Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Популяционно-цитогенетический анализ комаров комплекса Anopheles maculipennis

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Популяционно-цитогенетический анализ комаров комплекса Anopheles maculipennis"

□□30542Э5

На правах рукописи

Русакова Антонина Михайловна

ПОПУЛЯЦИОННО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОМАРОВ КОМПЛЕКСА ANOPHELES MACULIPENNIS

(DIPTERA : CUL1CIDAE)

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск-2007

003054295

Работа выполнена в Научно - исследовательском институте биологии и биофизики Томского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кучер Аксана Николаевна НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск

кандидат биологических наук Перевозкин Валерий Петрович Томский государственный педагогический университет, г. Томск

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск)

Защита диссертации состоится «21» февраля 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 212.267.10 в ГОУ ВПО Томский государственный университет по адресу: 634050 г. Томск, пр. Ленина,

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томского государственного университета

Автореферат разослан «16» января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

36.

кандидат биологических наук

Е,Ю. Просекина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Изучение генетических механизмов адаптации и видообразования остаётся актуальной проблемой современной популяционной и эволюционной генетики. Для многих семейств отряда Díptera показано, что в основе этих процессов лежит реорганизация хромосомного аппарата, обусловленная, прежде всего пара- и перицентрическими инверсиями, структурными модификациями гетерохроматина (Чуксанова, 1971; Стегний, 1984, 1993; Шарахова, Стегний, Браганец, 1997; Дурнова, Белянина, 2001; Кикнадзе, Сиирин, 1991; Кикнадзе, Истомина, 2000; Wasserman, 1963; Kitzmiller, Frizzi, Baker, 1967; Yoon, Richardson, 1978; Coluzzi et al„ 1979).

Изменения климатических условий, связанные с увеличением среднегодовых температур за последние 10-15 лет, делают актуальным "ревизию" частотных характеристик инверсионного полиморфизма в природных популяциях различных полиморфных видов насекомых, в том числе малярийных комаров Anopheles messeae Fall. Инверсионный полиморфизм этого вида был всесторонне изучен в 70-е годы (Кабанова, Карташова, Стегний, 1972; Плешкова и др., 1978; Новиков, Кабанова, 1979). Было показано межгодовое изменение частот инверсионных вариантов за период с 1972 по 1982 гг. (Стегний, 1991) и с 1982 по 1997 гг. (Новиков, 1997), по-видимому, связанное с изменениями температурных режимов существования популяции. Вместе с тем, изменение климатических условий должно накладывать отпечаток не только на межгодовую динамику хромосомных инверсий, но и сезонную и межпопуляционную.

Несмотря на длительный период изучения гетерохроматина вопрос о его функциях остается открытым (Zuckerkandl, Hennig, 1995; Hennig, 1999; Dimitri et al., 2005). В результате изучения природных популяций малярийных комаров обнаружен ещё один тип полиморфизма, основанный на изменении количества прицентромерного гетерохроматина у An. messeae и An. maculipennis Mg. в политенных хромосомах питающих клеток яичников (Шарахова, Тимофеева, Стегний, 1997; Тимофеева, Шарахова, 1999) и это даёт возможность изучения функциональной значимости гетерохроматина в процессе адаптации.

Изменения гетерохроматина играют важную роль в процессе видообразования в отряде Díptera. В комплексе Anopheles maculipennis процесс видообразования связан с преобразованием архитектуры хромосом в политенных ядрах генеративных клеток (Стегний, 1979). Прежде всего, эти преобразования касаются гетерохроматина прицентромерных участков хромосом (Стегний, 1979; Стегний, 1993; Шарахова, Брагинец, Стегний, 1999). Гетерохроматиновые участки, располагаясь в прицентромерных районах, обеспечивают определённое расположение хромосом в политенных ядрах трофоцитов яичников, что было показано на примере малярийных комаров и дрозофил (Стегний, Вассерлауф, 1991; Стегний, 1993; Стегний, Вассерлауф, Ананьина, 1996). Изменение в молекулярном составе ДНК гетерохроматина может являться причиной пространственной реорганизации ядер в ходе эволюции в комплексе Anopheles maculipennis (Грушко и др., 2004).

В то же время, увеличение количества гетерохроматина в хромосомах видов комплекса Anopheles maculipennis, в том числе а гомосеквентных, является видоспецифичным признаком (Сгегний, 1993; Шарахова, Брагинец, Сгегний, 1999). .

