Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование и молекулярный анализ последовательности альфоидной ДНК из прицентромерного района хромосомы 21 человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование и молекулярный анализ последовательности альфоидной ДНК из прицентромерного района хромосомы 21 человека"

РГ8 ОД

1 2 \|]р }ь<113и"ская ^кадемия медицинских наук Медико-генетический научный центр

На правах рукописи

РОМАНОВА Лариса Юрьевна

УДК 575.113

картирование и молекулярный анализ

последовательностей альфоидной днк из прицентромерного района хромосомы 21 человека

03.00.15 — генетика

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993

Работа выполнена в лаборатории цитогенетики НЦПЗ РАМН.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор биологических наук ЮРОВ Ю. Б.

доктор биологических наук КАЛИНИН В. Н., КАНА биологических наук ПРОСНЯК М. И.

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельга.рдта РАМН

Защита состоится « » . . . . 1993 г. в... ч.... мин. на заседании специализированного совета Д. 001.16.01 при Медико-генетическом научном центре РАМН (Москва, 115478, Москворечье, 1).

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан « »..... 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

Актуальность

Картирование хромосом является одной из наиболее_актуальных и ~ сложных задач_современной молекулярной биологии и генетики человека. Детальное картирование повторяющихся последовательностей ДНК, Формирующих районы прииентромерного гетерохроматина хромосом человека, юэволит, вероятно, более детально описать их молекулярную структуру, исследовать особенность эволюпии и приблизиться к понинанию Функций, до сих пор не известных.

АльФа-сателлитная ДНК представлена иерархически организованными ювторами с элементарной повторяющейся единицей длиной 171 н.п. Вторым структурным уровнем организации альФоидной ДНК являются, так называемые "предковые повторы", которые различаются по нуклеотидной юследовательности и характеру чередования входящих в.них мономеров. : настоящему времени описано три способа организация элементарных 1льфоидных мономеров (Табл.1). Первые два представлены регулярно ¡ередуюшимися мономерами по типу -Л-зг- и -01-02-, третий ииеет ;ентамерную организацию по типу (УШагй, иауе.

987; А1ехапс1гоу е1 а!., 1989). Родственные хромосомо-спеииФичные арианты объединяются, соответственно, в три надхромосомные семей-тва. Каждое семейство локализовано только на группе хромосом А1ехап<1го7 е! а!.. 1989).

аблипа 1. Организация надхромосомных семейств альФоидной ДНК человека

М1ХР0М0С0МН0Е СЕНЕИСТВО ХРОМОСОМЫ ТИПЫ МОНОМЕРОВ ПРЕДКОВЫИ ПОВТОР

1 1, 3, 5, б. 7, 10. 12. 16. 19. л, аг ДИЛЕР -л-ж-

2 2, 4, 8, 9, 13, 14, 15, 18. 20, 21, 22. т. ъг ДИИЕР -01-02-

3 1.11. 17, X. ПЕНТАНЕР

По классификации Уауе апс! УИ1агс1 (1987а), А1ехап<1гоУ ег а1. > (1988. 1991).

Третьим уровней организации альФоидных повторов является пов торяюшаяся единица высокого порядка, которая представляет собой с мент предковой альфа-сателлитной последовательности, подвергшейся последней амплификации в ходе эволюции данного альФоидного домена Специфичность семейств альфа-сателлитной ДНК определяется уникалы структурой повторявшейся единицы высокого порядка.

Исследования последовательностей альфа-сателлитных ДНК. форм; руюших прииентромерный гетерохроматин хромосомы 21. показали, что данном районе генома имеется, по-крайней мере, два альФоидных доме на. различных по молекулярной организации входящих в них альФа-сателлитных ДНК (ЮеУНее ег а1. . 19бб; №ов и др. . 1987; сьоо ег а1.. 1990). Однако исследование данного гетерохроматинового участк основывалось на изучении небольших, клонированных в плазмидных век торах. Фрагментов альфоидной ДНК человека. К сожалению, такие мето не позволяют составить достаточно полное представление об организа ции данного района.

Методы клонирования ДНК в космидных и дрожжевых (УАСэ) векторах, разработанные в последние годы, позволяют выделить и исследовать гигантские Фрагненты ДНК размером от 40 до 400 т. н. п. Одий'из таких подходов был использован в данной работе для анализа альФа-сателлитных последовательностей ДНК хромосомы 21 человека.

Цель и задачи исследования

Цель диссертационного исследования состояла в картировании, а также в анализе первичной структуры клонированных в космидном векторе альФа-сателлитных ДНК из прицентромерного района хромосомы 21 человека.

Для достижения этой цели решались следующие экспериментальные задачи:

1. Из специфичной'для хромосомы 21 человека космидной библиотеки выявить клоны, содержащие наряду с альФа-сателлитными ДНК повторяющиеся последовательности неальфоидной природы.

2. Определить последовательность нуклеотидов различных последовательностей ДНК. входящих в состав клонированного в космидном векторе геномного Фрагмента. Построить рестриктную карту фрагмента, содержащего область контакта альФоидных и неальФоидных последовательностей ДНК.

3. Картировать клонированные последовательности ДНК на хромосомах человека с использованием панели соматических гибридов.

- г -

4. Провести анализ первичной структуры.альфоидных последова-ельностей ДНК космианого клона и установить их принадлежность к

Ромосомо-спеииФичным и надхромосомным альФоидным семействам.

_____________ -Научная новизна и практическое значение работы

В данной работе впервые выявлен и охарактеризован клониро-анный в космидном векторе геномный Фрагмент ДНК. размером 40 . н. п. , содержащий наряду с последовательностями альФоидной ДНК дис-эргированные повторы Alu- и Kpn-сенейств. Указанный геномный Фраг-гнт также содержит не описанные ранее повторяющиеся последователь-эсти ДНК, присутствующие только в акроцентрических хромосомах чело-гка.

Показано, что выявленные в данной работе альФа-сателлИтные пос-гдовательности отличны от ранее описанных по первичной структуре и юсобу организации альФоидных мономеров.

В результате настоящей работы были охарактеризованы два новых юсоба организации последовательностей альФоидной ДНК. что позволи-) существенно расширить представления о структуре аЛьФа-сателлитных Ж. Клонированные последовательности альФоидной ДНК могут быть ис->льзованы в качестве молекулярных маркеров при картировании хромо-ж человека и в медико-генетической диагностике.

