Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетический анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L к ядерной оболочке трофоцитов яичников малярийного комара Anopheles beklemishevi (Diptera, Culicidae)

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетический анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L к ядерной оболочке трофоцитов яичников малярийного комара Anopheles beklemishevi (Diptera, Culicidae)"

На правах рукописи

Пищелко Анна Олеговна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ДНК РАЙОНА ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМЫ 2L К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ МАЛЯРИЙНОГО КОМАРА ANOPHELES BEKLEMISHEVI (DIPTERA, CULICIDAE)

03.02.07 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 АВГ 2014

Москва 2014

005552033

005552033

Работа выполнена в лаборатории эволюционной цитогенетики Научно-исследовательского института биологии и биофизики Томского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

СТЕГНИИ Владимир Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор

ГОРДЕЕВ Михаил Иванович Московский государственный областной университет, заведующий кафедрой общей биологии и экологии

доктор биологических наук ГРИШАНИН Алексей Константинович ФГБУН Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, научный сотрудник

Ведущая организация:

ФГБУН Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита диссертации состоится «24» сентября 2014 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу 119334, Москва, ул. Вавилова, 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН: http://idbras.comcor.ru/.

Автореферат разослан » ¿201М?/7>а_ 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Бойко О.В.

Актуальность работы. Современный взгляд на структурную организацию генома предполагает существование хромосомных территорий и связь хромосом с ядерной оболочкой. В этом процессе большое значение имеет гетерохроматин, обеспечивающий динамичность хромосомно-мембранных отношений, что предусматривает его важную роль в эволюции эукариот. Различия в составе, количестве, структуре и распределении характеризуют гетерохроматин как фактор, сопутствующий видообразованию (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Жимулев, 1993). Одной из главных черт, отличающей гетерохроматин, является наличие повторенных последовательностей ДНК, что определяет его как быстро эволюционирующую часть генома. Состав и сочетание высоких и умеренных повторов, с включенными в них мобильными элементами, а также их разнообразие и особенности кластерной представленности, видимо, имеет специфичность и определяет особенную структуру гетерохроматина различных видов (Dimitri et al., 2009, Stacie et al., 2009). Прицентромерные гетерохроматиновые районы (ТТГ) хромосом часто являются районами прикрепления (РП) к ядерной оболочке, поэтому изучение прицентромерного гетерохроматина позволяет расширить знания о влиянии изменений состава гетерохроматина на пространственную структуру ядра. Уникальным объектом для данных исследований являются малярийные комары рода Anopheles комплекса maculipennis (Díptera, Culicidae), которые обладают хорошо структурированными политенными хромосомами в ядрах трофоцитов яичников у самок имаго и в ядрах слюнных желёз у личинок.

Политенные хромосомы в ядрах трофоцитов яичников восьми видов комаров комплекса maculipennis имеют четкие различия по наличию, либо отсутствию облигатного прикрепления к ядерной оболочке, по морфологии участков прикрепления и по внутрихромосомному расположению РП (Стегний, 1979, 1987). У мух рода Drosophila — Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) и Drosophila virilis (Sturtevant, 1916) также были обнаружены структурные изменения прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом и их отношения к ядерной оболочке при видообразовании (Стегний, Вассерлауф, 1994; Стегний и др., 1996). Изучение гетерохроматина в группах близкородственных видов является актуальным, поскольку позволяет проследить процесс видообразования. Среди восьми видов комплекса наиболее яркие различия прицентромерного гетерохроматина по структуре и взаимодействию с ядерной оболочкой наблюдаются у вида Anopheles atroparvus (van Thiel, 1927) в районе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R. Молекулярный состав данного района является характерным для конститутивного гетерохроматина, образован повторяющимися последовательностями ДНК, мобильными элементами и структурными генами. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации районспецифичного ДНК-зонда Atr2R из района прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R на политенные хромосомы трофоцитов яичников малярийных комаров An. atroparvus, Anopheles messeae (Falleroni, 1926), Anopheles beklemishevi (Stegnii et Kabanova, 1976) показали наличие гомологичных последовательностей со всеми

з

районами прицентромерного (а- и ß-) гетерохоматина хромосом данных видов, кроме прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi (Грушко и др., 2004). Для изучения состава ДНК был выбран район ß-гетерохроматина прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi, поскольку он имеет «жесткое» крепление к оболочке ядра и, видимо, сильно отличается по молекулярному составу от нуклеотидных последовательностей прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является молекулярно-генетический анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L малярийного комара An. beklemishevi и сравнение его с ДНК районов прикрепления хромосом уже изученных видов комплекса maculipennis. Задачи исследования:

- получить минибиблиотеку фрагментов хромосомной ДНК из РП левого плеча хромосомы 2 An. beklemishevi (Abekl2L) методом микродиссекции с последующей амплификацией и клонированием в плазмидном векторе, определить первичную последовательность полученных фрагментов ДНК;

провести сравнительный анализ локализации нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидным последовательностям библиотеки Abekl2L в хромосомах Л п. beklemishevi, An. atroparvus, An. messeae;

проверить возможность наличия/отсутствия взаимосвязи между морфологическим типом отношения хромосомы к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП на примере близкородственных видов двух родов Díptera: Anopheles и Drosophila. определить нуклеотидную последовательность ДНК клонов фрагментов минибиблиотеки Abekl2L методом секвенирования. Провести аннотирование последовательностей ДНК минибиблиотеки при помощи различных методов биоинформатики;

выявить отношения фрагментов ДНК из РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi к фрагментам ДНК, предположительно участвующим в формировании разных типов петель хроматина: MAR/SAR, ДНК ядерной ламины, ДНК синаптонемного комплекса, ДНК розеткоподобных структур. Научная новизна. Впервые на молекулярно-цитологическом уровне изучены нуклеотидные последовательности РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi. Определена первичная нуклеотидная последовательность данного участка хромосомной ДНК, в результате анализа которой было выявлено наличие повторяющихся последовательностей ДНК, гомологичных разнообразным мобильным элементам класса LINE семейства LI, GYPSY 12-1 D. melanogaster, простым тандемным повторам (TTGTG), сателлитам (ТААААА)2, (СААААА)п, фрагментам генов An. gambiae, Ае. aegypti и D. melanogaster. При сравнении нуклеотидных последовательностей минибиблиотеки изучаемого района An. beklemishevi и минибиблиотеки из района прикрепления 2L An. atroparvus между собой найдено только две пары фрагментов ДНК с высокой степенью гомологии (95%). При помощи методов

4

биоинформатики обнаружено, что в составе последовательностей ДНК минибиблиотеки РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi присутствуют нуклеотидные последовательности, относящиеся к последовательностям MAR/SAR, ялДНК, скДНК (предполагаемые «структурные» участки хромосом). РП прикрепления к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi отличается по соотношению представленности разных классов «структурных» участков хромосом как от РП хромосомы 2R An. atroparvus так и от РП An. messeae.

