Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный цитогенетический анализ гетерохроматина политенных хромосом малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный цитогенетический анализ гетерохроматина политенных хромосом малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis"

На правах рукописи УДК:575.2(8):595.771

V. /

ч

^IIIAPАХОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕТЕРОХРОМАТИНА ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ КОМПЛЕКСА ANOPHELES MACULIPENNIS

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1997

Работа выполнена в НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.Н.Стегний,

НИИ биологии и биофизики

Томского государственного университета, г. Томск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.Ф. Жимулев, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Л.В.Высоцкая, Новосибирский государственнный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт медицинской генетики РАМН, г. Томск.

Защита диссертации состоится 1997 г.

на Ц/П^лсп - заседании диссертационного совета Д-002.11.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институт« цитологии и генетики СО РАН в конференцзале Института по адресу: 630090 Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10. С диссертацией можно оз накомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан " "//^ /С^С^!^-^^^ 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, ^ ._______________

доктор биологических наук________ А.Д.Грузде]

Актуальность проблемы.

Одной из центральных задач эволюционной цитогенетики является решение проблемы структурно-функциональной реорганизации генома при видообразовании и внутривидовой генетической адаптации популяций (Стегний, 1993). При этом наиболее сложным является вопрос о роли гетерохроматина в этих процессах (обзор Прокофьева-Бельговская, 1986; обзор Жимулев, 1993). Гетерохроматиновые модификации, сопровождающие видообразование, наиболее детально изучаются на представителях двукрылых насекомых, среди которых особый интерес представляют малярийные комары. Исследование этой группы Díptera представляется перспективным в силу ряда специфических особенностей объекта: 1) наличия структурированных политенных хромосом в различных тканях (Coluzzi, 1968), и в том числе в генеративной, для которой характерна более высокая степень репликации гетерохроматина (Redfern, 1981); 2) детально изученной архитектоники политенных ядер (Стегний, 1979; 1987а; б); 3) подробно исследованной филогении (Kitzmiller et al., 1967; Kitzmiller, 1976; Стегний, 1976a; 19916).

Проведение сравнительного цитогенетического анализа гетерохроматина политенных хромосом различных тканей малярийных комплекса Anopheles maculipennis представляется актуальным в нескольких аспектах. Цитогенетиче-ский анализ структуры политенных - хромосом соматической и генеративной системы выявил наличие существенных отличий в их организации в районах прицентромерного гетерохроматина (ПГ). Поэтому возникла необходимость более тщательного цитогенетического сравнения и картирования этих областей хромосом в различных тканях комаров (слюнных железах и питающих клетках яичников).

Проведенные ранее эволюционные исследования показали, что видообра-зователыше события у малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis связаны с возникновением фиксированных хромосомных инверсий (Стегний, 1981), причем детальный анализ мест разрывов хромосом показал существование на хромосомах "горячих" зон, в которых наблюдается явная концентрация разрывов у различных видов комплекса (Стегний, 19766). Поэтому возникла необходимость выяснить молекулярную природу данных районов хромосом. Кроме того, ранее было показано существование четких видовых отличий пространственного расположения хромосом в политенных ядрах трофоцитов яичников (Стегний, 1979). Эти отличия связаны с изменениями зон прикрепления хромосом к ядерной оболочке! (Стегний, 19876), которые являются гетерохроматиче-

скими и формируются в основном прицентромерным гетерохроматином (Стегний, Шарахова, 1991). Поэтому возник интерес к исследованию цитогене-тических отличий в морфологии ПГ у разных видов комплекса, так как возможно именно эти изменения являются причиной пространственных реорганизаций ядер в ходе эволюции.

Исследование генетических механизмов адаптации в природных популяциях малярийного комара A. messeae Fall, выявило, наряду с наличием инверсионного полиморфизма (Стегний, 1991), существование еще одной полиморфной системы, связанной с размерами блоков прицентромерного гетерохроматина (Шарахова и др., 1996). Изучение межпопуляционных различий в размерах блоков ПГ представляло интерес в плане выявления возможного влияния данной системы полиморфизма на процессы адаптации природных популяций.