Обнаружение нового вида в роде Anopheles -An. artemievi Gordeev et al. (Гордеев и др., 2004; 2005), создает предпосылки для изучения систематических и филогенетических отношений с другими видами данной группы насекомых, позволяет выявить пути видообразовательпых событий в отряде Díptera. Подключение к исследованиям палеарктической группы малярийных комаров, неарктического вида комплекса Anopheles maculipennis — An. freeborni Aitken позволяег дополнить существующие схемы видообразования и оценить степень филогенетической близости в изучаемой группе организмов.

Наличие эпидемически опасных видов рода Anopheles в отряде Díptera ещё более повышает актуальность цитогенетическош изучения адаптации и эволюции представителей этой группы.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является популяционно-цитогенетическое изучение механизмов адаптации и видообразования в комплексе Anopheles maculipennis на основе анализа хромосомных инверсий, структуры гетерохроматина и архитектуры хромосом в политенных ядрах.

Для достижения поставленной цель предполагается решить следующие задачи:

1. Провести анализ сезонной, межгодовой и межпопуляционной динамики полиморфных вариантов по инверсиям и гетерохроматину Anopheles messeae.

2. Выявить межвидовые отличия по молекулярной организации прицентромерного гетерохроматина малярийных комаров - Anopheles messeae и Anopheles atroparvus van Thiel.

3. Изучить пространственную организацию политенных хромосом трофоцитов яичников Anopheles artemievi и Anopheles freeborni.

4. Провести сравнительный межвидовой анализ особенностей политенных хромосом по распределению гетерохроматина и взаимодействию хромосом с ядерной оболочкой в комплексе Anopheles maculipennis.

Научная новизна. В проведённом исследовании установлено существенное изменение частотных характеристик адаптивного инверсионного полиморфизма An. messeae за период с 2003 -2005 гг. по сравнению с периодом 1972 -1982 гт. Выявлено, что хромосомные инверсии, ранее доминирующие на юго-западе ареала , вида An. messeae стали преобладать и в центральной части ареала. Изучение полиморфизма прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 в питающих клетках яичников An. messeae выявило межпопуляционные различия, что, по-видимому, свидетельствует о его адаптивном характере.

Изучение молекулярной организации прицентромерного гетерохроматина An. messeae и An. atroparvus выявило отличия по содержанию и локализации консервативных повторов ДНК.

Впервые в результате проведённой работы изучено пространственное расположение политенных хромосом в ядрах питающих клеток яичников An. artemievi и An, freeborni. Показаны межвидовые отличия видов An. artemievi и An. freeborni по распределению гетерохроматина и взаимодействию хромосом с ядерной оболочкой от ранее изученных видов комплекса maculipennis.

Практическая ценность. Выявленные в ходе проведения данной работы межвидовые различия An. messeae и An. atroparvus по содержанию консервативных повторяющихся последовательностей могут быть использованы для видовой диагностики. Установленные видоспецифичные признаки организации хромосом политенных ядер питающих клеток яичников и модификации гетерохроматина позволяют идентифицировать виды комаров An. artemievi и An. freeborni на стадии имаго при минимальном количестве изучаемого биологического материала, что важно для практических энтомологов и эпидемиологов в связи с проблемами регуляции численности опасных переносчиков малярии.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на Второй Сибирской школе молодого учёного (Томск, 1999); International Conference "Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia: BDENE" (Novosibirsk, Russia 2000); на II и III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2004); на III симпозиуме по кариосистематике беспозвоночных животных (Санкт-Петербург, 2006); на конференции "Проблемы популяционной экологии животных" (Томск, 2006); на VII межрегиональном совещание энтомологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка используемой литературы. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, включает 14 таблиц, 12 рисунков.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Гибридизация in situ проводилась совместно с к.б.н. О.Г. Грушко.

Благодарности. Искренняя благодарность к.б.н. МБ. Шараховой, которая была первым учителем. Слова благодарности и сердечную признательность за доверие, поддержу и постоянную помощь выражаю научному руководителю д.б.н.,

проф. В Н. Стегнию. Собирать материал помогали к.б.н. В.А. Бурлак, к.б.н. A.B. Катохин, к.б.н. О.Г. Грушко, Е.П. Герик, Ю.В. Шабанова, Г.Н. Артемов. За помощь и поддержку слова благодарности близким и родным мне людям и к.б.н. С.И. Цитленок. Без помощи и поддержки всех сотрудников лаборатории эволюционной цитогенетики и кафедры цитологии и генетики Томского госуниверситета невозможна была бы вся работа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материал.