В работе показано, что все разнообразие альФа-сателлитных пос-;довательностей хромосом человека можно объяснить комбинацией двух шов мономеров, содержащих и не содержащих сайты связывания с иен-юмерным ядерным белком CENP-B, принимающим участие в Функциониро-1нии центромеры. Последовательности каждого надхромосомного семей--ва имеют определенное распределение сайтов связывания с данным

'лком.

Апробапия

Результаты работы были представлены на 11 конференции "Генетика ловека и патология" (Томск. 1992). на VI съезде ОГИС им. Н. И. Бажова (Минск. 1992), на 4-ой конференции "Геном человека-93", (Чер-головка, 1993), на научном семинаре лаборатории иитогенетики НШ13 . ЛН (1992). а также на межлабораторном семинаре ВНГНИ РАИН (1993).

ОУбликапии

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

структура и объем работы диссертация состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включаюшей описание материалов и методов, а так* результатов с обсуждением. Список литературы состоит из 99 работ, в тон числе а отечественных.

Ii

Полояевия, выдвигаемые ва зашиту 1. в составе геномного фрагмента ДНК. размером около 40 т. н. п наряду с альФа-сателлитными последовательностями хромосомы 21 чело века, имеются повторяющиеся последовательности неальфоидной природ г. Обнаружены два новых способа организации альФоидных мономе ров, отличающиеся от описанных ранее нуклеотидной последовательностью и характером чередования альФоидных мономеров. Последовател ности. организованные этими способами, принадлежат к двум новым на хромосомным семействам альфоидной ДНК.

3. Разнообразие хромосом-спеыифичных семейств альФоидных ДНК связано с комбинированием мономеров двух типов - содержащих и не содержащих сайты связывания с пентромерным ядерным белком CENF-B.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы Для изоляции космидного клона использована космидная библиоте ка, специфичная для хромосомы 21 человека, предоставленная д. Харди (St.Mary's Medical School, England). Также в работе была использована панель Фирмы BIOS, содержащая гидролизаты тотальной ДНК человека и китайского хомячка. Картирование космидного клона проводили с помощью анализа панели гибридов соматических клеток, содержащих отдельные хромосомы человека, которая предоставлена специально .для этой цели Е. Джабс (Johns HopKlns University, USA).

В работе был использован полученный в нашей лаборатории аль-фоидный клон alhpaR1-6. специфичный для хромосом 13 и 21. В качест) Alu- и Крп-зондов были использованы клонированные последовательное PHS35 И PHS94. '

Все нанипуляпии с ДНК (выделение плазмидной и высокомолекулярной ДНК, обработку ДНК рестрикиионными эндонуклеазами, электроФоре-тическое Фракционирование фрагментов ДНК. мечение препаратов ДНК радиактивнын фосфором, гибридизацию колоний) проводили в соответствии с протоколами, приведенными в руководстве Maniatis et al. (19в9)

Полимераэную цепную реакцию проводили с использованием стандартного набора реактивов и по протоколам Фирмы PerKin Elmer 'USA)

Нуклрптилныр последовательности гУ'КЛОниР'щаннн* фрагментов ^п-зеделяли по методу Онгера, используя набор, стандартных р^нтибоп и 1ротоколы_К/КТ — Se<Tuertc tne_Systems.

Для анализа последовательностей использовали пакет программ, разработанный специально для этой пели л. И. Медведевым и И. А. тюмене-зои.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Скрининг космидвой библиотеки и отбор реконбинантши клонов

Для отбора клонов, содержащих области контакта ДНК альФоидной и шальФоидной природы, была использована космидная библиотека. Библи->тека сконструирована на основе вектора Lorlst6. в который клониро-¡аны частично гидролизованные по сайту HlndlII рестрикиионной эндо-¡уклеазы Фрагменты соматического гибрида WA17, содержащего на Фоне юлного набора хромосом китайского хомячка хромосому 21 человека. :крининг библиотеки проводился путем последовательной гибридизации с [льфоидным зондом alPhaRl-б, а также зондами PHS35 и PHS94. Один из слонов интенсивно гибридизовался со всеми зондами. Он был взят для [альнейшего исследования.

Доказательство нехимервой природы геномного фрагневта, клонируемого в коснидный вектор 1. При блот-гибридизации панели, содержащей гидролиэаты тоталь-ой ДНК человека и китайского хомячка с космидным клоном, гибршшза-ия наблюдалась только с гидролизатами тотальной ДНК человека. Это озволяет исключить наличие дик китайского хомячка в исследуемом еномном Фрагменте.

г. Присутствие повторяющихся последовательностей различных лассов в клонируемом в космидном векторе Фрагменте может, либо от-ажать их естественную комбинацию в геноме, либо быть результатом лучайного соединения двух фрагментов. При этом один из Фрагментов одержит альфоидные ДНК. другой - повторяющиеся последовательности еальФоидной природы.

В дальнейшем была проведена последовательная блот-гибридизация indiП-перевала коснидного клона с ранее описанными зондами, содер-ашими альфоидные, Alu- и Крп-повторы. HindiII-перевар содержит 8

Фрагментов. Фрагмент 5.1 т. н.п. соответствует космидному вектору Loristö. С фрагментом размером 5, б т. н. п. гибридизуются зонды, сс дер*ашие Alu-, Крп- и аяьФоидные повторы.

Так как Фрагмент, содержащий все три класса повторов, не соде жит внутри себя HindiII сайта, то< вероятно, он отражает естестве ную комбинацию повторяющихся последовательностей в геноме и не яв ется химерным.

Субкловирование и анализ состава Фрагментов коснидвого клона Далее проводили субклонирование фрагментов космидной ДНК по сайту рестриктазу EcoRl, а также анализ состава каждого фрагмента методами гибридизации с вышеперечисленными зондами и с помощь» ан; лиза нуклеотидных последовательностей. Размер клонированного в koi мидном векторе Фрагмента составляет 45 т. н. п. Нуклеотидная послед< вательность субклонированных Фрагментов определена на протяжении < т.н.п. фрагменты альФоидных субклонов А+. Е159-2, A3, Ра17 помете! в базу данных EHBL поя номерами Z12004, Z12005. Zl200e, Z1201ч сос тветственно. EcoRI-перевар содержит lö Фрагментов размером от 11 т. н. п. до 170 н. п.

Субклон AI соответствует EcoRI-фрагменту космиды размером пр* близительно 11 т. н.п. По данным блот-гибридизаиионного анализа он содержит последовательности альфошшой ДНК, а также повторы Alu- и Kpn-сенейств. Данный субклон повторно субклонирован по сайту Xbal рестрикпионной эндонуклеазы. наибольший Фрагмент Ai-Xbai (б т. н. п. - по сайту Pstl эндонуклеазы. На рисунке 1 представлен порядок рас положения сайтов и соответствующих им субклонов внутри AI фрагмент а также стратегия секвенирования. относительные размеры просеквени рованных фрагментов и предположительная структура субклона AI.