Вместе с тем привлечение к изучению гетерохроматина новых, ранее не изученных объектов, какими являются малярийные комары комплекса Anopheles maculipennis, актуально в плане выяснения универсальности организации самого гетерохроматина как на структурном, так и на функциональном уровне.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы является сравнительный цитогенетический анализ гетерохроматина политенных хромосом восьми видов малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis. Для достижения этой цели были поставлены следующие конкретные задачи.

1. Изучить свойства гетерохроматина политенных хромосом слюнных желез и питающих клеток яичников с помощью методов дифференциального окрашивания и in situ гибридизации различных повторяющихся последовательностей ДНК.

2. Сравнить структурные особенности гетерохроматина политенных хромосом слюнных желез и питающих клеток яичников у малярийного комара Anopheles messeae Fal.

3. Исследовать межвидовые особенности морфологии прицентромерного гетерохроматина у различных видов комплекса Anopheles maculipennis.

4. Изучить закономерности внутривидового варьирования свойств прицентромерного гетерохроматина, встречающегося у некоторых видов комплекса.

Научная новизна.

Впервые проведен сравнительный цитогенетический анализ гетерохрома-тина политенных хромосомах слюнных желез и питающих клетках яичников у палеарктических видов малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis. С помощью методов дифференциального окрашивания выделено два типа организованного в виде блоков а-гетерохроматина: прицентромерный и интерка-лярный. Сравнительный анализ прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом слюнных желез и питающих клеток яичников выявил его существенную недорепликацию в слюнных железах. Изучение особенностей морфологии прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов у разных видов комплекса выявило как межвидовое, так и внутривидовое варьирование его организации. Показано, что изменение числа блоков гетерохроматина имеет широтный градиент как в пределах отдельных видов, так и во всем комплексе. Выявлена повышенная устойчивость к воздействию энтомопатоген-ных бактерий у особей A. messeae с наименьшими размерами прицентромерных блоков. Основные результаты получены автором самостоятельно.

Практическая ценность.

Данная работа представляет ценность с точки зрения эпидемиологии, как теоретическая основа для разработки генетических методов борьбы с малярийными комарами, как переносчиками опасного заболевания. Кроме того, предложен ряд модификаций стандартных методик выявления локализации гетерохроматина на политенных хромосомах у малярийных комаров, которые могут быть успешно применены для изучения гетерохроматина у различных групп Díptera.

Апробация результатов.

Результаты работы были представлены на VI и VII Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом", Пущино 1988, 1991; на III Школе- семинаре по генетике и селекции животных, Алтай, 1989; на 1-й Всесоюзной конференции по генетике насекомых, Москва, 1991; на VI съезде Общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова, Минск, 1992; на 1-ом съезде ВОГИС, Саратов, 1994; на XX Международном Энтомологическом Конгрессе (XX International Congress of Entomology), Флоренция, Италия, 1996; на 10-ой конференции Европейского общества экологии переносчиков (10th. European SO VE Meeting), Страсбург, Франция, 1996 и на XII Всеросийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра, Санкт-Петербург, 1996.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Благодарности.

Автор выражает благодарность В.Н. Стегнию за интересную постановку проблемы исследования и творческое руководство, а также Т.С. Пестряковой, инициатору генетических исследований малярийных комаров в Томском университете, за ценные советы при написании диссертации и постоянную поддержку в ходе работы. Выражаю искреннюю признательность В .А. Бурлаку и И.В. Шарахову за участие в проведении некоторых экспериментов и обсуждение работы, Э.М. Баричевой, Т.П. Лушниковой, М.О. Протопопову и А.К. Сибатаеву за методическую помощь, а также Т.В. Ананьиной за участие в оформлении диссертации и всем студентам и сотрудникам лаборатории за помощь и моральную поддержку.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения; а также выводов и списка цитируемой литературы (247 наименований). Работа изложена на 155 страницах, проиллюстрирована 2â рисунками и содержит 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы.