Практическая значимость. В настоящей работе впервые проведено молекулярно-цитогенетическое исследование нуклеотидных

последовательностей РП хромосомы 2L An. beklemishevi; получена минибиблиотека клонов ДНК этого района, определена первичная последовательность РП прикрепления к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi. Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание механизма структурной реорганизации генома эпидемилогически опасных малярийных комаров комплекса maculipennis в процессе видообразования.

Апробация результатов. Результаты работы представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009), Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «Карио V» (Новосибирск, 2010). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, две из которых - статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.

Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор лично планировал эксперименты и обобщал полученные данные. Микродиссекция и DOP-ПЦР проводились совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН). Секвенирование фрагментов библиотеки Abekl2L на начальном этапе проводилось совместно с к.б.н. М.В. Лебедевой (НИИ МГ СО РАМН), далее самостоятельно. Компьютерный анализ первичных последовательностей выполнен совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко (ИЦиГ СО РАН). FISH ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi с политенными хромосомами близкородственных видов Drosophila подгруппы melanogaster проведена при участии к.б.н. К.Е. Усова (НИИ ББ ТомГУ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, 2 из которых - статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Библиографический список включает 142 источника. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Характеристика объекта исследования. В работе использовали взрослых самок малярийных комаров трех видов: An. beklemishevi, An. messeae и An. atroparvus. Самок An. atroparvus отбирали из лабораторной культуры НИИ ББ ТомГУ. Самок An. messeae и An. beklemishevi собирали из природных популяций в летний период в местах дневки.

2. Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом. Яичники самок малярийных комаров для приготовления воздушно-сухих препаратов фиксировали в растворе Карнуа (96 % этанол с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1). Фолликулы яичников малярийного комара выдерживали 5 минут в 50 % пропионовой кислоте на предметном стекле. Затем материал накрывали покровным стеклом и раздавливали. Далее препарат опускали в жидкий азот, покровное стекло удаляли. Дегидратацию проводили в 50 %, 70 % и 96 % растворах этанола по 5 минут в каждом при -20 °С. Препараты сушили при комнатной температуре

3. Микродиссекция хромосом с последующим получением ПЦР-продукта. Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером. Амплификация ДНК диссектированного материала с частично вырожденным праймером проводилась по описанной ранее методике (Рубцов и др., 1999). Полученной коллекции ДНК дали название т.ф. Abekl2L.

4. Микроклонирование ПЦР-продукта. Часть амплифицированной ДНК была использована для ре-ПЦР, затем очищена на колонках с помощью QIAquick PCR product Purification kit (Германия) по рекомендованному протоколу. Полученные фрагменты ДНК лигировали по сайту Smal в вектор pCR 4-ТОРО, полученную смесь трансформировали Е. coli, штамм DHSa. Коллекцию клонированных фрагментов назвали Abekl2L. Культивирование клеток на селективной среде, отбор колоний, их выращивание на жидкой среде и экстракцию плазмидной ДНК выполняли по стандартным протоколам (Маниатис и др., 1984).

5. In situ гибридизация тотального препарата ДНК из РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi с хромосомами малярийных комаров. На подготовленные препараты политенных хромосом наносили гибридизационную смесь, накрывали покровным стеклом. Денатурировали 2 минуты при 72 °С и гибридизовали 17 часов при 37 °С в TERMOBRAIT (США). Отмывали от несвязавшейся ДНК. Детекцию пробы проводили при помощи Anti-Digoxygenin-Rhodamine (Sigma, США). Окраску хроматина осуществляли с помощью DAPI (Sigma, США). Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiolmager (Zeiss, Германия), CCD-камеры AxioCam и программного обеспечения AxioVision LE Reí. 4.5. Для FISH использовали препараты хромосом An. messeae, An. atroparvus, An. beklemishevi, D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri. Было проанализировано не менее 30 ядер в каждом эксперименте.

6. Выделение геномных ДНК An. beklemishevi, An. messeae, An. atroparvus. Геномные ДНК An. beklemishevi, An. messeae и An. atroparvus выделяли по

б

модифицированному методу Бэндера (Bender et al., 1983)

7. Выделение тазмидной ДНК. Выделение проводилось методом щелочного лизиса (по Маниатис и др., 1984).

8. Секвенирование клонированных фрагментов минибиблиотеки Abekl2L. Клоны минибиблиотеки были просеквенированы с помощью набора реактивов BigDye Terminators (ABI PRISM) версия 3.1 на автоматическом секвенаторе в НИИ МГ (Томск) с использованием стандартных праймеров ТЗ (5"-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3") II Т7 (TAATACGACTCACTATAGGG).

9. Анализ последовательностей ДНК РП. Биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей выполнен с помощью пакетов программ BLAST, FASTA, DNASTAR (DNASTAR Inc.). Поиск гомологичных последовательностей проводился по базам данных нуклеотидных последовательностей на BLAST-сервере NCBI NIH (http://ncbi.nlm.nih.gov). Для сравнительного анализа использовали последовательности из соответствующих баз данных секвенированных геномов (UCSC Genome Bioinformatics Site http://genome.ucsc.edu/). На наличие тандемных повторов ДНК анализировали с помощью программы Tandem Repeat Finder (http://tandem.bu.edu/trf/trf.html). Мобильные элементы идентифицировали с помощью программ CENSOR и Repeat Masker (http://www.repeatmasker.org). Поиск гомологии между фрагментами минибиблиотеки осуществлялся с помощью программы BLAST 2 Sequences, полученной с ftp-сайта ftp://ftp.ncbi.nih.gov/BLAST/executables/. Принадлежность фрагментов библиотеки Abekl2L к ДНК MAR/SAR и к фрагментам ДНК, лежащим в основании петель разных типов хроматина: ДНКял, ДНКск, ДНКрс., предсказывали с помощью программы ChrClass, (Rogozin et al., 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности локализации гомологичных последовательностей ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Anopheles комплекса maculipennis.

Хромосома 2L An. beklemishevi жестко крепится к ядерной оболочке прицентромерным районом прикрепления (РП) 15d, образованным ß -гетерохроматином (Стегний, 1993). Для изучения состава ДНК этот район был выделен с помощью микродиссекции, ДНК амплифицирована. Амплификату присвоили название Abekl2L (рис. 1). Чтобы определить наличие общих последовательностей ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi и ДНК прицентромерных районов (некоторые из них являются РП) других видов комплекса maculipennis, была проведена in situ гибридизация тотальной смеси фрагментов т.ф.АЬек12Е на хромосомы питающих клеток яичников An. beklemishevi, An., messeae, An. atroparvus. Следует отметить, что у трех изучаемых видов хромосомы трофоцитов яичников не объединены в один хромоцентр и есть различия по характеру прикрепления хромосомы 2. Так, у An. beklemishevi хромосома 2 в области прицентромерного гетерохроматина образует облигатный контакт с оболочкой ядра, у An. messeae хромосома вообще не

Публикации. По результатам исследования опубликованы 15 работ общим объёмом 3,66 п. л., в т.ч. 6 работ в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации состоит из введения, трех глав, десяти параграфов, заключения, списка использованной литературы, приложений. Изложена на 141 странице машинописного текста и включает 27 таблиц и 8 рисунков.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Обобщены основные теоретические подходы к определению высококвалифицированных специалистов в России и зарубежных странах с точки зрения миграционных процессов. В результате было сформулировано понятие «высококвалифицированный мигрант», под которым предлагается понимать категорию работников, чьи знания, навыки и умения соответствуют критериям «уровень образования», «род занятий» и «уровень заработной платы» и не могут быть предложены работодателям местными работниками. И на этой основе была уточнена типология миграционных потоков высококвалифицированных специалистов, в классификацию которой добавлены виды миграционных потоков «по уровню образования» и «по роду занятий».