нуклеотидная последовательность субклона AI с "левого" края определена полностью в области субклонов El-59-5, E1-S9-1 и Е1-59-Al-PStl (870 Н. п. ) и Ai-Pstl (510 Н. п. ). СУбКЛОН А+ (1,7Т. Н. п.) частично секвенирован с двух концов. Отсутствие шмера при блот-гиб ршшэашш гидролизатов тотальной ДНК человека с субклоном А+ позволяет заключить, что он не содержит диспергированных повторов. Субклон AI-PstI (4,5 т. н. п. ), находящийся в центре AI Фрагмента. так> секвенирован частично с двух сторон. Субклонированные Фрагменты "левой" части субклона AI, включая прилежашую область AI Pstl 4,5 т. н. п.. по крайней мере на протяжении 4 - 4, 5 т. н. п., имеют гомологию с последовательностью альФа-сателлитной ДНК.

- б -

XXX Н-1-1-

ö > . А + <1.7)

А 1 P s t < 1 . 0 >

E159-3<0,:63>

E 1 59 - 5 ( 0 . 3 4 ) А 1 P s t < 0 . 6 )

e 1 5 9 - а < 1 | , 7 >

£ 1 5 9 - 1 ( 0,3 4 )

E159-S( 0 , 51 )

AlPst(4.5)

с ) .

alpha, satelllte

ГГ7-;

Kpn- Alu-

РИС. 1 Субклон AI. a>. ПослевоЬотельность рестрикционных саитоЬ.Е, X, P - EcoRI» Xbal и Pst! рестрикционные энйонуклеазы соответственно. Стратегия секбенироЬамия и относительные — • • размеры просекЬенироЬанных фрагментов показаны стрелками, б). Наименование и размеры I' субклонироЬанных фрагментов AI. с). Пребполагавмая схема организации послеЭоЬателыностея

• субклона AI. •

с "правого" края субклона А1 первичная структура определена пс ностью в области субклона Е1-59-3. СУбклон Е1-59-4 секвенирован чг тично с двух сторон. От "правой" границы субклона А1 на протяженш 184 н. п. . наблюдается гомология 81И с участком (423-607 н. п.) уср« ненной А1ц-последовательности. К этому району примыкает область, имеюшая гомологию с участком 3651 - 4500 н. п. Крп-повтора в состаЕ ЬэП последовательности, в районе, гомологичном Крп-повтору, обнаружена 79-нуклеотидная деления Фрагмента, соответствуешего 37713850 н.п. ЬзП последовательности. Так как Крп-1 повтор имеет длин порядка б т. н. п. . вероятно, он продолжается вглубь субклона Е-1-59 и непосредственно контактирует с последовательностью, расположенно с противоположного края данного субклона. Эта же последовательност располагаеся в прилегающей области субклона А1-ХЬа (6,0 т. н. п. ).

При анализе первичной структуры рассматриваемой последователь ности было обнаружено, что она не имеет гомологии с известными пос ледовательностями приматов, внесенными в базу данных ЕМВЬ на 1991 год (выпуск 29).

Картирование космидного клона Для картирования космидного клона к данной последовательности были сконструированы праймеры и проведен анализ ее распределения в соматических гибридах, содержащих на Фоне полного набора хромосом китайского хомячка или мыши одну из хромосом человека. Анализ проводили с помошью полимеразной цепной реакции, фрагмент расчитанноп размера 310 н. п. амплиФицируется только в клеточных линиях, содержащих акроиентрические хромосомы 13, 14, ,15. 21, 22, а также в лиш клеток человека 1Шг91.

В результате проведенных экспериментов можно заключить, что обнаруженный нами космидный клон содержит Фрагмент ДНК. принадлежащий одной из акроцентрических хромосом человека, и (так как кос-мидная библиотека специфична для хромосомы 21 человека) наиболее вероятно, хроносоме 21.

Присутствие данного Фрагмента во всех акроцентрических хромосомах позволяет предположить повторяющуюся природу "неидентифи-цированной" последовательности. Указанные последовательности могут быть типичны либо для эухроматиновых, либо гетерохроматиновых районов акроцентрических хромосом. Если такие последовательности локализованы вне центромер акроцентрических хромосон человека, присутствие их в центронерной области хромосомы 21 человека может быть

связано с инсерциеи геномного Фрагмента из области эухроматина в альфоидннй домен хромосомы 21 человека.

Если "неидентиФииированная" последовательность-типична для-цен-~~' —тромерной области акроцентрических хромосом, она представляет интерес по следуюшим причинам. В ранее опубликованных работах (Willard, 19901 было предложено три теоретически возможных модели организации пентромерной области эукариотических хромосом. Одна из них предполагает существование в центромерных последовательностях регулярно следующих сайтов связывания с ядерными белками, принимающими участие в функционировании центромеры. При этом сайты могут Формироваться участками встроенных в данную последовательность повторов, однако до сих пор не было найдено повторяющихся последовательностей ДНК, встроенных достаточно регулярно в пентромерные последовательности сателлитной ДНК. Поэтому большой интерес представляет дальнейшее изучение распространил "неидентифипированной" последовательности в геноме, в частности, определение ее копийности и локализации в отдельных акроиентрических хромосонах.

Анализ альфоидных субклонов коснидного клона

Гибридизацию in situ субклонированных альфоидных последовательностей проводили в условиях, допускающих перекрестную гибридизацию различных хромосом-спепиФичных вариантов в пределах одного над-хромосомного семейства. Результаты гибридизации позволяют заключить, что сходные варианты альФа-сателлитных ДНК присутствуют во всех акроиентрических хромосомах, в том числе в хромосоме 21 человека.

АльФоидные субклоны космидного клона отличаются от всех клонированных ранее альФоидных последовательностей-хромосомы 21 по первичной структуре.

Анализ альФоидной части космидного клона проводили по всем трем уровням организации последовательностей альФоидной ДНК.

Анализ третьго уровня органиэапии альФа-сателлитных ДНК -повторявшейся единицы высокого порядка

Специфичность различных семейств альфа-сателлитной ДНК определяется уникальной структурой повторяющейся единицы высокого порядка. Описание амплификаиионной единицы данного альФоидного домена включает в себя опенку размера последней, определение выявляющей ее рестрикиионной эндонуклеаэы и характеристику степени различия между двумя амплификанионными единицами, которая обычно составляет 1-2*.