Таблица 1 - Выборки комаров, использованные в работе

Вид Место сбора Дата сбора п

An. messeae Томск 06.1998 50

(с. Коларово) 07.1998 80

08.1998 20

05.1999 33

06.1999 46

07.1999 26

08.1999 50

09.1999 35

07.2000 54

07.2001 46

07.2002 41

07.2003 54

05.2004 27

06.2004 51

07.2004 115

07.2005 36

Москва 07.1998 50

Полоцк 08.2000 29

Бирск 08.2000 70

Челябинск 08.2000 59

Курган 08.2000 52

Омск 08.2000 18

Шира 07.2003 26

Бийск 08.2003 19

Тегульдет 08.2003 30

Воронеж 08.2004 56

Всего: 1173

An. artemievi Республика Кыргызстан, г. Майлуулусуу 06.2006 18

В работе использованы четыре вида малярийных комаров: Ап. те$$еаегАп. аКоратш, Ап. аПеппет, Ап. /гееЪогт. Виды Ап. теязеае, Ап. аг1ет1е\1 были собраны в природных популяциях (Таблица 1). Изучение видов Ап. Ыгорагхш и Ап. /гееЪогт проводили на лабораторных культурах. Все исследования проводились на взрослых самках малярийных комаров.

Методы. Для проведения цитогенегического анализа отбирали самок всех изученных видов находящихся на активной стадии созревания трофоцитов (П-1У стадии переваривания крови и развития яичников по Селла). Фиксацию яичников проводили с использованием этанол-уксусной смеси в соотношении 3:1.

Цитогенетические препараты готовили по стандартной лактоацетоорсеиновой методике (Кикнадзе, 1967; Кабанова, Карташова, Стегний, 1972). На каждом препарате анализировали 10-15 ядер.

Цитогенетический анализ препаратов политенных хромосом питающих клеток яичников проводили при увеличении 10x100 с использованием масляной инверсии на микроскопе оснащенным цифровой фотокамерой. Гетерохроматин измеряли с помощью окуляр-микрометра, вариант прицентромерного гетерохроматина Ап. та^еае оценивали по количеству блоков визуально.

Для приготовления воздушно-высушенных препаратов политенных хромосом Ап. тец-еае и Ап. сигоратпз 5-6 фолликулов из яичника помещали на предметное стекло в каплю 50% пропионовой кислоты, мацерировали, инкубировали 10 -15 минут. Затем фолликулы раздавливали под предметным стеклом и, инкубировали 1 минуты при + 65°С и охлаждали до комнатной температуры, после чего препараты замораживали в течение 1 -2 минут в жидком азоте. Затем удаляли покровное стекло и препарат помещали в холодный (- 20°С) 50% этанол на 2 часа при температуре + 4°С. После чего препарат обезвоживали, выдерживая последовательно по 5 минут в 70%, 90% и 100% этаноле при + 4°С. После этого препарат фиксировали 5 минут при + 4°С в этанол-уксусном фиксаторе (3:1), высушивали на воздухе, промывали в 100% этаноле и затем окончательно высушивали на воздухе. Хранили препараты при +20°С.

Амплификацию, гибридизацию, детекцию консервативных высокоповторённых последовательностей ДНК проводили на политенных хромосомах Ап. та^еае и А п. Шгорап'ш. Фрагме) ггы А1г211-25а, Ай"2К-25Ь, АМЯ-46а, АЬ-211-73, Ай2К-85а, Аи211-90 АйЖ-Ш и Л1г2Я-136 были получены в результате микродиссекции прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Ап. мгораюш (Грушко и др., 2004). Для получения зондов ДНК клонированные фрагменты Ай"211-25а, А^2Я-25Ь, А1г2Я-46а, АЬЖ-73, Аи2Я-85а, А1г2Я-90 А^Л-118 и Л(х2Г<-136 (Грушко и др., 2004) были амплифицированы в ходе ПЦР (95°С / 5 мин, 25 циклов: 94°С / 30 сек, 70°С / 2 мин и 68°С / 3 мин) в присутствии 1 пикомоля праймеров ТЗ и Т7 и рекомбинантных плазмидных клонов в качестве матричных ДНК. Биотинилирование зондов ДНК, их гибридизацию и детекцию на препаратах политенных хромосом проводили согласно рекомендованным

протоколам с использованием соответственно GIBCO BRL BioPrime DNA labeling system, GIBCO BRL In situ Hybridization and Detection system (Invitrogen / Life Technologies, США) и Rbodamin-Avidin/Birtinyfaied Anh-Avidm (Vector laboratories, США). Хромосомы окрашивали флуоресцентным красителем YOYO-J (Sigma-Aldrich, CI11A) и заключали в DABCO antifede solution (Sigma-Aid rich, США) Регистрацию результатов осуществляли на конфокальном микроскопе BioRad MRC 1024 Scanning Con focal.