Существуют разные теоретические подходы к определению высококвалифицированных специалистов, но среди них выделяются основные.

В Организации экономического сотрудничества и развития предлагают определять высококвалифицированного специалиста исходя из следующих критериев: уровень образования; род занятий; уровень заработной платы.

С точки зрения статистики, главными для определения мигрантов высокой квалификации являются международная стандартная классификация образования и международная стандартная классификация занятий. При этом уровень образования должен быть не ниже уровня бакалавра, магистра либо послевузовское образование.

В России специалисты высокого уровня квалификации определяются Общероссийским классификатором занятий ОК 010-93, утверждённым Постановлением Госстандарта Российской Федерации4, и относятся ко второй укрупнённой группе.

Однако миграционным законодательством Российской Федерации установлено, что высококвалифицированным иностранным специалистом является иностранный гражданин, который имеет опыт работы и навыки или достижения в конкретной области деятельности. Условием привлечения его к труду в Российской Федерации является его заработная плата (вознаграждение) в размере 2-х и более миллионов рублей за период, не превышающий 1 год.

По нашему мнению, статистический учет высококвалифицированных специалистов только по принципу дохода существенно занижает объемы

4 Общероссийский классификатор занятий ОК 010 - 93 [Электронный ресурс]: утв. Постановлением Госстандарта РФ от 30 декабря 1993 г. № 298 // КонсультантПлюс: справ, правовая система. Версия Проф. М., 2014.

малярийных комаров имеют различия по наличию/отсутствию прикрепления хромосомы 2 к ядерной оболочке. Так у Ап. beklemishevi хромосома 2 в области ПГ образует облигатный контакт с ядерной оболочкой. У Ап. messeae хромосома 2 вообще не контактирует с ядерной оболочкой, а у Ап. atroparvus обнаруживается внутривидовая изменчивость морфологии данного района, с образованием факультативных связей хромосомы с ядерной оболочкой (Стегний 1993). Сходный морфологический тип организации хромосом по отношению к ядерной оболочке есть и у видов Drosophila подгруппы melanogaster. У D. melanogaster хромосомы разобщены и прицентромерным участком контактируют с оболочкой ядра. У D. erecta хромосомы, объединенные в диффузный хромоцентр, не прикрепляются к ядерной оболочке, у D. teissieri хромосомы визуально не объединены в хромоцентр, а плечи хромосом 2 и 3 не разобщены, объединены гетерохроматиновым блоком и не контактируют с оболочкой ядра (Стегний, 1993). Представлялось интересным выяснить наличие гомологичных последовательностей с ДНК РП хромосомы 2L Ап. beklemishevi, имеющим «жесткое» прикрепление к ядерной оболочке, у видов Drosophila с различным морфотипом организации хромосом по отношению к ядерной оболочке.

С

2

2

XL

3 3

<— 4—

б С С _

С 3L

2L | _

Рис. 3. Флуоресцентная in situ гибридизация нуклеотидных последовательностей Abekl2L на политенных хромосомах трофоцитов яичников: а — D. melanogaster, б - D. erecta', в — D. teissieri. 2L, 2R, 3R, 3L, XL -политенные хромосомы; с - центромерные районы; масштабная шкала 5 ¡Ш1.

Была проведена флуоресцентная in situ гибридизация ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi с политенными хромосомами трофоцитов D. melanogaster, Drosophila erecta (Tsacasand Lachaise, 1974), Drosophila teissieri (Tsacas, 1971).

Результаты свидетельствуют о том, что нуклеотидные последовательности, гомологичные ДНК т.ф. Abekl2L обнаружены у всех трех видов Drosophila (рис. 3). Необходимо отметить, что у D. melanogaster был выявлен наиболее интенсивный сигнал в ПГ всех хромосом, который является РП. Что свидетельствует о сходстве нуклеотидного состава РП хромосомы 2L Ап. beklemishevi и РП хромосом D. melanogaster. По всей видимости, этими последовательностями являются разнообразные повторы ДНК. Кроме того, интенсивность сигнала в прицентромерных районах разных хромосом у D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri была неодинаковой. Это может быть связано

9

с различием как в качественной, так и в количественной представленности гомологичных последовательностей из РП хромосомы 2L An. beklemishevi на исследуемых хромосомах D. melanogaster, D. erecta, D. Teissieri, или и с тем и с другим.

Далее представлялось интересным выяснить вопрос о взаимосвязи сходства морфологических типов организации хромосом по отношению к оболочке ядра со сходством нуклеотидных последовательностей РП хромосом.

2. Характеристика последовательностей ДНК минибиблиотеки AbekI2L.

Клонированные фрагменты библиотеки секвенировапи. Первичная последовательность была определена у 97 фрагментов (150 - 450 п.н.). Общая длина секвенированных последовательностей составила 46921 п.н. Из них было выбрано 38 не гомологичных фрагментов общей длиной 10824 п.н., которые подверглись дальнейшему анализу.

Для того чтобы охарактеризовать последовательности библиотеки Abekl2L на первом этапе, было решено сравнить их с последовательностями ранее полученных минибиблиотек из ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus (Atr2R) и ДНК района прикрепления 2Ь-с хромосомы XL An. messeae методом поиска гомологии. В результате анализа минибиблиотек Abekl2L и Atr2R были найдены только две пары гомологичных фрагментов - Abekl2L-37 и Atr2R-70, Abekl2L-135 и Atr2R-133 - со степенью гомологии (80% — 95%). При сравнении библиотеки Abekl2L и Mes2bc один фрагмент Abekl2L-46 проявил гомологию с двумя фрагментами Mes2bc: Mes2bc-23(70%) и Mes2bc-426 (80%). Все три района, из которых были получены минибиблиотеки, имеют гетерохроматическую природу. Это может свидетельствовать о специфичности данного участка хромосомы 2L An. beklemishevi среди видов комплекса maculipennis.

