) Основным показанием к проведению диагностики было желание пациенток определить пол эмбриона Учитывая полученную возможность

одновременно исследовать гоносомы и хромосому 21, было решено провести данное исследование

Перенос эмбрионов был осущсствтсн в 20 циклах, в 2 переноса не было по причине отсутствия генетически норматьиых эмбрионов Среднее количество пригодных для переноса эмбрионов было 2, беременность наступила у 6 женщин (27 3% на цикл, 30% на перенос) У 3 пациенток были получены беременности двойней У одной из этих женщин в 1 триместре произошла саморедукцня одного плода

При исследовании 107 одноядерных бластомеров результат был получен в 102 (95 3%) Из проанатизируемых ядер 71 из 102 содержали норматьный набор по изучаемым хромосомам, что составило 69 6%, а в 31 отмечены различные типы анеуплоидии (30 4%)

Из выявленной патологии, изменения в комплексе голосом наблюдали в 11 ядрах из 31 (35 5%), при этом трисомия половых хромосом была отмечена в 6 наблюдениях (в 4 случаях- ХХУ, в 2- XXX), тетрасомию и моносомию хромосомы X наблюдати в 2-х случаях, и в одном наблюдении была обнару жена моносомия хромосомы У

Анеу плоидия хромосомы 21 была обнаружена в 12 наблюдениях из 31 (38 7%), из них трисомия и моносомия были представлены в равных долях по 6 наблюдений (50%)

Одновременное присутствие анеуплоидии гоносом и хромосомы 21 было выявлено в 8 наблюдениях из 31 (25 8%)

Среди эмбрионов с норматьным набором по изучаемым хромосомам 11 из 71 были плохого качества (15 5%), среди эмбрионов с патологией - 9 из 31 (29%) При анатизе качества эмбрионов, содержащих более 1 ядра в бластомере, плохое качество было отмечено в 2 эмбрионах из 8 (25%) Процент эмбрионов плохого качества среди эмбрионов, где не было получено ядер, равнялся 21 7% (5 из 23)

Возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, был 36, 43, 42, 42, 38 л (средний 40 2 г) У одной женщины 38 лет было выявлено 2 эмбриона с трисомией

Из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21, два эмбриона были плохого качества (33%), и один эмбрион был плохого качества с моносомией Среди эмбрионов с анеуплоидией гоносом плохое качество эмбрионов было отмечено у 3 из 11(27 3%)

Среди эмбрионов со смешанной патологией отмечачея самый высокий процент эмбрионов плохого качества - 37 5% (у 3 из 8)

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 84% случаев

Таким образом, анатиз результатов ПД с применением зондов к 13, 21 и Х,У, 21 хромосомам показал, что данная диагностика может являться хорошим профилактическим

мероприятием в рамках программы ВРТ Получение результата в 95% наблюдений у казывает на то, что примененный нами молекулярно-цитогенетический FISH метод может быть успешно использован с целью диагностики анеуплоидии по различным хромосомам в ПД Наше исследование показато, что бластомеры, не содержащие ядер, встречаются значительно чаще, чем бластомеры, содержащие одновременно несколько ядер 17 2% и 6 7%, соответственно (в 2 8 раза) При этом эмбрионы, от которых были получены многоядерные и безъядерные бластомеры, являлись непригодными для переноса как по генетическим, так и по морфологическим критериям отбора Так, среди эмбрионов, где полученные бластомеры не содержали ядер, плохое качество было отмечено в 21 7% и 47 4%, а в ядрах, полу ченных из одного бластомера, отмечали различные анеуплоидии Таким образом, данные эмбрионы не рекомендуется использовать в программе ВРТ для их дальнейшего переноса в полость матки женщины Наряду с этим имеющие в хромосомном наборе анеуплоидию эмбрионы могут быть хорошего качества (от 71% до 88 5%), т е морфологически нормального строения и в случаях, если бы не было проведено их генетическое исследование, они могли бы быть в дальнейшем использованы в программе ВРТ Так, эмбрионы с трисомией хромосомы 21 имели плохое качество только в 16 7% и 33% наблюдений, в остальном проценте они вполне соответствовали критериям визуального отбора для переноса в полость матки Таким образом, визуальное исследование морфологических параметров эмбриона не всегда может отражать его генетический статус Среди эмбрионов с нормальным набором исследуемых хромосом плохое качество отмечалось у 15 5% и 16 7% эмбрионов соответственно Среди эмбрионов с одновременной анеуплоидией по различным хромосом плохое качество отмечается чаще, чем при анеуплоидии одной из исследуемых от 37 5% (X,Y, 21 хромосом) до 40% (13, 21 хромосом) Полученные данные указывают на то, что одновременное нарушение в наборе нескольких хромосом может оказывать большее негативное влияние на развитие эмбрионов, чем нарушения только по одной хромосоме Наши данные о том. что морфологические параметры эмбриона не всегда могут отражать его генетический статус подтверждаются и работами других авторов [Baltaci V , 2006].

У женщин старше 39 лет при проведении ПД перенос эмбрионов может не производиться в 114% случаях по причине отсутствия нормальных эмбрионов по генетическим критериям К такому заключению авторы пришли после анализа результатов 3597 циклов ВРТ с ПД В 410 циклах все эмбрионы содержали различные формы анеуплоидии [Chatzimeletiou К, 2005]

По мнению многих авторов, селекция и перенос эмбрионов с нормальным хромосомным набором увеличивают частоту имплантации, снижают риск спонтанных

абортов, и пред}преждают рождение детей с генетической патологией у пациентов программы ВРТ [Harper J , 2006, Munne S , 2006, Rossignol, S , 2006]

Результаты ПДу супружеской пары с частым пузырным заносом в анамнезе Известно, что пузырный занос в ряде случаев возникает из-за аномального оплодотворения яйцеклетки и нарушений в хромосомном наборе зиготы, эмбриона В таких случаях ПД может решить проблему повторных пузырных заносов [Reubinoff В , 1997]

ПД была проведена у фертильной женщины с двумя пузырными заносами в анамнезе, пожелавшей пройти ПД в рачках программы ВРТ Пузырный занос у пациентки выявлялся по ультразву новому исследованию в сроки 7 и 9 недель беременности В одном наблюдении у нее был обнаружен полный пузырный занос, в другом частичный Перед проведением программы ВРТ пациентка была проконсу льтирована врачами-онкологами

Для F1SH исследования ядер эмбрионов использовали зонды на хромосомы X, Y и 21 Из 12 полученных эмбрионов только 10 были пригодны для диагностики (83%) Нормальный набор по исследуемым хромосомам был определен в 3 эмбрионах из 10, подвергнувшихся диагностике (30%) в одном наблюдении был представлен женским полом, в двух -мужским Патология хромосом была представлена как в комплексе гоносом, так и по хромосоме 21 Уровень анеуплоидии хромосомы 21 составил всего 16 7% (одно наблюдение из 6) от общего числа выявленной патологии Все формы хромосомной патологии были представлены по одному наблюдению XX,21, ХХХ.2121, ХХХХ.2121, Y.2121, XXY,2121, Х,2121

В результате переноса 2 эмбрионов (одного женского и одного мужского пола) наступила одноплодная беременность, которая развивалась норматьно Ультразвуковое исследование на разных сроках беременности пороков развития и отклонений в протекании беременности не показало В сроке 18 недель беременности пациентка отказалась от проведения пренатальной диагностики На 40 неделе беременность закончилась рождением здоровой девочки

Таким образом, программа ВРТ с проведением ПД у женщин с повторными пузырными заносами в ряде случаев может являться хорошим профилактическим мероприятием Наше исследование показало, что в данном наблюдении у эмбрионов отмечается высокий уровень генетических аномалий (70%), что могло являться причиной предыдущих пузырных заносов Учитывая тот факт, что почти вся выявленная патология была представлена анеу плондней гоносом, можно предположить, что данная патология может вносить значительный вклад в развитие данного заболевания Можно предположить, что подобная тактика ведения пациенток с пузырными заносами с использованием ПД найдет свое применяться в медицинской практике

Результаты ПДу супружеских пар с определением пола у эмбрионов по желанию пациентов Преимплантационное определения пола эмбриона в программе ВРТ по желанию пациентов занимает большую долю от всех случаев проведенной диагностики

С просьбой определения пола эмбриона обратились 42 супружеские пары У них было проведено 60 циклов ВРТ с ПД Следует отметить, что только 4 пары к моменту обращения были фертильными, у остальных наблюдали либо первичное, либо вторичное бесплодие

Средний возраст пациенток в этой группе, не считая женщин, включенных в программу донации ооцитов, составил 32 года (от 23 до 43 лет)

У 40 пациенток была проведена стимуляции суперовуляции У одной женщины 46 лет было проведена программа донации ооцитов Другая пациентка 49 лет помимо программы донации ооцитов была включена еще в программу суррогатного материнства У обеих было проведено по 4 попытки исследования пола эмбриона

Из 60 случаев проведенной диагностики отмена переноса в связи с отсутствием нужного пола была в 10 случаях Всего беременность наступила в 17 проведенных циклах, что составило 28% на цикл и 34% на перенос эмбрионов В 4 наблюдениях беременность была отмечена только как биохимическая, т е результаты исследования [5-субъеденицы хорионического гонадотропина через 14 дней после переноса эмбриона указывали на наличие беременности, однако последующее ультразвуковое исследование через неделю не подтвердило ее наличие Из 13 клинически распознанных беременностей 4 остановились в развитии в 1 триместре беременности, и 1 прервалась во 2 Таким образом, в результате 8 беременностей, родилось 10 здоровых детей нужного пола (в 2 случаях - двумя плодами)

При исследовании 281 ядра, принадлежащего одноядерным бластомерам. нормальный набор по изучаемым хромосомам был определен в 217 ядрах из 281, что составило 77 2%, а в 64 отмечали различные типы анеуплоидии (22 8%) Женский набор хромосом был определен в 104 наблюдениях, мужской - в 113

Среди выявленной патологии по изучаемым хромосомам наибольшая частота относилась к моносомии хромосомы X - 29 7% (в 19 наблюдениях из 64) Моносомия хромосомы У была отмечена в 8 случаях Таким образом, общий уровень моносомии составил- 42 2% (в 27 случаях из 64) Трисочия гоносом среди случаев выявленной анеуплоидии была отмечена в 28 наблюдениях, что составило 43 8% Полисомия гоносом составила 12 5% (в 8 наблюдениях из 64) После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие среди пригодных для биопсии эмбрионов наблюдати в 79% случаев

Сводные данные по ПДс применением зондов к разтчным хромосомам Результаты ПД с применением зондов к различным хромосомам представлены в таблицах 1 и 2

Результаты анализа показали, что анеуплондня по хромосоме 21 занимает в среднем 40 5% от общего уровня выявленной патологии, а по хромосоме 13 - 38 5% Средний уровень анеуплоидии гоносом составил наименьший процент - 29 2 Этим объяснятся, что уровень генетически нормальных эмбрионов при исследовании только гоносом оказался самым высоким, а самым низким - при исследовании хромосом 13 и 21 Следует отметить, что уровень анеуплоидии гоносом (35 5%), где исследовали еще и хромосому 21, оказался выше, чем в тех случаях, где исследовали только гоносомы (22 8%) Мы считаем, что это может быть связано с тем. что возраст пациентов в этих гру ппах был различным Подобная ситуация наблюдается и при анализе частоты анеуплоидии хромосомы 21 В группе, где средний возраст пациенток составил 36 лет, этот уровень составил 42 3%, а в группе, где возраст был 34 7 года - 38 7%

Таблица 1

Уровень анеуплоидии по различным хромосомам в ядрах бластомеров

Исслед>емые Ср возраст Пригодных для Уровень 1енетически нормальных

хромосомы пациенток биопсии эмбрионов эморионов

лет % %

13, 14

(при транс локации в (средний 70%)

кариотипе)

1 наблюд 32 69 6 62

2 наблюд 33 714 0

X, Y

1) у женщины с

мозаицизмом в

кариотипе 31 60 66 7

2) у мужчины с

кариотипом 47,XYY 31 77 33 3(1 попытка)-54 5(2 попытка)

(ср 43 9)

13,21 36 714 61 8

X.Y. 21 34 7 76 69 6

X. Y 32 66 8 77 2

При исследовании частоты анеуплоидии выявили, что трисомия хромосомы 21 и гоносом составила 52 3% и 49 2%, соответственно, а по хромосоме 13 трисомия занимает только 20%

Из полученных данных видно, что патология одновременно нескольких хромосом занимает меньшу ю долю, чем анеу плоидия по отдельным хромосомам

Таблица 2

Характер аиеуплоидии по различным хромосомам в ядрах бластомеров_

Иссл-мые хромосомы 13,21 Иссл-мые хромосомы X, У, 21 Иссл-мые хромосомы X, Y

Анеупл 21 хром от общего % выявленной патологии 42 3 Из них трисомии -54 5 Анеупл 21 хром от общего % выявленной патологии 38 7 Из них трисомии -50 Уровень анеу плоидии гоносом 22 8 Моносомия гоносом от общего % выявленной патологии 42 2% Трисомия гоносом от общего % выявленной патологии 43 8%

Анеупл 13 хром от общего % выявленной патологии 38 5 Из них трисомии -20 Анеупл гоносом от общего % выявленной патологии 35 5 Из них трисомии - 54 5

Анеупл одноврем 21 и 13 хром от общего % выявленной патологии 19 2 Анеупл одноврем 21 хромосомы и гоносом от общего % выявленной патологии 25 8

Наши исследования показали, что ПД с биопсией одного бластомера не влияет на

дальнейшее развитие эмбриона После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 82% случаев (среднее значение) Результаты с применением FISH метода были получены в 95% наблюдений

Анализ полученных после проведения ПД беременностей и рожденных детей показал, что данная технология с использованием FISH метода является высокоэффективным методом и может быть рекомендована для широкого применения в рамках программы ВРТ К такому же выводы пришли и другие авторы [Munne S , 2005, Harper J , 2006]

Анализ кариотипа неразвивающихся плодов пациентов программы ВРТ Исследование кариотипа эмбрионов при неразвивающихся беременностях, полученных в программе ВРТ, имеет значение, так это может помочь в последующем выборе алгоритма лечения для конкретной супружеской пары

Было проанализировано 57 образцов хориона неразвивающихся плодов, полученных в программе ВРТ Средний возраст пациенток, включенных в исследование, составил 33 4 г (от 24 до 44 лет)

Статистической значимой разницы по полу эмбрионов, методу зачатия, возраста женщин и сроку прерывания беременности не наблюдали, хотя имеется незначительное повышение возраста женщин, имевших эмбрионы с трисомией по 21 хромосоме и хромосомам группы D Следует отметить, что оба кариотипа с трисомией гоносом - 47,XXY принадлежали птодам, зачатых из тестикулярных сперматозоидов

Хромосомные нарушения у эмбриона были выявлены в 31 наблюдении, что составило 54 4% На первом месте по частоте встречаемости хромосомной патологии в спонтанных

абортусах была моносомия хромосомы X (22 6%) Трисомии различных хромосом (в том числе 2 наблюдения трисомии гоносом) от общего уровня выявленной патологии составили 58 1% (табл 3)