Таблица 1. Виды Anopheles, использованные в работе.

ВИДЫ МЕСТО СБОРА ГОД ЧИСЛО ОСОБЕЙ

личинки имаго

A. labranchiae Италия, Рим 1995 - 16

A. atroparvus лаб. культивирование 1991-1994 12 97

A. martinius Туркменистан, Ташауз 1980 - 45

A. sacharovi лаб. культивирование 1991 12 12

A. beklemishevi Томская обл.Тегульдет 1993 14 32

A. maculipennis Сочи, Совхоз "Россия" .1991 10 83

A. subalpinus Сочи, Совхоз "Россия" 1991 10 10

A. messeae Томская обл. Коларово 1991-1994 12 128

Джамбул.обл.Георгиевка 1992 95 -

Томская обл.Тегульдет 1993 - 60

Павлодар.обл.Черноярка 1994 - 26

Цитогенетнческие методы.

Давленные препараты приготовляли по стандартной лактоацетоорсеиновой методике (Стегний, 1987а). Сухие препараты приготовляли с помощью вымораживания на жидком азоте (Стегний, Шарахова, 1990). С-окрашивание хромосом проводилось по стандартной методике с предварительной обработкой гид-роксидом бария (Sumner,1972). Для получения дифференциального выцветания политенных хромосом трофоцитов A. messeae яичники предварительно обрабатывали 80% молочной кислотой, а затем окрашизали по стандартной методике (Стегний, 1987а). Аналогичный характер выцветания наблюдался при хранении обычных лактоацетоорсеиновых препаратов в течение 5 лет (Стегний, Шарахова, 1991). Дифференциальное энзиматическое переваривание политенных хром-сом трофоцитов A. atroparvus рестриктазами EcoR I, Avail, Нае III и Hind III проводили по методике Mezzanotte (1986).

Молекулярные методы.

ДНК выделяли фенольно-детергентным методом из личинок комаров (Маниатис и др., 1984). Высокоповторяющиеся последовательности ДНК выделяли с помощью обработки S1 нуклеазой (Young et al., 1976). Гибридизацию меченной [3Н] ДНК проводили по стандартной методике (Gall, Pardue, 1971). Сателлит 1,688 и НеТ ДНК D. melanogaster, любезно предоставленные Лохом и Пардью (Lohe, Roberts, 1988; Pardue, Hennig, 1989), метили биотинилированны-ми dNMPs при помощи Enzonick-translation system (Enzo Diagnostic, New York, NY).

Эксперименты на устойчивость личинок комаров к энтомопатогеи-ным бактериям.

В экспериментах на устойчивость личинок комаров A. messeae и А. atroparvus с различными генотипами к воздействию бактерий использовали клоны кристалообразующей бактерии Bacilus thuringiensis subsp. israelensis серо-тип Hl4, любезно предоствленные В.А. Бурлаком. Условия выращивания культуры бактерий описаны ранее (Бурлак, Сибатаев, 1995). Эксперименты проводили в пластиковых кюветах 21x10 см. Доза рабочей суспензии бактерий составляла 40 мкл/повторность. Параллельно с экспериментальной группой выращивали контрольную без патогена. Выживших личинок выращивали до имаго и анализировали хромосомы трофоцитов вылетевших, накормленых кровью самок комаров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Свойства гетерохроматина политенных хромосом A. messeae и А. atroparvus.

Свойства гетерохроматина политенных хромосом. • малярийных комаров были изучены с помощью методов дифференциального окрашивания: С-окраски, предобработки молочной кислотой с последующим окрашиванием лактоацетоорсеином, выцветания при длительном хранении препаратов и дифференциального энзиматического периваривания хромосом рестриктазами (RE-banding), а также гибридизации in situ на политенных хромосомах A. messeae различных повторяющихся последовательностей ДНК (высокоповторякмцихся последовательностей ДНК малярийного комара, сателлита 1.688 и Не-'Г повтора D. meianogaster) (Стегний, Шарахова, 1990; Шарахова и др., 1997а,в).