Далее был проведен поиск последовательностей, гомологичных фрагментам библиотеки Abekl2L, в базах данных на BLAST-сервере NCBI NIH с геномами других Díptera. Выявлена гомология с последовательностями из генома комара Anopheles gambiae (Giles, 1902) (Abekl2L-211, Abekl2L-137, Abekl2L-138, Abekl2L-150, Abekl2L-45(2), Abekl2L-48). Клон Abekl2L-211 имеет гомологию с последовательностью интрона EST ВХ624735 (AgamP3:3R:53200684:l) и интрона ВХ029300 (lAgamP3:3L:l:41963435:l) в mRNA. Клон Abekl2L-48 проявляет сходство с несколькими LTR. Остальные последовательности неизвестны (таб. 1а). С геномом комара Aedes aegypti (Linnaeus in Hasselquist, 1762) значительные гомологии с неизвестными последовательностями проявили клоны Abekl2L-137, Abekl2L-133, Abekl2L-215, Abekl2L-209, Abekl2L-186. Клон Abekl2L-186 также содержит небольшой микросателлитный тракт (СААААА)п (таб. 16). Выявленная гомология ДНК-фрагментов библиотеки Abekl2L An. beklemishevi с ДНК видов An. gambiae и Ас. aegypti подтверждает принадлежность An. beklemishevi к семейству Culicidae отряда Díptera. Ряд последовательностей библиотеки Abekl2L обнаружили гомологию с последовательностями генома D. melanogaster. Клоны Abekl2L-125 и Abekl2L-171 содержат области, гомологичные фрагменту Gypsyl2_I,

ю

класса LTR семейства Gypsy, клон Abekl2L-114 содержит область, гомологичную МГЭ FB_4DM семейства ТС1, клоны Abekl2L-39 и Abekl2L-67 оказались гомологичными с последовательностью неизвестной локализации. Клон Abekl2L-93 проявил гомологию с районом последовательности интрона гена DOP 2R, Abekl2L-130 - гомологию с геном chico D. melanogaster. Abekl2L-39 гомологичен экзону и последовательности З'-UTR белок кодирующего гена D. melanogaster CG4609-RD.

Фрагмент Abekl2L-67 показывает сходство с геном nahoda transcript (jiahodá), mRNA и NM_079091 белок-кодирующим геном с неизвестной молекулярной функцией. Abekl2L-144 проявляет гомологию с Eph receptor tyrosine kinase CG1511-RC D. melanogaster, фрагмент Abekl2L-37 гомологичен гену AY070948 D. melanogaster RE04191 full length cDNA, который кодирует NADH dehydrogenase subunit 4 (табл. 1в). Отсутствие абсолютной гомологии фрагментов с последовательностями An. gambiae, Ае. aegypti и D. melanogaster говорит о том, что они являются "осколками" LTR-ретротранспозонов и LINE-элементов, генов из указанных геномов, а также о присутствии в районе прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi данных классов последовательностей. Молекулярный состав районов прикрепления характеризуется наличием большого количества мобильных элементов среди прочих классов последовательностей. Например, у An. gambiae среди всех мобильных элементов обнаружено преобладание ретротранспозонов (Tu, Coates, 2003).

Предполагается, что обилие gy/wy-подобных ретротранспозонов в определенном районе хромосом может приводить к прикреплению к ядерной оболочке (Gerasimova, 2000). Известно, что ДНК РП хромосом к ядерной оболочке у D. melanogaster и An. gambiae содержат последовательности МГЭ, при этом политенные хромосомы питающих клеток яичников образуют прочные контакты с ядерной оболочкой у D. melanogaster (Стегний, Вассерлауф, 1994) и в составе хромоцентра у An. gambiae (Sharakhov, 2002). Возможно, что способность района прицентромерного гетерохроматина к прикреплениям к оболочке зависит от присутствия в нём определенного количества встроек £у/»у-подобных LTR-ретротранспозонов (Gerasimova., 2002).

Фрагменты минибиблиотеки Abekl2L проверили на наличие повторов методом компьютерного анализа. Как оказалось, в минибиблиотеке Abekl2L содержатся повторяющиеся последовательности ДНК, гомологичные разнообразным мобильным элементам (табл. 1), и небольшое количество простых тандемных повторов Abekl2L-45 (простой повтор TTGTG); например, фрагмент Abekl2L-41 содержит микросателлит (ТААААА)2, Abekl2L-186 содержит микросателлитный тракт (CAAAAA)n, Abekl2L-33 - фрагмент с вырожденным микросателлитным трактом (ТАСАА). Между тем, тандемные повторы играют важную роль в геноме. Известно, что сатДНК внутри вида могут обладать как видоспецифичным, так и хромосомоспецифичным характером.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности, гомологичные фрагментам библиотеки AbekI2L в геномах: a) An. gambiae, б) Ае. aegipti, в) D. melanogaster.

а)_

С^ижяг Хрсмоссмная локализация Пэследокпельносш, прояшвшиезгшмую гсмспогию Гсмспогия % High Score Наименыная суммарная BepcetiHocib

АШ2Ь211 3R 3L AgamR3:3R532006&4:l ипронЕ5Т lA^mP3:3L:l:41963435:l 83 61 50 72e№ 0.00091

Abekt2L-l37 2L Ag3tnP32L: 1:49364325:1 93 38 0.66

Abekl2L-l38 2R AgammR-1:61545105:1 SA 27 0.9991

Abdd2L-150 LNKNdna AgmP3:UNKN: 1:42389979:1 75 35 0.997

Abdd2L-45(2) 2L AgamH32L:l:49364325J 97 55 l.Oe™

Abekl2L-48 X AgimKX 124393108:1 LTR 86 34 0.0024

а

Фрагмент Хромосомная жжалгаация Последовагелшосш, проявиншезитмую гомологию Гсмошгая % High Score Наиметьшая суммарная ВфСВПНЭСТЬ

Abek£2U37 superoonll.8: 3R AaegLl siperoonfl 8.: 1:4905038:15086030150860500 93 36 100 fswBS 0.18 0.66

Abekl2U33 2L BDGP5.42L 123011544:1 75 29 0.76

Abdd2L-215 superccntf.48 AaegU Sfeoonfl .48:13355344:1 61 36 0.55

Abdd2Lr209 supercon±577 AaegU supacortl577:1:756046:1 88 70 1.3eu

AbekEU86 superoond.74 Aae^J supocond .74:129174821 65 48 4.6e^

Фрагмент Хрсмосомгая локализация Посвдовагелыюсщ, проявившие эснимую гомологию Гомология % Kj^iSoore Наименыная суммзргая вессишосгь

AbeM2L-67 нагаесша AJ270939|AJ270939.1 59 157(sw)

Abekl2L-53 X BDGR5.4X 1:22422827:1 55 32 0.92

Abekl2L^4 4 BDGP5.4:4:1:1351857:1 76 29 0.999

Abekl2L-39 неияесша АВЭ14296|АН)1429б.4 48 206(sw)

Abekl2L-125 3L ACQZ3675|ACQ23675.4 G>p,yl2-I,LTR 59 143(sw)

Abdd2L-l 14 3RHet BDGP5.4:3Rbtt 12517507:1 FB4_DM,Tc1 67 36 0.W5

AbekEL-93 3R BDGP5.4:3R:127905053:1 с районом ишрона гаи DOR2R 83 29 0.9995

Abekl2L-130 2L BDGR5.42L: 1 '23011544:1 топология с инн chioo 81 29 0.76

Примечание: High Score - значение, вычисляемое из чиста брешей и замен в сравниваемых последовательностях нуклеотидов. Наименьшая су ммарная вероятность - вероятность случайного сходства сравниваемых последовательностей.