Мы попытались выявить повторяющуюся единицу высокого порядка с помошыо метода блот-гибридизации различных гидролизатов тотальной ДНК человека с альфоидными субклонами космидного клона. При этом пр гидролизе тотально'й ДНК Xbal и Rsal рестриктазами выявлялась мажорная полоса размером 1.2, т. н. п., которая могла соответствовать повто ряюшейся единице высокого, порядка.

Однако в пределах космидного клона секвенировано более 30 аль-Фоидных мономеров обшей длиной более 5 т. н. п. При этом только два субклона содержат по паре мономеров, отличающихся друг от друга на

ъ

t-гх и. по-видимомУ| принадлежат соответствующим участкам двух различных амплиФикаиионных единиц. Это не согласуется с оценкой размер повторяющейся единицы высокого порядка, полученной с помощью гибри-дизационных методов.

Возможным объяснением получненных результатов явилось следующее. На блот-гисридизаиионнои картине наблюдается гибридизация с последовательностями аль+омднои ДНК. высоко гомологичными имеющимся в космидном клоне. При этом указанные последовательности могут формировать свой домен с аиплификаиионнои единииеи 1.2 т. н п. . наиболее вероятно, на одной из акроиентрических хромосом. Такую организацию может иметь альФоидныи домен, краевые участки которого представлены последовательностями космидного клона.

В пределах космидного клона, то есть на границе последовательностей ДНК альФоидной и неальФоидной природы, как предполагается по модели Smith (1976), регулярная структура альФа-сателлитной ДНК может быть нарушена. Амплификационные единицы, если таковые имеются в данном районе, могут значительно отличаться друг от друга, вследствие чего не выявляться с помощью гибридизаиионных методов.

Амплификаиионная единица также может не выявляться с помощью указанного метода из-за значительного размера, превышающего разрешающую способность электрофореза или из-за низкои копийности ампли-Фшшрованного фрагмента. Поэтому для достаточно полного описания структуры последовательностей альФоидных ДНК, клонированных в космидном векторе, вероятно, требуется составление полной рестриктной карты космидного клона.

Установление принадлежности последовательностей альфоидных космшшых субкловов к надхромосоннын семействам Выделение новых вадхромосонных семейств

Анализ второго уровня организации альФа-сателлитйых днк космидного клона проводили следующим образом. Последовательность разбивали

- 10 -

!а мономеры. Каждый мономер сравнивали с девятью типами' альФойЯнйх юномеров трех известных надхромосомных семейств. Критериями принад-1ежности к надхромосомному семейству служили достоверно большее — :ходство мономера только с одним консенсусом, а также чередование юномеров, характерное для данного надхромосомного семейства.

В левой части таблицы 2 под номерами 18-гб приведены показа-ели дивергенции мономеров космипного клона с девятью консенсусныни юследовательностями (колонки Л. Jг, 01. 02 и VI-У5) трех надхромо-омных семейств. Каждый исследуемый мономер наиболее близок сразу к ;вум типам мономеров 02 и У4. которые являются структурными композитами двух различных надхромосомных семейств. В пределах анализи-■умой последовательности, следовательно, не наблюдается чередования ономеров. характерного ни для 2-го, ни для 3-го надхромосомных се-ейств. Таким образом. альФоидные последовательности космидноГо кло-а не удалось отнести к одному из ранее охарактеризованных надх1>омо-омных семейств. Поэтому они были объединены с группой ранее проана-изированных в нашей лаборатории последовательностей, также не соот-етствуюших вышеприведенным критериям, список последовательностей анной группы приведен в т;аблиае 3.

аблииа 3. Последовательности, не принадлежащие ранее охарактеризованным надхромосомным семействам.

Клон Число Хромосома Ссылки

МОН^Мйрпв

У736 14 И-11) Y Trier-Smith and Brown. 1987

гг/1 Л 1 И-1Т) г г McDermit et al. 1966

м \г < 19-гл> 21

:21 5 (27-31) Jones and Potterl983

\7 3 (32-34) - Potter and Jones 1983

/АН8- •37 5 (35-39) 13, 14, 15, 21, 22

1GB7* 16 (1'-1б") 7 ware et al. 198T

32Н 10 (17--гб'; 1 14 Mitchell et al. 1965

гтг- 45 5 (27'-31'! 1 5, 19

U6 3 (32'-34': 1 5, 19 Hulsebos et al. 1988

В скобках приведен порядок мономеров согласно таблиае 2. порядок шомеров гс группы также сохраняется в табл.5.

- И -

Таблица 2 Сравнение нономероЬ раное tie клаесифицироЬанных послеЭоЬательностеи с 12 консемсусными мономерами нити наЗхропосопнмх сеивястЬ.

J1 J2 D1 1)2 W1 V2 V3 V4 WS M RI R2

M

1 19 27 19 1? 23 ?A ZZ Jß. 24 1/ 17 14

2 21 26 21 J5 22 24 22 12. 20 t 14 12

3 19 25 22 1Z 25 24 24 1& 21 13 17 13

4 23 27 21 12 25 26 23 Ц 24 13 18 15

5 20 23 18 15 22 20 21 16. 18 в 14 12

6 1в 24 19 15 22 23 22 !£. 18 в 13 11

7 18 23 20 15 21 22 21 15, 20 3 13 IQ 6 17 22 19 Ii 22 23 Iii 16. 19 f 13 11 9 22 24 21 15 23 25 24 12. 24 13 16 14