Статистическую обработку данных проводили с использованием общепринятых методов (Боровиков, 2003).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ инверсионного полиморфизма An. messeae в томской популяции показал существенное изменение частот инверсионных вариантов за изученный период (с 2003 по 2005 г.) по сравнению с 1972-1982 г. (рисунок 1,2).

б.

10D

1 80

1$ m

3 40

I го

и

ii 100

1

#

О so

О

40

£ 20

№ Г 0

г! 100

I 80

s 60

5 «

Е 20

¥ о

|п_11 и_01 о _С0

SL

л

|£3_11 п_001

XL ___2R_3R 31

joji e_oi □ _.оо □ jг]

Рисунок 1 - Сезонное распределение инверсионных вариантов Ап. техяеае в томской популяции в 2004 г.; а) май; б) июнь; в) июль

Изучение томской популяции с мая по июль 2004 г. {Рисунок 1) показало преобладание инверсионных вариантов 2Коо, ЗКад> ЗЬ00; по X хромосоме преобладают гетерозиготы ХЬо, и гомозиготы ХЬп. В период с 1972 по 1982 год в начале репродуктивного сезона преобладали варианты, 2К|Ь ЗК.1 [, частота инверсионных вариантов ХЦю, 211оо, ЗКоо, увеличивалась только к середине сезона.

Анализ межгодовых распределений частот инверсионных вариантов в томской популяции с 2003 по 2005 год показал, что во всех выборках примерно с одинаковой частотой преобладают варианты Х1-01 (Рисунок 2).

б.

* 100

& ео

К ага

с

Л

Ё Ё 20

я, ак зя 31. в_01 р„00о_12]

¡г 1оо | 50

8 50

0

140

° го

1 о

0_11 р_01 п_оо

□ Ня_01п_00

Рисунок 2 - Межгодопое распределение частот инверсионных вариантов у Ап, теьхеае и томской популяции: а) 2003 г.; 6} 2004 г.; в) 2005 г.

Частоты го .поз л гот ХЬ(( и ХХ^ю также практически не меняются во всех изученных выборках. В выборке 2003г. с частотой 2% обнаружен вариант ХЬг в составе гетерозиготы ХЬи, По хромосоме 2К, ЗЯ и ЗЬ преобладают гомозиготы 2Коо, ЗНоо, ЗЬоо-

В период с 1974 по 1976 год по X хромосоме в популяции Томска преобладали гомозиготы XLn, частота гетероэигот XLoi при этом не превышала 25% (Плешкова и др., 1978),

По хромосоме 2 а период с 1974 no Í976 год в томской популяции преобладали гомозиготы 2Roo, как и в 2003, 2004 и 2005 году, но при этом частота инверсионного варианта 2Rrj составляла около 10%, в последние годы вариант 2R|, представлен только в виде гетерозигот, и то с низкой частотой

Существенные отличия выявлены по 3R между выборками 70-х годов и 2003-2005 гг. В 70-е годы в томской популяции преобладали гомозиготы 3R|f с частотой 52 - 81%, сейчас около 75% особей имеют генотип ЗКо». По хромосоме 3L уже в 1974-1976 гг. отмечалась высокая концентрация гомозигот ЗЬун (до 79%), которая к 2003 -2005 гг. увеличилась более чем до 90%

В 1981 г. наблюдалось резкое увеличение частот ХЦ до 21 %г 2R0 до 78%, 3Ro до 54%. Проведенное сравнение температурных данных с 1972 по 1982 гг. показало, что в 1981 г. наблюдалось увеличение среднегодовой температуры, и изменение частот инверсий было связано с изменением теплового режима (Стегний, 1991).

Анализ географически разобщенных популяций (Рисунок 3) показал, что в воронежской и томской популяциях преобладают инверсионные варианты, характерные в 70-е годы для популяций западной части ареала (Стегний, Кабанова, 1985).

É

о_и «_oi п_оо i

I го

[OÍ 1 ■ _01 О _0Q р _22Я _12j

й 1 Ь

Ibi J i

в. г.

Рисунок 3 - Распределение частот инверсионных вариантов у Лп. messeae в географически разобщённых популяциях: а) Воронеж; б) Томск; в) Тегульдет; г) Шира

J0

Популяция Тегульдета, расположена в микроклиматической зоне с более резко выраженным континентальным климатом, который характерен для зоны северной тайги и отличается от томской популяции по частотному распределению инверсионных последовательностей по хромосомам ХЬ, 2К, ЭЙ, и почти не отличается по ЗЬ.