Такая ДНК территориально фиксирована на хромосоме и, возможно, участвует не только в определении положения хромосомы в пространстве (взаимное расположение между хромосомами), но и влияет на некоторые генетические процессы (Кузнецова и др., 2002; Cremer, 2006). Гены, кодирующие белки, для этого очень консервативны и не могут обеспечить всех межвидовых и индивидуальных различий между особями одного вида. В то же время, однозначно, тандемные повторы являются важной структурно-функциональной частью генома.

3. Классификация РП хромосомы 2L An. beklentisltevi по программе ChrClass.

Компьютерная программа ChromomerClass способна классифицировать фрагменты (области) хромосомной ДНК по их принадлежности к тем или иным «структурным» участкам хромосомной ДНК, предположительно лежащим в основании разных типов петель хроматина: MAR/SAR (Matrix/Scaffold Association Region), ДНК ядерной ламины (ялДНК), ДНК синаптонемного коплекса (скДНК) и ДНК розеткоподобных структур (рсДНК) («структурные» участки хромосомной ДНК) (Glasko et al., 2001). Районы прикрепления хромосом к ядерной оболочке по определению должны входить в класс особых хромосомных участков - MAR/SAR (Gasser, Laemmli, 1987). Так как фрагменты ДНК библиотеки Abekl2L принадлежат к РП хромосом к ядерной оболочке, было интересно выявить отношение фрагментов к различным классам «структурных» участков хромосомной ДНК.

Ранее было установлено, что порядка 80 - 90% изученных фрагментов ДНК минибиблиотеки из района прицентромерного гетерохроматина (РП) хромосомы 2R An. atroparvus и РП хромосомы XL An. messeae классифицируются как те или иные «структурные» участки хромосом. У An. atroparvus в большем количестве представлены последовательности ДНК, относящиеся к скДНК - 59%, однако, выявляются и последовательности ДНК, относящиеся к ялДНК - 7%, к MAR/SAR относится 14% фрагментов (Грушко и др., 2004). Таким образом, несмотря на отсутствие прочного крепления изучаемого района прицентромерного гетерохроматина к оболочке ядра в трофоцитах яичников у An. atroparvus, в его составе присутствуют потенциальные «структурные» участки хромосом. Следовательно, одного наличия подобных последовательностей ДНК ещё недостаточно для формирования прочной связи хромосомы с ядерной оболочкой. У An. messeae 19% фрагментов относятся к MAR/SAR, 21% - к ялДНК, 16% - скДНК и 37% -срДНК (Артемов, неопубликованные данные). При анализе последовательностей библиотеки Abekl2L на принадлежность к «структурным» участкам хромосом, с помощью программы ChrClass было выяснено, что ими обладают 90% исследуемых фрагментов, из них 37% относятся к MAR/SAR, 28% - к ялДНК, 22% - скДНК, 13% - срДНК. Таким образом, РП трех видов малярийных комаров отличаются по представленности различных классов «структурных» участков хромосом.

У An. beklemishevi наиболее представлен класс MAR/SAR - 37%, у An.

13

atroparvus скДНК - 59%, у Ап. messeae срДНК - 37%. К тому же участок РП хромосомы 2 R Ап. atroparvus эволюционно исходного вида отличается по морфологии взаимодействия с ядерной оболочкой (не имеет прочного крепления) от РП хромосомы 2L вида Ап. beklemishevi и РП хромосомы XL Ап. messeae, имеющих «жесткое» крепление к ядерной оболочке. Что может говорить о взаимосвязи между морфологическим типом отношения хромосом к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе установлено, что ДНК района прикрепления хромосомы 2L Ап. beklemishevi к ядерной оболочке имеет гетерохроматиновую природу, так как содержит последовательности, характерные для прицентромерного гетерохроматина отряда Díptera. Об этом свидетельствуют результаты поиска гомологии с использованием компьютерных баз геномов Díptera. Были найдены гомологичные последовательности фрагментов ДНК района прикрепления хромосомы 2L Ап. beklemishevi к ядерной оболочке с геномом видов Ап. gambiae, Ае. aegypti, и D. melanogaster.

В ДНК района прикрепления хромосомы 2L Ап. beklemishevi методом биоинформатики были обнаружены мобильные элементы, тандемные и сателлитные повторы, а также последовательности, гомологичные фрагментам генов D. melanogaster. Все последовательности не являются районами прикрепления в геномах Ап. gambiae, Ае. aegypti и D. melanogaster.

Показано, что состав ДНК РП к ядерной оболочке хромосомы 2L Ап. beklemishevi характеризуется частичным сходством с составом ДНК РП всех районов прикрепления хромосом у Ап. atroparvus, Ап. messeae и района прикрепления хромосомы XL у Ап. messeae. В результате нельзя сказать, что РП к ядерной оболочке хромосомы 2L Ап. beklemishevi и РП хромосомы XL Ап. messeae обладают какими-то уникальными последовательностями, которые обеспечивают характерный морфологический тип организации хромосом по отношению к ядерной оболочке - «жесткое» прикрепление хромосомы к оболочке ядра. Кроме того гомологичные последовательности фрагментов РП хромосомы 2L Ап. beklemishevi были найдены в геномах других Díptera, но они не являются РП этих видов. Тем не менее, молекулярный состав ДНК района прикрепления хромосомы 2L обнаруживает лишь единичные случаи гомологии при сравнении последовательности минибиблиотек из прицентромерного района хромосомы 2R Ап. atroparvus, района прикрепления 2Ь-с хромосомы Ап. messeae и хромосомы 2L Ап. beklemishevi. Это, видимо, связано с особенностями взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой. Интересно, что РП к ядерной оболочке хромосомы 2L Ап. beklemishevi обнаружил сходство со всеми прицентромерными участками хромосом трех видов Drosophila подгруппы melanogaster с различным морфологическим типом организации хромосом по отношению к ядерной оболочке D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri. Необходимо отметить, что у D. melanogaster был выявлен наиболее интенсивный сигнал in-situ гибридизации, что может быть обусловлено как высокой копийностью (представленностью) гомологичных

14

последовательностей, так и наличием большего количества гомологичных последовательностей в библиотеке Abekl2L с РП хромосом D. melanogaster, или же — и тем и другим.