10 E2 27 22 lg 25 ES 23 12. 23 13 16 14

11 20 26 20 16 22 24 23 lg. 21 9 15 13

12 22 26 19 IS 23 25 23 lfi. 23 // 17 14

13 19 E4 18 IS El EE El Ц 19 7 13 11

14 22 28 22 12 25 27 24 23 U 18 14

15 19 25 22 15 25 24 25 16. 20 9 14 11

16 19 25 18 15 20 24 20 1± 20 7 13 11

17 22 28 22 12 27 26 26 12. 25 13 17 15

18 19 24 19 15 22 24 21 1£. 19 3 12 U

19 28 33 29 £4 32 29 30 26. 29 13 1,9 16

20 17 26 19 14 23 22 22 16. 20 7 13 11

21 23 29 22 £Q 27 27 25 12 23 14 18 16

22 21 26 21 18 25 27 24 18 23 !3 17 15

23 22 27 24 12 26 26 26 18. 23 14 18 15

24 20 24 22 J6 24 27 24 1£ 21 13 17 13

25 22 30 27 ig 87 30 28 £0 25 14 20 17

26 20 28 20 lê 25 25 24 lg. 21 13 17 13

27 22 23 19 17 22 20 21 16. 21 10 13 13

28 21 27 23 gb 26 25 24 12. 23 13 18 16

29 E4 EB 23 12 26 27 E5 19.24 10 14 14

30 19 E4 18 15 21 23 21 16. 20 t 13 11

31 21 28 21 1Й 25 23 22 18 23 11 16 14

32 21 27 El 12 26 25 23 12. 23 13 17 14

33 21 24 22 18 23 24 24 12. 23 11 17 14

34 20 26 20 Ii 24 21 24 16. 20 // 16 12

35 20 27 21 18 24 23 24 jB 18 // 16 13

36 IS 24 18 14 21 21 18 1£ 18 f 14 10

37 18 El 18 1з 18 20 18 14. 18 S 10 10

38 21 27 23 17 27 28" 24 lg. 23 13 17 15

39 18 23 18 14 21 21 20 !§. 18 ¿12 9

J1 J2 Dl D2 VI U2 U3 V4 V5 M RI R2

N

1 ' E0 21 16. 17 18 20 17 JS 22 12 S 13

2' 22 21 16 18 19 19 17 1£ 22 14 1С 14

3' 16 26 W 16 23 22 19 \г SO 12 14 /7

4' 1? 23 17 13 19 22 17 ¿4 21 13 12 10

5' 28 23 20 1? 22 22 M 22 27 19 14 20

6' 18 27 "25" 17 25 24 21 .16. 21 15 17 30

T El E9 E4 18 E7 30 E7 19 24 18 18 15

8' 20 26 21 TT" 25 25 21 Tg 19 15 17 Ю

9' 19 26 20 Tf 21 24 19 15 20 15 15 13

10' El 24 1BE0 19 S3 18 19 23 16 13 15

11 ' 17 20 "TB" 14 17 18 TS- 12 18 13 11 10

12' 23 20 J6.T7 19 21 17 1Y 23 16 SU

13' -SO 24 19 IB E2 22 21 Ib. SD 16 16 14

14' 24 29 24 20 28 28 29 .19 24 18 19 IS

15' 23 20 17 1в_ га 18 18 19 20 16 11 15

16' 21 20 14 17 18 19 17 16 21 14 S 13

17' 23 27 IS J9. 26 28 26 19 23 19 20 IS

18' 14 18 14 Ii 17 20 17 13 18 9 9 S

19' 20 20 16 15 18 19 19 .15 19 14 10 12

20' 18 20 17 14 21 20 20 16 21 14 12 11

21 ' 22 27 25 18 27 26 28 lg 23 14 15 M

22* 21 21 HTT 21 23 23 19 22 17 14 13

23' 18 23 17 16 21 23 20 Ц 20 11 9 3

24' 19 20 15 1£ 19 17 19 _14 20 11 S 8

25' Iß £û 15 14 19 18 19 15 19. 14 И 10

26' 19 25 17 1?" 22 26 20 15 20 15 16 13

27' 15 26 20 J± 24 Е7 21 15 21 15 16 13

28' 26 24 20 22 Ц 24 21 22 26 18 14 18

29' 25 ЕЗ TfT.20 ЕО 22 TS ЕЕ Е6 18 13 17

30' \ 17 24 19 12 2F E2 TÏJ 13 ЕО 12 13 S

31' El 19 13"î¥ 17 20 1516 23 15 fO 14

32' 15 21 16 10 17 21 18 12 18 В 11 7

33' 30 26 24 26 25 27 25 29 20 14 19

34' 18 22 16 15 23 22 21 15 21 15 13 13

* Jl, JEj 01, 12) V1-V5 - конг.гнсусные мономеры новхроносомных семепстЪ 1,2 и 3 соотЬетсЬежо) H и Rl, RS - семевстЬ 4 и 5. НазЬония лослебоЬательностеи, иономесы kotodux Ьзяти йля imuum п ---------»-■■ ---»-•-

Гомологии мономеров указанной группы с 9-ю консенсусными последовательностями приведены здесь же. Группу можно условно разбить на две части.-Расположенные в левой и~правой частях таблицы - группы 1с и гс. При сравнении каждого мономера группы 1с с любой консенсусной последовательностью показатели дивергеннии - величины одного порядка. Это позволяет предположить, что группа высоко гомогенна, Каждый мономер данной группы в наибольшей степени сходней с мономерными типами Б2 и УЧ. В менее гомогенной группе гс наряду с 02-У4 подобными мономерами присутствуют мономеры, наиболее близкие к УЗ и другим мононерным типам. В дальнейшем эти группы анализировались раздельно.

Анализ последовательностей групп 1с и гс проводили по следующей схеме:

1. В пределах каждой группы выявляли мононеры. которые присутствуют в каждой последовательности и имеют общие нуклеотидные замены. Для этого проводили попарное сравнение мономеров с использованием параметра индекса идентичности с консенсусом (ИКИ), который представляет собой выраженное в процентах число совпадающих нуклеотидных оснований из числа отличных от некоторой консенсусной последовательности.

СНП

ИКИ = — 100у., где НЙ

НП - сумма всех отличных от консенсуса (неконсенсусных) нуклеотидных оснований; СНП - сумма совпадающих неконсенсусных нуклеотидных оснований <иауе, УШага, 1965).

Критериями формирования подгруппы в пределах анализируемой группы являлись:

- значение ИКИ, более чем в 1. 5 раза превышающие "Фоновые" значения (среднее значение) в пределах последовательности (или последовательностей) , к которым принадлежат сравниваемые мономеры;

- сходство каждого мономера выделенной подгруппы со всеми мономерами этой же подгруппы.

2. Для определения "компактности" выделенных подгрупп в пределах каждой подгруппы анализировали показатели отличии диверен-цию) при попарном сравнении мономеров.

3. Также проводили попарное межгрупповое сразнение мономеров. Средние показатели межгрупповых различий мономеров, превышающие средние внутигрупповые, считались критериями различия анализируемых

групп.

4. Подтверждением полученных результатов считали достоверно большее сходство мономеров с консенсусНой последовательностью (мономерным типом ) . выведенной из выделенной подгруппы, чем с остальными.

5. В последовательностях анализируеной группы устанавливали характерное чередование мономеров.

' Анализ последовательностей группы 1с

При анализе ИКИ в пределах группы 1с нам не удалось выделить каких-либо группировок, общих для каждой из представленных в ней последовательностей.