Популяция Шира отличается от других изученных популяций по распределению инверсионных вариантов по хромосоме 3. В ней преобладают варианты ЗЯц и ЗЬщ, что не характерно для трёх других изученных популяций.

Таким образом, изучение сезонных и межгодовых распределений инверсионных вариантов в томской популяции и анализ распределений в географически разобщённых популяциях показал, что хромосомные инверсии, ранее доминирующие на юго-западе видового ареала 2Иоо, ЗКоо, ЗЬоо стали преобладать в центральной части ареала.

Результаты анализа сезонной динамики частот особей Ап. теьБеае с различными вариантами прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 питающих клеток яичников в течение репродуктивного периода 1998, 1999 и 2004 гг. представлены на рисунке 4. Показано, что в начале и конце репродуктивного сезона популяция более разнообразна по составу. К середине сезона разнообразие уменьшается, и в популяции преобладают особи с двойным вариантом блока.

Анализ межгодового распределения частот особей с полиморфными вариантами прицентромерного гетерохроматина (Рисунок 5) показал, что во всех выборках в период с 1998 по 2005 гг. преобладали особи с двойным вариантом блока.

Изучение географически разобщенных природных популяций Ап. теззеае не выявило чёткой клиналыюй изменчивости (Рисунок 6). Популяции Воронежа, Челябинска, Томска, Тегульдета отличаются от всех других изученных популяций. Для них характерно преобладание особей с двойным вариантом блока гетерохроматина. Во всех других популяциях преобладают особи с одинарным блоком.

Рисунок 4 - Сезонное распределение частот особей Ап. теззеае с полиморфными вариантами при центр о мерного гетерохроматина в томской популяции: а) 1998 г.; б) 1999 г.; в) 2004 г.

100 , 90

1Э98 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005

□ одинарный и двойной п тройной п гетер оз и готы

Рисунок 5 - Межгодовое распределение частот особей Ап. тезхеае с полиморфными вариантами прицентромерного гетерохроматина в томской популяции

□ одинарный идвойной тройной □ гетеро зиготы

Рисунок 6 - Географическое распределение частот особей Ап, теззеае с полиморфными вариантами прицентромерного гетерохроматина

Таким образом, изучение полиморфизма по блокам прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Ап. теззеае в период с 1998 по 2005 гг. показало пространственно-временную динамику, проявляющуюся в сезонном, межгодовом и межпопуляционном изменении вариантов блока прицентромерного гетерохроматина.

Изучение прицентромерного гетерохроматина малярийных комаров комплекса тасиИрептй представляет интерес в плане выявления межвидовых отличий по молекулярной организации ДНК данных районов. Изучение содержания 8 консервативных повторов в прицентромерных районах хромосом Ап. тевхеае и Ап. Мгорагчш выявило межхромосомные и межвидовые отличия в составе ДНК у этих видов (Рисунок 7).

В составе хромосом Ап. сйгорагуш выявлен ряд фрагментов: А1:г211-46а, А1г2Я-85а, А1г2К-90, А1т2Н.-118, А1т2К-136, но эти фрагменты не выявлены в хромосомах Ап. теззеае. Фрагмент - А(х211-25Ь (Рисунок 7) не выявлен при т 5;7м гибридизации в составе хромосом Ап. а!гортл'ш, хотя минибиблиотека создана из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Ап. а(горап>ш. Отсутствие фрагментов в составе политенных хромосом может быть связано с их недостаточной представленностью, либо с небольшим числом их копий в составе политенных хромосом.

Межвидовые различия в локализации консервативных повторов, проявляются не только в наличии и отсутствии, но и в местах локализации этих повторов на хромосомах. Фрагменты АЦ"2Я-25а и А1г2К-73 гибридизовались на хромосомах обоих видов, но они оказались локализованными в разных районах прицентромерного гетерохроматина. У Ап. теязеае фрагмент А1г2К-25а был локализован в диффузном прицентромерном гетерохроматине хромосомы 2, и в диффузном прицентромерном гетерохроматине правого плеча хромосомы 3. У Ап. а1горапча- клон А1т211-25а выявлен в блочном и диффузном прицентромерном гетерохроматине хромосом X и 2. Клон А^2Я-73 у Ап. тевягае был локализован в блоках прицентромерного гетерохроматина трёх хромосом - X, 2 и в блоках плеча 311 хромосомы 3. Однако, у Ап. аггорагхт клон А1г2Я-73 обнаружен только в одном районе - в диффузном гетерохроматине хромосомы 2.