Наши данные совпадают с результатами других исследователей Ряд авторов показали, что анеуплоидии гоносом занимают первое место в структуре хромосомной патологии у аборту сов, полученных в программе ВРТ Моносомия хромосомы X занимает превалирующие место и может доходить до 11 2% и выше от общей доли хромосомной патологии [Байбарина Г В , 2004, Causio F, 2002, Philipp Т, 2004, Plachot М 1989]

Таблица 3

Цитогенетическое исследование клеток хориона неразвивающихся беременностей,

полученных в программе ВРТ

Сроки прерывания беременности Средний возраст пациенток Кариотип аборту сов Число наблюденш"! (п=57)

7-8 31 9 Норма 26

5 34 Трисомия хромосомы 1 1

5-8 37 2 Трисомия хромосом группы Б 5

5-10 33 7 Трисомия хромосомы 16 6

7-8 38 Трисомия хромосомы 20 1

8-12 36 7 Трисомия хромосомы 21 3

6-7 29 Трисомия гоносом (ХХУ) 2

5-9 34 3 Моносомия хромосомы X 7

6-7 32 Тетраплоидный набор хромосом 1

8 33 Триплоидный набор хромосом 1

6-7 35 Иверсия хромосомы 2 1

5-8 37 Мозаицизм хромосом 2

7-8 31 Наличие маркерной хромосомы в кариотипе 1

Анализ полученных результатов показал высокий уровень хромосомных нарушений в

клетках неразвивающихся беременностей, полученных в программе ВРТ Это указывает на необходимость разработки профилактических мероприятий у данной группы пациентов с оптимизацией программы ВРТ, которая может заключаться в применении ПД Мы считаем, что в тех наблюдениях, где в хромосомном наборе абортуса выявлены изменения, а у пациентов перед программой ВРТ предварительно не был исследован кариотип, супружеским парам в обязательном порядке рекомендуется провести цитогенетическое исследование перед следующей попыткой

Особенности проведения ПД с помощью метода FISH с оптимизацией метода в современных условиях

Любая из существующих на сегодняшний день лабораторных диагностик имеет определенные сложности при ее проведении

Отсутствие или наличие нескольких ядер в бласточерах, неполное отхождение цитоплазмы бластомера от ядра, потеря ядер были главными проблемами, с которыми нам пришлось столкнуться в ходе проведения ПД

По нашим данным до 17% бластомеров не содержали ядер и 6% бластомеров были многоядерные Зачастую в разных ядрах, полученных из одного бластомера, либо отсу тствовали сигналы, либо в них был отмечен разный состав по изучаемым хромосомам В одном наблюдении в двух ядрах из одного бластомера были получены наборы хромосом, которые соответствовали женскому и мужскому набору

Потеря ядер бластомеров в ходе диагностики в основном была связана с неполным отхождением цитоплазмы от ядра и при обработке образца пепсином ядро «отклеивалось» вместе с цитоплазмой Изначально в основе проведения ПД был использован протокол, рекомендуемый фирмой производителем Время экспозиции препарата в пепсине по протоколу - 20 минут При четком соблюдении этой рекомендации потеря ядер на данном этапе диагностики составляла 6 2%, при этом в 62 5% наблюдений ядро освобождалось от цитоплазмы Изменение времени пребывания ядра в пепсине с 20 минут до 3 позволило сократить потерю ядер с 6 2 % до 2 4% Отсутствие сигналов в ядрах при использовании зондов к различным хромосомам мы наблюдали в от 18 7% до 5 5% случаев В основном сигналы отсутствовали в тех ядрах, которые были получены из одного бластомера (многоядерные бластомеры), и где имелась цитоплазма вокруг ядра

К следующим проблемам, которые представляли трудности для точной постановки диагноза, можно отнести неправильные формы ядер, с размытыми не четкими контурами, наложение сигнатов, сдвоенные сигначы (split signals) Наложение сигналов и сдвоенные сигналы затрудняет точную интерпретацию полученных результатов Наложение может возникать как из-за одновременного исследования нескольких хромосом, так и из-за расположения хромосом в исследуемом ядре

Моногенные нарушения у супружеских пар с НРФ и профилактика рождения

больных детей

Исследование моногенных мутаций проводили не у всех пациентов программы ВРТ Показаниями к выявлению нарушений в гене CYP21B являлись в одних случаях высокие значения 17-ОП, в других либо клинические проявления синдрома (гирсутизм. позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т д),

либо обнаруженные в системе HLA-1 класса генетические маркеры данного заболевания -антигены В35, В14

Исследование мутации гена CYP21B молекулярно-генетическим методом было проведено у 108 человек 70 женщин (34 пациентки - I группы, 36 -II группы) и 38 мужчин (18 человек- I группы, 20 -II группы) Гетерозиготное носительство мутации гена CYP21B было выявлено у 34 женщин (14- в I группе, 20 -II группы) и 19 мужчин (5- в I группе, 14 -II группе) В 6 наблюдениях (1- в I группе, 5 -И) исследование выявило наличие мутации в гене CYP21B у обоих супругов Данная ситуация требует медико-генетического консультирования супружеской пары во время беременности для решения вопроса о проведении пренатальной диагностики

Анализ результатов нагрузочной пробы с АКТГ обнаружил высокую эффективность выявления (85 7%) гетерозиготного носительства у обследуемых пациентов (у 12 из 14) Из всех выявленных мутаций, среди мужчин и женщин обеих групп, делеция гена CYP21B составила 70 7%, ду пликация - 24 4%

При делециях гена CYP21B маркер HLA В14 был выявлен в 11 наблюдениях из 16, что составило 68 8%, при дупликациях этого гена маркер HLA В35 был выявлен в 6 наблюдениях из 9, что составило 66 7%

У 164 мужчин с различными отклонениями в показателях спермограммы проводили исследования локуса AZF хромосомы Y и гена CFTR Результаты исследования показали, что 42 мужчины имели мутации в исследуемых генах в 21 наблюдении (12 8%) - мутации в локусе AZF хромосомы Y; в 21 (12 8%) - мутации гена муковисцидоза (табл. 4 и 5)

Таблица 4

Выявленные мутации гена Си К и результаты спермограмм у мужчин программы

ИКСИ

Выявленные мутации в Результаты спермограммы Число наблюдений

гене CFTR (п=21)

F508del OAT 3

W1282X OAT 1

2143delT OAT 1

1677delTA астенотератозооспермия 1

2184msA обструктивная азооспермия 1

F508del и5Т олигозооспермия 1

5T ОАТ 6

Необстру ктивная азооспермия 1

Астенотератозооспермия 2

тератозооспермия 1

5T/5T Обстру ктивная азооспермия 1

Необструктивная азооспермия 2

Таблица 5

Микроделеции AZF локуса хромосомы Y, выявленные у пациентов программы

икси

Выявленные микроделеции AZF локуса хромосомы Y Результаты спермограччы Число наблюдений (п=21)

Del sY 1192 (n=7) OAT Тератозооспермия Олигоастенозооспермия Олиготератозооспермия 3 2 1 1

Del sY 1291 (n=5) астенотератозооспсрчия азооспермия Олигоастенозооспермия Олиготератозооспермия 1 1 1

Del sY 242 (n=l) ОАТ 1

Del sY 1125 (n=l) ОАТ 1

Del sY 254, sY255 (n=3) Азооспермия ОАТ 1

Del sY 1291, Del sY 1197 (n=l) ОАТ 1

Del sY 242. Del sY 254. Del sY 157 (n=l) ОАТ 1

Del sY 1192, Del sY 254, Del sY 255, Del sY 1206 (n=l) азооспермия 1

Del sY 1192, Del sY 254, Del sY 255, Del sY 1291, Del sY 1206 (n=l) ОАТ 1

Анализ результатов исследования гена СРТЯ показал, что аллель 5Т был выявлен в

14 наблюдениях из 21, в том числе у 3 пациентов в гомозиготном состоянии, и у одного пациента в сочетании с F508del Общая частота аллеля 5Т от выявленных изменений в гене CFTR составила - 40 5% На втором месте по частоте встречаемости оказалась мутация F508del, которая была выявлена в 4 наблюдениях, что составило 9 5%

Женщинам из супружеских пар, где у мужей были выявлены мутации гена му ковисцидоза, было рекомендовано исследование данного гена, которое выявило у 2 пациенток также мутации в исследуемом гене

Наши данные совпадают с результатами исследования других авторов Многочисленные исследования пациентов с патологией семявыводящих протоков показали у них высокий уровень мутаций в гене CFTR около 70% [Escudero J , 1997] Одновременное присутствие двух различных му таций в гене CFTR у данной группы пациентов по данным разных авторов отмечается в 14 5-40% случаев [Bienvenu Т, 1996, Braekeleer M, 1996, Duneu 1. 1997] Исследователи показали, что частота мутации F508del составляет самый высокий процент среди других мутаций - до 62% [Robert F, 1999, Suzuki Y, 2002], Аллель 5T, по мнению некоторых авторов, может являться причиной нарушения сперматогенеза различной степени тяжести, а также причиной идиопатического бесплодия у женщин,

особенно в тех случаях, когда аллель находится в гомозиготном состоянии [Chillón М, 1995, Claustres М, 2005]

Вышеперечисленные авторы показали, что среди супружеских пар с репродуктивными нарушениями частота мутаций и полиморфизмов в гене CFTR выше, чем в общей популяции, однако до сих пор остается не решенным вопрос о влиянии данных мутаций и полиморфизма гена CFTR на сперматогенез Использование репродуктивных технологий у этой группы пациентов позволяет решить проблему деторождения, однако, может способствовать увеличению риска рождения детей с MB

Самой распространенной микроделецией в AZF локусе хромосомы Y была Del sY 1192, которая была выявлена в 7 наблюдениях в минорном состоянии и в 2 - в комплексе с другими микроделециями, что составило 42 8% (в 9 наблюдениях из 21)

В двух наблюдениях у пациентов с тератозооспермией и астенотератозооспермией одновременно были выявлены и микроделеция субрегиона AZFc, и гетерозиготное носительство 5Т атлеля

Высокая частота микроделеции субрегиона AZFc у мужчин с отклонениями в показателях спермограммы была отмечена и другими исследователями Многочисленные данные продемонстрировати, что среди мутаций в AZF локусе хромосомы Y микроделеции субрегиона AZFc занимают 1-е место, субрегиона AZFb - 2-е, субрегиона AZFa-3-e [Черных В Б , 2002, Dada, R 2002, Katagin Y , 2004, Loginova Iu А , 2003] Большинство авторов рекомендуют таким супружеским проведение ПД с выбором пола

ПД с выбором пола эмбрионов нами была проведена у 4 супружеских пар, где у мужей отмечена олигоастенотератозооспермия и была выявлена делеция субрегиона AZFc хромосомы Y Было проведено 7 циклов стимуляции суперовуляции, беременность насту пила у 2 женщин 3 плодами, родилась одна девочка, беременность близнецами в настоящее время протекает без осложнений

Выявленные высокие уровни носительства мутаций генов CFTR и CYP21B указывают на необходимость разработки и применения ПД с целью диагностики данных заболеваний у эмбриона до переноса его в полость матки К большому сожалению, несмотря на своевременное решение проблемы пренаталъной диагностики в перспективных и информативных семьях, в России до сих пор не проводится ДНК исследование ядер бластомеров на моногенные нарушения Внедрение ПД с целью выявления моногенных нарушений у эмбриона будет способствовать так называемой, первичной профилактике MB и ВДКН, уменьшая число новых больных с этими серьезными заболеваниями Исследование антигенов системы HLA у пациентов с НРФ Изучение особенностей антигенов системы HLA у мужчин, включенных в программы ВРТ

Полигенность и многофункциональность системы HLA предоставили идеальную возможность для поиска маркеров, обнаружение которых у индивида могло бы сигнализировать о наличии риска возникновения патологии

Используя эту возможность, а также учитывая разноречивые данные литературы по этому вопросу [Aleksovski D, 1988, Krause W, 1983, Miura Н, 1988], были изучены фенотипы HLA у мужчин программы ВРТ с нормозооспермией и различными отклонениями в показателях спермограчмы

Группа мужчин с отклонениями в показателях спермограммы была разделена на две подгруппы Первую подгруппу составили 109 мужчин с сочетанными формами отклонений в показателях спермограммы (ОАТ), вторая подгруппа состояла из 55 мужчин с астенозооспермией Контрольная группа была представлена 106 мужчинами

Анализ полученных результатов позволил установить, что почти по всем выделенным антигенам HLA между собой достоверно различались мужчины с ОАТ и нормозооспермией Причем положительные ассоциации у мужчин с ОАТ были обнаружены по антигенам HLA В18, В35 и С\\4, отрицательные - по антигенам HLA AI, В39, В40 и C\v3 Повеем выделенным антигенам HLA положительно ассоциирующихся с ОАТ относитетьный риск больше 2-х

Мужчины с астенозооспермией и мужчины с нормозооспермией не отличались по частоте всех исследованных антигенов HLA

Различие по антигенному составу HLA между мужчинами с ОАТ и астенозооспермией было выявлено только по HLA В12, который достоверно был ниже у мужчин с ОАТ (р > 0,001)

Анализ результатов позволил обнаружить, что наличие в фенотипе антигенов HLA В18, и В35 сочетающихся с А24, а также А25 и А26, являющихся аллельными вариантами А10 и образующих гаплотипы, дает высокий риск развития ОАТ

Полученные результаты обследования мужчин с ОАТ имеют принципиальное значение для медико-генетического консультирования пар программы ЭКО Обнаружение положительной ассоциации патологии сперматогенеза с антигенами HLA В18 и HLA В35, по-видимому, не случайно Антиген HLA В18 был типичным маркером фенотипа мужчин из супружеских пар с бесплодием и пар с неразвивающейся беременностью

Проведенное исследование убеждает не только в необходимости проведения обязательного генетического консультирования мужчин из супружеских пар программы ВРТ, но и требует разработки правил использования этой программы у лиц с высоким генетическим риском Это необходимо как для профилактики рождения детей с патологией, так и для успешного осуществления программы ВРТ

Анализ гистосовместимости супругов, включенных в программу ВРТ, по антигенам системы НЬА 1и II классов Всего НЬА исследование было проведено у 853 супружеских пар, у 339 - I группы и у 514 - II группы Среди пациентов I группы одновременное исследование НЬА I и II классов было проведено у 143 супружеских пар, исследование только НЬА I или II классов - 182 и 14 пар, соответственно Таким образом, антигены НЬА I класса были изучены у 325 супружеских пар, а НЬА II класса - у 314

В 45 наблюдениях из 143 (31 5%) у пациентов наблюдали идентичные антигены в обоих классах НЬА Подробные данные исследования антигенов системы НЬА пациентов I группы представлены в таблице 6

Таблица 6

Изучение антигенов системы НЬА пациентов I группы

Класс НЬА 2 идентичных антигенов (72 наблюдения) 3 идентичных антигенов (40 наблюдений) 4 идентичных антигенов (14 наблюдений) 5 идентичных антигенов (4 наблюдения)

НЬА I класса лок\с А 9 - - -

НЬА I класса лок\ с В 3 - - -

НЬА I класса лок\ сы А и В 32 - - -

НЬА II класса 14 27 - -

НЬА I и 11 классов 14 13 14 4

Изучение антигенов системы НЬА II класса показало, что 22 пациента I группы (11 женщин и 11 мужчин) из 314 обследуемых (7%) были гомозиготами по данному классу