Изучение дифференциального окрашивания хромосом питающих клеток яичников A. messeae (хромосомы слюнных желез дифференциально не окрашивались примененными нами методами) позволило выделить два типа организованного в виде блоков а-гетерохроматина: прицентромерный и интеркалярный (локализованный во внутренних районах хромосом). Типы значительно отличались между собой по свойствам. Способность к С-окрашиванию проявили только блоки ПГ. Для этих же районов оказалось свойственно интенсивное включения высоких повторов комаров и локализация сателлита 1.688 D. meianogaster (рис.1).

Интеркалярный гетерохроматин дифференциально окрашивался при предобработке хромосом молочной кислотой с последующей окраской лактоацетоорсеином (Шарахова и др., 1997г), а также при длительном хранении препаратов (Стегний, Шарахова, 1990). Анализ других свойств интеркалярного гетерохроматина выявил значительную гетерогенность в их проявлении. Отдельные районы обладали промежуточными свойствами. Так, районы 2Ь и ЮаЬ не всегда выявлялись при дифференциальном окрашивании. Интересно, что район ЮаЬ, имеющий морфологию двух пакетов мелких дисков, наряду с промежуточными свойствами по дифференциальному окрашиванию обнаружил также локализацию умеренного теломерного повтора D. meianogaster (рис. 1).

Гетерогенность по способности к дифференциальному окрашиванию отдельных районов хромосом была обнаружена другими исследователями на хромосомах слюнных желез Ch. thummi и Ch. plumosus (Бадаев и др., 1973; Бе-лянина, Сигарева, 1978).

+ +# + ++ +*+ + ++ ++ + + +

+ +

+ + + +

++ ++

+ + + +

+ + + + +

ГП 1 II I I

+++ +*+ + +++ + +

+ + + +++

+ + +

+

III I (<

+ высокие повторы Не^повтор ИЕ-ЬапсЛпд (ЕсоМ) выцветание в молочной кислоте сателлит 1.688 С-окрашивание

1а 2Ь 4а 5Ь 6а10аЫ5с1 21са 22а 25а-с 326 35Ь 39а XI. С 2Я С 21 314 С 31

Рис.1. Свойства гетерохроиатина политенных хромосом А. шеззеае.

ХЬ, 2П, 21, ЗИ, ЗЬ - плечи хромосом. С- прицентромерные районы. Звездочками обозначены места интенсивного включения высоких повторов.

Теломерные районы хромосом у малярийных комаров дифференциально не окрашивались, но проявили обогащенность высокими повторами.

Таким образом, проведенный анализ позволил выделить два типа а-гетерохроматина: прицентромерный и интеркалярный, а также выявил гетерогенность в организации гетерохроматина малярийных комаров на молекулярном и морфо-функциональном уровне.

Сравнительный цитогенетический анализ гетерохроматина политен-ных хромосом слюнных желез и питающих клетках яичников А. те5кезс.

С целью сопоставления структуры политенных хромосом слюнных желез (Стегний и др., 1976) и питающих клеток яичников у А. теББеае (Стегний, Ша-рахова, 1991) были построены сравнительные карты хромосом. Проведенный анализ показал наличие больного сходства по числу дисков и их относительной яркости. Наиболее существенные межтканевые различия были обнаружены в прицентромерных районах хромосом.

Было показано, что блоки прицентромерного а-гетерохроматина в питающих клетках яичников имеют существенно большие размеры, что свидетельствует об их недорепликации при политенизации в соматических тканях. Кроме того в питающих клетках яичников обнаружено появление дополнительного блока в хромосоме ЗЯ, не выявляемого в слюнных железах. Причем этот блок при С-окрашивании проявлял менее интенсивную окраску, чем основной блок а-гетерохроматина, и обнаруживал меньшую интенсивность включения метки при гибридизации с высокими повторами..