При анализе последовательностей библиотеки Abekl2L на принадлежность к «структурным» участкам хромосом, с помощью программы ChrClass было выяснено, что к ним относятся 90% исследуемых фрагментов, из них 37% -MAR/SAR, 28% - к ялДНК, 22% - скДНК, 13% - срДНК. Интересно, что при сравнении по этому же критерию участков ПГ 2R An. atroparvus, и РП хромосомы XL An. messeae классифицируются как те или иные «структурные» участки хромосом так же 80 - 90% исследуемых фрагментов. Однако представленность разных типов «структурных» участков хромосом в РП у всех трех видов различна. Это можно объяснять как тем, что исследуемые РП относятся к разным видам комаров, так и тем, что они принадлежат к разным хромосомам.

Таким образом, расположение хромосом в ядре и их взаимоотношение с ядерной оболочкой не определяется универсальными последовательностями ДНК в РП, но, возможно, определяется сложными сочетаниями определенного числа копий определенных нуклеотидных последовательностей или композициями нуклеотидных последовательностей РП.

ВЫВОДЫ

1. Получена библиотека клонов из района прикрепления хромосомы 2L к ядерной оболочке трофоцитов яичников An. beklemishevi, которые затем использовали для анализа первичной структуры ДНК района прикрепления.

2. Локализованы нуклеотидные последовательности из РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Díptera. Гомологичные нуклеотидные последовательности обнаружены во всех районах прикрепления хромосом у An. beklemishevi An. atroparvus и An. messeae, кроме района прикрепления хромосомы XL у An. messeae.

3. Впервые показана взаимосвязь между морфологическим типом отношения хромосом к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП.

4. Показано, что ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi имеет типичный для прицентромерного гетерохроматина состав: содержит повторяющиеся последовательности ДНК, гомологичные мобильным элементам класса LINE семейства LI, GYPSY 12-1 D. melanogaster, простым тандемньтм повторам (TTGTG), сателлитам (ТААААА2), (СААААА)п, фрагментам генов An. gambiae, Ае. aegypti и D. melanogaster.

5. Нуклеотидные последовательности библиотеки Abekl2L содержат в своем составе предполагаемые «структурные» участки хромосом, к ним относятся 90% исследуемых фрагментов, из них 37% - MAR/SAR, 28% - к ялДНК, 22% -скДНК, 13% - срДНК. Три вида малярийных комаров можно различить между собой по наиболее представленным классам «структурных» участков ДНК: An. beklemishevi - MAR/SAR, An. Atroparvus - скДНК, An. Messeae - срДНК.

ñ

г - /

/Л /

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК

1. Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Артемов Г.Н., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Молекулярно-цитогенетическое изучение ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 малярийных комаров вида Anopheles beklemishevi Stegniy et Kabanova (Culicidae, Díptera) // Генетика. -

2009. - Т. 45. - № 1. - С. 1-15.

2. Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Елисафенко Е..А., Стегний В.Н. Изучение молекулярного состава прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 малярийных комаров (Díptera,Culicidae) // Генетика. - 2010. - Т. 46.-№9. -С. 1307-1311.

Статьи и тезисы в других изданиях

3. Стегний В.Н., Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Артемов Г.Н. Молекулярно-цитогенетический анализ участков прикрепления хромосом к ядерной оболочке у малярийных комаров // Цитология. - 2007. - Т. 49. - № 9. -С. 796-797.

4. Стегний В.Н., Артемов Г.Н., Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Усов К.Е. Принципы молекулярно-цитогенетической организации хромосомных локусов, обеспечивающих трехмерную организацию интерфазного ядра // Цитология. —

2010.-Т. 52.-№ 8.-С. 683.

5. Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Артемов Г.Н., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Сравнительный анализ молекулярного состава прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом малярийных комаров рода Anopheles (CULICIDAE, DIPTERA) // Вестник Томского государственного университета. Серия Биология. - 2007. - № 1. - С. 96-106.

6. Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Стегний В.Н. Молекулярно-цитогенетическое изучение ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 комаров комплекса ANOPHELES MACULIPENNIS // Материалы международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы клеточной и молекулярной биологии». - Томск. - 2007. - С. 156.

7. Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Елисафенко Е.А., Стегний В.Н. Изучение молекулярного состава прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 малярийных комаров (Díptera,Culicidae) // Материалы международной конференции «Хромосома 2009». - Новосибирск. - 2009. - С. 153.

8. Сайджафарова А.О. (Пищелко А.О.), Елисафенко Е.А., Стегний В.Н. Молекулярная структура прицентромерного гетерохроматина хромосом ANOPHELES // Материалы международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «Карио V». — Новосибирск. — 2010. - С. - 63.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пищелко, Анна Олеговна, Москва

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИМ ИНСТИТУТ

БИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ ТОМСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА

На правах рукописи

04201460415

Пищелко Анна Олеговна

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДНК РАЙОНА ПРИКРЕПЛЕНИЯ ХРОМОСОМЫ 2L К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ МАЛЯРИЙНОГО КОМАРА ANOPHELES BEKLEMISHEVI (DIPTERA, CULICIDAE)

Генетика -03.02.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д-р биол. наук, профессор В.Н. Стегний

МОСКВА -2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1 Гетерохроматин - эволюционно значимая часть генома эукариот 11

1.2 Структурно-функциональные особенности

гетерохроматина интерфазных ядер 17

1.3 Молекулярный состав гетерохроматина 24

1.4 Гетерохроматин политенных хромосом Diptera 34

1.4.1 Drosophila 35

1.4.2 Anopheles 38 1.5. Таксономия комплекса maculipennis 41

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47

2.1 Характеристика объекта исследования 47

2.2 Приготовление цитологических препаратов политенных хромосом 47

2.3 Микродиссекция с последующим получением ПЦР-

продукта 48

2.4 Микроклонирование ПЦР-продукта 49

2.5 In situ гибридизация ДНК-пробы из хромосомы 2L An. beklemishevi на геномную ДНК исследуемых видов 50

2.6 Выделение геномных ДНК An. beklemishevi, An. messeae,

An. atroparvus 52

2.7 Выделение плазмидной ДНК 52

2.8 Секвенирование клонов минибиблиотеки Abekl2L 53

2.9 Анализ последовательностей ДНК 53

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 5 5 3.1 Особенности локализации ДНК района прикрепления 55

хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Díptera

3.1.1 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомах видов Anopheles комплекса maculipennis

3.1.2 Особенности локализации ДНК района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi (Abekl2L) на хромосомах видов D. melanogaster, D. erecta, D. teissieri

3.1.3 Характеристика последовательностей ДНК минибиблиотеки Abekl2L

3.2 Взаимосвязь особенностей молекулярного состава ДНК и

прикрепления к оболочке участков прицентромерного

гетерохроматина политенных хромосом комаров комплекса

Anopheles maculipennis

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений и обозначений ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Atr2R - минибиблиотека из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus

Abekl2L - минибиблиотека из прицентромерного гетерохроматина

хромосомы 2L An. beklemishevi

ПГ - прицентромерный гетерохроматин

РП - район прикрепления хромосомы к оболочке ядра

ПЦР - полимеразная цепная реакция

DOP-ПЦР - полимеразная цепная реакция с частично вырожденными праймерами

кДНК — ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в реакции, катализируемой обратной транскриптазой.