Среди пациентов II группы одновременное исследование НЬА I и II классов было проведено у 179 супружеских пар, исследование только НЬА I или II классов - 303 и 32 пары, соответственно Таким образом, антигены НЬА I класса были изучены у 482 супружеских пар, а НЬА II класса - у 211

В 79 наблюдениях из 179 (44 1%) у пациентов наблюдались идентичные антигены в обоих классах НЬА Подробные данные исследования антигенов системы НЬА пациентов II группы представлены в таблице 7

Таблица 7

Изучение антигенов системы HLA пациентов II группы

Класс 2 идентичных 3 идентичных 4 идентичных 5 идентичных

HLA антигенов антигенов антигенов антигенов

(81 наблюдение) (50 наблюдений) (23 наблюдения) (8 наблюдений)

HLA I класса 3 - - -

локус А

HLA I класса 1 - - -

локус В

HLA I класса 39 - - -

локусы А и В

HLA II класса 20 20 - -

HLA I и II 18 30 23 8

классов

Изучение антигенов системы HLA II класса показало, что 28 пациентов (11 женщин и 17 мужчин) из 422 обследуемых (6 6%) были гомозиготами по данному классу В двух парах оба супруга оказались гомозиготами по антигенам HLA II класса

Наши результаты показали, что совпадения по антигенам системы HLA у супружеских пар программы ВРТ могут наблюдаться до 44 1% по 2 классам одновременно Учитывая тот факт, что идентичность супругов по антигенам HLA создает условия для развития бесплодия, тяжелых осложнений течения беременности - нефропатии, преэклампсии [Дранник Г.Н, 1986, Карпова, ТВ , 1998, Latinen, Т, 1993] эти супружеские пары нуждаются в консультации врачей отделения невынашивания беременности до начала программы ВРТ, а так же в случае наступления беременности и должны пройти ряд профилактических мероприятий, направленных на сохранение беременности

Пути профилактики врожденной и наследственной патологии у naijueHmoe программы ВРТ Результаты МГК с методами генетического обследования пациентов программы ВРТ показали высокий уровень хромосомных и генный изменений в этой группе пациентов На основании анализа полученных данных нами был разработан алгоритм проведения медико-генетического консультирования с методами генетического обследования супружеских пар I и II групп (рис 1 и 2)

Рис 1 Алгоритм генетического обследования су пру жеских пар I группы

Разработка генетических подходов к обследованию доноров половых клеток в программе

ВРТ

В настоящее время требования к кандидатам в доноры половых клеток в России регламентируются Приказом Минздрава РФ от 26 февраля 2003 г N 67 "О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия", согласно которому донорами половых клеток могут стать любая соматически здоровая женщина в возрасте от 20 до 35 лет и мужчина в возрасте от 20 до 40 лет при наличии собственных здоровых детей и отсутствии выраженных фенотипических проявлений Учитывая, что наше исследование показало высокий процент гетерозиготного носительства различных мутаций среди пациентов с НРФ, недопустимо использовать в программе ВРТ доноров, не обследованных на наличие носительства таких мутаций Мы рекомендуем обследовать доноров гамет на носительство мажорных мутаций часто встречающихся заболеваний (муковисцидоз, фенилкетонурия, ВДКН, нейросенсорная тугоухость, спинальная мышечная атрофия) При исследовании доноров необходимо уделять внимание представителям определенных национальностей и этнических групп, так как генетическое обследование необходимо проводить с учетом частоты встречаемости конкретных моногенных заболеваний среди этих групп

Рис 2 Алгоритм генетического обследования су пружеских пар II группы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Медико-генетическое консультирование с генетическими исследованиями 1898 пациентов программы ВРТ выявило у них высокий уровень генетических изменений Выявленные мутации были представлены большим разнообразием как на хромосомном, так и на генном уровне, они затрагивали как гоносомы, так и соматические хромосомы

Первичное МГК пациентов ВРТ на основании собранного анамнеза и наличие результатов некоторых генетических исследований, проведенных у пациентов ранее, выявило у них в 4 2% (у 80 из 1898) наблюдений различные врожденные пороки развития, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов Дальнейшее генетическое исследование этих пациентов выявило различные генные мутации еще у 97

человек Таким образом, общий уровень данных изменений составил 9 3% (у 177 из 1898 пациентов)(табл 8)

Таблица 8

ВПР, хромосомные нарушения, моногенные заболевания и гстсрозшотное носительство

мутантных генов, выявленные у пациентов программы ВРТ

Наименование врожденных пороков развития и генетических нару шений Женщины число наблюдений Му жчины число наблюдений

I гр (72) II гр (47) 1гр(12) Игр (112)

Изменения кариотипа 24 7 5 30

Гетерозиготное носительство мутации гена СУР21В 14 20 5 14

Гетерозиготное носительство мутации гена СРТИ. - 2 - 21

ВПР почек, вызванный наличием в генотипе доминантного мутантного гена - - - 1

Мутации А2¥ локу са хромосомы У - - - 21

Носитетьство рецессивного мутантного гена, приводящего к ВПР почек V детей 1 2 - -

Носительство рецессивного мутантного гена, приводящего к ВПР ЦНС у детей 1 - - -

Синдром Марфана 1 - - -

Нейрофиброматоз 1 - - -

Синдром Дель-Кастильо 1 - - 1

Синдром Рокитанского-Кюстера 2 - - -

Гетерозиготное носительство мутации гена СМА I 1 - - -

Гетерозиготное носительство [З-талассемии - 1 - -

Гетерозиготное носительство мутации гена, приводящего к глухоте - - 1 -

Атрофия зрительного нерва, Х-сцеатенное заболевание - - - 1

Спинно-бульбарная амиотрофия Кеннеди - - - 2

Синдром Поланда - - - 1

Гипохондроплазия - - - 1

Брахидактилия - - - 1

Синдактилия - - - 1

ВПР сердца 2 1 - 3

Различные ВПР почек 5 4 1 6

Различные ВПР матки, труб, половых органов 16 8 - 5

Заячья гу ба, волчья пасть 1 2 - -

ВПР желудочно-кишечного тракта 1 - - 1

ВПР щитовидной железы 1 - - 1

ВПР стоп - - - 1

Выявленный уровень хромосомных нарушений у супружеских пар программы ВРТ составил 7% Эти супружеские пары составляют основную группу пациентов с высоким риском появления у потомства хромосомных аберраций

Молекулярно-генетическое исследование половых клеток мужчин с измененным кариотипом не только подтвердило это утверждение, но и позволило сделать вывод о том, что у этих мужчин повышен риск рождения детей с мутациями de novo Различный уровень хромосомных нарушений в сперматозоидах пациентов при одной и той же хромосомной патологии в кариотипе указывает на индивидуальные особенности мейоза у пациентов и может повлиять на дальнейшую тактику лечения этих супружеских пар Таким образом, с учетом изменений кариотипа общий уровень генетических нарушений среди пациентов программы ВРТ составил 12 8%

Выявленный высокий уровень мутаций у нуждающихся в лечении методами ВРТ супружеских пар указывает на необходимость медико-генетического консультирования пациентов с НРФ до включения их в программу ЭКО/ИКСИ В случае обнаружения у них генетических изменений следует проводить оптимизацию метода ВРТ с применением к ним ПД и последующей пренатальной диагностики

ВЫВОДЫ

1 Медико-генетическое консультирование с методами генетического обследования пациентов, включенных в программу ВРТ, выявило в 9 3% наблюдений врожденные пороки развития, моногенные заболевания и гетерозиготное носительство мутантных генов, в 3 5% - хромосомные изменения Суммарный уровень генетических изменений у пациентов с нарушением репродуктивной функции составил 12 8%

2 У пациентов, в системе HLA I класса которых выявлены антигены В35, В14, с высоким значением гормона 17-ОП, с клиническими проявлениями ВДКН (такими, как гирсутизм, позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т д), уровень гетерозиготного носительства мутации гена CYP21В составил 37.1% Делеция гена CYP21B составляет 70 7%, дупликация - 24 4%

3 У пациентов с отклонениями в показателях сперчограчмы мутации в локусе AZF хромосомы Y и гене CFTR выявляются в 12 8% наблюдений Del sY 1192 является самой распространенной микроделецией в локусе AZF хромосомы Y - 42 8% Частота аллеля 5Т составляет 40 5%, мутации F508del - 9 5%

4 Установлена ассоциация антигенов системы HLA I класса у мужчин славянской популяции с нарушением сперматогенеза при олигоастенотератозооспермии - HLA В18, В35 и С\\4 Высокий риск возникновения у мужчин олигоастенотератозооспермии (RR=11)

связан с наличием в фенотипе одновременного присутствия антигенов HLA В18 и В35

5 У пациентов с НРФ у ровень совпадений антигенов в системе HLA I и II классов может достигать 44 1%

6 У мужчин с робсртсоновской транслокацией хромосом 13, 14 в кариотипе уровень мутаций в их половых клетках по этим хромосомам составляет от 16 1% до 36%, а процент мутаций de novo гоносом - от 0 6% до 1 7%

7 Уровень хромосомных нарушений, выявленный в клетках хориона полученных в программе ВРТ неразвивающихся беременностей, составляет 54 4% Моносомия хромосомы X занимает первое место и составляет 22 6% Суммарный уровень трисомии различных хромосом от общего процента выявляемой патологии составляет 58 1%

8 У супружеских пар программы ВРТ, где один из супругов имеет генетические изменения (хромосомные аберрации в кариотипе, чикроделеции локуса AZF хромосомы Y), частота наступления беременности после проведенной ПД в пересчете на пункцию составляет 23%, в пересчете на перенос эмбрионов - 30% В этой группе пациентов в 23% наблюдений отсутствуют эмбрионы, пригодные для переноса по генетическим критериям У женщин из супружеских пар с норматьным кариотипом при проведении ПД частота насту пления беременности составляет 36% на цикл, или 38% на перенос

9 При проведении ПД бластомеры, не содержащие ядер, встречаются в 17 2% наблюдений, бластомеры, содержащие одновременно несколько ядер - в 6 7% Эмбрионы, от которых были получены многоядерные и безъядерные бластомеры, являются непригодными для переноса, как по генетическим, так и по морфологическим критериям отбора

10 Визуальное исследование морфологических параметров эмбриона не всегда отражает его генетический статус Эмбрионы, имеющие в хромосомном наборе анеуплоидию, могут быть хорошего качества (от 71% до 88 5%), эмбрионы с трисомией хромосомы 21 имеют плохое качество в 16 7% и 33% (при использовании разных наборов зондов, включающих хромосому 21)

11 Одновременное наличие анеуплоидий нескольких хромосом оказывает большее негативное влияние на развитие эмбрионов, чем анеупловдия по одной хромосоме от 37 5% до 40% (при использовании разных наборов зондов, включающих хромосому 21) против 16 7% и 33% соответственно Трисомия хромосомы 21 у эмбрионов составила 52 3%, гоносом - 49 2%

12 Используемая нами с целью профилактики рождения генетически больного ребенка у пациентов программы ВРТ ПД молекулярно-цитогенетическим FISH методом зарекомендовала себя как высокоэффективный метод профилактики рождения генетически

больного потомства и может быть рекомендована для широкого использования в рамках данной программы не только у супружеских пар с бесплодием, но и у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения ребенка с генетической патологией 13 Кандидаты в доноры гамет должны пройти исследование на носительство

мажорных мутаций часто встречающихся заболеваний, таких как муковисцидоз и ВДКН

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Пациентам с бесплодием перед включением их в программу ВРТ рекомендуется пройти медико - генетическое консультирование

2 Исследование кариотипа лимфоцитов периферической крови следует проводить обоим су прутам всех супружеских пар программы ВРТ

3 У мужчин, в кариотипе которых выявлены хромосомные аберрации, необходимо проведение молекулярно-цитогенетического исследования сперматозоидов с применением зондов к соответствующим хромосомам

4 У пациентов с высоким значением гормона 17-ОП, с клиническими проявлениями ВДКН, такими как гирсутизм, позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т д, либо при обнаружении у них в системе III.А I класса антигенов В35, В14 рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования мутаций в гене СУР 21В При обнаружении у одного из супругов мутации в исследуемом гене второму рекомендуется провести аналогичное исследование

5 Мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ИКСИ и имеющих отклонения в спермограмме, рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования гена СК1К, Т/Т аллеля, локуса А2Т хромосомы У При обнаружении у мужа мутации в гене СРП1, 5Т аллеля супруге рекомендуется провести аналогичное исследование

6 Включенным в программу ВРТ пациентам, у которых имеются хромосомные изменения в кариотипе, необходимо проведение ПД для выявления различных анеуплоидий у эмбрионов

7 Супружеским парам, где у мужей имеются делеции локуса А7Р хромосомы У, необходимо проведение ПД для выбора эмбрионов женского пола

В Женщинам старше 35 лет рекомендуется исследование эмбрионов на самые распространенные анеуплоидий - трисомии хромосом 13, 16, 18, 21 и гоносом

9 Исследование антигенов системы НЬА I и II классов рекомендуется проводить всем супружеским парам перед программой ВРТ Это позволяет выделить группу риска пациентов, у которых возможно невынашивание беременности и которые должны пройти

ряд профилактических мероприятий, направленных на сохранение беременности Кроме того, антигены системы HLA служат маркерами, которые могут сигнализировать о наличии риска возникновения заболевания как у самого пациента, так и у его потомства

10 Женщинам, у которых выявлена неразвивающаяся беременность и планируется ее прерывание, показано цитогенетическое исследование клеток полученного хориона

11 Лицам, планирующим стать донорами половых клеток, необходимо пройти медико-генетическое консультирование и обследование на самые распространенные мутации генов, приводящие к заболеваниям в первую очередь - му ковисцидоз и ВДКН, а при возможности и на др (фенилкетону рия, нейросенсорная тугоухость, спинальная мышечная атрофия)

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АКТГ - адренокортикотропный гормон

Б -1 - бесплодие I

Б - II - бесплодие II

ВДКН - врожденная дисфункция коры надпочечника

ВДОСП (CBAVD) - врожденное двустороннее отсутствие семявыводящих протоков

(congenital bilateral absence of the vas deferens) BPT - вспомогательные репроду ктивные технологии

ИКСИ (ICSI) - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида

в цитоплазму ооцита (intracytoplasmic sperm injection) МГК - медико-генетическое консультирование

MB - муковисцидоз

НРФ - нарушение репродуктивной функции

ОАТ - олигоастенотератозооспермия

ПД - преимплантационная диагностика

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ЭКО и ПЭ - экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов

AZF - Azoospermia Factor (фактор азооспермии)

CFTR - су stic fibrosis transmembrane conductase regulator (ген

трансмембранного регулятора чуковисцидоза)

ESHRE

- European Society of Human Reproduction and

Embryology (Европейское общество репродукции

человека и эмбриологии)

HLA

FISH

-Fluorescent In Situ Hybndization(флуоресцентная гибридизация in situ)

- Human Leucocyte Antigens - главный комплекс гистосовместимости человека

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 Глинкина. Ж И Преимплантационная диагностика хромосомных аберраций и пола плода методом FISH- анализа в программе ЭКО и ПЭ (обзор литературы)/ Ж И Глинкина, Б В Леонов, В А Лукин //М, МИА, -2000, Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия Под ред Акад РАМН Кулакова В И,-бОЗстр