Отличия в степени недорепликации гетерохроматина слюнных желез и питающих клетках яичников малярийных комаров ранее были выявлены также с помощью других методов (ИесИёгп, 1981). Сходное явление политенизации а-гетерохроматина в псевдопитающих клетках яичников обнаружено на О. melanogaster (МаГсеуа, 2]ти1еу, 1993). При этом отмечено общее ослабление проявления всех свойств гетерохроматина в клетках генеративной системы (Мальцева, 1997).

В целом, проведенный анализ показал существование явных межтканевых отличий в организации гетерохроматина политенных хромосом сомати ческой ткани и клеток зародышевого пути, к которым относятся питающие клетки яичников малярийных комаров.

Межвидовые особенности организации гетерохроматина политенных хромосом питающих клеггок яичников и эволюция комплекса Anopheles maculipennis.

Сравнительный цитогенетический анализ гетерохроматина политенных хромосом питающих клеток яичников у восьми видов комплекса выявил существенные различия в морфологических особенностях прицентромеркого гетро-хроматина (ПГ) (Шарахова и др.,1997г). Морфология ПГ у восьми видов малярийных комаров варьировала по следующим показателям: число и размеры блоков а-гетерохроматина (Табл.2), наличие - отсутствие взаимодействия с ядерной оболочкой диффузного прицентромерного хроматина, степень асинапсиса гомологов в прицентромерной зоне (Табл.3).

Таблица 2. Число блоков ПГ з политенных хромосомах трофоцитов яич-

ников у комаров комплекса Anopheles maculipennis.

ВИДЫ ХРОМОСОМЫ ВСЕГО

X 2 3R 3L

A.labranchiae - 1 1 0-1 2-3

A. atroparvus - 2 1 - 3

A. sacharovi - 1 1 - 2

A. beklemishevi 1 1 2 - 4

A. subalpinus - 2 2 - 4

A. maculipennis 0-1 2 2 0-1 4-6

A. messeae 2 1-4 2 - 5-8

Таблица 3. Варьирование морфологии прицентромерного гетерохроматина

трофоцитов яичников у комаров комплекса Anopheles maculipennis

ВИДЫ ДЕСПИРАЛИЗА-ЦИЯПГ КРЕПЛЕНИЕ К ЯДЕРНОЙ ОБОЛОЧКЕ АСИНАПСИС ГОМОЛОГОВ

хромосомы хромосомы хромосомы

X 2 3 Х- 2 3 X 2 3R 3L

A.labranchiae + - + - + + + + - +

A. atroparvus + + + + - + - - + +

A. sacharovi + + - - - + - - - -

A. beklemishevi - - - - + + - + - +

A. subalpinus + - + - - + - + + +

A. maculipennis + - + + - + + + +

A. messeae - - + - - + + + + +

На основе построенной ранее схемы эволюции малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Стегний, 1991) и проведенного нами исследования построена схема эволюции ПГ для всех трех хромосом (Рис.2). По-видимому, наиболее существенны в эволюционном отношении изменения гетерохроматина, который непосредственно связан с прикреплением хромосом к ядерной оболочке. Эти изменения вероятно могут заключаться как в делециях, так и в амплификациях материала гетерохроматина. По этому признаку всегда наблюдаются четкие отличия между всеми видами комплекса (табл.3). Возникновение дополнительных блоков а-гетерохроматина характерно для "северной" эволюционной ветви. Значительные эволюционные изменения претерпевает ПГ половой хромосомы X. Причем для видов эволюционно исходных характерно диффузное состояние ПГ.

Наряду с морфологическими изменениями -• • • ПГ видообразова-тельные события у малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis связаны с возникновением фиксированных хромосомных инверсий, отличающих отдельные виды комплекса друг от друга (Стегний, 1981). Сравнение интерка-лярной локализации высокоповторяющихся последовательностей ДНК с установленными ранее "горячими зонами" инверсионных разрывов в комплексе Anopheles maculipennis показало, что четыре из восьми "горячих точек" приходятся на пики встречаемости высокоповторенной ДНК. То есть, обнаружена тенденция локализации "горячих зон" инверсионных разрывов в комплексе Anopheles maculipennis в местах хромосом с повышенным содержанием высоко-повторяющихся последовательностей ДНК (Стегний, Шарахова, 1990).