МГЭ- мобильные генетические элементы M/SAR - Matrix/Scaffold Association Region п.н. - пар нуклеотидов

срДНК - ДНК из белковых сердцевин розеткоподобных структур, скДНК - ДНК синаптонемного комплекса, ялДНК - ДНК ядерной ламины т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Современный взгляд на структурную организацию генома предполагает существование хромосомных территорий и связь хромосом с ядерной оболочкой. В этом процессе большую роль играет гетерохроматин, обеспечивающий динамичность хромосомно-мембранных отношений, что предусматривает его важную роль в эволюции эукариот. Различия в составе, количестве, структуре и распределении характеризуют гетерохроматин как фактор, сопутствующий видообразованию (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Жимулев, 1993). Одной из главных черт, отличающей гетерохроматин, является наличие повторенных последовательностей ДНК, что определяет его как быстро эволюционирующую часть генома. Состав и сочетание высоких и умеренных повторов, с включенными в них мобильными элементами, а также их разнообразие и особенности кластерной представленности, видимо, имеет специфичность и определяет особенную структуру гетерохроматина различных видов (Dimitri et al, 2009, Stacie et al, 2009). Прицентромерные гетерохроматиновые районы (ПГ) хромосом часто являются районами прикрепления (РП) к ядерной оболочке, поэтому изучение прицентромерного гетерохроматина позволяет расширить знания о влиянии изменений состава гетерохроматина на пространственную структуру ядра. Уникальным объектом для данных исследований являются малярийные комары рода Anopheles комплекса maculipennis (Díptera, Culicidae), которые обладают хорошо структурированными политенными хромосомами в ядрах трофоцитов яичников у самок имаго и в ядрах слюнных желёз у личинок.

Политенные хромосомы в ядрах трофоцитов яичников восьми видов комаров комплекса maculipennis имеют четкие различия по наличию, либо отсутствию облигатного прикрепления к ядерной оболочке, по морфологии участков прикрепления и по внутрихромосомному расположению РП (Стегний, 1979, 1987). У мух рода Drosophila - Drosophila melanogaster (Meigen, 1830) и Drosophila virilis (Sturtevant, 1916) также были обнаружены структурные изменения прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом и их отношения к ядерной оболочке при видообразовании (Стегний, Вассерлауф, 1994; Стегний и др, 1996). Изучение гетерохроматина в группах близкородственных видов является актуальным, поскольку позволяет проследить процесс видообразования. Среди восьми видов комплекса наиболее яркие различия прицентромерного гетерохроматина по структуре и взаимодействию с ядерной оболочкой наблюдаются у вида Anopheles atroparvus (van Thiel, 1927) в районе прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R. Молекулярный состав данного района является характерным для конститутивного гетерохроматина, образован повторяющимися

последовательностями ДНК, мобильными элементами и структурными генами. Результаты флуоресцентной in situ гибридизации районспецифичного ДНК-зонда Atr2R из района прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2R на политенные хромосомы трофоцитов яичников малярийных комаров An. atroparvus, Anopheles messeae (Falleroni, 1926), Anopheles beklemishevi (Stegnii et Kabanova, 1976) показали наличие гомологичных последовательностей со всеми районами прицентромерного (а- и ß-) гетерохоматина хромосом данных видов, кроме прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi (Грушко и др, 2004). Поэтому для изучения

состава ДНК был выбран район Р-гетерохроматина прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L An. beklemishevi, поскольку он имеет «жесткое» крепление к оболочке ядра и, видимо, сильно отличается по молекулярному составу от нуклеотидных последовательностей прицентромерного

гетерохроматина хромосомы 2R An. atroparvus.

Цель и задачи исследования Целью исследования является сравнительный межвидовой анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L малярийного комара An. beklemishevi и сравнение его с ДНК районов прикрепления хромосом уже изученных видов комплекса maculipennis. Задачи исследования:

1 получить минибиблиотеку фрагментов хромосомной ДНК из РП левого плеча хромосомы 2 An. beklemishevi (Abekl2L) методом микродиссекции с последующей амплификацией и клонированием в плазмидном векторе, определить первичную последовательность полученных фрагментов ДНК;

2 провести сравнительный анализ локализации нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидным последовательностям библиотеки Abekl2L в хромосомах An. beklemishevi, An. atroparvus, An. messeae\

3 проверить возможность наличия/отсутствия взаимосвязи между морфологическим типом отношения хромосомы к ядерной оболочке и паттерном нуклеотидных последовательностей РП на примере близкородственных видов двух родов Díptera: Anopheles и Drosophila;

4 определить нуклеотидную последовательность ДНК клонов фрагментов минибиблиотеки Abekl2L методом секвенирования. Провести аннотирование последовательностей ДНК минибиблиотеки при помощи различных методов биоинформатики;

5 выявить отношения фрагментов ДНК из РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi к фрагментам ДНК, предположительно участвующим в формирование разных типов петель хроматина: MAR/SAR, ДНК ядерной ламины, ДНК синаптонемного комплекса, ДНК розеткоподобных структур.

Научная новизна.

Впервые на молекулярно-цитологическом уровне изучены нуклеотидные последовательности РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi. Определена первичная нуклеотидная последовательность данного участка хромосомной ДНК, в результате анализа которой было выявлено наличие повторяющихся последовательностей ДНК, гомологичных разнообразным мобильным элементам класса LINE семейства LI, GYPSY 12-1 D. melanogaster, простым тандемным повторам (TTGTG), сателлитам (ТААААА)2, (СААААА)п, фрагментам генов An. gambiae, Ае. aegypti и D. melanogaster. При сравнении нуклеотидных последовательностей минибиблиотеки изучаемого района An. beklemishevi и минибиблиотеки из района прикрепления 2L An. atroparvus между собой найдено только две пары фрагментов ДНК с высокой степенью гомологии (95 %). При помощи методов биоинформатики обнаружено, что в составе последовательностей ДНК минибиблиотеки РП к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi присутствуют нуклеотидные последовательности, относящиеся к последовательностям MAR/SAR, ялДНК, скДНК (предполагаемые «структурные» участки хромосом). РП прикрепления к ядерной оболочке хромосомы 2L An. beklemishevi отличается по соотношению представленности разных классов «структурных» участков хромосом как от РП хромосомы 2R An. atroparvus так и от РП An. messeae.

Практическая значимость.