2 Глинкина, Ж И Применение молекулярно-цитогенетического метода гибридизации днк хромосом с днк пробами (FISH) для идентифицирования хромосомных аномалий у эмбрионов в рамках программы ЭКО и ПЭ/ Ж И Глинкина, Б В Леонов, А А Беляева // сборник трудов, Кубанский Конгресс по гинекологии «Актуальные вопросы оперативной гинекологии и репродукции человека», -346 стр

3 Глинкина, Ж И Медико-генетическая преимплантационная диагностика в программе ЭКО и ПЭ/ Ж И Глинкина // Материалы III Российского форума «Мать и дитя» тезисы докладов, -2001г,-стр 328

4 Глинкина, Ж И Исследование кариотипа и антигенов HLA супружеских пар при неразвивающейся беременности/ Ж И Глинкина, И Г Дзенис, Г В Байбарина, Э Р Дуринян, ТВ Бугай// Материалы III Российского форума «Мать и дитя» тезисы докладов, -2001г, -стр -291,

5 Глинкина, Ж И Преимплантационная генетическая диагностика наследственных и врожденных заболеваний в программе ЭКО/ Ж И Глинкина, В А Бахарев // Практическая гинекология Под ред Акад РАМН Кулакова В И, Прилепской В Н, МЕДпресс-инфорч, М -2001, -стр 720-730

6 Глинкина, Ж И Опыт использования F1SH- метода в акушерстве и гинекологии/Ж И Глинкина, В А Бахарев, И Г Дзенис// Медицинская генетика, Тезисы Всероссийской научно- практической конференции «Современные достижения клинической генетики, -

2003, -№10,-стр 410

7 Глинкина, Ж И Изучение FISH методом особенностей мейоза у мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ/Ж И Глинкина, В А Бахарев, И Г Дзенис, Ю А Гаврилов //Проблемы репродукции, Тезисы XII Международной конференции «Репродуктивные технологии сегодня и завтра», -2003г, -стр 38

8 Glinkma, Zh Expérience of FISH use in IVF and ICSI programme/ Zh Glinkina, V A Bakharev, L N Kuzmichev, IG Dzenis // Abstract book «PGD m 2003 A Genetic odyssey », Brussels, Belgium, -2003, -p 30

9 Глинкина, Ж И Медико-генетическое консультирование и клинико-генетические методы обследования супружеских пар в программе ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ Ж И Глинкина В А Бахарев, Б В Леонов, И Г Дзенис// Поликлиническая гинекология, под Ред Прилепской В H, - 2004 г , -стр 220-241

10 Глинкина, Ж И Исследование ядер сперматозоидов FISH методом у мужчин, включенных в программу ЭКО и ПЭ/ Ж И Глинкина, В А Бахарев, И Г Дзенис, Ю А Гаврилов// тезисы докладов Международный конгресс с курсом эндоскопии «Современные технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний», М,- 2004. -стр 160-161

11 Глинкина, Ж И Опыт медико-генетического консультирования у пациентов программы ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ Ж И Глинкина, В А Бахарев, ИГ Дзенис, Л H Кузьмичев, Л Б Киндарова// тезисы докладов, Материал VI Российского Фору ма «Мать и Дитя», M, -

2004,-стр 606-607

12 Глинкина, Ж И Использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) для профилактики врожденной патологии в потомстве/В А Бахарев, И Г Дзенис, Л H Кузьмичев, Л П Лисова // тезисы докладов, Материалы VI Российского Форума «Мать и Дитя», M , -2004,-стр 607

13 Глинкина, Ж И Преимплантационная диагностика - профилактика появления потомства с врожденной и наследственной патологией/ Ж И Глинкина // тезисы докладов, III Российский конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии», M , -2004, стр 90-91

14 Черных, В Б Кольцевая Y- хромосома клинический случай и обзор литературы/ В Б Черных, Ж И Глинкина, Л Ф Курило, Т M Сорокина, Е M Гришина и др // Ж Медицинская генетика, -2004, № 10, -стр 474-479

15 Glinkina, Zh FISH Method m IVF-ICSI/Zh Glinkina, VI Kulakov, LN Kuzmichev,VA Bakharev, S A Diyakonov // Abstract book «12th word congress on human reproduction», -2005, -p 24

16 Глинкина, Ж И Роль цитогенетического и молекулярно- цитогенетического исследования лимфоцитов крови у супружеских пар, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ЖИ Глинкина, В. А Бахарев, ЛН Кузьмичев, ИГ Дзенис, Г И МушаковаУ/Журнал Российского общества акушеров-гинекологов, -2004, -№ 3, -стр 35-38

17. Глинкина, Ж И Анализ частоты анеуплоидии гоносом у мужчин программы ЭКО и ЭКО/ ИКСИ/ Ж И Глинкина // Ж Медицинская генетика, -2005, -т 4, -№2, -стр 60-64

18 Кулаков, В И Преимплантационное определение пола эмбрионов у пациентов программы ЭКО/ В И Кулаков, Ж И Глинкина, В А Бахарев, И Г Дзенис, Л Н Кузьмичев, Л Б Киндарова //Ж Акушерство и гинекология, -2005, -№ 2, -стр 43-46

19 Глинкина, Ж И Определение пола у преимплантационных эмбрионов пациентов программы ЭКО/ Ж И Глинкина, В А Бахарев, ИГ Дзенис, ЛН Кузьмичев, Л Б Киндарова//Ж Медицинская генетика,-2005,-№ 4,-т 4,-стр 173

20 Бахарев, В А Исследование кариотипа абортусов программы ЭКО И ПЭ/ В А Бахарев, Ж И Глинкина, В В Мамонова, Г В Байбарина// Ж Медицинская генетика, -2005, -№ 4, -т 4, -стр 224

21 Глинкина, Ж И Клинико-генетическое обследование супружеских пар в программе ЭКО и ПЭ, ИКСИ/ Ж И Глинкина, В А Бахарев, И Г Дзенис, Ю Е Мосесова// Вспомогательные репродуктивные технологии в лечении женского и мужского бесплодия под ред Кулакова В И, Леонова Б В М, - 2005, -стр 147-161

22 Глинкина, Ж И Преимплантационная генетическая диагностика врожденных и наследственных заболеваний методом FISH в программе ЭКО и ПЭ/ Ж И Глинкина, Б В Леонов, В А Бахарев, В А Лукин// Вспомогательные репродуктивные технологии в лечении женского и мужского бесплодия под ред Кулакова В И, Леонова Б В М, - 2005, -стр 162175

23 Глинкина, Ж И Роль медико-генетического консультирования пациентов при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ)/ Ж И Глинкина, Л Н Кузьмичев, В А Бахарев, И Г Дзенис, В В Мамонова, Н А Туровец// тезисы докладов, Материалы VII Российского Фору ма «Мать и Дитя», М , -2005,-стр 359

24 Яворовская, К А Перспективы развития вспомогательных репродуктивных технологий/ К А Яворовская, Ж И Глинкина, С А Дьяконов // Ж Здравоохранение и медицинская техника, -2005, -№ 9(23), -стр 37

25 Глинкина, Ж И Особенности генотипов пациентов, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения/ Ж И Глинкина // Ж Акушерство и гинекология, -

2006, -№ 1, -стр 27-30

26 Глинкина, Ж И Комплексное генетическое обследование мужчин программы ИКСИ/Ж И Глинкина// Ж Гинекология, -2006, -т 8, -JV»4, -стр 60-63

27 Глинкина. Ж И Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов у пациентов с робертсоновскими транслокациями/ Ж И Глинкина // тезисы докладов, Материалы VIII Российского Форума «Мать и Дитя», М , -2006,-стр 361-362

28 Глинкина, Ж И Особенности генотипов мужчин, включенных в программу ИКСИ/ Ж И Глинкина, JIН Кузьмичев, Н А Туровец, В А Бахарев, И Г Дзенис // Тезисы научно-практической конференции «Современные возможности вспомогательных репродуктивных технологий», -2006. -стр 35

29 Глинкина, Ж И Роль преимпланташюнной генетической диагностики у пациентов ВРТ с робертсоновскими транслокаццями в кариотнпе/ Ж И Глинкина, JI Н Кузьмичев, В А Бахарев, И Г Дзенис и др // Тезисы IV Международного конгресса «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)», -2007, -стр 19

30 Глинкина, Ж И Изучение особенности мейоза у пациентов ВРТ с робертсоновскими транслокациями в кариотипе// Тезисы IV Международного конгресса «Актуальные вопросы вспомогательных репродуктивных технологий (проблемы и решения)», -2007, -стр 17-18

31 Глинкина, Ж И Значение медико-генетического обследования му жчин, включенных в программу ИКСИ/ Глинкина, Ж И // тезисы докладов, Материалы IX Российского Форума «Мать и Дитя», М , -2007, -стр 366

32 Глинкина, Ж И Преимплантационная генетическая диагностика эмбрионов у пациентов сделецией AZF локуса Y хромосомы/Ж И Глинкина, JIH Кузьмичев, В А Бахарев, ИГ Дзенис и др //тезисы докладов, Материалы IX Российского Форума «Мать и Дитя», М , -

2007, -стр 367

33 Глинкина, Ж И Особенности мейоза у мужчин с робертсоновскими транслокациями в кариотипе/Глинкина, Ж И //Ж Акушерство и гинекология,-2008,-№3,-стр 67-70

34 Глинкина, Ж И Роль прс им плантационной диагностики в профилактике рождения потомства с врожденной и наследственной патологией у супружеских пар программы ВРТ/ Ж И Глинкина, JI Н Ку зьмичев, К А Яворовская//Ж Здравоохранение и медицинская техника, -2008, -№ 2, -стр 38

35 Глинкина, Ж И Исследование гена чуковисцвдоза у мужчин с нарушением репродуктивной фу нкции программы ВРТ/ Глинкина, Ж И //Ж Медицинская генетика, -2008, -№ 4, -стр 37-39

36 Глинкина, Ж И Профилактика хромосомных нарушений у плодов пациентов программы вспомогательных репродуктивных технологий с робертсоновскичи транслокацнями в кариотипе/ Ж И Глинкина, Л H Кузьмичев, В А Бахарев и др //Ж Акушерство и гинекология, -2008, -№4, -стр 28-31

37 Глинкина, Ж И Преимплантационная диагностика в профилактике наследования мутаций потомством мужчин с делецииями в AZF локусе хромосомы Y/ Ж И Глинкина, Л H Кузьмичев, В А Бахарев, А В Поляков, И Г Дзенис и др /ПК Андрология и генитатьная хирургия, -2008, -№ 2, -стр 42-46

38 Glinkina, Zh Chromosomal changes in IVF/ICSI patients/Zh Glinkina, VI Kulakov, LN Kuzmichev, S A Diyakonov, V A Bakharev, L В Kindarova// Reproductive BioMedicme Online, «6й International Symposium on Preimplantation Genetics», -2005, -Vol 10, Supplement 2, -p 41

39 Diyakonov, S A Association of MHC class I antigens with spermatogenesis abnormalities in male patients of m vitro fertilization/ S A Diyakonov, Zh Glinkina, L N Kuzmichev, V A Bakharev, IG Dzenis // American J of Reproductive Immunology, -2005, -V 54, -N3, -p 155-156

40 Glinkina, Zh Genetic Evaluation of Male IVF/ICSI Patient Serono Symposia International/ Zh Glinkina, S A Diyakonov, L N Kuzmichev, V A Bakharev et al // Abstract book «The First seven days», 2006, -p 98

Подписано в печать 16 сентября 2008 г

Формат 60x90/16

Объем 2,00 п л

Тираж 100 экз

Заказ № 190908150

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912V772801001

Адрес 117292, г Москва, \ л Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тел 740-76-47, 125-22-73 " http //www univerpnnt ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Глинкина, Жанна Ивановна

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.6 стр.

ВВЕДЕНИЕ.8 стр.

ГЛАВА I. Особенности профилактики врожденных и наследственных заболеваний у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции обзор литературы).17 стр.

1.Частота встречаемости различных мутаций у пациентов с нарушением репродуктивной функции.18 стр.

2. Особенности мейоза у мужчин с изменениями в кариотипе.20 стр.

3. Роль моногенных мутаций у пациентов с НРФ.23 стр.

3.1.Врожденная дисфункция коры надпочечников (ВДКН).23 стр.

3.2. Исследование гена СБТЯ у мужчин программы ВРТ.31 стр.

3.3. Исследование AZF локуса хромосомы У у пациентов программы ВРТ .35 стр.

4. Значение системы НЬА в репродуктивных процессах.40 стр.

4.1. Корреляция антигенов системы НЬА с нарушениями репродуктивной функции.41 стр.

4.2. Особенности ассоциации антигенов гистосовместимости у мужчин с нарушением сперматогенеза.43 стр.

5. Преимплантационная диагностика (ПД).44 стр.

5.1. Современный метод диагностики хромосомных и наследственных заболеваний.44 стр.

5.2. Роль изучения кариотипа у неразвивающихся плодов в I триместре беременности.46 стр.

5.3. Принципы и основы ПД в современных условиях.51 стр.

5.4.Диагностика хромосомных нарушений и пола у эмбрионов.53 стр.

5.5. Диагностика моногенных заболеваний у эмбрионов.60 стр.

5.6. Проблемы, встречающиеся при проведении ПД.63 стр.

ГЛАВА II. Материалы и методы исследования.71 стр.

1. Общая характеристика обследованных супружеских пар.71 стр.

2. Характеристика сперматогенеза у включенных в обследование мужчин .79 стр.

3. Методы исследования.81 стр.

3.1. Цитогенетический метод.81 стр.

3.1.1. Исследование лимфоцитов периферической крови.81 стр.

3.1.2. Исследование клеток хориона.83 стр.

3.2. Спермиологический анализ.85 стр.

3.3. Молекулярно-цитогенетический метод (РКН).86 стр.

3.3.1 .Молекулярно-цитогенетическое исследование ядер сперматозоидов.86 стр.

3.3.2. Преимплантационная диагностика.88 стр.

3.4. Молекулярно-генетические исследования.90 стр.

3.4.1. Регистрация делеции в 3 экзоне гена СУР21В.92 стр.

3.4.2. Анализ микроделеций в локусе хромосомы У.95 стр.

3.4.3. Анализ мутаций и ТТ-полиморфизма гена СРТЯ.98 стр.

3.5. Исследование НЬАI класса.102 стр.

3.6. Исследование НЬА II класса.103 стр.

ГЛАВА III. Медико - генетическое обследование супружеских пар программы ВРТ.106 стр.

1.Результаты цитогенетического обследования супружеских пар, эмбрионов и плодов программы ВРТ.109 стр.

1.1. Хромосомные нарушения у супружеских пар с НРФ и профилактика рождения больных детей .110 стр.

1.1.1. Изучение процесса сегрегации хромосом в половых клетках у мужчин, имеющих изменения в кариотипе.112 стр.

1.1.2. Результаты ПД у супружеских пар с хромосомными аберрациями в кариотипе.119 стр.

1.2. Результаты ПД у супружеских пар с нормальным кариотипом.ЛЗО стр. 1.2.1. Частота анеуплоидии хромосом 13 и 21, X, Y, 21 у эмбрионов

130 стр.