Распределение консервативных повторённых последовательностей ДНК районоспецифичной библиотеки прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Ап. сйгорагхт (клонов А1г2Я-25а, А1т211-25Ь, Аи2Я-46а, А1:г2Я-73, А1г21*-85а, АЦ-2Е1-90, А1г21М 18 и А1г2Я-136) у Ап. аггорагпк и Ап. те.кеае отличается как между хромосомами, так и между видами.

Рисунок 7 - Сравнение локализации консервативных повторённых последовательностей ДНК клонов Л1г2К.-25Ь, А1г21(-73 и А1г2К-25а □ прицентромерном гетерохроматине полнтенных хромосом Ап. а1горшуш и Ап. теззеав, а - клон А1г211-25Ь на хромосомах Ап. а1горап>ш; б - клон А1г2К-25Ь на хромосомах Ап. теязеае^ в - клон АЬг2Л.-73 на хромосомах Ап. Мгорапгиз, г - клон Аи2П-73 на хромосомах Ап теззеае; д - клон А1г2К-25а на хромосомах Ап. аГгорат е - клон А1г2Я-25а на хромосомах Ап. тевзеае. Контуры стрелок указывают п р и центр омер н ые участки хромосом. Стрелки указывают на меченые районы хромосом. X, 2Ц 2К, ЗЬ, ЗК — плечи хромосом. Шкала — 10 мкм

Таким образом, изучение молекулярной организации прицентромерного гетер охроматина показало отличия по содержанию и локализации в хромосомах консервативных повторов ДНК.

Обнаружение нового вида в комплексе тасиИрептх - Ап. апеттч ОогсЬзу е! а]. (Гордеев и др., 2004) и изучение особенностей организации политенных хромосом питающих клеток яичников одного из видов неарктической группы -Ап. /гееЬогт, дает возможность расширить имеющиеся знания по особенностям пространственной организации хромосом в политенных ядрах видов комплекса

По линейной структуре политенных хромосом А п. апетечг является гомосеквентным видом группе тасиИрепт$-те1апооп (зиЬа!ртш). Ап. /гееЬогт по линейной организации политенных хромосом наиболее близок к гомосеквентным видам Ап. мгорагчш и Ап. IаЬгапсЫае, от этих видой Ли ],гееЬогп/ отличается сложной инверсией по X хромосоме и инверсией в плече 314 хромосомы 3. По хромосоме 2 Ап. /гееЬогт полностью идентичен типу шгоратш-1аЬгапсЫае.

Анализ взаимоотношения хромосом с ядерной оболочкой выявил чёткие видовые отличая Ап. аПеяй&п и Ап. /гееЬогт от других видов (Рисунок 9. 10).

Ап. шжяЖреялЬ Ли тлг11шш А!! Ли ЬхккшнЬсм

Ч С / - « " с г* ^

ШШш

Ж Ж

г ■

АЛ Й**Ыим|

Ч

А'г шг/ядооя Ап. Аа_ авврогив Ап. ¡ашзвеЫае

с С| \.с.-., ж Ь,. ЩрС

»

Рисунок 8 - X хромосомы трофоцитов яичников видов комплекса тасиИрепЫз

Примечание: С ~ центромера; стрелками указаны участки контакта с ядерной оболочкой; (фотографии хромосом Ап. $асЬаго\ч, Ап. тагитш. Ап. те!апооп (шЬа1р1пиз). Ап. ¡аЬгапсЫае использованы из статьи Шарахова, Сгегний, Брагинец, 1997)

По типу взаимоотношения X хромосомы с оболочкой ядра все виды различны (Рисунок 8). Гомосеквентные виды также различаются по характеру

взаимоотношений хромосом с ядерной оболочкой 'Гак, например, виды Ап. тасиИрептз, Ап. те1апооп (зиЬЫртги) и Ап. аггеппелп с идентичным дисковым строением политенных хромосом, различаются по хромосомпо-ядерпым взаимодействиям XI,. У Ап. те1апооп (виЪа1ртш) прицентромерный участок X хромосомы связан с ядрышком и расположен в некотором отдалении от ядерной оболочки В отличие от Ап. теЬпооп (яиШртш), Ап. тасиЧрептв имеет прикрепление X!.-плеч а к ядерной оболочке центромерной частью (Шарахова, Стегний, Брагинец, 1997). У Ап. аПегтехп в некоторых случаях наблюдается разобщение гомологов в центромерном районе, что характерно для Ап. тасиИрептз и не характерно для Ап. те!апооп ($г»Ьа1рмщ). В то же время, в отличие от Ап. те1апооп ($иЬа1рти$) в прицентромерном районе Ап. аПет1е1>1 не формируется яркоокрашенный гетерохроматиновый блок (Рисунок 8).