В настоящей работе впервые проведено молекулярно-цитогенетическое исследование нуклеотидных

последовательностей РП хромосомы 2Ь Ап. ЪеЫетЬБкеуЬ; получена минибиблиотека клонов ДНК этого района, определена первичная последовательность РП прикрепления к ядерной оболочке хромосомы 2Ь Ап. Ьек1ет15Иеуг. Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание механизма структурной реорганизации генома эпидемилогически опасных малярийных комаров комплекса тасиИрепп18 в процессе видообразования. Апробация результатов.

Результаты работы представлены на Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.), на Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных «Карио V» (Новосибирск, 16 - 20 августа 2010 г.). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, дае из которых - статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК. Личный вклад автора.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Автор самостоятельно планировал эксперименты и обобщал полученные результаты. Микродиссекция и БОР-ПЦР проводились совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН). Секвенирование фрагментов библиотеки АЬек12Ь на начальном этапе проводилось совместно с к.б.н. М.В. Лебедевой (НИИ МГ СО РАМН), далее самостоятельно. Компьютерный анализ первичных

последовательностей выполнен совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко (ИЦиГ СО РАН). FISH ДНК из прицентромерного района хромосомного плеча 2L An. beklemishevi с политенными хромосомами близкородственных видов Drosophila подгруппы melanogaster проведена при участии к.б.н. К.Е. Усова (НИИ ББ ТомГУ).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, заключение, выводы и список литературы. Библиографический список включает 142 источника. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 8 таблицами.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Гетерохроматин - эволюционно значимая часть генома

эукариот

Гетерохроматин является специфической частью хроматина. В 1904 году хроматин был охарактеризован Т. Бовери как вещество клеточного ядра, которое в процессе митоза преобразуется в хромосомы. Позднее понятие хроматина Э. Гейц дополняет двумя новыми понятиями - гетерохроматин и эухроматин. Уже на раннем этапе исследований гетерохроматина было обнаружено, что распределение этого элемента хроматина в клеточном ядре закономерно связано с определенными участками хромосом и хромосомами в целом. Например, гетерохроматином полностью образована половая У-хромосома и большая часть половой X-хромосомы многих видов животных и растений. Так, у П. melanogaster полностью гетерохроматизирована У-хромосома и около 40 % Х-хромосомы. Так же, стало очевидным широкое распространение гетерохроматиновых районов: в области ядрышкового организатора, в области центромер, в теломерных районах (Прокофьева-Бельговская, 1986). Открытие политенных хромосом с высокой степенью политенизации у двукрылых позволило более детально изучить свойства гетеро- и эухроматиновых районов. Оказалось, что гетерохроматические зоны хромосом организованы так же, как и эухроматические -имеют нуклеосомную организацию (ОНпв, ОНпб, 1974), но многочисленные исследования гетерохроматина выявили особые его цитологические, молекулярные и генетические свойства. Гетерохроматин чаще всего располагается в прицентромерных районах, иногда в теломерных областях. Обнаружены вкрапления

гетерохроматина в эухроматиновые участки хромосомных плеч. Такой гетерохроматин называют интеркалярным, он хорошо заметен в сильно декомпактизованных хромосомах, например, в политенных. Расположение и количество гетерохроматина на хромосомах видоспецифично (Redi et al., 2001).

Ряд методов специфичных окрасок позволяет выявить ярко окрашивающийся, блочный гетерохроматин - а-гетерохроматин, который составляет, как правило, саттелитная ДНК. р-гетерохроматин присутствует в виде рыхлых зернистых блоков и занимает большую часть прицентромерной области. Он преимущественно образован мобильными элементами и их производными и содержит меньше повторов (Прокофьева-Бельговская, 1986). Переход между этими типами гетерохроматина определить довольно сложно (Zhimulev, 2003). У большинства видов эукариот хромосомы содержат как эу-, так и гетерохроматиновые участки. Чаще всего, у эукариот гетерохроматин сконцентрирован в блоки (около миллиона пар нуклеотидов), в основном, в прицентромерных и субтеломерных районах всех хромосом (Redi et al., 2001). Гетерохроматин составляет значительные части геномов - до 60% геномов некоторых организмов и около 30% геномов человека и дрозофилы (Прокофьева-Бельговская, 1986; Gatti, PimpinelH, 1992; Жимулев, 1993).

Первые исследования гетерохроматина на предмет активности в клеточном метаболизме привели ученых к выводу о нейтральности его функций и мнению о том, что гетерохроматин является балластом в структуре хромосомы. В начале 70-х г.г. прошлого столетия было экспериментально доказано наличие сателлитных последовательностей в гетерохроматине, а затем и содержание в них некоторых РНК-кодирующих

последовательностей (Commings, Mattoccia, 1972; Gall et al., 1971). Эти факты указывали на наличие определенных функциональных свойств гетерохроматина. Всего за время изучения гетерохроматина были открыты следующие его свойства. Первым открытым свойством является сохранение компактного состояния на протяжении почти всего клеточного цикла (Heitz, 1928). Впоследствии обнаружили преимущественную локализацию гетерохроматина на периферии интерфазного ядра, а связи его с ядерной оболочкой имеют пространственно упорядоченный характер. Такое взаимодействие является основой как для упорядочения хромосом между собой, так и по отношению к ядерной оболочке в интерфазном ядре в целом (Paddy et al., 1990; Belmont et al., 1993; Marshall et al., 1996; Carvalho et al., 2001; Sage, Csink, 2003; Стегний, 1993). Гетерохроматин реплицируется в самом конце S-фазы (Lima-de Faria, Jaworski, 1968; Прокофьева-Бельговская, 1986), благодаря, в том числе, и альтернативным механизмам инициации процесса, которые различны для эу- и для гетерохроматина, и регулируются независимо друг от друга (Груздев, 1999). Таким образом, проявляется лабильность репликации гетерохроматина, что обеспечивает избирательное функционирование и гетерохроматиновых районов, и прилегающих к ним эухроматиновых районов в онто- и филогенезе (Прокофьева-Бельговская, 1986). В политенных хромосомах наблюдается недорепликация гетерохроматина прицентромерных районов (Rudkin, 1965, Жимулев, 1993). Гетерохроматин наделяет специфическими свойствами прилегающие участки хромосом. Например, такие участки могут обладать повышенной мутабельностью генов, высокой вероятностью разрывов и хромосомных перестроек (Прокофьева-Бельговская, 1938; 1986). Эти свойства гетерохроматина имеют большое значение, особенно

принимая во внимание его молекулярный состав. Сейчас известно, что гетерохроматин является не менее важной частью генома, чем эухроматин. (Корочкин, 1983; Стегний, 1991; Кикнадзе и др., 1991, Dimitri et al., 2005, 2009).

Гетерохроматин содержит повторяющиеся последовательности ДНК и обогащен этими последовательностями (Britten, Kohne, 1968, цит. по Жимулев,1993). Повторенные последовательности обнаружили в результате градиентного центрифугирования в хлористом цезии. Эти последовательности ДНК были названы сателлитными ДНК (сатДНК) (по аналогии со спутник - сателлит), так как при центифугировании кроме основной фракции выделилось еще несколько - о