1.2.2 Результаты ПД у супружеской пары с частым пузырным заносом в анамнезе.142 стр.

1.2.3. Результаты ПД у супружеских пар с определением пола у эмбрионов по желанию пациентов.143 стр.

1.3. Анализ кариотипа неразвивающихся плодов пациентов программы ВРТ.149 стр.

2. Особенности проведения ПД с помощью метода FISH с оптимизацией метода в современных условиях.153 стр.

3. Моногенные нарушения у супружеских пар с НРФ и профилактика рождения больных детей .157 стр.

3.1. ВДКН, обусловленная недостаточностью 21 -гидроксилазы у пациентов ВРТ.157 стр.

3.2. Анализ мутаций в гене CFTR у мужчин с отклонениями в показателях спермограммы.160 стр.

3.3. Анализ микроделеций в локусе AZF хромосомы Y у мужчин с отклонениями в показателях спермограммы.162 стр.

3.4. ПД у супружеских пар программы ИКСИ, при наличии у мужей микроделеции в локусе AZF хромосомы Y.165 стр.

4. Исследование антигенов системы HLA у пациентов с НРФ.167 стр.

4.1. Изучение особенностей антигенов системы HLA у мужчин, включенных в программы ВРТ.167 стр.

4.2. Анализ гистосовместимости супругов, включенных в программу ВРТ, по антигенам системы HLA I и II классов.171 стр.

5. Пути профилактики врожденной и наследственной патологии у пациентов программы ВРТ.174 стр.

6. Разработка генетических подходов к обследованию доноров половых клеток в программе ВРТ.177 стр.

ГЛАВА IV. Обсуждение полученных результатов.186 стр.

ВЫВОДЫ.213 стр.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Диагностика и профилактика врожденных и наследственных заболеваний при вспомогательных репродуктивных технологиях"

Научно-практическая деятельность отделений ВРТ разных стран показала, что изменения в генотипе среди пациентов с нарушением репродуктивной функции отмечаются значительно чаще, чем в популяции. Нарушение репродуктивной функции обычно обусловлены хромосомными и генными мутациями, наличием наследственной предрасположенности к заболеванию [26, 63].

Мутации у родителей, приводящие к нарушению репродукции и невозможности зачатия ребенка естественным путем, могут передаваться будущему потомству через гаметы при применении программ ВРТ. Все эти данные указывают на необходимость проявлять настороженность при использовании методов ВРТ у пациентов с генетической патологией.

В структуре перинатальной смертности и заболеваемости новорожденных врожденная и наследственная патология занимает 2-3 место [23]. Выявление предрасположенности к данным формам патологии у включенных в программу ВРТ пациентов имеет большое медицинское и социальное значение. Это объясняется тем, что беременность в программе ВРТ зачастую наступает не с первой попытки, на фоне мощной гормональной терапии, отдаленные последствия которой до конца не изучены. Врачи пытаются сохранить данную беременность любыми способами. При неблагоприятном исходе долгожданной беременности супружеской паре иногда трудно решиться на повторную попытку.

Следует отметить, что прогресс в развитии микроманипуляционной техники и методов лечения НРФ в настоящее время опережает разработку и внедрение методов профилактики рождения здорового потомства. Появление в печати противоречивых данных как о наследственных, так и возникших de novo заболеваний у детей, рожденных в программах ВРТ, ставит перед специалистами вопрос: не смогут ли с применением этих технологий заболевания, ранее считавшиеся только врожденными, стать наследственными, и не произойдет ли накопление приводящих к бесплодию мутаций генов в популяции, тем самым пополняя ряды пациентов с НРФ [44, 50, 231, 240]? Такие опасения вызваны результатами исследования кариотипа у 430 детей, рожденных в программе ЭКО/ИКСИ, которое показало у 15 (3.5%) из них хромосомные изменения, а в контрольной группе из такого же числа детей, рожденных естественным путем, не было выявлено ни одного случая с хромосомной патологией [44].

Кроме того, с 2002 года в печати стали появляться работы, в которых авторы сообщают о случаях рождения в программе ЭКО детей с возникшими de novo заболеваниями геномного импринтинга: синдромами Видемана-Беквита, Энгельмана и др., которые не диагностируются стандартными цитогенетическими методами пренатальной диагностики, и для выявления которых во время беременности требуется достаточно сложное комплексное обследование [48, 51, 75, 104, 144, 152, 182, 203, 220, 225]. По данным литературы, частота синдрома Видемана-Беквита среди детей, рожденных в программе ВРТ, в 3.3 раза превышает таковую в популяции [66, 152]. В данных исследованиях не было выявлено четкой корреляции между уровнем рождения детей с болезнями геномного импринтинга и методом оплодотворения эмбрионов (классическое ЭКО или ИКСИ). Это позволило исследователям предположить, что ошибки импринтинга могут возникать в ходе этапа или этапов как процедуры ЭКО, так и процедуры ИКСИ. Исследования, проведенные на эмбрионах мышей, показали, что некоторые компоненты, входящие в состав среды для культивирования эмбрионов in vitro, могут нарушать нормальный процесс метилирования и экспрессию генов. Другими причинами возникновения ошибок геномного импринтинга, по мнению авторов, могут служить: отсутствие естественной селекции; нарушение условий созревания ооцитов; механическое повреждение механизмов внутриклеточного гомеостаза ооцитов при проведении процедуры ИКСИ; неестественные условия культивирования эмбрионов в термостате; использование в программе незрелых половых клеток и др.

До настоящего момента решающая роль в комплексе мероприятий предупреждения рождения больного ребенка принадлежит пренатальной диагностике. Решение о необходимости проведения данной диагностики принимается во время медико-генетического консультирования пациентов.

В действующем на сегодняшний день приказе № 457 Минздрава РФ от 28.12.2000 года показаниями для проведения инвазивной пренатальной диагностики являются: возраст матери 35 лет и старше; рождение в семье ребенка с хромосомной патологией; носительство семейной хромосомной аномалии; наличие у плода ВПР; наличие эхографических признаков хромосомной патологии; отклонение уровней сывороточных материнских маркеров АФП, ХГЧ и др.

Несмотря на значительное усовершенствование существующих на сегодняшний день скрининговых программ по выявлению женщин групп высокого риска рождения генетически больного ребенка, они не могут быть в достаточной мере использованы для выявления аномалий у плодов, полученных в программах ВРТ. При разработке этих программ не учитывались особенности методов получения (стимуляция суперовуляции) беременности и ее течения (мощная гормональная поддержка, часто многоплодие) при использовании репродуктивных технологий. Новые условия требуют создания новых подходов к разработке профилактики врожденной и наследственной патологии и рождения здорового потомства у пациентов, включенных в программу ВРТ.

Новым и исключительно перспективным направлением в клинической практике в плане исключения рождения генетически больного ребенка должна стать преимплантационная диагностика, большим преимуществом которой является исследование эмбриона до момента переноса его в организм матери [110, 167].

Однако, несмотря на наличие технических возможностей проведения ПД, до сих пор неизвестно, как влияет сама эта манипуляция на дальнейшее развитие эмбрионов, какова эффективность данного метода; не разработан алгоритм проведения этой процедуры, до конца не сформулированы возможности ПД, показания к ее проведению.

Преимплантационная диагностика может стать альтернативой пренатальной диагностике для тех имеющих высокий риск рождения ребенка с наследственной или врожденной патологией фертильных супружеских пар, которые в случае обнаружения у плода генетической патологии выступают против медицинского аборта по моральным, религиозным или другим мотивам.

Несмотря на наличие многочисленных публикаций по данному вопросу, содержающаяся в них информация носит фрагментарный характер. До настоящего времени в литературе нет обобщенных данных о лечении и исходах беременностей у пациентов с генетическими мутациями. Все вышесказанное указывает на необходимость разработки алгоритма медико-генетического обследования и проведения профилактических мероприятий с помощью медико-генетического консультирования пациентов программы ВРТ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Изучить особенности генотипа супружеских пар, включенных в программу ВРТ, и разработать алгоритм профилактических мероприятий врожденных и наследственных заболеваний у потомства.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Оценить частоту хромосомных и некоторых моногенных мутаций при различных формах бесплодия;

2) провести исследование генотипов супружеских пар программы ВРТ: цитогенетическое обследование; исследование гена CYP 21В; гена трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR - cystic fibrosis transmembrane conductase regulator); анализ микроделеций в локусе AZF хромосомы Y, антигенов системы HLA (Human Leucocyte Antigens);

3) выявить уровень хромосомных аберраций в сперматозоидах у мужчин, в кариотипе которых отмечаются хромосомные изменения;

4) определить частоту и характер хромосомных аберраций у эмбрионов in vitro, у неразвивающихся плодов, полученных в программе ВРТ;

5) провести анализ результатов программы ВРТ с проведением ПД у супружеских пар с изменениями в генотипе и без таковых; оптимизировать метод FISH;

6) разработать рекомендации генетического обследования доноров половых клеток;

7) на основании полученных данных разработать алгоритм генетического обследования пациентов и профилактических мероприятий для конкретной супружеской пары с высоким риском рождения ребенка с генетическим заболеванием в программе ВРТ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В последнее время значительно возрос интерес как к самим новым методам вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), так и к здоровью зачатых с помощью ВРТ детей. Это связано с тем, что в связи с достижениями в области микроманипуляционной техники, биологии, медицины даже у пациентов с генетическими мутациями появилась возможность иметь здоровых детей. В данном исследовании впервые проведено комплексное медико-генетическое обследование страдающих бесплодием и включенных в программу ВРТ супружеских пар, определены особенности генотипа, выявлены удельный вес и тип генетических мутаций у этой группы пациентов. В диссертации впервые предложен алгоритм комплексного медико-генетического обследования пациентов программы ЭКО и ИКСИ. Важным и новым являются разработанные в работе положения, доказывающие необходимость проведения преимплантационной диагностики у супружеских пар с генетическими нарушениями, оптимизирован протокол проведения гибридизации in situ и оценена эффективность преимплантационной диагностики FISH методом. Определена частота анеуплоидии в ядрах бластомеров у пациентов с генетическими изменениями (хромосомными и генными). Впервые выявлена положительная ассоциация антигенов системы HLA I класса у мужчин славянской популяции с нарушением сперматогенеза. Выявлено соотношение клонов с нормальным и аберрантным хромосомным набором в сперматозоидах у мужчин с робертсоновской транслокацией хромосом 13 и 14 в кариотипе. Таким образом, данное исследование направлено на повышение эффективности программы ВРТ и профилактику рождения ребенка с генетическими нарушениями у супружеских пар с нарушением репродуктивной функции, а также у фертильных супружеских пар с высоким риском рождения потомства с мутациями.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В данной работе на основе проведенных научных исследований решен ряд важных практических вопросов, направленных на повышение эффективности программы ВРТ и рождения здорового потомства у пациентов этой программы. Полученные данные указывают на необходимость комплексного проведения медико-генетического обследования обоих супругов, нуждающихся в лечении бесплодия до их включения в программу ВРТ.

Выявленный высокий уровень различных генетических изменений у супружеских пар с бесплодием позволяет разработать рекомендации по формированию группы риска пациентов, у которых в потомстве могут возникать мутации. В связи с этим предложена и показана важность оптимизации программы ВРТ для конкретной супружеской пары с генетическими нарушениями (хромосомными и/или генными) с разработкой индивидуального алгоритма лечения бесплодия методами ЭКО, ИКСИ.

Оптимизирован метод флуоресцентной гибридизации in situ, благодаря чему удалось повысить эффективность проведения ПД методом FISH.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Высокая частота хромосомных и генных изменений в генотипе пациентов программы ВРТ обуславливает необходимость проведения медико-генетического консультирования, цитогенетического обследования обоим супругам и по показаниям молекулярно -генетическое обследования до включения их в программу ЭКО/ИКСИ.

2. У мужчин с робертсоновской транс локацией хромосом 13, 14 в кариотипе выявляется положительная корреляция между показателями спермограммы и частотой нерасхождения в сперматозоидах вовлеченных в транслокацию хромосом и гоносом. При наличии хромосомной аберрации в кариотипе и отклонений в показателях спермограммы в мейозе отмечается высокий уровень нерасхождения хромосом 13, 14, а также гоносом.

3. Антигены системы HLA I класса могут служить надежными маркерами в прогнозе наличия у мужчин нарушений сперматогенеза. Исследование фенотипов HLA I класса мужчин программы ВРТ с отклонениями в показателях спермограммы обнаружило положительные ассоциации между олигоастенотератозооспермией и антигенами HLA В18, В35, Cw4.

4. Преимплантационная диагностика является одним из основных этапов в профилактических мероприятиях у пациентов программы ВРТ. ПД с помощью FISH анализа является эффективным методом определения различных типов анеуплоидии в ядрах бластомеров и может быть рекомендована для применения в клиниках ВРТ как у пациентов с бесплодием, так и у фертильных супружеских пар, имеющих высокий риск рождения ребенка с генетической патологией.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ: Работа изложена на 246 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 45 таблицами и 20 рисунками. Библиографический указатель включает 244 литературных источника, из которых 43 работы отечественных и 201 - зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Глинкина, Жанна Ивановна

Результаты исследования ядер бластомеров FISH методом с использованием зондов к гоносомам у супружеских пар программы ВРТ

Хромосомный набор Число наблюдений

XX 104

XY 113 хо 19

Y0 8

XXY 14

XYY 8

XXX 6

ХХХХ 4

XXYY 3

XXXXY 1

YY 1

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие среди пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 79% случаев.

Наши данные показали, что моносомия и трисомия гоносом являются наиболее частой хромосомной патологией среди обследуемых эмбрионов и встречаются практически с одинаковой частотой 42.2% и 43.8%. Однако следует отметить, что частота встречаемости моносомии хромосомы X в 2.4 раза выше частоты моносомии хромосомы У. Повидимому, эмбрионы с набором хромосом УО прекращают свое развитие на более ранних стадиях развития, либо такого типа нарушения формируются достаточно редко. К таковым также можно отнести и обнаруженные находки в виде набора хромосом УУ и ХХХХУ.

Сводные данные по ПД с применением зондов к различным хромосомам представлены в таблицах 34 и 35.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Пациентам с бесплодием перед включением их в программу ВРТ рекомендуется пройти медико - генетическое консультирование.

2. Исследование кариотипа лимфоцитов периферической крови следует проводить обоим супругам всех супружеских пар программы ВРТ.

3. У мужчин, в кариотипе которых выявлены хромосомные аберрации, необходимо проведение молекулярно-цитогенетического исследования сперматозоидов с применением зондов к соответствующим хромосомам.

4. У пациентов с высоким значением гормона 17-ОП, с клиническими проявлениями ВДКН, такими как гирсутизм, позднее менархе, нерегулярный менструальный цикл, невынашивание беременности и т. д., либо при обнаружении у них в системе НЬА I класса антигенов В35, В14 рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования мутаций в гене СУР 21В. При обнаружении у одного из супругов мутации в исследуемом гене второму рекомендуется провести аналогичное исследование.

5. Мужчинам из супружеских пар, включенных в программу ИКСИ и имеющих отклонения в спермограмме, рекомендуется проведение молекулярно-генетического исследования гена СБТЫ, Т/Т аллеля, локуса AZF хромосомы У. При обнаружении у мужа мутации в гене СБТЯ, 5Т аллеля супруге рекомендуется провести аналогичное исследование.