Мономеры группы 1с также не в большей степени отличны друг от друга, чем мономеры остальных мономерных типов. Средний показатель различий (дивергенции) при попарном сравнении мономеров в среднем составляет 19. 5у- (Табл. 4 ) и не превышает соответствующих значений в 'других группах мономеров. В то же время при попарном сравнении мономеров этой группы с нономерами других, наиболее близко расположенных групп И2 и У4. аналогичньй*,показатели составляют 24. 2 и 23,'4соответственно, что превышает средние различия внутри данной'группы. Мономеры группы 1с обладают наиболее высокой гомологи-ел''Ь'о! своим консенсусом (ТабЛ. 2); среднее значение показателя дивергенции составляет И. и (Табл. 4). в остальных группах мономеров они колеблются от 7, б до \гV-: Таким образом, последовательности.

Таблица'4. Показатели дивергенции <*) при попарном сравнении -,< 'о 1В-' мономеров групп 1с. шиз и 0244.

Группы мономеров внутригрупповое попарное сравнение мономеров : Попарное сравнение : : с соответствующим : : консенсусом :

Среднее : Пределы « : Среднее : пределы :

1с 19, 5 11-30 : И. 1 8-15 • 1

ИШЗ 19. 3 : 5-2в : и,в : 8-17 : • •

ъгич 19, 8 : 5-гв • :. и,9 : 8-17 : I 1 1 •

входящие в группу 1с, имеют отличный от охарактеризованного ранее способ организации альФоидных мономеров, основанный на мономерном типе _М. .Группа мономеров типа-Н отлична от других групп и не более дивергирована, чем они. Последовательности, организованные таким образом. были отнесены к новому надхромосомному семейству 4.

Анализ последовательностей группы гс

Для того, чтобы определить спепень гомогенности в пределах группы гс, мономеры, представленные в правой части таблицы г, попарно сравнивали друг с другом относительно консенсусной последовательности кс, выведенной из этой группы, также используя ики (Рис. г, табл. 5). Анализ указанного параметра показал, что 13 мономеров этой группы (1. 2, 5. 10. 12. 15. 16, 19, 24. 26. 29, 31 и 33) сходны между собой и отличны от остальных мономеров. Присутствие таких мономеров в каждой последовательности группы позволяет выделить их в отдельную подгруппу.

Большинство нономеров вновь выделенои подгруппы, в дальнейшем названной 01из-подобной, наиболее близки к консенсусам и из (Табл. 2) Оставшиеся мономеры. 02У4-подобная подгруппа, наиболее схожи с консенсусами Р2 и ич. В пределах каждой из выделеных подгрупп также не было выявлено группировок, общих для каждой из представленных в них последовательностей.

Средние показатели дивергенции, полученные при попарном сравнении мономеров внутри ВШЗ и 02М4-подобных подгрупп составляют 19.2* и 19.8и, соответственно (Табл. 4). Средние различия при сравнении мономеров ШУЗ и йгич подгрупп между собой и с мономерами других мономерных семейств, в том числе группы 1с, лежат в пределах от 21.6 до 30,ох, что превышает средние внутригрупповые различия.

Мономеры группы гс наиболее близки к своин консенсусным последовательностям (Табл. 2), средние показатели отличий мономеров групп ШУЗ и 02Ы4 от 1?1 и й2 консенсусных последовательностей соответственно - и,.а и 11, 9х (Табл.4), что не превышает аналогичных показателей в других группах. Последовательности группы гс содержат два типа чередующихся друг с другом мономеров и 1)2, хотя регулярности в чередовании, характерной для ряда других типов мономеров, нам установить не удалось. Таким образом, последовательности группы гс также представляют собой отличный от уже известных, а также от последовательностей группы 1с способ организации альФоидных повторов, основанный на нерегулярно чередующихся мономерных типах Й1 и Й2. названный надхромосомным семейством 5.

'- 15 -

с s

t=

о 35

а

s

i cj c_>

CO tj

4 U U U

LO

i

a => г ■ ss

a

S

S'

a .

' S U LS

•С CJ -

L3

i

s

«a; -X ,

s

u5u u

»— 1

uu us <-o

■-a

2t=

Ш

ses «—• t—

t

5

U LJ U

a

â

tu «

1i a

г 8

i 2t3

u

S

s

cj и

** CJ _ •« , uuo о

»— ' I 1 >— 1

^ «C ^ с *r ^ «S «X -H-

с 3

t (J

о

3 <

• iî < из н-

РЦ1Д1— С g

I

•л,

е es в «г в

с с с: с в

с с е с с

с с в с в

е с в с в

— - - «; С

С С С

С КЗ с

с е с

Р с с

с с с

с с с

SS-^b §

,И< С

LS

с с с с; С С с с с с с с

е с с с

LS

_ . С С С с « с с

Ol-b-gHUh- CJK— и уь-и. е с е «s ег с «s

О С5 е с с с: е с с

и _ и с с с с с с с

i— С е е е «s «г с: с

_ и С С с с с с с

3 4 h* с е е с с: с с

«1ЭО с с «s е с а с

¿3 _ ^ и С С с с с с с

LS -с с е е е сг е <е

h—■ С С С С С С С

(J С С С С С с t

с с с с с

с с е с с

U с с с с с

1 с с с с «

с с с ее

с с с ци с с

с с с , 3 ее

с с в Цкь- t_> с с <_J

g Ё St= ,t= %%

ес° , <= % %

в с с i U _ С с _

с с: «г «х к— L» »— l3 с LS

с: с в <=

с: с с _ е

ёс с с

ее с

с с е с с

<3 5

с S?

G 3

>-. Of

s

* aS S

С m

>. <

eg 1 §

w £

p

îi i-s

с

■ i

<c <c «с

U) о

«с

. Ч^ри^пспис пимипсрии I 1РОООР1 " группы.