Изменения ПГ широко распространены в эволюции различных групп организмов (Keyl, 1965; Wulker, Butler, 1983; Кикнадзе, Сиирин, 1991). Так, увеличение массы ПГ происходило неоднократно в разных цитокомплексах рода Chironomus (Keyl, 1965). Причем большие блоки гетерохроматина характерны для более молодых в эволюционном отношении видов (Keyl, 1965), а также для видов, обитающих в более северных климатических зонах (Кикнадзе, Сиирин, 1991; Кикнадзе и др., 1996). Среди малярийных комаров количественные различия в содержании гетерохроматина отмечены между видами комплекса Anopheles dirus (Baimai, Traipakvisin, 1987). Авторы делают вывод, что эволюция может идти как путем аккумуляции, так и утери гетерохроматиновых блоков. Межвидовые различия гетерохроматина половой хромосомы отмечены также в комплексе Anopheles gambiae (Bonaccorsi et al., 1980).

б)

* -.зоны контакта с ядерной оболочкой

- крепление к ядерной оболочке В - а -ретерохроматин

g - крупногранупированные блоки гетерохроматнна Q - диффузный хроматин, обогащенный повторами

Рис. ¿. Схема эволюции прицентромерного гетерохроматнна хромосом X (а), 2 (б) и 3 (в) у малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis. Квадратами обведены хромосомы гомосеквентных видов комаров.

Таким образом, проведенное на малярийных комарах комплекса Anopheles maculipennis исследование показало, что видообразование сопряжено с морфологическими изменениями прицентромерного гетерохроматина. Возможно, эти изменения непосредственно связаны с пространственными реорганизациями ядер трофоцитов, отмеченных в эволюции комплекса Anopheles maculipennis (Стегний, 1979; 1987а).

Внутривидовое варьирование морфологии прицентромерного гетерохроматина летающих клеток яичников у некоторых видов комплекса.

Внутривидовое варьирование свойств прицентромерного гетерохроматина было обнаружено у трех видов комаров A. messeae, A. maculipennis и А. atroparvus. Для A. messeae свойственен полиморфизм прицентромерных блоков гетерохроматина хромосомы 2 трофоцитов яичников. Было обнаружено наличие четырех вариантов, различающихся по толщине блоков ПГ. Размеры (относительная толщина) блоков разных вариантов соотносятся приблизительно как 1:2:3:4 и были соответственно названы одно-, двух-, трех- и четырехблооч-ными. Размеры одинарного блока варьировали в зависимости от степени политении в интервале 1,00 - 1,43 мкм. Относительные размеры блоков были следующими: одноблочный вариант - 0,89±0,23; двухблочный вариант - 1,55+0,33; трехблочный вариант - 2,33±0,22; четырехблочный вариант - 3,05±0,28. Одинарные варианты иногда хорошо просматривались в блоках более высокого уровня. В некоторых случаях блоки имели гранулированную или вакуолизиро-ванную структуру. При наличии крупных (тройных и четверных) блоков гомологи в этой зоне обнаруживали синапсис, в результате которого образовывался единый общий блок.

Исследование природных популяций, в том числе географически удаленных, выявило существование в них тех же размерных вариантов ПГ. Однако, встречаемость отдельных вариантов оказалась различной в каждой популяции (рис.5). Большие блоки гетерохроматина оказались характерными для наиболее северных популяций.

Для выявления возможного адаптивного значения данного полиморфизма была проведена оценка устойчивости особей с различными вариантами ПГ к энтомопатогенным бактериям Bacillus thuringiensis. Оказалось, что к данному воздействию напротив наименее чувствительны особи, обладающие одинарными прицентромерными блоками (х2=3,91, df=l, р<0,05).