X хромосома Ап. тасиИрептх, Ап. Шгораппя и Ап. IаЪгапсЫае из палеарктической группы имеет прикрепление к оболочке прицентромерным участком (Шарахова, Стегнии, Брагинец, 1997). По морфологии участка прикрепления X хромосома Ап. /гееЬопи отличается от этих трех видов. В прицентромерном районе X хромосомы Ап. /гсеЬогт не наблюдается асинапсиса гомологов

Ди. ашоЛряшге }1 с ' ж

М

Ли тсЬПООН

Ли ЫнавсЬж,

& £ £ 2Я -Ь ^ ъ ¿К 1

Рисунок 9 - Приценгромерные участки хромосомы 2 трофоцитов яичников видов комплекса тасиИрепяйз

Примечание: 2Ь — левое плечо хромосомы 2; 2К - 1гравое плечо хромосомы 2; С - центромера, стрелками указаны участки контакта с ядерной оболочкой, (фотографии хромосом Ап засЬагш, Ап. таШтиз. Ап. тектооп (зиЬафгш), Ап. ¡аЬгапсЫае использованы из статьи Шарахова, Стегний, Брагинец, 1997)

По взаимодействию хромосомы 2 с ядерной оболочкой большинство видов не имеют чётких отличий (Рисунок 9). Из 8 изученных ранее видов только у Ап. Ьек1епилНе\<1 и Ап. ШЬгапсЫае наблюдается разобщение плеч хромосомы 2 и прикрепление прицентромерными районами к оболочке ядра (Шарахова, Стегний, Ерагинсц, 1997), V изученных в данной работе видов Лп. агишеп и Ап. /гееЬогт плечи хромосомы 2 также разобщены в при центром ер ном районе

и связаны с ядерной оболочкой в прицентромерном районе хромосомы 2.

Лп. лшгшгрешая

I

, V / с

.Ал. алсрягпа

: . ---. -

Ап атиит

31.

с

Ли

Ш'

Ш

ж

Аи £ЗйЬзГО1»1

•4а. ¿гееЬоп«

С >

■Л'

ай ш^ыюоп

К с *> • > .»>

зь ж

ап. ьь/зйсыл^

Я

.

зГ; X

\ ЗА

с -1

ЗК

V

ЬеЫ&т&еи

зГ^

Рисунок 10 - Прицентромерные участки хромосомы 3 грофоцитои яичников видов комплекса тасиНрептз

Примечание. ЗЬ — левое плечо хромосомы 3; ЗЯ - правое плечо хромосомы 3, С - центромера, стрелками указаны участки контакта с ядерной оболочкой, (фотографии хромосом Ап. .гасЪаго\ч, Ап. тагПтш, Ап. те!апооп (¡иЪа1ртш), Ап. IаЬгапсЫае использованы из статьи Шарахова, Стегний, Крагннец, 1997)

По хромосоме 3 Ап. апегтеуг соответствует остальным палеарктическим видам, и имеет прикрепление к ядерной оболочке прицентрсмерными районами Зй и ЗЬ (Рисунок 10).

В то же время, Ап. /гееЬогт по организации хромосомы 3 в питающих клетках отличается от всех изученных палеарктических видов малярийных комаров комплекса тасиИрептз тем, что у этого вида отсутствует прикрепление хромосомы 3 к ядерной оболочке. Это является четким диагностическим признаком Ап. /гееЬогт.

Хромосома 3 у видов Ап. тас.икргптз, Ап. те!апооп ($иЬа1рти$) и Ап. аг%егте\1 идентична по дисковой структуре, но эти виды различаются по распределению гетерохроматиновых участков (Рисунок 11).

Л:. т&СнЬрСпШ$

Рисунок 11 - Сравнение прицентромерного участка хромосомы ЗЬ гомосеквентных видов комплекса тасиИрептз

Обозначения: линиями обозначены гомологичные районы хромосом; ЗЗав, 34а, 35в - районы хромосом.

У An. maculipennis не обнаружено ярких блоков в районах 34, 33. У An. melanoon (subalpinus) в районе 34а 3L плеча формируется крупный интеркалярный блок гетерохроматина. В отличие же от An. melanoon (,subalpinusj, у An. artemievi блок располагается ближе к центромере - район ЗЗа/Ь.

Таким образом, для An. artemievi и An. freeborni характерны как общие для комплекса maculipennis (отсутствие объединения центромерных районов всех хромосом в единый хромоцентр), так видоспецифичные черты пространственной организации политенных хромосом трофоцитов яичников.