1 г 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 го 21 22 23 24 25 26 27 26 £9 30 31 32 33 34

1 к /6 19 18 13 21 26 23 18 17 17 16 21 26 /3 13 28 15 19 21 23 23 17 15 20 22 22 22 20 19 15 17 24 19

г 30 ж 18 19 19' га 26 24 20 19 18 /6 20 27 17 16 29 18 17 19 21 23 17 15 18 22 23 25 20 22 19 19 22 22

3 9 20 ж 18 25 15 25 12 20 21 18 22 17 26 23 20 25 16 22 20 20 22 17 18 19 21 20 27 25 19 22 17 28 20

4 14 13 21 ж 22 20 23 20 18 20 16 18 22 гз 19 19 25 15 19 20 20 22 17 15 19 18 17 22 22 16 20 15 24 18

5 36 35 7 15 ш 26 30 30 26 22 22 /3 25 32 21 19 26 23 23 24 27 26 20 21 24 24 £8 23 23 24 22 23 26 26

6 15 15 44 27 13 ж 26 18 24 22 19 21 13 26 25 24 22 16 23 19 19 22 16 18 19 20 22 29 25 19 23 17 27 21

.7 4 7 17 21 3 25 ж 26 26 26 23 26 27 16 27 24 27 20 26 24 21 26 20 22 22 24 24 27 29 21 25 21 28 24

8 8 11 58 27 3 43 22 ж 23 22 20 26 21 27 25 25 26 18 24 21 20 23 19 21 19 24 23 30 26 22 25 18 29 22

9 16 16 23 £9 13 18 20 18 ж 23 19 гз 25 27 22 22 26 19 23 23 23 24 18 21 £3 22 21 27 27 19 23 1В 27 23

10 га 23 11 16 30 21 13 14 7 * 20 го 25 30 13 13 28 17 19 20 22 23 19 17 19 24 23 23 20 22 19 19 23 20

11 " 19 13 17 19 22 20 15 12 25 16 ж 19 19 25 18 17 24 14 19 16 17 20 10 15 14 19 18 23 20 17 18 15 24 19

18 34 37 б 13 45 22 7 7 8 34 17 ж 22 27 19 11 26 16 16 19 23 21 15 13 19 20 23 22 22 19 13 18 19 20

13 19 26 40 15 16 53 19 30 14 1 0 20 18 ж 28 27 23 23 18 24 21 20 24 17 21 21 22 23 30 26 21 23 19 29 25

14 7 7 16 24 3 27 57 21 19 3 14 7 18 ж 29 25 28 20 26 23 21 25 20 21 £3 24 25 30 29 £3 25 20 28 24

15 33 35 4 16 37 11 10 11 15 33 25 33 7 6 ж 17 31 19 /9 21 24 24 20 16 20 26 26 25 20 £3 20 21 21 21

16 40 34 4 13 36 11 11 8 8 3/ 23 50 8 1 0 40 ж 28 18 18 19 22 21 17 13 19 22 22 21 19 19 1б\ 19 22 18

17 4 0 19 16 16 31 19 17 13 V 12 4 21 19 0 0 ж 21 25 2Ь 23 26 16 24 24 19 26 33 29 19 28' 21 30 24

18 17 5 21 17 4 23 17 19 10 10 24 5 19 16 5 6 24 ж 15 15 14 18 11 12 16 17 18 21 17 9 15 9 23 16

19 20 24 5 10 20 4 4 4 4 28 10 23 0 0 22 24 4 19 ж 19 19 21 17 6 19 23 21 24 17 16 17 16 19 19

20 5 14 14 5 8 17 8 13 0 17 15 9 13 11 13 15 9 19 17 ж 12 13 14 16 5 23 24 24 17 15 19 18 24 19

21 5 5 23 15 О 29 19 24 13 9 20 0 24 22 4 5 21 38 16 49 ж 17 16 18 8 23 22 25 20 15 23 14 27 22

22 5 9 9 ' 0 1 8 7 8 0 12 10 9 12 11 8 14 4 12 15 51 30 ж 17 18 И 23 25 25 22 19 £2:19 24 21

23 6 6 11 6 13 14 9 10 15 0 24 5 19 13 5 35 16 0 13 13 6 * 14 14 12 19 23 18 12 15 14 23 17

24 1г 17 5 12 13 5 0 5 0 20 6 /6 0 0 15 23 5 16 67 13 6 12 0 ж 15 19 20 20 15 13 15 113 20 15

25 5 15 14 5 8 1" 8 17 0 18 21 10 13 11 14 15 9 13 17 80 61 53 14 14 ж 21 23 23 17 15 19 ,16 23 19

£6 5 4 17 18 1 1 23 25 15 16 8 14 9 15 24 4 4 40 гз 0 5 го 5 35 0 5 ж 21 2В £4 16 21 18 30 21

27 4 4 23 32 3 24 26 24 25 14 24 4 14 25 4 8 18 20 13 4 21 0 5 4 1& ж 25 26 16 23 17 29 21

га 22 Л? 7 11 33 6 1? 6 3 30 1 1 2/ 3 9 23 25 3 13 24 16 12 11 0 13 16 4 16 ж 17 £5 19 22 23 25

го 23 26 7 е ¿о 13 9 1 0 4 34 16 25 ~7 6 35 30 3 9 25 21 12 12 0 19 £1 4 3 51 * 24 13 21 23 24

30 13 0 21 31 11 3-1 2Ъ 23 24 12 23 17 19 ?1 8 13 ?7 28 5 10 24 5 и 6 1 0 22 39 7 8 ж 22 11 21 18

31 33 25 ■1 4 32 4 4 8 31 18 33 11 27 34 0 5 24 10 0 9 и 17 10 4 0 39 4! 0 ж 19 24 20

32 11 0 2 ! 4 Я 6 го 22 19 я 22 5 22 23 5 5 27 48 ¡2 12 40 И 14 14 18 26 23 8 А 36 0 * '¿4 15

33 17 20 4 в 21 7 1 0 4 8 26 9 27 4 1 0 26 24 4 1 0 32 18 4 17 0 21 19 0 4 20 25 8 20 '. 5 ж 26

34 1 И 1'"-. 21 ! •! !Р Г' 18 15 26 21 24 4 1 9 23 2? 13 15 18 14 :з 9 5 21 14 8 22 17 10 29 12 24 15 ж

НаО Эм'згоиа.м»« " псжизател! 1 ,1| |Ье-| и" :и <;;> моноиерой. Значения." поЭ Эиагоналыо чЬляотся ин8ексами

.идентичности с консен.-.усноп послеОсЬагс'/.ьностыо RC. Курсивом ЬыОе/.ены значения показаталеп ЙиЬергенции и

¡шОекзо?) коноенсусноп политичности пуиомероЬ группы ЫУЗ.

Анализ распределения сайтов связывания с пентронернын ядерный 1 белкон CENP-B белкон в надхроносомных семействах

альФа-сателлитной ДНЕ

Последовательности альФоидной ДНК - это единственный класс повторявшихся последовательностей, присутствующий в центромерной области всех хроносом человека tWUlard, 1990). В работе Сооке с соавторами (1990) с использованием метода электронной микроскопии было обнаружено, что непосредственно под пластинкой кинетохора локализован один из пентромерных ядерных белков - белок CENP-B. В работах, опубликованных Masumuto с соавторами (1989), было также показано, что часть мономеров альФа-сателлитной ДНК содержат последова-ч.л&ность длиной ¡7 нуклеотидов, которая является сайтом связывания с указанным ядерным белком. Кроме того, антитепа к данному белку, введенные в ядро в поздней интерФазе. нарушают пропесс митотического расхождения хромосом (Bernât et al., 1990. 1991). Приведенные выше эксперименты позволяют заключить, что данный белок активно задействован в процессе функционирования центромеры.