CZZI

Павлодар

Томск г

Томск 1

12 22 23 И 33 34 Генотип по гетерохроматину

Рис. 3. Встречаемость различных вариантов блоков ПГ хромосомы 2 тро-фоцитов яичников в трех природных популяциях А. тевзеае 11 - одноблочный, 22 - двухблочный, 33 - трехблочный, 44 - четырехблочный варианты; 12, 13, 23, 34 - гетерозиготы между различными вариантами блоков.

Сравнивая полученные данные с литературными, можно отметить, что очень близкие к вышеописанным свойства обнаруживает ПГ в слюнных железах различных видов хирономид (Keyl, 1965; Wulker, Butler, 1983; Кикнадзе, Сиирин, 1991). Общность прослеживается в кратности увеличения размера блока ПГ, а также в приуроченности больших размерных вариантов к наиболее северным популяциям.

У А. maculipennis был обнаружен полиморфизм блоков ПГ в хромосомах 1 и 3, в то время как хромосома 2 всегда имела двухблочный вариант ПГ. Хромосома 1 у А. maculipennis имела три варианта организации ПГ: наличие а~ блока, отсутствие блока и гетерозиготный вариант. В некоторых случаях блоки имели крупногранулированную структуру. Аналогичный полиморфизм оказался свойственным также хромосоме 3 в 3L плече.

Изменчивость прицентромерного гетерохроматина у А. atroparvus заключалась в появлении ахроматиновой зоны между плечами этой хромосомы в рай-

оне 14c-15d (Шарахова, Шарахов, 1992). Размеры ахроматиновой зоны значительно варьировали от 1-3 мкм вплоть до полного отрыва плеч друг от друга. Экспериментальные исследования показали наличие корреляции между изменением морфологии ПГ хромосом в трофоцитах родительской самки и понижением жизнеспособности потомства, а также снижением общей физиологической адаптации организма (Бурлак и др., 1997).

Таким образом, гетерохроматин, по-видимому, является существенным фактором, влияющим на приспособленность малярийных комаров к различным природным условиям.

ВЫВОДЫ

На основании сравнительного цитогенетического анализа гетерохромати-на политенных хромосом слюнных желез и питающих клеток яичников у пале-арктических видов малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis сделаны следующие выводы.

1. Изучение дифференциального окрашивания хромосом питающих клеток яичников A. messeae позволяет выделить два типа организованного в виде блоков а-гетерохроматина: прицентромерный и интеркалярный (локализованный во внутренних районах хромосом).

2. Изучение локализации высокоповторяющихся последовательностей ДНК с помощью гибридизации in situ с политенными хромосомами A. messeae показало, что наиболее интенсивное включение метки проявляет прицентромерный а-гетерохроматин, меньшее количество метки было обнаружено в те-ломерных районах, интеркалярном а-гетерохроматине и некоторых других внутренних районах хромосом.

3. В прцентромерном гетерохроматине слюнных желез A. messeae обнаружено включение сателлита 1.688 и умеренного теломерного НеТ-повтора D. melanogaster. Сателлит локализован в прицентромерном а-гетерохроматине, НеТ ДНК наряду с более обширным включением в прицетромерных участках хромосом была обнаружена в районах 4а и 25а-Ь.

4. Сравнительный анализ прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом слюнных желез и питающих клеток яичников выявил его существенную недорепликацию в слюнных железах.

5. Показано варьирование структуры прицентромерного гетерохроматина трофоцитов яичников у разных палеарктических видов комплекса Anopheles

и

maculipennis по следующим показателям: число и размеры блоков прицентро-мерного гетерохроматина, степень асинапсиса гомологов в прицентромерной зоне. Показано, что изменение числа блоков гетерохроматина имеет широтный градиент.

6. У A. raesseae выявлено существование четырех размерных вариантов а-блоков, показана приуроченность больших размерных вариантов к наиболее северным популяциям, а также повышенная устойчивость к воздействию энтомо-патогенных бактерий особей с одинарным прицентромерным блоком.