6. Включенным в программу ВРТ пациентам, у которых имеются хромосомные изменения в кариотипе, необходимо проведение ПД для выявления различных анеуплоидий у эмбрионов.

7. Супружеским парам, где у мужей имеются делеции локуса АХ¥ хромосомы У, необходимо проведение ПД для выбора эмбрионов женского пола.

217

8. Женщинам старше 35 лет рекомендуется исследование эмбрионов на самые распространенные анеуплоидии - трисомии хромосом 13, 16, 18, 21 и гоносом.

9. Исследование антигенов системы НЬА I и II классов рекомендуется проводить всем супружеским парам перед программой ВРТ. Это позволяет выделить группу риска пациентов, у которых возможно невынашивание беременности и которые должны пройти ряд профилактических мероприятий, направленных на сохранение беременности. Кроме того, антигены системы НЬА служат маркерами, которые могут сигнализировать о наличии риска возникновения заболевания как у самого пациента, так и у его потомства.

10. Женщинам, у которых выявлена неразвивающаяся беременность и планируется ее прерывание, показано цитогенетическое исследование клеток полученного хориона.

11. Лицам, планирующим стать донорами половых клеток, необходимо пройти медико-генетическое консультирование и обследование на самые распространенные мутации генов, приводящие к заболеваниям: в первую очередь - муковисцидоз и ВДКН, а при возможности и на др. (фенилкетонурия, нейросенсорная тугоухость, спинальная мышечная атрофия).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Глинкина, Жанна Ивановна, Москва

1. Айламазян, Э.К. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней / Э.К. Айламазян, B.C. Баранов // М. МЕДпресс-информ - 2006 - с. 109-111.

2. Алексеев, Л.П. Иммунология / Л.П. Алексеев // М. 1985 - т. 3 - № 3 -с. 5-9.

3. Байбарина, Г.В. Индуцированная беременность: особенности течения и значение генетических факторов в невынашивании: автореф. дис. . кандид. мед. наук / Г.В. Байбарина М. - 2004 - 23 с.

4. Баранов, A.A. Система HLA и патология человека / A.A. Баранов, Б.С. Каганов, С.А. Шер и др. // М. Династия - 2003 - с. 10.

5. Баранов, B.C. Пренатальная диагностика хромосомных болезней у плода. Методические рекомендации / B.C. Баранов, Т.В. Кузнецова, Н.Ю. Швед и др. // СПб. 1995 - с. 21.

6. Ворсанова, С.Г. Аномалии половых хромосом при нарушении репродуктивной функции у мужчин / С.Г. Ворсанова, В.О. Шаронин, Л.Ф. Курило //Пробл. репрод. 1998 - №2 - с. 12-21.

7. Ворсанова, С.Г. Способ оптимизации условий получения дифференциального окрашивания хромосом с помощью С метода для диагностики хромосомных аномалий / С.Г. Ворсанова, И.А. Демидова // Рац. предл. - 1989 - № 744 - 2 с.

8. Горбунова, В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. / В.Н. Горбунова, B.C. Баранов // СПб.-Специальная Литература 1997 - с. 220-222.

9. Дзенис, И.Г. Современные пути диагностики и профилактики наследственной недостаточности 21- гидроксилазы: автореф. дис. . докт. мед. наук / И.Г. Дзенис / М. 1994 - 34 с.

10. Захаров, А.Ф. Хромосомы человека: Атлас / А.Ф.Захаров, В.А. Бенюш, Н.П. Кулешов и др.//М. Медицина- 1982 - с. 255-263.

11. Иванов, В.И. Генетика / В. И. Иванов, Н. В. Барышникова, Дж. С. Билева и др. // М. ИКЦ Академкнига - 2006 - с. 569.

12. Иващенко, Т.Э. Биохимические и молекулярно-генетические основы патогенеза муковисцидоза / Т.Э. Иващенко, В.С. Баранов // СПб -Интермедика 2002 - с. 256.

13. Ижевская, В.Л. Этико-правовые аспекты генетического тестирования и скрининга / В.Л. Ижевская // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике Новосибирск - Альфа Виста - 2006 - вып. 9 - с. 315.

14. Иен, С.С. Репродуктивная эндокринология / Под ред. Дедова И.И./ С.С. Йен, Р.Б. Джаффе // М. Медицина - 1998 - с. 369-370.

15. Капранов, Н.И. Муковисцидоз. Достижения и проблемы на современном этапе / Н. И. Капранов, Н. Ю. Каширская, Н. В. Петрова // Медицинская генетика 2004 - №9 - с. 398-412.

16. Карпова, Т.В. Особенности системы НЬА у женщин с привычным невынашиванием и бесплодием : автореф. дис. . кандид. мед. наук / Т.В. Карпова М. - 1998 - с. 23.

17. Кулаков, В.И. Экстракорпоральное оплодотворение и его новые направления в лечении женского и мужского бесплодия / В.И. Кулаков, Б.В. Леонов // М. МИА - 2000 - с.5

18. Кулаков, В.И. Профилактика и пренатальная диагностика врожденной патологии плода и новорожденного / пособие для врачей / В.И. Кулаков, Ю. И. Барашнев, В.А. Бахарев и др. // М. 2003 - с. 5.

19. Кулешов, Н.П. Современные проблемы в клинической цитогенетике: сб. науч. трудов / Н.П. Кулешов // М. 1991 - № 91 - 163 с.

20. Кулешов, Н.П. : автореф. дис. . док. мед. наук / Н.П. Кулешов // М. -1997-42 с.

21. Курило, Л.Ф. Анализ патологии сперматогенеза различной этиологии по эякуляту /Л.Ф. Курило, В.П. Дубинская, Т.В. Остроумова и др. // Пробл. репрод. 1995 - т. 3 - с. 33-38.

22. Курило, Л.Ф. Частота и структура хромосомных аберраций у пациентов с репродуктивной недостаточностью/Л.Ф. Курило// Медицин. Генетика 2007. - т. 6 - №10 (64) - с. 41-44.

23. Лебедев, И.Н. Молекулярно цитогенетическая характеристика хромосомных аномалий при анэмбрионии и неразвивающейся беременности: Дисс. Канд. биол. наук / И.Н. Лебедев // Томск - 2001 - с. 45.

24. Логинова, Ю.А. Молекулярно генетический анализ микроделеций У- хромосомы у мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза / Ю.А. Логинова, И.И. Нагорная, С.А. Шлыкова и др. // Молек. биология - М. -2003-т. 37-№ 1 - с. 74-80.

25. Михайличенко, В.В. Особенности ассоциаций гистосовместимости у больных с бесплодием обусловленным варикоцеле /В.В. Михайличенко, В.П. Александров и др. // Урология, нефрология 1992 - № 6 - с. 39-40

26. Монтаг, Е.С. Перекрестно реагирующие антигены системы НЬА как фактор, повышающий риск бездетности в семье / Е.С. Монтаг, Г.Н.Дранник, М.И. Горпинченко и др. // Врачебное дело 1993 - т.4 - с. 86-90.

27. Петрова, Н.В. Молекулярно-генетические особенности муковисцидоза в российских популяциях / Н.В. Петрова // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике Новосибирск - Альфа Виста - 2006 -вып. 9-с. 109-120.

28. Раисова, А.Т. Невынашивание беременности у женщин репродуктивного возраста: дисс.докт. мед. наук / А.Т. Раисова // М. 1990 - 283 с.

29. Савельева, А.П. Структура хромосомной патологии среди пациентов с мужским бесплодием и патозооспермией: автореф. дисс. . канд. биол. наук / А.П. Савельева // М. 2002 - 31 с.

30. Снелл, Дж. Совместимость тканей / Дж. Снелл, Ж. Доссе, С. Нетенсон //М. 1979-с. 24-36.

31. Тананов, А.Т. Система HLA антигенов и болезни / А.Т. Тананов, А. В. Орлов-Морозов // Научное обозрение - М. - 1982 - с. 345.

32. Тишкевич, O.JI. Невынашивание беременности после ЭКО и ЭКО/ИКСИ / O.JI. Тишкевич, С.В.Жуковская, С.Б. Шелег и др. // Пробл. репрод. 1998-№ 6- с. 21

33. Черных, В.Б. Микроделеционный анализ AZF-локуса в рамках комплексного клинико-генетического обследования мужчин с азооспермией и олигозооспермией: автореф. дис.кандид. мед. наук / В.Б.Черных // М. 2002 - 25 с.

34. Черных, В.Б. Частота и типы делеций Y-хромосомы при бесплодии у мужчин / В.Б. Черных, A.JI. Чухрова, Т.С. Бескоровайная, и др. // Генетика -2006-т. 42 № 8 - с. 1-6.

35. Шабалин, В.Н. Актуальные проблемы прикладной иммунологии / В.Н.Шабалин, Л.Д. Серова // М. 1986 - с. 92-108.

36. Aboulghar, Н. A prospective controlled study of karyotyping for 430 consecutive babies conceived through intracytoplasmic sperm injection / H. Aboulghar, M. Aboulghar , R. Mansour et al. // Fértil. Steril. 2001 - vol. 76 -№2-p. 249-253.

37. Affara, N. Report of the international workshop on Y chromosome mapping 1995 / N. Affara, C. Bishop, W. Brown et al. // Cytogenet. Cell. Genet.- 1996-№73 -p. 33 -76.

38. Aleksovski, D. Possibilies of azoospermia and о ligospermia with some HLA sistem antigens / D. Aleksovski, Z. Todorov // Hum. Reprod. 1988 - vol. 3 - № 1 - p. 83-84.

39. Allen, C. Assisted reproduction technology and defects of genomic imprinting / C. Allen , W. Reardon // BJOG 2005 - vol. 112 - № 12 - p. 1589- 1594.

40. Altarescu, G. Simultaneous preimplantation genetic diagnosis for Tay-Sachs and Gaucher disease / G. Altarescu , B. Brooks, E. Margalioth et al. // Reprod. Biomed. Online 2007 - vol. 15 - № 1 - p. 83 - 88.

41. Antoni, К. Тезисы 17-го ежегодного конгресса ESHRE / К. Antoni // Hum. Reprod. 2001 - № 16 - p. 121.

42. Arnaud, P. Epigenetic deregulation of genomic imprinting in human disorders and following assisted reproduction / P. Arnaud, R. Feil. // Birth. Defects. Res. C. Embryo. Today 2005 - vol. 75 - № 2 - p.81-97.

43. Balakier, H, Cadesky, K. The frequency and developmental capability of human embryos containing multinucleated blastomeres / H. Balakier, K. Cadesky // Hum. Reprod. 1997 - vol. 12 - № 4 - p. 800-804.

44. Baltaci, V., Satiroglu, H., Kabukcu, C. et al. Relationship between embryo quality and aneuploidies / Baltaci, V., Satiroglu, H., Kabukcu, С.// Reprod. Biomed. Online 2006 - vol. 12 - № 1 - p. 77-82.

45. Belvedere, M., Livieri, L., Martinetti, M. HLA haplotypes earring the 21-hydroxylase mutation in 25 Italian families / Belvedere, M., Livieri, L., Martinetti, M. // Atti. Assoc. Genet. Ital. 1984 - №30 - p.27.

46. Benet, J., Oliver-Bonet, M., Cifuentes, P. et al. Segregation of chromosomes in sperm of reciprocal translocation carriers: a review / Benet, J., Oliver-Bonet, M., Cifuentes, P. // Cytogenet. Genome. Res. 2005 - vol. 111 - № 3-4 - p. 281 -290.

47. Bienvenu, T, Claustres, M. Molecular basis of cystic fibrosis and congenital bilateral agenesis of vas deferens / Bienvenu, T, Claustres, M. // Contracept. Fértil. Sex. 1996 - vol. 24 - № 6 - p. 495-500.

48. Biricik, A., Fiorentino, F., Nuccitelli, A. et al. PGD for single gene disorders: outcomes of over 200 cycles / Biricik, A., Fiorentino, F., Nuccitelli, A. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 3 - p. 24.

49. Blaszczyk, A. et al. Preimplantation genetic diagnosis of human embryos for Marfan's syndrom / Blaszczyk, A. // J. of Assisted Reproduction and Genetics -1998-vol. 15 № 5 - p. 281-284.

50. Bochm, B.O. Classical and late-onset forms of 21-OH deficiency reveal different alterations in the HLA class III region / Bochm, B.O. //Acte. Endocr. Suppl. 1987 - № 283 - p. 172-173.

51. Braekeleer, M, Ferec, C. Mutations in the cystic fibrosis gene in men with congenital bilateral absence of the vas deferen. / Braekeleer, M, Ferec, C. // Mol. Hum. Reprod. 1996 - vol. 2 - № 9 - p. 669 - 677.

52. Carvalho, F., Sousa, M., Silva, J. et al. Update on PGD in Portugal for familial amyloidotic polyneuropathy / Carvalho, F., Sousa, M., Silva, J. // Reprod. Biomed. Online 2005- vol. 10 - № 2 - p. 12.

53. Causio, F., Fischetto, R., Schonauer, L. M. et al. Intracytoplasmic sperm injection in infertile patients with structural cytogenetic abnormalities / Causio, F., Fischetto, R., Schonauer, L. M. // J. Reprod. Med. 1999- vol. 44 - № 10 -p. 859-864.

54. Chandley, A.C., Hargreave, T.B. Genetic anjmaly & ICSI / Chandley, A.C., Hargreave, T.B. // Hum. Reprod. 1996 - vol. 11 - № 5 - p. 930-933.

55. Chang, S.Y., Tsai, M.Y. Detection of azoospermic factor genes in Chinese men with azoospermia or severe oligozoospermia / Chang, S.Y., Tsai, M.Y.// J. Assist. Reprod. Genet. 1999 - vol. 16 - №5 - p. 259 - 262.

56. Chernykh, V.B., Chukhrova, A.L., Beskorovainaya, T.S. et al. Types of Y Chromosome Deletions and Their Frequency in Infertile man / Chernykh, V.B., Chukhrova, A.L., Beskorovainaya, T.S. // Human. Genet. 2006 - vol.42 - p-936-941.

57. Chevret, E. et al. Increased incidence of hyperhaploid 24, XY spermatozoa detected by three-colour FISH in 46,XY/47,XXY male / Chevret, E. / Human. Genet. 1996-vol. 97-№2-p. 171-175.

58. Chillon, M., Casals, Т., Mercier, В. et al. Mutations in the cystic fibrosis gene in patients with congenital absence of the vas deferens / Chillon, M., Casals, Т., Mercier, B. // New Eng. J. Med. 1995 -vol. 332 - p. 1475 - 1480.

59. Claustres, M. Molecular pathology of the CFTR locus in male infertility / Claustres, M. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 1 - p. 14 - 41.

60. Coskun, S, Alsmadi, O. Whole genome amplification from a single cell: a new era for preimplantation genetic diagnosis / Coskun, S, Alsmadi, O. // Prenat. Diagn. 2007 - vol. 27 - № 4 - p.297 - 302.

61. Coullin, P., Kottler-Missonnier, M.L., Grisard, M.C. et al. HLA-A,B,C,DR alleles in congenital adrenal hyperplasia / Coullin, P., Kottler-Missonnier, M.L., Grisard, M.C. // J. Hum. Genet. 1980 - vol. 53 - №3. - p. 389-392.