Большинство отличий между группами D1V3 и D2W4 локализовать, в области неопределенных позиций 37, 38, 40, 47 и 50 консенсусной последовательности, нуклеотидные основания в которых на рисунке 2 выделены жирным шриФтон. В указанных позициях мономеры D1W3 типа содержат Т, С, Т. с. G; для D2W4-nono6Hux мономеров в соответствующих позициях этой группы характерны а, t. g, а, а нуклеотидные основания. При этом участок мономера с 35 по 51 н. п. ВШЗ-подгруппы является сайтом связывания с CENP-B белком.

В ранее охарактеризованных надхромосомных семействах сайты связывания с ядерным белком CENP-B (CEHF-B боксы) присутствуют в мономерах J2, Di. VI, V2 и V3 типов. Мономеры типа л, D2. V4 и V5 не содержат сайтов связывания с указанным белком. Таким образом, в над-хромосомных семействах 1, Z. 3 и 5 имеются,два типа мономеров. Над-хромосомное семейство 4 содержит только один тип мономера, не имеющий сайтов связывания с СЕНР-В белком (Рис. 3). Интересно заметить, что на хромосоме Y до настоящего времени обнаружены только последовательности, относящиеся к данному семейству. Последовательности мономеров африканской зеленой мартышки также не содержат СЕЫР-В-бокса. Вследствие этого можно предположить, что существует иной тип организации центромерной области. Показано, что у африканской зеленой мартышки данную функцию несут АТ-богатые участки альфоидного мономера -I. II и III сайты связывания с альФа-протеином - белком (Strauss,

Рис. 3. Схема рапределения мономеров, содержащих СЕНР-В бокс (выделены черными стрелками), в пяти надхромосомных семействах альфоидной ДНК. Номера надхромосомных сенейств приведены слева.

УагзЬаУзКУ, 1984), существенно отличающимся по своим Физическим свойствам от СЕЫР-В-белка. Возможно, именно такой механизм сохранился на У-хРомосоме и, может быть, на некоторых других хромосомах человека.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе выявлен и детально исследован клонированный в космидном векторе геномный фрагмент ДНК из прииеитромерного района хромосомы 21 человека, содержащим наряду с последовательностями аль-1>оидной ДНК диспергированные повторы Alu- и Кгп-сомейств. Показано, 1то указанный фрагмент также содержит ранее не описанные пооторяю-пиеся последовательности, локализованные только в акроцентрических [ромосомах человека.

Построена рестриктная карта Фрагмента, содержащего область кон-'акта ДНК альФоидной и неальфоидной природы.

Анализ первичной структуры альтоидш.х субклопов п сравнешши с ядом других (актированных альФа-сателлитных ДНК, спеиифичных для азличных хромосом человека, показал наличие двух новых способов ор-анизации альфоидных повторов и соответствующих им двух новых над-ромосомных семейств. Нономерный способ организации, который имеют

альфоидные сУбклоны космидного клона, характеризуется наличием мономеров только одного типа. Второй способ органиэаииии характеризуется присутствием нерегулярно чередующихся мономеров двух типов.

Проведен компьютерный анализ распространения сайтов связывания с ядерным белком CENP-B, предположительно принимающим участие в функционировании центромеры. Показано, что надхромосомные семейства, имеющие димерую и пентамерную организацию, содержат регулярно чередующиеся сайты связывания с указанным ядерным белком. Семейство, имеюшее мономерную организацию, не содержит сайтов связывания с ядерным белком CENP-B.

ВЫВОДЫ

1. Выявлен и исследован Фрагмент генома человека длиной 40

т. н.п. из прииентромерной области хроносомы 21. Указанный геномный фрагмент содержит повторяющиеся последовательности ДНК различных типов: альфоидную ДНК, а также диспергированные повторы Alu- и Крп-семейств.

2. Определена нуклеотидная последовательность субклонированных фрагментов кОсмидного клона обшей длиной 9 т. н. п. Составлена рес-триктная карта Фрагмента, содержащего область контакта ДНК альфоид-ной и неальфоидной природы.

3. Обнаружено существование двух новых способов организации альфоидных последовательностей, соответствующих новым надхромосомным семействам, которые отличаются от охарактеризованных ранее первичной структурой и характером чередования альФоидных мономеров. Мономерный способ организации альфоидных субклонов космидного клона характерна ЗУется наличием в альФа-сателлитной последовательности мономеров только одного типа. Второй способ организации характеризуется при-сутстием:'нерегУлярно чередующихся мономеров двух типов.

4. С помошью компьютерного анализа показано, что последовательности. имеющие динернло и пентамерную организацию, а также организованные как нерегулярно чередующиеся мономеры двух типов, содержат сайты связывания с иентромерным ядерным белком CENP-B. АльФоидные последовательности, имеющие мономернло организацию, не содержат сайтов связывания с указанным ядерным белком.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕПЕ ДИССЕРТАЦИИ

17 Романова 71. Ю. , Александров H.A., Медведев Л. И. , Машкова Т.Д., Юров Ю. Б. , Киселев Л./I. , (1992). Выявление нового семейства альФа-сателлитной ДНК человека. Докл. Акад. Наук, 326, (б), с. 10731077.

2. Юров Ю. Б. . Александров И. а. , Синев Е. М. , Яковлев А. Г. , Демидова И. А. , Романова Л. Ю. , Дерягин Г. В. , Ворсанова С. Г. (1992). Молекулярный и молекулярно-цитогенетический анализ гетерохроматинового района хромосомы 21 человека. Сб-к научных трудов "Генетика человека и патология", Из-во Томского Униветситета, Томск, с. 227.

3. Юров Ю. Б. . Александров И. А. , Синев Е. М. , Яковлев А. Г. , Романова Л. Ю. , Дерягин Г.В. (1992) Картирование прииентромерного района хромосомы 21 человека. Мат-лы VI съезда ОГИС им. Н.И.Вавилова, Минск, с. 1 Зв.

4. Машкова Т. Д., Романова Л. Ю. ■ Александров И. А. Нарушение регулярности геномной организации альФоидной ДНК. Тезисы, 4-ая Всес. конф. "Геном человека-93". Черноголовка, март, 1993, с.