7. Обнаружено варьирование количества прицентромерного а-гетерохроматина хромосом 1 и 3L у А. maculipennis, а также варьирование морфологии прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 у A. atroparvus, заключающееся в появлении ахроматиновой зоны между плечами хромосом и проявляющееся в понижении жизнеспособности особей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шарахова М.В., Стегний В.Н. Особенности локализации высокоповто-ряющихся последовательностей ДНК в политенных хромосомах генеративной и соматической систем у малярийных комаров // Тезисы докладов III школы-семинара по генетике и селекции животных. Новосибирск. 1989., С.121.

2. Шарахова М.В. Особенности реассоциации ДНК на препаратах политенных хромосом малярийного комара // Генетика. 1990. N26. С. 367-369.

3. Стегний В.Н., Шарахова М.В. Повторяющиеся последовательности ДНК малярийных комаров. Особенности локализации высокоповторяющёйся ДНК у Anopheles messeae Fall. // Генетика. 1990. N7. С. 1187-1194.

4. Стегний В.Н., Шарахова М.В. Системная организация архитектоники политенных хромосом в онто- и филогенезе малярийных комаров. Структурные особенности зон прикрепления хромосом к ядерной оболочке // Генетика. 1991. N5. С.828-835.

5. Шарахова М.В., Стегний В.Н. Гетерохроматин малярийных комаров И Тезисы докладов 1-ой Всесоюзной конференции по генетике насекомых. Москва. 1991. С.117.

6. Шарахова М.В., Шарахов И.В. Изменение морфологии хромосом при прохождении популяции малярийного комара через "горлышко бутылки" // В сборнике: Экоген / Томск. 1992. N1. С. 1.1.2.

7. Шарахова М.В. Межвидовые различия и внутривидовой Полиморфизм прицентромерного гетерохроматина в питающих клетках яичников малярийных комаров комплекса "maculipennis" // Генетика. 1994. (Приложение). С.181.

8. Шарахова М.В., Шарахов И.В., Стегний В.Н. Организация хромоцен-тра в слюнных железах малярийного комара Anopheles messeae Fall // Генетика. 1997а. T.33.N2. С.196-201.

9. Шарахова М.В., Стегний В.Н., Тимофеева О.В. Полиморфизм прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов яичников в природных популяциях малярийного комара Anopheles messeae Fall. // Генетика. 19976. Т.ЗЗ. N2. С.281-283.

10. Stegnii V.N., Sharakhov I.V., Sharakhova M.V., Sibataev A.K., Wasserlauf I.E. Evolution-genetic analysis of the palearctic Anopheles maculipennis (Diptera: Culicidae) complex // Proceedings of XX International Congress of Entomology, Firence, Italy, August 25-31, 1996, P. 256.

11. Stegnii V.N., Sharakhov I.V., Sharakhova M.V., Sibataev A.K., Wasserlauf I.E., Burlak V.A. Evolution-genetic analysis of the palearctic Anopheles maculipennis (Diptera: Culicidae) complex // Proceedings of 10th. European SOVE Meeting, Strasbourg, France, September 2-6, 1996. P. 41.

12. Шарахова M.B., Шарахов И.В., Котликова И.В., Гостева Л.Г. Структурно-функциональная организация гетерохроматина у малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis // Цитология. 1997в. N1.C.120.

13. Тимофеева О.В., Шарахова М.В., Стегний В.Н., Бурлак В.А. Полиморфизм прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом трофоцитов яичников в природных популяциях малярийного комара Anopheles messeae Fall.//Цитология. 1997. N1. С.109.

14. Бурлак В.А., Шарахова М.В., Шарахов И.В., Лапик Е.Р., Сибатаев А.К. Связь мор.фотипов хромосом самок малярийного комара Anopheles atroparvus с чувствительностью их потомства к Bacillus thuringiensis israelensis // Генетика. 1997.

15. Шарахова М.В., Стегний В.Н., Брагинец О.Т. Межвидовые различия структуры прицентромерного гетерохроматина трофоцитов яичников и эволюция малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis // Генетика. 1997г.