62. Cox, G.F., Bürger, J., Lip, V. et al. Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting defects /Сох, G.F., Bürger, J., Lip, V. // Am. J. Hum. Genet. 2002 - vol. 71 - № 1 - p. 162 - 164.

63. Dada, R., Gupta, N.P., Kucheria, K. AZF microdeletions associated with idiopathic and non-idiopathic cases with cryptorchidism and varicocele / Dada, R., Gupta, N.P., Kucheria, K. // Asian. J. Androl. 2002 -vol. 4. - №4 - p. 259 -263.

64. Delhanty, J. et al. Multicolor FISH frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients. / Delhanty, J. // Hum. Genet. 1997 - vol. 9 - № 6 - p. 755 - 760.

65. Deng, J., Peng, W.L., Li, J. et al. Successful preimplantation genetic diagnosis for alpha- and beta-thalassemia in China / Deng, J., Peng, W.L., Li, J.// Prenat. Diagn. 2006 - vol. 26 - № 11 - p. 1021 - 1080.

66. Diemer, T., Desjardins, C. et al. Developmenfol and genetic disordnction / Diemer, T., Desjardins, C. // Updata 1999 - vol. 6 - № 2 - p. 120-140.

67. Duppont, B., Smithwick, E. H., Oberfield, S. E. et. al. Close genetic linkade between HLA and congenital adrenal hyperplasia (21- hydroxylase deficiency) / Duppont, B., Smithwick, E. H., Oberfield, S. E. // Lancet 1977 -vol. 2 - p. 1309-1312.

68. Durieu, I., Bey-Omar, F., Rollet, J. et al. Male infertility caused by bilateral agenesis of the vas deferens: a new clinical form of cystic fibrosis? / Durieu, I., Bey-Omar, F., Rollet, J. // Rev. Med. Interne. 1997 - vol.18 - №2 - p. 114118.

69. Edwards, R., Gardner, R. Sexing of five rabbit blastocysts / Edwards, R., Gardner, R. // Nature 1967 - vol. 214 - p. 567-577.

70. Escudero, J., Telleria- Orriols, J.J. et al. Agenesis of vas deferens and cystic fibrosis / Escudero, J., Telleria- Orriols, J.J. // Actas. Urol. Esp. 1997 -vol.21-№8-p.73 -76.

71. Ferlin, A., Moro, E., Rossi, A. et al. The human Y chromosome's azoospermia factor b (AZFb) region: sequence, structure, and deletion analysisin infertile men / Ferlin, A., Moro, E., Rossi, A. // J. Med. Genet. 2003 - vol. 40-p. 18-24.

72. Ferlin, A., Tessari, A., Ganz, F. et al. Association of partial AZFc region deletions with spermatogenic impairment and male infertility / Ferlin, A., Tessari, A., Ganz, F. // J. Med. Genet. 2005 - vol. 42 - p. 209-215.

73. Fernandes, S., Huellen, K., Goncalves, J. et al. High frequency of DAZ1/DAZ2 gene deletions in patients with severe oligozoospermia / Fernandes, S., Huellen, K., Goncalves, J. // Mol. Hum. Reprod. 2002 - vol. 8 -p. 286-298.

74. Findlay, I., Matthews, P.L., Mulcahy, B.K. et al. Using MF-PCR to diagnose multiple defects from single cells: implications for PGD / Findlay, I., Matthews, P.L., Mulcahy, B.K. // Mol. Cell. Endocrinol. 2001 - vol. 22 - № 183 - p. 5 -12.

75. Fiorentino, F., Kahraman, S., Karadayi, H. et al Short tandem repeats haplotyping of the HLA region in preimplantation HLA matching / Fiorentino, F., Kahraman, S., Karadayi, H. // Eur. J. Hum. Genet. 2005 - vol. 13 - № 8 -p. 953 - 958.

76. Fiorentino, F., Biricik, A., Nuccitelli, A. et al. Strategies and clinical outcome of 250 cycles of Preimplantation Genetic Diagnosis for single gene disorders / Fiorentino, F., Biricik, A., Nuccitelli, A. // Hum. Reprod. 2006 -vol. 21 - №3-p. 670-684.

77. Ford, C.E., Hamerton, J.L. The chromosomes of man / Ford, C.E., Hamerton, J.L. // Nature 1956 - p. 1020 - 1023.

78. Foresta, С., Moro, E., Ferlin, A. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis / Foresta, C., Moro, E., Ferlin, A. Y // Endocr. Rev. 2001 - vol. 22 - p. 226-239.

79. Gianaroli, L. Gamete and embrio donation // Hum. Reprod. 2002 - vol. 17 - № 5 - p. 1407- 1408.

80. Gianaroli, L., Magli, M.C., Ferraretti, A.P. et al. Possible interchromosomal effect in embryos generated by gametes from translocation carriers / Gianaroli, L., Magli, M.C., Ferraretti, A.P. // Hum. Reprod. 2002 - vol. 17 - № 12 - p. 3201 -3207.

81. Gissier, Mika, Silverio, Maili Malin, Heminki, Elina. In-vitro Fertilisation pregnancies perinatal health in Finland 1991-1993 / Gissier, Mika, Silverio, Maili Malin, Heminki, Elina // Hum. Reprod. 1995 - vol. 10 - № 7 -p. 1856-1861.

82. Griffin, D. et al. Clinical experience with preimplantation diagnosis of sex by dual fluorescent in situ hybridization / Griffin, D. // J. Assist. Repro. Genet. 1994 - vol. 2 - № 9 - p. 1733 - 1737.

83. Guidelines for gamete and embryo donation: a practice committee report // Fertility and Sterility 2002 - vol. 77 - № 6 - p. 1 - 5.

84. Gosden, R, Trasler, J, Lucifero, D. Rare congenital disorders, imprinted genes, and assisted reproductive technology / Gosden, R, Trasler, J, Lucifero, D. // Lancet 2003 - vol. 7 - № 361 - p. 1975 -1977.

85. Hamanoue, H., Umezu, N., Okuda, M., Complete hydatidiform mole and normal live birth following intracytoplasmic sperm injection / Hamanoue, H., Umezu, N., Okuda, M., // J. Hum. Genet. 2006 - vol. 51 - № 5 - p. 477 - 479.

86. Handyside, A. et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification / Handyside, A. // Nature -1990-vol. 344-p. 768-770.

87. Harada, Fumiki. Fucuoca acta med / Harada, Fumiki //1987 № 78 -p.55 -66.

88. Harper, J. International data collection / Harper, J. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 5.

89. Harper, J., Boelaert, K., Geraedts, J. et al. ESHRE PGD Cosortium data collection V: Cycles from January to December 2002 with pregnancy follow-up to October 2003 / Harper, J., Boelaert, K., Geraedts, J. // Hum. Reprod. 2006 -vol. 21- № 1 - p. 3 - 21.

90. Hellani, A., Coskun, S., Tbakhi, A. et al. Clinical application of multiple displacement amplification in preimplantation genetic diagnosis / Hellani, A., Coskun, S., Tbakhi, A. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 3 - p. 376-380.

91. Horwitz, A., Tur- Kaspa, I., Lavin, C. et al. No increased birth defects in 576 live born babies after PGD / Horwitz, A., Tur- Kaspa, I., Lavin, C. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 16.

92. Hungerford, D.A. Leukocytes culture from small inocula of whole blood and preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl / Hungerford, D.A. // Stain. Technol. 1965 - № 40 - p. 333-338.

93. ISCN An international system for human cytogenetic nomenclature, Mitelman F. (ed); S. Karger, Basel 1995 - p. 5 -115.

94. Jacobs, P.A., Melville, M., Ratcliffe, S. et al. Cytogenetic survey of 11,680 newborn infants / Jacobs, P.A., Melville, M., Ratcliffe, S. // Ann. Hum. Genet. 1974 - vol. 37 - № 4 - p. 359-376.

95. Jezeguel, P. et al. Molecular scrining of gene CFTR by patology of vasdeferens:identification of three new mutatious / Jezeguel, P. // Mol. Hum. Reprod. 2000 - vol. 6 - № 12 - p. 1063-1067.

96. Jobling, M.A., Samara, V., Pandya, A., et al. Recurrent duplication and deletion polymorphisms on the long arm of the Y chromosome in normal males / Jobling, M.A., Samara, V., Pandya, A. // Hum. Mol. Genet. 1996 - vol. 5 -p. 1767-1775.

97. Johansson, S., Levkov, L., Fridstom, M. et al. Blastocyst development after embryo biopsy using the single needle method in PGD / Johansson, S., Levkov, L., Fridstom, M. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 17.

98. Joris, H., De Vos, A., Janssens, R. Comparison of the results of human embryo biopsy and outcome of PGD after zona drilling using acid Tyrode medium or a laser / Joris, H., De Vos, A., Janssens, R. // Hum. Reprod. 2003 -vol. 18 - № 9-p. 1896-1902.

99. Jun, J. H., Lim, C.K., Cho, J. W. et al. Aneuploidy of chromosomes related and unrelated translocations in embryos from reciprocal and Robertsonal translocates / Jun, J. H., Lim, C.K., Cho, J. W. // RBM Online 2005 - vol.10 -№2-p. 27.

100. Kahraman, S., Findikli, N., Berkil, H. et al. Results of preimplantation genetic diagnosis in patients with Klinefelter's syndrome / Kahraman, S., Findikli, N., Berkil, H. // Reprod. Biomed. Online 2003 - vol. 7 - № 3 - p. 346 - 352.

101. Kalakoutis G., Kuliev A., Rechitsky S. et al. Preimplantation diagnosis for ß thalassamia in Cyprus // Reprod. Biomed. Online - 2005 - vol. 10- p. 23.

102. Katagiri, Y., Neri, Q.V., Takeuchi, T. Y chromosome assessment and its implications for the development of ICSI children / Katagiri, Y., Neri, Q.V., Takeuchi, T. // Reprod. Biomed. Online 2004 - vol. 8- № 3 - p. 307 - 318.

103. Kim, S.W., Kim, K.D., Paick, J.S. Microdeletions within the azoospermia factor subregions of the Y chromosome in patients with idiopathic azoospermia / Kim, S.W., Kim, K.D., Paick, J.S. // Fertil. Steril. 1999 - vol. 72 - № 2 - p. 349 - 353.

104. Kligman, I., Benadiva, C., Alikani, M. et al. The presence of multinucleated blastomeres in human embryos is correlated with chromosomal abnormalities/ Kligman, I., Benadiva, C., Alikani, M. // Hum. Reprod. 1996 -vol. ll-№7-p. 1492- 1498.

105. Kokkali, G., Vrettou, C., Traeger-Synodinos, J. et al. Moving towards blastocyst biopsy: trophectoderm biopsy for PGD of ß-thalassaemia / Kokkali, G., Vrettou, C., Traeger-Synodinos, J. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 22.

106. Krause, W., Schierke, G. et al. HLA system and disorders of spermatogenesis / Krause, W., Schierke, G. // Hautarzt 1983 - vol. 34 - № 1 -p. 24-26.

107. Kuliev, A. Preimplantation diagnosis of thalassemias / Kuliev, A. // J. of Assisted Reproduction and Genetics 1998 - vol. 15 - № 5 - p. 219-225.

108. Kuliev, A., Rechitsky, S., Verlinsky, O. Preimplantation diagnosis and HLA typing for haemoglobin disorders / Kuliev, A., Rechitsky, S., Verlinsky, O. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 11 - № 3 - p. 362 - 370.

109. Latinen, T. et al. Foeto maternal compatibility in HLA-DR,- DQ., and-DP loci in Finnish conples suffering from recurrent spontaneons aborxions / Latinen, T. //European Y. of Jmmunogenetics - 1993 - vol. 20 - № 4 - p. 249258.

110. Lashwood, A., Kanabar, D., Braude, P. et al. Paediatric outcome from birth to 2 ears after PGD / Lashwood, A., Kanabar, D., Braude, P. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 19.

111. Lathi, R.B., Milki, A.A. Rate of aneuploidy in miscarriages following in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection / Lathi, R.B., Milki, A.A. // Fértil. Steril. 2004 - vol. 81 - № 5 - p. 1270 - 1272.

112. Lawler, S.D., Fisher, R. A, Dent, J. A prospective genetic study of complete and partial hydatidiform moles / Lawler, S.D., Fisher, R. A, Dent, J. // Am. J. Gynecol. 1991 - vol. 164 - № 5 - p. 1270-1277.

113. Le Lore, M., Tachdjiank G., Frydmank N. et al. Contribution of probes in preimplantation diagnosis of Robertsonian translocations / Le Lore, M., Tachdjiank G., Frydmank N. // Reprod Biomed Online 2005 - vol. 10. - № 2 -p. 28.

114. Lens, J.W., Rijnders, P.M. The embryo practice. Laboratory aspects of in-vitro fertilization / Lens, J.W., Rijnders, P.M. // The Niderlands / N.V. Organon, 1996 - p. 177-204.

115. Lidegaard, O., Pinborg, A., Andersen, A.N. Imprinting disorders after assisted reproductive technologies / Lidegaard, O., Pinborg, A., Andersen, A.N. // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2006 - vol. 18 - № 3 - p. 293 - 296.

116. Liu, J. et al. Polymerase chain reaction analysis of the cystic fibrosis DF 508 mutation in human blastomeres following oocyte injection of a single sperm from a carrier / Liu, J. // Prenatal Diagnosis 1993 - vol. 13 - p. 878 - 880.

117. Lledó, B., Ten, J., Galán, F.M. Preimplantation genetic diagnosis of Marfan syndrome using multiple displacement amplification / Lledó, B., Ten, J., Galán, F.M. // Fértil. Steril. 2006 - vol. 86 - № 4 - p. 949 - 955.

118. Lledó, B., Bernabeu, R., Ten, J. Preimplantation genetic diagnosis of X-linked adrenoleukodystrophy with gender determination using multiple displacement amplification / Lledó, B., Bernabeu, R., Ten, J. // Fértil. Steril. -2007 vol. 9 - p.34 - 36.

119. Loke, Y.W., King, A. Immunological aspects of human implantation / Loke, Y.W., King, A. // J. Reprod. Fértil. Suppl. 2000 - vol. 55 - p. 83 - 90.

120. Maher, E.R. Imprinting and assisted reproductive technology / Maher, E.R. // Hum. Mol. Genet. 2005 - vol. 15 - № 14 - p. 133 - 138.

121. Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A.P. Embryo aneuploidies / Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A.P. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 7.

122. Malcov, M., Naiman, T., Yosef, D.B. Preimplantation genetic diagnosis for fragile X syndrome using multiplex nested PCR / Malcov, M., Naiman, T., Yosef, D.B. // Reprod. Biomed. Online 2007 - vol. 14-№4-p. 515 - 521.

123. Martin, R.H. The risk of chromosomal abnormalities following ICSI / Martin, R.H. // Hum. Reprod. 1996 - vol. 10 - № 7 - p. 924 - 925.

124. Miura, H., Tsujimura, A. et al. Sisceptibility to idiopathic azoospermia in Japanes men is linked to HLA class I antigen / Miura, H., Tsujimura, A. // J. Urol. 1998 -vol. 56 № 6 - p. 1939- 1941.