ВЫВОДЫ

Проведённый комплексный популяционно-цитогенетический анализ полиморфизма по инверсиям, структуре гетерохроматина и пространственной организации хромосом 10 видов малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis из Палеарктики (9 видов) и Неарктики (1 вид) позволил сделать следующие выводы.

1. Популяционно-цитогенетический анализ полиморфизма по инверсиям показал, что за последние годы (2003-2005 гг.) существенно изменились частотные характеристики адаптивного инверсионного полиморфизма у An. messeae по сравнению с 1972 -1981 гг.

2. Хромосомные инверсии, ранее доминирующие на юго-западе ареала вида (XL оо 2Roo 3Roo 3Loo) стали преобладать и в центральной части ареала.

3. Изучение полиморфизма по блокам прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Anopheles messeae в 1998 -2004 гг. выявило пространственно-временную динамику частот вариантов, при этом в географически отдаленных популяциях не обнаружено значимых изменений, тогда как сезонные изменения частот демонстрируют устойчивую динамику отдельных вариантов, связанную очевидно с изменением их адаптивной ценности в сезоны размножения и зимовки популяции.

4. Исследование молекулярной организации прицентромерного гетерохроматина An. messeae и An. atroparvus показало отличия по содержанию и локализации в хромосомах консервативных повторов ДНК. Выявлены фрагменты высокоповторяющихся последовательностей ДНК обеспечивающие взаимосвязь хромосом с ядерной оболочкой.

5. Межвидовой анализ линейной и пространственной организации хромосом трофоцитов яичников 10 видов малярийных комаров позволил установить отличия видов Ап. аПепйелч и А п. /гееЬопи но распределению гетерохроматина и по характеру взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой от других видов комплекса тасиИрептя, что позволяет их чётко идентифицировать.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Русакова A.M., Шарахова М.В. Полиморфизм прицеитромерного

гетерохроматина в природных популяциях малярийных комаров // Труды Второй сибирской школы молодого учёного. - Томск, 2000. -Т. 1.-С. 117- 120.

2. Русакова A.M., Шарахова М.В. Сезонная, годовая и межпопуляционная динамика полиморфизма прицеитромерного гетерохроматина хромосомы 2 в питающих клетках яичников малярийного комара Anopheles messeae // Материалы II Съезда ВОГиС.

- Санкт-Петербург, 2000.

3. Rusakova A.M., Sharakhova M.V. Variability of a pericentric heterochromatin inconnection with adaptation of natural populations of malarial mosquitoes // International Conference "Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia"- Novosibirsk, 2000. - V. 1-P. 99.

4. Русакова A.M., Шарахова M.B., Стегний B.H. Изучение сезонной и популяционной изменчивости прицеитромерного гетерохроматина малярийных комаров Anopheles messeae Fall. // Материалы III съезд ВОГиС "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития". - М., 2004. - Т. 2. - С. 220.

5. Артёмов Г.Н., Русакова A.M., Стегний В.Н. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anopheles messeae в природных популяциях // Вестник Томского государственного университета. Бюллетень оперативной научной информации. - 2004 - №30. - С. 3 - 7.

6. Грушко О.Г., Русакова A.M., Стегний В.Н., Шарахова М.В., Шарахов И.В. Особенности локализации повторённых последовательностей ДНК в прицентромерном гетерохроматине малярийных комаров комплекса "Anopheles maculipennis" // Цитология. - 2006. — Т. 48. - № 3.

- С. 240 - 245.

7. Артёмов Г.Н., Русакова A.M., Стегний В.Н. Полиморфизм прицеитромерного гетерохроматина хромосомы 2 трофоцитов яичников Anopheles messeae Fall, в природной популяции Томска // Материалы VII Межрегионального совещания энтомологов Сибири и

Дальнего Востока в рамках Сибирской зоологической конференции. -Новосибирск, 2006. - С. 22 - 24.

8. Русакова A.M., Стегний В.Н. Цитогенетический анализ политенных хромосом трофоцитов яичников малярийного комара Anopheles freeborni II Материалы VII Межрегионального совещания энтомологов Сибири и Дальнего Востока в рамках Сибирской зоологической конференции. - Новосибирск, 2006. - С. 126 - 127.

9. Русакова A.M. Экологическая дифференцировка особей с различными вариантами блока прицентромерного гетерохроматина в природной популяции малярийного комара Anopheles messeae Fall. // Материалы Международной конференции "Проблемы популяционной экологии животных". - Томск, 2006. - С. 249 - 251.

Отпечатано на участке оперативной полиграфии редакционно-издательского отдела ТГУ Лицензия ПД № 00208 от 20 декабря 1999 г.

Заказ № 4£>_от «Л » 0 1 2007г. Тираж 400 экз.