125. Moncharmont, P., Bielsa, S. et al. HLA antigens and infertility with sperm autoantibodies in man / Moncharmont, P., Bielsa, S. // Tissue. Antigens. 1989 -№34 - p. 90 - 96.

126. Moutou, C., Gardes, N., Nicod, J.C. Strategies and outcomes of PGD of familial adenomatous polyposis / Moutou, C., Gardes, N., Nicod, J.C. // Mol. Hum. Reprod. 2007 - vol. 13 - № 2 - p. 95 - 101.

127. Muller, U., Lalande, M. A physical map of the human chromosome Y shot arm / Muller, U., Lalande, M. // Genomics 1990 - №7 - p. 517 - 523.

128. Munne, S., Cohen, J. Unsuitability of multinucleated human blastomeres for preimplantation genetic diagnosis / Munne, S., Cohen, J. // Hum. Reprod. -1993 vol. 8 - № 7 - p. 1120- 1125.

129. Munne, S., Sandalinas, M., Escudero, T. et al. Chromosome mosaicism in cleavage-stage human embryos: evidence of a maternal age effect / Munne, S., Sandalinas, M., Escudero, T. // Reprod. Biomed. Online 2002 - vol. 4 - № 3 -p 223 - 232.

130. Munne, S. Embryonic chromosome abnormalities / Munne, S. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 3.

131. Munne, S., Fischer, J., Warner, A. et al. Results of PGD for infertility in 3597 cycles / Munne, S,. Fischer, J, Warner, A. // RBM Online 2005 - vol. 10 -№2-p. 12.

132. Munne, S., Zheng, X., Colls, P. et al. Chromosome abnormalities in embryos and spermatozoa of TESE patients compared with controls / Munne, S., Zheng, X., Colls, P. // RBM Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 13.

133. Munne, S. Analysis of chromosome segregation during preimplantationgenetic diagnosis in both male and female translocation heterozygotes / Munne, S. //Cytogen. Genome Res. 2005 - vol. 111 - № 3-4 - p. 305-309.

134. Munne, S., Fischer, J., Warner, A. et al. Preimplantation genetic diagnosis significantly reduces pregnancy loss in infertile couples: a multicenter study / Munne, S, Fischer, J, Warner, A. // Fertil. Steril. 2006 - vol. 85 - №2 -p. 326-332.

135. Nicolaidis, P., Petersen, M. Origin and mechanisms of non-disjunction in human autosomal trisomies / Nicolaidis, P., Petersen, M. // Hum Reprod. -1998 vol. 13 - №2 - p. 313-319.

136. Ninkovic, M. Soon to be a geriatric problem / Ninkovic, M. // Abstr. 25th Cong. ECFS 2002 - S 12.4. - p. 322.

137. Nielsen, J., Wohlert, M. Chromosome abnormalities among 34 910 newborn children: results from a 13-year incidence study in Arthus, Denmark / Nielsen, J., Wohlert, M. // Hum. Gen. 1991 - vol. 87 - №1 - p. 81-83.

138. Ohama, K., Ueda, K, Okamoto, E. et al. Cytogenetic and clinicopathologic studies of partial moles / Ohama, K., Ueda, K., Okamoto, E. // Obstet. Gynecol. 1986 - vol. 68 - № 2 - p. 259-262.

139. Okada, H., Yoshimura, K., Fujioka, H. et al. Assisted reproduction technology for patients with congenital bilateral absence of vas deferens / Okada, H., Yoshimura, K., Fujioka, H. // J. Urol. 1999 - vol. 162 - № 4 - p. 1391.

140. Oliver-Bonet, M., Navarro, J., Codina-Pascual, M. et al. From spermatocytes to sperm: meiotic behaviour of human male reciprocal translocations / Oliver-Bonet, M., Navarro, J., Codina-Pascual, M. // Hum.

141. Reprod. 2004 - vol. 19 - № 11 - p. 2515-2522.

142. Paoloni-Giacobino, A., Chaille,t J.R. Genomic imprinting and assisted reproduction / Paoloni-Giacobino, A., Chaillet, J.R. // Reprod. Health. 2004 -vol. 26 - № 1 -p. 1-6.

143. Parriego, M., Sole, M., Vidal, F. et al. Cytogenetic analysis of blastocysts derived from multinucleated embryos / Parriego, M., Sole, M., Vidal, F. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 20.

144. Plachot, M. Chromosome analysis of spontaneous abortions after IVF. A European survey / Plachot, M. // Hum. Reprod. 1989 - vol. 4 - № 4 - p. 425 -429.

145. Pujol, A., Benet, J., Staessen, C. et al. The importance of aneuploidy screening in reciprocal translocation carriers / Pujol, A., Benet, J., Staessen, C. // Reproduction-2006-№ 131 p. 1025-1035.

146. Rechitsky, S. et al. Allele Dropout in polar bodies and blastomeres / Rechitsky, S. // J. of Assisted Reproduction and Genetics 1998 - vol. 15 - № 5 -p. 253 -257.

147. Rechitsky, S., Kuliev, A., Sharapova, T. et al. Preimplantation HLA typing with aneuploidy / Rechitsky, S., Kuliev, A., Sharapova, T. / Reprod. Biomed. Online 2006 - vol. 12 - № 1 - p. 89-100.

148. Ren, Z., Zhou, C., Xu, Y. Mutation and haplotype analysis for Duchenne muscular dystrophy by single cell multiple displacement amplification / Ren, Z., Zhou, C., Xu, Y. // Mol. Hum. Reprod. 2007 - vol. 13 - № 6 - p.431 -436.

149. Reubinoff, B. et al. Intracytoplasmic sperm injection combined with preimplantation genetic diagnosis for the prevention of recurrent gestational trophoblastic disease / Reubinoff, B. // Hum. Reprod. 1997 - vol. 12 - № 4 -p. 805-808.

150. Robert, F., Rollet, J., Lapray, J.F. et al. Agenesis of the vas deferens in male infertility. A tentative classification based on 39 cases / Robert, F., Rollet, J, Lapray, J.F. // Press. Med. 1999 - vol. 23 - № 28 (3) - p. 116 - 121.

151. Roberts, C., Franklin, S. Experiencing new forms of genetic choice: findings from an ethnographic study of preimplantation genetic diagnosis /

152. Roberts, C., Franklin, S. // Hum. Fértil. (Camb). 2004 - vol. 7 - № 4 - p. 285 -293.

153. Roux, C., Tripogney, C., Morel, F. et al. Segregation of chromosomes in sperm of Robertsonian translocation carriers / Roux, C., Tripogney, C., Morel, F. // Cytogenet Genome Res. 2005 - vol. Ill - №3-4 - p. 291-296.

154. Rubio, C., Pehlivan, T., Rodrigo, L. et al. Embryo aneuploidy screening for unexplained recurrent miscarriage: a minireview / Rubio, C., Pehlivan, T., Rodrigo, L. //Am. J. Reprod. Immunol. 2005 - vol. 53 - № 4 - p. 159 - 165.

155. Rubio, C., Rodrigo, L., Mercader, A. et al. Impact of chromosomal abnormalities on preimplantation embryo development / Rubio, C., Rodrigo, L., Mercader, A. // Prenat. Diagn. 2007 - vol. 4 - № 27(8) - p. 748-756.

156. Saiki, R. et al. Enzymatic amplification of (3- globin genetic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia / Saiki, R. // Science -1985-vol. 230-p. 1350- 1354.

157. Seabright, M. //Lancet -1971 vol. 2 - p. 971 - 972.

158. Senger, D., Mervant, H. et. al. Tissue Antigens / Senger, D., Mervant, H. // 1983 vol.21 - № 4 - p. 345-347.

159. Silber, S., Escudero, T., Lenahan, K. et al. Chromosomal abnormalities in embryos derived from testicular sperm extraction / Silber, S., Escudero, T., Lenahan, K. // Fertil. Steril. 2003 - vol. 79 - № 1 -p. 30-38.

160. Skaletsky, H., Kuroda-Kawaguchi, T., Minx, PJ. et al. The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes / Skaletsky, H., Kuroda-Kawaguchi, T., Minx, P.J. // Nature 2003 - vol. 423. -p. 825-837.

161. Spandorfer, S.D., Davis, O.K., Barmat, L.I. et al. Relationship between maternal age and aneuploidy in in vitro fertilization pregnancy loss / Spandorfer, S.D., Davis, O.K., Barmat, L.I. // Fertil. Steril. 2004 - vol. 81 - № 5 - p. 1265 - 1269.

162. Staessen, C. et al. Clinical experience of sex determination by fluorescent in- situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis / Staessen, C. // Molecular Hum. Reprod. 1999 - vol. 5 - № 4 - p. 382 - 389.

163. Staessen, C., Tournaye, H., Van Assche, E. et al. PGD in 47,XXY Klinefelter's syndrome patients / Staessen, C., Tournaye, H., Van Assche, E. // Hum. Reprod. Update 2003 - vol. 9 - № 4 - p. 319 - 330.

164. Steffann, J., Gigarel, N., Frydman, N. et al. Preimplantation diagnosis of the NARP mitochondrial DNA mutation / Steffann, J., Gigarel, N., Frydman, N. // Reprod Biomed Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 9.

165. Stern, C., Pertile, M., Norris, H. et al. Chromosome translocation in couples with in- vitro fertilization implantation failure / Stern, C., Pertile, M., Norris, H. // Hum. Reprod. 1999 - vol. 14 - № 8 - p. 2097-2101.

166. Sun, C., Skaletsky, H., Rozen, S. et al. Deletion of azoospermia factor a (AZFa) region of human Y chromosome caused by recombination between HERV15 proviruses / Sun, C., Skaletsky, H., Rozen, S. // Hum. Mol. Genet. -2000-vol. 9-p. 2291-2296.

167. Sutcliffe, A.G., Peters, C.J., Bowdin, S. et al. Assisted reproductive therapies and imprinting disorders~a preliminary British survey / Sutcliffe, A.G., Peters, C.J., Bowdin, S. // Hum. Reprod. 2006 - vol. 21 - № 4 - p. 1009 -1011.

168. Suzuki, Y., Sasagawa, I., Tateno, T. Absence of microdeletions in the Y chromosome in patients with Prader-Willi syndrome with cryptorchidism / Suzuki, Y., Sasagawa, I., Tateno, T. // Int. J. Androl. 2002 - vol. 25 - №1 - p. 5.

169. Szulman, A.E., Philippe, E, Boue, J. G. et al. Human triploidy: association with partial hydatiform moles and nonmolar conceptuses / Szulman, A.E., Philippe, E, Boue, J. G. // Hum. Pathol. 1981 - vol. 12 - № 11 - p. 1016-1021.

170. Testart, J., Gautier, E., Brami, C. et al. Intracytoplasmic sperm injection in infertile Patients with structural chromosome abnormalities / Testart, J., Gautier, E., Brami, C. // Hum. Reprod. 1996 - vol. 11 - № 12 - p. 2609-2612.

171. Thompson, M. Genetics in medicine / Thompson, M. // Sauders. Philadelphia 1991- p. 47-52.

172. Thompson, J.R., Williams, C.J. Genomic imprinting and assisted reproductive technology: connections and potential risks / Thompson, J.R., Williams, C.J. // Semin. Reprod. Med. 2005 - vol. 23 - № 3 - p. 285 - 295.

173. Tiepolo, L., Zuffardi, O. Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of human Y chromosome long arm / Tiepolo, L., Zuffardi, O. // Hum. Genet. 1976 - vol. 34 - p. 119 - 124.

174. Tkachuk, D. et al. Clinical applications of fluorescence in situ hybridization / Tkachuk, D. // Genet. Anal. Tech. Appl. 1991 - vol. 8 - p. 6774.

175. Traeger-Synodinos, J., Vrettou, C., Tzetis, M. et al. Six years of PGD for (3- haemoglobinopathies and cystic fibrosis in Greece / Traeger-Synodinos, J., Vrettou, C., Tzetis, M. // Reprod. Biomed. Online 2005 - vol. 10 - № 2 - p. 23.

176. Tsui, L.C. The spectrum of cystic fibrosis mutation / Tsui, L.C. // Trends Genet. 1992 - vol.8 - p.392-398.

177. Van Sterteghem, A., Bonduelle, M. Follow-up of children conceived by ICSI / Van Sterteghem, A., Bonduelle, M. // Abstract book of the 10th Word Congress of In-vitro Fertilization and Assisted Reproduction, Vancouver, B.C. -Canada. 1997 - p.20.

178. Verlinsky, Y. et al. Preimplantation diagnosis of single gene disorder by two- step oocyte genetic analysis using first and second polar body / Verlinsky, Y. // Biochem. Mol. Med. 1997 - vol. 62 - p. 182 - 187.

179. Velilla, E., Escudero, T., Munne, S. / Velilla, E., Escudero, T., Munne, S. // RBM Online 2002 - vol. 4 - № 3 - p. 210-217.

180. Verlinsky, Y., Cieslak, J., Evsicov, S. et al. Nuclear transfer for full karyotyping and preimplantation diagnosis for translocations / Verlinsky, Y., Cieslak, J., Evsicov, S. // RBM Online. 2002 - №5 - p. 300-305.

181. Verlinsky, Y., Rechitsky, S., Sharapova, T. et al. Preimplantation diagnosis for immunodeficiencies / Verlinsky, Y., Rechitsky, S., Sharapova, T. // Reprod. Biomed. Online 2007 - vol. 14 - № 2 - p. 214 - 223.

182. Vogt, P.H., Edelmann, A., Kirsch, S. et al. Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subregions in Yql 1 / Vogt, P.H.,

183. Edelmann, A., Kirsch, S. // Hum. Molec. Genet. 1996 - vol. 5 - №7 - p. 933 -943.

184. Wang, J.Y., Samura, O., Zhen, D.K. et al. Fluorescence in- situ hybridization analis of chromosomal constitution in spermatozoa from a mosaic 47,XXY/46,XY male / Wang, J.Y, Samura, O., Zhen, D.K. // Mol. Hum. Reprod. 2000 - vol. 6 - № 7 - p. 665-668.

185. Welsh, M.J., Smith, A.E. Molecular mechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis / Welsh, M.J., Smith, A.E. // Cell 1993 -vol. 2-p. 1252-1254.

186. Wennerholm, U. B., Bergh, C., Hamberger, L. Obstetric outcome of pregnancies following ICSI, classified according to sperm origin and quality / Wennerholm, U. B., Bergh, C., Hamberger, L. // Hum. Reprod. 2000 - vol. 15- №5-p. 1189-1194.

187. Wiland, E., Jarmumz, M., Kurpisz, M. Segregation of the marker chromosome der(20) in the sperm of a male with karyotype 46,XY961./ 47,XY+mar[4] / Wiland, E., Jarmumz, M., Kurpisz, M. // Med. Sci. Monit. -2005-vol. 11 -№3-p. 9- 15.

188. Witt, M. Chronic pancreatitis and cystic fibrosis / Witt, M. // Gut. 2003 -Suppl.2-p.1131 - 1141.

189. Zenzes, M.T., Wolf, U., Engel, W. Organization in vitro of ovarian cells in testicular structures / Zenzes, M.T., Wolf, U., Engel, W. // Hum. Genet. -1978 -№44-p. 333 338.

Информация о работе

Глинкина, Жанна Ивановна
доктора биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Диагностика и профилактика врожденных и наследственных заболеваний при вспомогательных репродуктивных технологиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы