Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Комплексы видов кровососущих комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae) России и ближнего зарубежья

ВАК РФ 03.02.05, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Комплексы видов кровососущих комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae) России и ближнего зарубежья"



Безжоиова Оксана Владимировна

Комплексы видов кровососущих комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae) России и ближнего зарубежья

Специальности 03.02.05 - энтомология и 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 9 СЕН 2011

москва-2011

4853573

Работа выполнена на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории сравнительной генетики животных Учреждения Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Научны1груководители: кандидат биологических наук

Федорова Марина Вадимовна

кандидат биологических наук Горячева Ирина Игоревна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ганушкина Людмила Алимпиевна

Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ММА имени И.М. Сеченова

кандидат биологических наук Андрианов Борис Витальевич

Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Ведущая организация: Московский Государственный

областной университет

Защита диссертации состоится «10» октября 2011 г. в «17» часов «00» минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.20 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1,Москва, Ленинские горы, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, д. 1 стр. 12, Биологический факультет, ауд. М-1. Факс: 8(495)939-17-46; E-mail: irbeme@maU.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор И.Р. Бёме

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. До настоящего времени малярия остается одним из самых распространенных трансмиссивных заболеваний: ежегодно в мире этой инфекцией болеют около 300 миллионов человек, а количество летальных случаев исчисляется сотнями тысяч (WHO, 2009,2010).

В результате интенсивных мероприятий на европейском континенте и на всей территории СССР передача малярии была практически прервана к 1950г., и в 1955г. ВОЗ объявила об окончательной ликвидации этого заболевания в Европе (Mendis et al, 2009). Однако во многих странах европейского региона ВОЗ плотность популяций переносчиков малярии, комаров рода Anopheles, оставалась высокой. Это создавало условия для возобновления местной передачи на основе завозных случаев или вследствие активизации местных остаточных очагов, и привело к развитию полномасштабных эпидемий малярии в Азербайджане и Таджикистане с середины 90-х годов, а потом и по всей территории европейского региона ВОЗ (Касумов, Гусейнов, 2001; Сабатинелли, 2002). В связи со сложившейся ситуацией ВОЗ была разработана программа «Обратим малярию вспять», которая вступила в действие в 1998 г. Одной из центральных задач программы стала ревизия фауны малярийных комаров с целью уточнения основных переносчиков заболевания и контроля их численности (Региональная стратегия, 2006).

Ареал малярии ограничивается в основном областью распространения переносчиков этого заболевания - комарами рода Anopheles. В мировой фауне насчитывается 484 вида этого рода (Sallum et al., 2000; Harbach, 2004; Harbach et al., 2005), но далеко не все они представляют опасность для человека. Эпидемиологическое значение имеют лишь те, которые удовлетворяют критерию "основной переносчик", т.е. обладают биологическими особенностями, повышающими вероятность контакта комаров с человеком. К таким биологическим особенностям комаров относятся высокая численность, способность развиваться вблизи жилья человека в антропогенных биотопах, высокий уровень антропофилии, эндофагии и эндофильности (Беклемишев, 1944). В настоящее время к числу основных переносчиков относят около 60 видов комаров рода Anopheles (Service, 2004; Fontenille et al.,2005).

Исследования особенностей пищевого и репродуктивного поведения, суточного ритма активности, сезонного хода численности и других биологических характеристик у ряда видов малярийных комаров показали, что они представляют собой комплексы близкородственных видов, морфологические различия между которыми выражены крайне слабо, а часто и вовсе отсутствуют, тогда как эпидемическая роль может существенно отличаться. Описание комплексов в роде Anopheles началось с европейского вида An maculipennis в 1920-годах и в дальнейшем затронуло значительное число видов (Norris, 2002). Уже в 30-40-е годы в Индии были найдены внутривидовые формы комара An. stephensi (Sweet, Rao, 1937), в Южной Америке - подвиды An.albitarsis, An. darlingi, An.crusians, An.quadrimaculatus, в Северной Америке - An.maculipennis, Anpseudopunctipennis (Aitken, 1945). Начавшееся в 40-е годы изучение An.gambiae, основного переносчика малярии в Африке (Coluzzi, 1964), привело к описанию по меньшей мере семи новых видов, образовавших комплекс An.gambiae (Coluzzi et al., 2002). Среди них пять видов являются переносчиками малярии. К настоящему времени показано, что около 77% видов - переносчиков малярии представляют собой комплексы видов. Разработка методов их идентификации является важной, но сложной задачей, которая в настоящее время далека от завершения.

На территории России и в других странах СНГ наиболее распространены представители комплекса Anmaculipennis, к числу которых относятся основные переносчики малярии (Gordeev et al., 2008). Кроме того, большое эпидемиологическое значение в некоторых регионах имеют комары An. claviger (Бубликова, 2001), а в Средней Азии - An.superpictus (Gordeev et al., 2008). По современных представлениям, оба эти вида также представляют собой комплексы.

Цель и задачи исследования. Целью работы была ревизия видового статуса комаров комплексов An.maculipennis, An.claviger и An.superpictus, их распространения на территории России и ближнего зарубежья и оценка области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) как универсального маркера для идентификации видов указанных комплексов. _В-СВязих-этим ^5ыли поставлены следующие-задачи:-

1) уточнение видового состава комаров комплекса An.maculipennis на территории России и некоторых стран СНГ методами морфологического, цитогенетического и молекулярно-генетического анализа;

2) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера рибосомных генов комаров комплекса An. maculipennis',

3) разработка молекулярно-генетического ключа для иде!гтификации видов комплекса An.maculipennis\

4) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) кластера рибосомных генов комаров комплекса An.claviger,

5) изучение комаров комплекса An.superpictus методами морфологического и молекулярно-генетического анализа.

Научная новтна. Впервые проведен сравнительный анализ методов идентификации видов-двойников, распространенных на территории России и ближнего зарубежья. Показано, что применение морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса An.maculipennis затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и схожести морфологии яиц у некоторых видов (например, An.maculipennis, An.alroparvus). Применение анализа структуры политенных хромосом для идентификации видов ограничено существованием гомосеквентных видов (An.labranhiae и An.alroparvus', An.maculipennis, An.melanoon и An. artemievi). Показано, что наиболее перспективным является молекулярно-генетический подход, основанный на использовании первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) как универсального маркера для идентификации видов комплекса An.maculipennis. С использованием этого маркера впервые разработан молекулярный ключ для идентификации видов комплекса An.maculipennis, обитающих на территории России и ближнего зарубежья.

У An.messeae, представителя комплекса An.maculipennis, впервые обнаружен внутригеномный полиморфизм ITS2. Изучение степени внутригеномного полиморфизма указанного вида на территории России показало, что недавно описанный в Европе вид An.daciae представляет собой одну из внутригеномных форм An.messeae и не может считаться самостоятельным видом. Другие исследованные виды комплекса An.maculipennis оказались мономорфными по маркеру ITS2. Использование молекуляро-генетических методов позволило выявить новый для фауны СНГ вид - An.persiensis, а также уточнить границы ареалов An.messeae, An.maculipennis, An.atroparvus, An.artemievi, An.melanoon и An.sacharovi.

В ходе цитогенетических исследований впервые получены данные по кариотипической структуре популяций An.messeae юго-восточной части Русской равнин. Выявлены три четко дифференцированные зоны, различающиеся по частоте встречаемости разных кариотипов.

Впервые выявлена и исследована внутригеномная изменчивость первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2) у An.claviger. Различия по этому маркеру между популяциями из Абхазии, с одной стороны, и Беларуси и Германии с другой, значительно превосходили различия на популяционном уровне. Эти результаты дают основу для дальнейшей исследовательской работы на уровне комплекса видов.

Впервые проведен молекулярно-генетический анализ An.superpictus в Туркменистане и Кыргызстане Показано, что морфологические формы An.superpictus не соответствуют молекулярным формам по ITS2 и COI-II; выявлены два новых митотипа XI (в Кыргызстане и Туркменистане) и Х2 (в Кыргызстане).

Теоретическое и практическое значение работы. Данные о внутривидовом и межвидовом полиморфизме в комплексах видов-двойников An.maculipennis, An.claviger и An, superp ictus по изученным маркерам являются важными для дальнейших систематических и эволюционных исследований, а также мониторинга биоразнообразия. Разработанный молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комаров комплекса An.maculipennis успешно применяют для изучения переносчиков по программе «Обратим малярию вспять» ВОЗ и в центрах эпидемиологии (Акт о внедрении от 21.04.2004 г.) Полученные результаты внесли изменения в видовой состав и распространение переносчиков малярии на территории РФ и некоторых стран ближнего зарубежья.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были представлены в виде докладов на 3 международных и 1 российской конференциях: Международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и ее практическое применение» (Москва, 2006), XII Международной орнитологической конференции (Ставрополь, 2006), I Всероссийском Совещании по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, 2006), III международном совещании "Молекулярная и популяционная биология комаров и других переносчиков заболеваний" (Колимбари, Крит, Греция, 13-20 июля 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатные работы, в том числе 10 статей, из которых 9 - в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», четырех глав, «Заключение», «Выводы», «Список литературы» (включающий 240 источник, из них 144 на иностранных языках). Текст изложен на 120 страницах (без учета приложений), содержащий 13 таблиц и проиллюстрированный 20 рисунками. Приложения содержат 5 таблиц.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубочайшую благодарность научным руководителям кандидату биол. наук М В. Федоровой и кандидату биол. наук И. И. Горячевой. Особую благодарность выражаю члену-корресполнденту РАН, доктору биол.наук И.А. Захарову-Гезехусу за всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы в руководимой им лаборатории. Я благодарю профессора, доктора биол. наук М.И. Гордеева и кандидата биол. наук Е.В. Шайкевич за совместную работу. Я искренне признательна за предоставление материала А.Б. Званцову, доктору биол. наук М.Ю.Щелканову, А.Бабуадзе, кандидатам биол. наук А. Кешишьян, Т.В.Волковой, Н.К. Потаповой. Я очень благодарна за всестороннюю помощь и профессиональные советы доктору биол. наук Н. А. Тамариной, кандидатам биол. наук Н.Я. Маркович и P.M. Горностаевой.

Работа финансировалась Глобальным фондом по борьбе со СПИДом, туберкулезом и малярией, Европейским региональным бюро Всемирной Организации Здравоохранения, а также по грантам РФФИ 05-04-49047, 05-04-49035, 06-04-08347, 08-04-01674-а; по грантам Президента РФ НШ-827.2003.4; НШ-15.2003.4; НШ-10122.2006.04, по программе РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

1.1. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.MACULIPENNIS

Комплекс видов Anopheles maculipennis - основной переносчик малярии в Палеарктике. Комплекс An. maculipennis включает в себя 11 Палеарктических видов (An. artemievi (jordeev, Zvantzov, Cioryacheva, Shaikevich and Ejov, An. atroparvus van Thiel, An. beklemishevi Stegnii & Kabanova, An. daciae Linton, Nicolescu & Harbach, An. labranchiae Falleroni, An. maculipennis Meigen, An. martinius Shingarev, An. melanoon Hackett, An. messeae Falleroni, An. persiensis Linton, Sedaghat & Harbach and An. sacharovi Favre) и 5 Неоарктических видов (An. occidentalis Dyar and Knab, An.aztecus, Hoffman, An.freeborni Aitken, An.earlei Vargas, An.hermsi Barr and Guptavanij) (Nicolescu et al., 2004; Kampen, 2005b).

В странах СНГ найдены 8 видов: An. artemievi, An. atroparvus van Thiel, An. beklemishevi Stegnii & Kabanova, An. maculipennis Meigen, An. martinius Shingarev, An. melanoon Hackett, An. messeae Falleroni и An. sacharovi Favre (Горностаева, 2000, 2003, 2009; Горностаева, Данилов, 2002; Мамедниязов, Ерохин, 2005; Мамедниязов, 1995; Ejov, 2005; Gordeev et al., 2008).

Изучение систематики видов комплекса не прекращалось на протяжении всего XX столетия. Первые работы были посвящены поиску морфологических особенностей и доказательствам существования репродуктивной изоляции между членами комплекса. Во второй половине столетия с успехом были использованы цитогенетические и биохимические подходы, а в последнее десятилетие широкое распространение получили методы молекулярной генетики. Итогом этих работ явилось открытие новых видов, часть из которых описана на основании молекулярно-генетических различий, а часть - с использованием методов цитогенетики.

1.2. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.CLAVIGER

В 40-х годах Del Vecchio на основании морфологических отличий яиц, личинок и куколок выделил два вариетета An.claviger. An.cl.petragnani и An.cl.missiroli (Del Vecchio, 1939; Lupascu, 1941; Senevet, Andranelli, 1955; Coluzzi, 1963). Видовая самостоятельность An.petragnani и An.claviger «.обсуждалась до 60-х г.г. XX в., когда Колуцци показал репродуктивную изоляцию этих форм (Coluzzi, 1963).

На территории бывшего СССР Устиновым (1946) и Маркович (1951) были выявлены две физиологические расы вида An.claviger, отличающиеся по признаку автогенности (способности самок откладывать первую кладку яиц без кровососания). Неавтогенные популяции были обнаружены в окрестностях Сочи (Шленова, 1938), в Адлере (Шипицина, 1941) и Абхазии (Устинов, 1945, 1946), тогда как популяции из европейской части Российской Федерации, Украины, Молдавии, Прибалтики, Казахстана и республик Средней Азии были способны к автогенному развитию яиц. Полученные данные поставили вопрос о видовом статусе комаров из автогенных и неавтогенных популяций на территории СНГ.

1.3. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.SUPERPICTUS

An.superpictus в последнее время рассматривается как комплекс видов. Известны две морфологические формы имаго (А и В), различающиеся по наличию или отсутствию темного пятна (кольца) на апикальном сегменте максиллярных щупиков (Amani, 1999).Молекулярно-генетический анализ области гена малой субъединицы цитохромоксидазы 1 (COI) и участка COI-II методом ПЦР-ПДРФ позволил выделить три молекулярные формы этого локуса, которые были обозначены как X, Y и Z (Oshagi et al, 2007а). Параллельно для выявления внутри- и межвидовых различий велись исследования другой маркерной области генома переносчика - первичной структуры области второго

внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (1Т52). Исследования показали отсутствие корреляции между молекулярными маркерами и морфологическими формами личинок и имаго е1 а1., 2007а, 2007Ь, 2008), но

выявили соответствие между митохондриальными и ядерными молекулярными формами.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

11.1. Места сбора. Материалом для работы послужили личинки и имаго малярийных комаров, собранные с 2004 по 2009 г.г. в Волгоградской, Астраханской, Ростовской, Пензенской областях, Краснодарском крае, Абхазии, республиках Адыгея и Калмыкия. Имаго собирали энтомологическим сачком, световыми ловушками, в местах дневок самок - заплечным пылесосом (BioQuip, USA), а также ловили на себе с помощью ловушки Крипгталя. Среди самок отбирали особей, напитавшихся кровью, которых помещали в индивидуальные пробирки для получения кладок. Сбор личинок проводили с помощью ковша. Кроме собственных сборов были проанализированы также личинки, имаго и яйца комаров из Воронежской области, республики Карачаево-Черкесия, Якутии, а также из Беларуси, Грузии, Армении и Азербайджана, любезно предоставленные местными энтомологами. Материал из Московской и Томской областей, Алтайского края, республики Калмыкия, из Казахстана, Кыргызстана, Узбекистана, Туркменистана и Таджикистана предоставлен М.И. Гордеевым и А.Б. Званцовым. Для определения имаго и личинок использовали стандартные ключи (Гуцевич и др., 1970).

11.2. Цитогенетический анализ. Для цитогенетических исследований личинок IV возраста фиксировали в смеси 96% спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1). Слюнные железы комаров выделяли в капле фиксатора под микроскопом МБС-10. Хитиновый покров личинки приподнимали с помощью препаровальных игл. Затем из грудного отдела извлекали парные слюнные железы. Железы окрашивали 2%-ным лактоацеторсином в течение 30 минут. Затем излишки краски убирали фильтровальной бумагой. Железы дифференцировали в 45% уксусной кислоте. Далее железы накрывали покровным стеклом и раздавливали легкими постукиваниями тупым концом препаровальной иглы. Цитогенетический анализ политенных хромосом проводили под микроскопом Micros (Австрия). Видовой и половой состав личинок малярийных комаров определяли путем сравнения препаратов политенных хромосом с фотокартами политенных хромосом видов-двойников рода Anopheles (Стегний, 1991). Для оценки достоверности различий в частоте встречаемости инверсий в разных популяциях An. messeae европейской части ареала использовали метод х2 (Гершкович, 1968).

11.3. Молекулярно-генетические методы.

Выделение ДИК. Для молекулярно-генетических исследований комаров фиксировали в 96° спирте. ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК DIAtom DNA Prep (Изоген, Россия) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Принцип действия данного набора основан на использовании Лизирующего реагента с гуанидинтиоцианатом, последний предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса и денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии Лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на NucleoS™-cop6eHTe, а затем легко отмывается от других компонентов (белков, солей) спиртовым раствором. ДНК элюируется с сорбента ЭкстраГеном Е™ или деионизованной водой. Полученную ДНК использовали для проведения ПЦР. В реакцию амплификации брали по 0,01 мкг выделенной тотальной ДНК.

ПЦР. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в объеме 25 мкл с использованием набора реактивов Encyclo PCR kit (Евроген, Россия).

Реакционную смесь готовили в соответствии с рекомендациями производителя: 2,5 мкл 10х Епсус1о-буфера, 0,5 мкл смеси dNTP, содержащей по 0,2 мМ каждого нуклеотида,

0,5 мкл 50х- Encyclo-полимеразы (конечная концентрация 0,5 ед.), по 0,2 мкМ каждого праймера, 100 нг/25 мкл тотальной ДНК, бидистиллированная вода добавлялась до конечного объема 25 мкл.

Амплификацию фрагментов ДНК проводили в течение 35 циклов на термоциклере GeneAmpR RCR System 2700 (Applied Biosystems, США). Структура использованных -праймеров представлена в таблице;--

Таблица 1. Последовательность использованных в работе праймеров

Название праймера Последовательность праймера Источник

5,8S 5'-TGT GAA CTG CAG GAC АСА TG-3' Porter,Collins, 1991

28S 5'- ATG CTT AAA TTT AGG GGG TA-3' Porter,Collins, 1991

28S1 5'- TAT GCT TAA ATT CAG GGG GT -3' Beebe, Saul, 1995

COIIR1 5 '-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 ' Roehrdanz, 1993

COIIR2 5 ' -CC ACAAATTTCTG AACATTG ACC-3 ' Crozier and Crozier, 1993

Полимеразную цепную реакцию с праймерами, комплементарными З'-концу гена 5,8S рРНК и 5'-концу гена 28S рРНК и фланкирующими область второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов, проводили по условиям, описанным ранее (Proft et al., 1999; Oshaghi et al, 2007a, 2007b). Для амплификации данной области генома использовали праймеры 5,8S и 28S для комаров комплекса An. maculipennis и комаров An. claviger, и праймеры 5,8S и 28S1 для комаров An. superpictus. Полимеразную цепную реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация - 3 мин 98°С, за которой следовали 35 циклов: денатурация - 20 сек 95°С, отжиг - 20 сек, полимеризация - 72°С - 40 сек; заключительная полимеризация 7 мин 72°С. Отжиг праймеров проводили при t=50°C для праймеров 5,8S и 28S, и при t=53°C для праймеров 5,8S и 28S1. Полимеразную цепную реакцию с праймерами COIIR1 и COIIR2, комплементарными фрагменту между генами субъединиц I и II цитохромоксидазы проводили при следующих параметрах: предварительная денатурация - 3 мин 98°С, 35 циклов: денатурация - 20 сек 95°С, отжиг - 20 сек 56°С, полимеризация - 72°С - 40 сек; заключительная полимеризация - 7 мин 72°С.

ПЦР-ПДРФ. Видовую идентификацию комаров комплекса An. maculipennis проводили методом ПЦР-ПДРФ на основании различий в паттернах рестрикции продуктов амплификации по ряду диагностических рестриктаз. Идентификацию видов осуществляли в несколько этапов. На первом этапе ПЦР-продукты, полученные в результате полимеразной цепной реакции с праймерами 5,8S и 28S, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Cfo\ (HhaY) (Promega Corporation, USA). Для этого 15 мкл ПЦР продукта смешивали с 2мкл 10х буферного раствора для рестриктазы Cfol и 5 ед рестриктазы. Смесь инкубировали при 37°С в течение часа. Результаты ПЦР-ПДРФ визуализировали методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле.

Использование данного подхода, предложенного Николеску с соавторами (Nikolescu et al., 2004), позволяет идентифицировать 3 вида из комплекса - An. atroparvus, An. maculipennis, An. sacharovi. Паттерны рестрикции видов An. messeae, An. daciae, An. melanoon, An. artemievi оказываются сходными. Для идентификации этих четырех видов автором был разработан подход, основанный на использовании эндонуклеаз рестрикции, имеющих сайты рестрикции в нуклеотидной последовательности только одного из четырех вышеназванных видов (специфически расщепляющими ПЦР-продукт лишь одного из вышеназванных видов с образованием паттернов рестрикции специфического размера). Поиск специфических эндонуклеаз был проведен с использованием программы «Restriction of DNA sequences» (Bikandi et al., 2004).

Для выявления митохондриальных гаплотипов An. superpictus проводили рестрикцию продуктов амплификации области генов цитохромоксидазы субъединицы I и

субъединицы II (COI-COII) с использованием эндонуклеазы рестрикции А!и{ (Fermentas, Литва) по ранее описанной методике (Oshaghi et al., 2008а). Для этого 15 мкл ПЦР продукта смешивали с 2мкл 10х буферного раствора для рестриктазы AM и 5ед рестриктазы. Реакцию проводили в течение часа и останавливали реакцию добавлением EDTA до конечной концентрации 20тМ.

Клонирование ПЦР фрагментов, их фракционирование в агарозном геле, элюция фрагментов ДНК и их секвенирование проводили согласно стандартным протоколам.

Методы биоинформационного анализа. Анализ хроматограмм проводили с помощью программы CromasPro 13.3 (Technelysium, Australia). Выравнивание последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в базах данных, проводили с помощью ресурсов, расположенных на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov, программ CLUSTAL W 1.83 (Thompson et al., 1994) и CLUSTAL X 2.1. (Larkin et al., 2007). Для статистической обработки последовательностей использовали программы BioEdit 7.0.5.3. (Hall, 1999). Для построения девдрограмм применяли программу MEGA 4.0. (Tarnura et al., 2007) с использованием алгоритма neighbor joining (NJ). Для оценки статистической достоверности полученных дендрограмм была выбрана величина бутстрэп-поддержки не менее 70%.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ III.1. Морфологические признаки, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности комаров комплекса An. maculipennis С помощью морфологических, цитогенетических и молекулярно-генетических методов были исследованы 8 видов комаров комплекса An.maculipennis. Всего проанализировано 2151 особей комаров, собранных в 10 странах. В 300 кладках, полученных от напитавшихся самок, были изучены морфологические особенности яиц.

III.1.1. Морфология яиц у комаров комплекса An.maculipennis Морфология яиц была изучена у 8 представителей комплекса На территории европейской части России An.maculipennis, An.messeae и An.atroparvus являются наиболее многочисленными видами, в южных и центральных регионах их ареалы симпатричны (Горностаева, Данилов, 2002). При анализе индивидуальных кладок An.maculipennis были обнаружены промежуточные варианты яиц. Количество пятен между черными перевязями на экзохорионе варьировало от практически полного их отсутствия до значительного количества. Изменчивость по признаку «количество пятен на экзохорионе яйца» была впервые отмечена в Македонии (Rice, Barber, 1937) и на Среднем Урале (Маркин, 1938), а впоследствии - в Армении, Одесской области и некоторых других регионах (Чубкова, 1948, Селене, 1953). При получении массовых кладок подобная картина изменчивости рисунка яиц существенно затрудняет видовую идентификацию.

В ряде исследованных регионов при получении индивидуальных кладок у An.messeae и An.atroparvus были обнаружены промежуточные варианты, у которых в разной степени были развиты темные поперечные перевязи у основания воздушных камер. Яйца еще одного представителя комплекса An.maculipennis - An.melanoon были либо полностью темные, либо с темными поперечными полосами и пятнами между полосами; в последнем случае яйца An.melanoon были практически неотличимы от яиц An.messeae. Сходство кладок An.melanoon и An.messeae в свое время создало трудности при идентификации переносчиков малярии в ряде стран, в том числе в Грузии (Гакетг, Барбер, 1935; Каландадзе, Сагателова, 1938) и Азербайджане (Ременникова, 1953, 1958; Киясов, 1970, 1973; Региональная стратегия, 2006), Турции (Postiglione et al., 1970), Греции (Linton et al., 2002) и на юге России (Маркович, 1936; Калита, 1939). Во всех указанных регионах отмечали оба вида (An.messeae и An.melanoon), основываясь на признаках морфологии и окраски экзохориона яиц. В дальнейшем было показано, что в странах Закавказья, Турции и, вероятно, на юге России (начиная от Адлера - 43°4'с.ш.)

распространен только An.melanoon, тогда как в Греции эти виды являются симпатричными (Postiglione et al., 1970; Linton et al., 2002). Более того, темные яйца An.melanoon явно не отличались от хорошо пигментированных яиц в кладках An.messeae и An.alroparvus, что вызывало дополнительные сомнения в правильности идентификации этих видов. Проблема в изучении распространения An.melanoon усложнилась после описания нового вида, An.persiensis; обнаруженного на севере Ирана, яйца которого похожи на яйца An.melanoon (Sedaghat et al, 2003)

Яйца An.sacharovi (Закавказье), An.martinius и An.artemievi (Средняя Азия) без воздушных камер и не различимы между собой. Идентификация этих видов проводилась нами с использованием цитогенетических и молекулярно-генетических методов анализа

Таким образом, использование морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса An.maculipennis затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и сходства морфологии яиц у некоторых видов.

III. 1.2. Цитогенетический анализ комаров комплекса An.maculipennis Цитогенетическими методами было изучено 205 кариотипов An.maculipennis и An.melanoon, 48 An.alroparvus, 12 An.sacharovi и 425 An.messeae.

Кариотип An.atroparvus принят как «стандартный» (Frizzi, 1947,1953) При изучении полученных нами препаратов не удалось выявить каких-либо особенностей. Кариотипы всех особей, собранных в южных регионах России (Краснодарский и Ставропольский край, Ростовская область, Калмыкия) по рисунку не отличались от фотокарт, сделанных в Западной Европе (Frizzi, 1947,1953) и на Украине, Молдавии, Ростовской области (Стегний, 1976, 1991; Шуваликов,1986).

При изучении рисунка политенных хромосом An.maculipennis, собранных в 10 регионах, не выявлено отличий от кариотипов, полученных ранее в Молдавии, Абхазии, на Украине, европейской части России и других исследованных ранее регионов (Стегний, 1976, 1991; Шуваликов, 1986; Гордеев, 1997). Редкая инверсия на левом плече второй аутосомы, описанная в молдавской популяции An.maculipennis Стегнием и Кабановой (1978), нами не обнаружена. Полученные нами данные показывают, что на всем изученном нами ареале этот вид является мономорфным. Сравнение кариотипов An.maculipennis с An.melanoon, собранного в Грузии и идентифицированного молекулярно-генетическими методами, подтвердило, что эти виды являются гомосеквентыми, т.е. имеют идентичную структуру политенных хромосом, и поэтому не могут быть диагностированы цитогенетическими методами.

Кариотипы An.sacharovi были исследованы в популяциях Грузии. Этот вид отличается от рассмотренных выше фиксированной инверсией в правом плече хромосомы 3R. В изученном нами материале никаких отличий от полученных ранее кариотипов выявлено не было.

Характерной особенностью полиморфных видов является наличие флуктуирующих хромосомных инверсий. Среди исследованных нами видов это явление было обнаружено у An. messeae. В изученных популяциях An.messeae нами выявлены только известные ранее хромосомные инверсии: XLj, xl4, 2R|, 3R|, 3L| (табл. 2). Все они, кроме xl4, широко распространены по ареалу вида. Инверсия XL4 является эндемичной и встречается с низкой частотой (2%) в Пензенской и Московской областях.

На основании сходства кариотипической структуры популяций на территории Русской равнины нами было выделено три зоны - юго-западная, юго-восточная и центральная, - которые отличались по набору хромосомных перестроек и частотам отдельных инверсий (табл.2).

По хромосоме XL: В юго-западной и юго-восточной зонах отмечена высокая частота инверсионной последовательности XLo. В центральной зоне встречается инверсия XL4 и наблюдается повышенная частота инверсии XL) (Х2=73,3; число степеней свободы df=2;p<0,001).

По хромосоме 2К: В юго-западной и юго-восточной зонах отсутствуют варианты с инверсией 215.1. В центральной зоне отмечена высокая частота гомо- и гетерозигот с этой инверсией (Х*=218; (114; р<0,001).

По хромосоме ЗК: Юго-восточная зона отличается от юго-западной и центральной зон по соотношению инверсионных генотипов (Х2=35,8; (Н'=4; р<0,001). В юго-восточной зоне наблюдается максимальная частота гомозигот ЗКц. Самая низкая частота вариантов с инверсией ЗЯ) отмечена в юго- западной зоне.

По хромосоме ЗЬ: Три зоны отличались друг от друга по составу инверсионных вариантов (Х2=93,5; (11=4; р<0,001). Юго-восточная зона характеризуется высокой долей вариантов ЗЦ1 и ЗЬц, В центральной зоне отмечена минимальная частота особей с инверсией ЗЬ[.

Три рассматриваемые зоны четко дифференцируются по кариотипическому составу. Центральная зона характеризуется более высоким уровнем инверсионного полиморфизма по всем хромосомам, кроме плеча ЗЬ. Для двух южных зон отмечена высокая частота инверсии ХЦ, наблюдается полное отсутствие гомо- и гетерозигот по инверсии 21?) и высокая доля особей с инверсией ЗЬь Одновременно эти южные зоны имеют ряд различий. Особенностью юго-восточной зоны является увеличение частоты гомо - и гетерозигот по инверсиям ЗК[ и 3.

Данные по кариотипической структуре популяций юго-восточной зоны Русской равнины получены впервые и хорошо согласуются с выводами В.Н. Стегния (1991) о клинальном характере изменчивости по инверсии 31^1 (увеличение частоты с запада на восток) и об увеличении доли гомозигот ЗЬ| 1 на южной и восточной периферии ареала

Таблица 2. Частоты инверсий у Ап.темеае в изученных зонах Русской равнины.

Инверсии Це1ггр Частота ([± %) Юго-Запад Частота (Г± яг, %) Юго-Восток Частота (Г±5Г, %)

ХЬО 16 9,4±2,3 71 47±4,1 147 45,7±2,8

ХЫ 151 88,3±2,5 80 53±4,1 175 54,3±2,8

ХЬ4 4 2,3±1,2 0 0 0 0

п' 171 151 322

21100 44 39,6±4,6 207 100 96 100

21101 49 44,2±4,7 0 0 0 0

2Л11 18 16,2±3,5 0 0 0 0

ЗЯОО 59 53,2±4,7 76 79,2±3,5 106 51,2±3,5

ЗШИ 46 41,4±4,7 19 19,8±3,2 67 32,4±3,3

31Ш 6 5,4±2,1 1 1±1,0 34 16,4±2,6

ЗЬОО 108 97,3±1,5 75 78,125±4,2 97 46,8±3,5

ЗЬ01 3 2,7±1,5 20 21±4,2 85 41,1±3,4

31Л1 0 0 1 1±1,0 25 12,1±2,3

п 111 96 207

Примечание: п-число особей, п'-число половых хромосом ХЬ у самцов и самок, ¡'-чпетита инверсий по отдельным хромосомам, 8(-стандартная ошибка.

Ш.1.3. Видовая идентификация комаров комплекса An. maculipennis методами молекулярно-генетического анализа

Всего методами молекулярно-генетического анализа была исследована 1461 особь (табл.3).

Для определения видовой принадлежности комаров комплекса An.maculipennis были проанализированы размер и первичная структура второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (ITS2).

Видовая идентификация комаров An.beklemishevi проводилась на основании оценки размера продукта амплификации. Размер продукта An.beklemishevi, получаемого в результате ПЦР с праймерами 5,8S и 28S, составляет около 750 п.н., что почти в два раза больше, чем у остальных представителей комплекса (рис.1).

Рис. I. Электрофоретическое фракционирование ПЦР-продуктов транскрибируемого спейсера 1Т82. М100 -маркер молекулярного веса, дорожки 1-3 -Ап. тасиИреппгя яЛ., 4-6 - Ап Ьек1ет1.чЬе\ч

Идентификация комаров Ап. Мгорагут, Ап.5асИагоу1, Ап.те1апооп, Ап.теязеае, Ап.рег1{ет1з и Ап.аг1ет1еу1 непосредственно после реакции амплификации с праймерами 5,85 и 28Б была затруднена из-за сходства размеров ПЦР-продуктов. Идентификация этих видов осуществлялась в несколько этапов методом ПЦР-ПДРФ с использованием разработанных нами подходов. На первом этапе была проведена рестрикция ПЦР-продукта с использованием эндонуклеазы С/Ы (НЬа1). Размеры фрагментов рестрикции представлены в таблице 4.

Таблица 4. Паттерны С}о\ рестрикции ПЦР продукта области 1Т82 комаров комплекса Ап.тасиИрептв

Вид Длина фрагментов рестрикции (п.н.)

48 78 102 107 108 in 113 129 135 136 141 207 272 286 389

An. sacharovi + + + +

An. messeae + + + +

An. melanoon + + + +

An. persiensis + + +

An.maculipennis + + +

An. atroparvus + +

An. artemievi + + + +

An. martinius + + +

Таблица 3. Виды малярийных комаров комплекса Ап.тскчИрепп1Я, определенные молскулярно-гснстическими методами

Области^ Страны Виды и колот сство исследованных комаров, в скобках приведены номера ссхаснироытшх последовательностей ЮДР-процуктов (клонов) 1Т82, зарегистрированных в СкпВапк входе настоящего исследования

Ап. ттНреппм Ал. а/горагуил Аитчзю* ».1 Лппнктое* Ап.Ьек1ет1зИ»У1 Ли. зосИаггт Ап. рм/епм Ап.апчпиУ!

Россия

Карачаево-Черкесия 83 (АМ409759, АМ409760) (АМ40976))

Краснодарский край Н республика Адиге* 76 35 53 (АМ409773, АМ409774 (Жб46207.1 04646206.1))

Ростовская обл 14 18 36(АМ41»9770-АМ409772)

Воронежская обл. 6 55

Калмыкия 14 27 (5(4)) (АМ409762, АМ409763, АМ409764<1?Ы6 4 6211, р№646212), АМ409765, АМ409766 (АМ409767, АМ4С97С8))

Астрахани- Кия обл. 82(2(9) (АМ409784, АМ409785 (АМ409786-АМ409788) (Ш646219 РЫ646218) (Ш64621б РШ46217) (АМ409782 АМ409783))

Ставрополье-кий край 9

Пете некая обл. (АМ409781) 5(1(2)) (АМ409769 (Ж646204. Ш646205))

Московская обл. 1 (АМ409780) 10(3(3)) (АМ409797, АМ409798 (Ш646215) АМ409799 (Ж646213. П>1646214))

Республика 36 46

Якутия 48

Томска! обл. 6 (АМ409775, Ш409Ш)

Беларусь 85 79

Закавказье

Абхазия 57 1 1

Грузия 58 (АМ269898 АМ269738) 20 (АМ271001) 17 АМ269899

Армения 48 24

Азербайджан 42 тб65790-тбб5792 235 Ж665793, РЫ665795, РЫ66579б 2 АМ409777 Ш665794

яя

Кирплия 18 15 (ТМ9<>8225>

Узбекистан 9(РК1>У8219» ГЫ908224)

Казахстан Э(К№Ю8217 ГЫ90Й218)

Таджикистан 4

Всего 4В5 (101 89 (2) 5СЮ (2(431)) 22(1) 46 286(4) 2(2) 31(9)

Анализ полученных данных показал, что только три вида комплекса- Ап.Шгораггш, АпласИагох!, Ап.тасиЦрептз - могут быть идентифицированы на основании структуры паттернов рестрикции по рестиктазе Cfo\, Паттерны рестрикции видов Лп.теыеае, Ап.сЬаае, Ап.те1апооп и Ап. аг1ет1ег1 плохо различались из-за сходства в размерах фрагментов рестрикции, в связи с чем для дифференциации этих видов был проведен

дополнительный рестрикционный анализ. __

-Для этого был разработан подход, основанный на использовании эндонуклеаз

рестрикции, имеющих сайты рестрикции в нуклеотидной последовательности только одного из четырех вышеназванных видов (специфически расщепляющих ПЦР-продукт лишь одного из вышеназванных видов с образованием паттернов рестрикции специфического размера). В каждом случае на начальном этапе исследования была проведена амплификация образцов ДНК с праймерами 5,85 и 285. Для дифференциации видов Ли.гаеиеае, АпМааае и Ап.те1апооп были использованы рестриктазы МгоХ1,5ас11 и Я*/ЕП, а для дифференциации видов Аптеззеае и Ап. аПет1Ы - эндонуклеазы рестрикции &/АС1 и ВпЛ.

ПЦР-ПДРФ ГО52 видов комплекса Ап.тасиИреппЬ

Ап. а!горапи\' Ап. тасииреппк Ап. хасНагоуг Ап. те$5еае, Ап. 4ас1ае, Ап. те!апооп Ап. тенеае, Ап. пг1ет!е\1

МгоХ£. ---'^ХаМ,

Ап. теххеае

Ап. (1ас'ше | Ап. теШпооп | | Ап. тешае | Ап. аг!сгп1еУ1

Рис.2 . Схема пошаговой рестрикции видов комплекса Л«. тасиИрептз.

Наши результаты показали, что дифференциацию и идентификацию видов комплекса Ап.тасиИрептй можно проводить с помощью методов ПЦР и ПЦР-ПДРФ с использованием в качестве маркера области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (1Т52). Идентификация проводится в несколько этапов. На начальном этапе на основании размера продукта амплификации идентифицируется вид Ап. Ьек!ет1зИеу1. Применение метода ПЦР-ПДРФ позволяет за несколько последовательных шагов идентифицировать 7 других представителей комплекса.

1П.1.3.1. Первичная структура 1Тв2 у комаров Ап. тасиИреппи, Ап-аиорагущ, Ап.5ас11аго\>1, Агирететк, АгиШепйЫ

Для изучения внутривидового индивидуального полиморфизма области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов было проведено секвенирование продуктов амплификации образцов ДНК Ап. тасиПрептз, Ап.а1горагуш, Ап.хасИагтг!, Ап.регз1епзи, An.artem.ievi. Анализ хромагограмм и сравнение нуклеотидных другими последовательностей, полученных в результате секвенирования, с последовательностями, размещенными в ОепеВапк, выявили идентичность последовательностей в пределах каждого из изученных видов. Комары Ап. тасиИрептз, Ап.а1горап>ш, Ап.аг1епйеу1, Ап.регз1епз1з, Ап.те!апоп, Ап.засНагоу/ на изученной территории являются мономорфными по структуре второго внутреннего

14

транскрибируемого спейсера, что позволяет считать эту область генома исключительно удобным маркером для видовой диагностики видов-двойников комплекса An.maculipennis.

III.1.3.2. Первичная структура ITS2 у Anjnesseae

Особый интерес для исследования представляли два вида комплекса An.maculipenms - An. messeae и An. daciae. Последний вид описан в 2004 году. An. daciae был выделен из вида An. messeae (Linton et al., 2005). У An. daciae были обнаружены пять позиций, по которым нуклеотидная последовательность этой области генома вида отличалась от нуклеотидной последовательности второго внутреннего транскрибируемого спейсера комаров An. messeae.

Паттерны рестрикции An.messeae и An.daciae после обработки эндонуклеазой рестрикции Cfal не отличались. Для дифференциации видов были отобраны рестриктазы MroXl и BseGI. Эндонуклеаза MroXl имеет сайт рестрикции в последовательности нукпеотидов второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов An. messeae в положении 161, в котором у An. messeae находится тимин. Для рестриктазы MroXl не было выявлено сайтов рестрикции в соответствующей последовательности комаров An. daciae, в том числе и в положении 161, поскольку у An. daciae в этом положении располагается аденин. Наличие аценина в положении 161 последовательности второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов An. daciae приводит к возникновению сайта рестрикции эндонуклеазы BseGI, отобранной для идентификации этого вида и дифференциации An. daciae от An. messeae.

ПЦР-ПДРФ анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции MroXI и BseGI был выполнен для 150 особей An.messeae. Паттерны рестрикции продуктов амплификации образцов ДНК 44 особей по эндонуклеазе рестрикции MroXl соответствовали An. messeae. Обработка продуктов амплификации этих особей рестриктазой BseGI не выявила специфических сайтов рестрикции для данной эндонуклеазы. ПЦР-ПДРФ анализ образцов ДНК 106 особей из Московской, Астраханской, Пензенской, Воронежской, Волгоградской, Ростовской областей, республики Калмыкия и Краснодарского края показал, что в геноме этих особей обнаруживаются оба варианта последовательностей, один - специфичный для An. messeae и второй - специфичный для An. daciae. Например, после обработки образцов эндонуклеазой рестрикции MroXl и проведения электрофореза выявлялись как фрагменты длиной 152 п.н. и 275 п.н., характерные для An. messeae, так и нерестрицированный продукт амплификации длиной 427 п.н., характерный для An. daciae.

Полученные результаты свидетельствовали либо об отсутствии репродуктивных барьеров и частых межвидовых скрещиваниях симпатрических видов, либо о наличии предкового полиморфизма An. messeae как особенности ввда. Для выбора альтернативной гипотезы было проведено прямое секвенирование продуктов амплификации. Анализ хроматограмм образцов, имеющих паттерны рестрикции, характерные для An. messeae (7 особей), показал, что в изученных последовательностях обнаруживается только по одному сигналу в каждом из положений 161, 165, 167, 362, 382 (GenBank, Калмыкия: АМ409762-АМ409764, Астраханская область: АМ409783, АМ409784, Томская область: АМ409775, АМ409776), что соответствует нуклеотидам TTC GG. Анализ образцов, для которых был выявлен внутригеномный полиморфизм, показал, что в положениях 161 п.н., 165 п.н., 167 п.н., 362 п.н., 382 п.н. на хроматограммах обнаруживается по два сигнала во всех или нескольких сайтах 161 п.н., 165 п.н., 167 п.н., 362 п.н., 382 п.н.

Для дальнейшего анализа были отобраны образцы, для которых внутригеномный полиморфизм был подтвержден методами ПЦР-ПДРФ и прямого секвенирования. Продукты амплификации 16 особей из Московской (2), Пензенской (1), Волгоградской (3), Астраханской (3) областей, республики Калмыкия (2) и Краснодарского края (3) были клонированы. Всего было получено и секвенировано 29 клонов. При сравнении

нуклеотидных последовательностей была выявлена их значительная изменчивость, как индивидуальная, так и внутривидовая (2,3%). Анализ только филогенетически значимых замен для образцов из центра европейской части (Московская и Пензенская области) показал, что варианты ГО>2 в этих образцах соответствуют молекулярным формам 1, 2 (Ап.тежеае) и 5 (АпАаЫае) согласно классификации, предложенной Ди Лука и др. (Р1 Ьиса е! а1. 2004) (табл.5). На юго-западе европейской части (Краснодарский край! выявлены—варианты—1Т52 №4 (Ап.тезхеае) и №5 (Ап.еЬЫае). Варианты последовательностей образцов из юго-восточных областей европейской части (Волгоградская, Астраханская области и Калмыкия) соответствовали № 1, 2, 3, 4 (Ап.тезяеае) и 5 (Ап.сЬаае). Нами впервые были найдены еще две уникальные формы по филогенетически значимым сайтам. В трех особях (двух из Ростовской, одной из Астраханской областей) найдены комбинации нуклеотидов, характерные как для Ап.теззеае, так и для Ап.сЬЫае.

Полученные нами данные указывают на то, что европейская часть России как центр ареала и происхождения Ап.техзеае, характеризуется высоким полиморфизмом первичной структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов. Наши результаты не совпадают с результатами западных исследователей (Б) Ьиса е1 а1., 2004; №со1езси е1 а1., 2004), также изучавших полиморфизм первичной структуры спейсера у комаров Ап. теззеае. В цитируемых работах первичная структура 1Т82 изучалась у комаров из локальных популяций, обитающих по краю ареала вида, где полиморфизм этого многокопийного элемента кластера может быть снижен и где в силу указанной причины, вероятно, представлен лишь один из вариантов последовательностей.

Таблица 5. Филогенетически значимые замены в области 1Т82 у Ап.теззгае

Молекулярные формы An.messeae Европейская часть РФ

(по Di Luca et al, 2004) Центр

TTC AC-1 TTC AC-1

АТС AC-2

АТС AC-2 AATAC-5

Юго-запад

АТС GG-3 TTC GG -4

TTC GG-4=An.messeae s.s. AATAC-5

AAT KC-S-An.daciae (Linton et al,2004) Юго- Восток

TTC AC-1

AAC AC-6 АТС AC-2

TTC GG -4

AAT AC-5

АТС AC

TTC AC

Исходя из изложенного выше, можно считать неправомерным выделение АпЛасше в качестве самостоятельного вида. Очевидно, что для Ап. теязеае с его высоким инверсионным полиморфизмом, огромным ареалом и высокой пластичностью характерны внутривидовая и индивидуальная изменчивости второго внутреннего транскрибируеого спейсера, являющиеся, возможно, адаптивно значимыми для этого вида. Дальнейшие исследования изменчивости 1Т82 Ап.теззеае по всему ареалу помогут выявить закономерности во встречаемости разных вариантов этого маркера.

III. 2. Молекулярно-генетические особенности комаровЛп. claviger Проведено изучение особенностей первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов у 13 комаров An. claviger из локальных географически удаленных популяций Абхазии, Краснодарского края и Беларуси.

Длина второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов у исследованных комаров An. claviger равна 315-336 п.н. Изменчивость размера фрагмента связана с многочисленными инсерциями/делециями длиной от двух до двадцати пар нуклеотидов.

"Г .....

»0jBel3ras.2 41J l- AY129232germany L— Belarus.1

.DQ229314.1lran 98 Ф02293131гап p Abhazial "lööl Abhazia2 -pelragnanl

- Gyuamskoe

— An.maculipennis

Рис. 3. Филогенетические связи между представителями комплекса Ап.с/ам^ег по данным анализа 1ТЯ2.

Филогенетический анализ, выполненный с привлечением базы данных GeneBank, позволяет выделить четыре варианта последовательностей второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов у An. claviger (рис.). Три группы, которые можно назвать: западно-европейской, иранской и абхазской, образуют кластер, обособленный от кластера, сформированного единственным вариантом ITS2, обнаруженным у комара из Гуамского ущелья, и An. petrognani (GenBank:AY129233). В пользу высказанного предположения о наличии четырех вариантов последовательностей ITS2 у комаров An. claviger свидетельствует высокий уровень бутстреп поддержки (94%). Следует отметить, что каждая группа последовательностей маркируется специфическими инсерциями/делециями.

В ранних исследованиях An. claviger указывалось, что популяции вида различаются по признаку автогенности/неавтогенности самок. Специфическая структура последовательности ITS2 комаров из популяции Абхазии и кластеризация в отдельную группу с высокой бутстрэп поддержкой являются указанием на генетическую обособленность неавтогенной популяции. Биологические характеристики, которые сопровождают подобную обособленность, могли бы существенно дополнить популяционно-генетические данные.

Особый интерес представляют данные о структуре последовательности ITS2, обнаруженной у комара из Гуамского ущелья. Статистический анализ указывает на то, что данная последовательность имеет весьма высокий уровень различия с последовательностями 1TS2 An. claviger, описанными другими авторами (GenBank: DQ229313, DQ229314, AY129232) и нами - до 34,4 % при попарном сравнении. Различия первичной структуры ITS2 комара из Гуамского ущелья и комара близкородственного вида An. petrognani из Франции составили 30,5%. При попарном сравнении последовательностей ITS2 комаров из абхазской и белорусской популяций, а также немецкого и иранских вариантов с первичной структурой ITS2 An. petrognani различия

достигают 39,6%. Отсутствие дополнительных данных, прежде всего данных по морфологии имаго и куколок и цитогенетике, не позволяют сделать однозначного вывода о таксономическом статусе находки. Высокая изменчивость структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера может быть особенностью вида Ап. claviger. С другой стороны, возможно существование критических видов в комплексе Ап. claviger.

Несмотря на вышесказанное, на современной стадии исследованийпредставляется возможным и желательным использование данных о первичной структуре второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов как маркера для диагностистики видов Ап. claviger и Ап. petrognani. С нашей точки зрения исключительно интересным представляется еще и возможность использования этого маркера для характеристики изменчивости локальных популяций вида Ап. claviger.

III.3. Морфологические и молекулярно-генетические особенности Aiusuperpictus

Интерес к этому виду обусловлен тем, что в Иране в 2007 году были описаны три молекулярные формы, открытие которых позволило авторам предположить, что An.superpictus является комплексом видов-двойников. Этот вид широко распространен в среднеазиатских республиках, что создает благоприятные условия для проверки этого предположения. Мы начали исследования с морфологического анализа. Известно, что форма А не имеет темного кольца на последнем членике максилярных щупиков, которое присутствует у формы В. Нами было просмотрено 39 самок из разных районов Туркменистана и Кыргызстана. Результаты показали, что на этих территориях преобладали морфологические типы А. Форма В была обнаружена в двух точках: в д.Сузак (Кыргыстан) - из 4-х исследованных самок 3 относились к форме Вив с.Узген 2 самки из 13 были определены как форма В.

Анализ первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера был проведен с использованием 28S1 обратного праймера. Сравнение полученных последовательностей с материалом из международных баз данных показал, что в исследованных районах Кыргызстана и Туркменистана распространена только одна молекулярная форма, которая соответствует форме X, описанной в Иране. Уровень сходства оказался равен 100%. Эта молекулярная форма обнаружена также в Греции, Узбекистане, Пакистане. По нашим данным, она представлена обеими морфологическими вариантами, т.е. формой А и В.

Для изучения молекулярно-генетической структуры популяций в целях оценки уровня полиморфизма и генетического разнообразия популяций Ап. superpictus был проведен ПЦР-ПДРФ анализ области COI-COII митохондриального генома переносчика. В Туркменистане и Кыргызстане преобладал митотип X, наряду с ним, в Туркменистане и Кыргызстане отмечен митотип Y в единичных экземплярах. Более того, было выявлено два новых гаплотипа XI в Туркменистане и Кыргызстане с паттернами рестрикции около 540 п.н., 420 п.н., 200 п.н., 150 п.н., 140 п.н. (1, 4 дорожки, рис. 4) и Х2 в Кыргызстане около 540,360,280,150, 140 (дорожка 2, рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма результатов рестрикции области С01-С0П Ап. хирегркШя по сайту рестрикции А1и\. 1 - Ап. вирегр^ш из Туркменистана (Лебапский велоят, Керки); 2,3 - Ап. яирегрШш г. Ташкумыр; 4,5 - Ап. зирегрШш, пос. Сузак (Кыргызстан).

Таким образом, исходя из полученных результатов, морфологические формы Ап.трегрШш не соответствуют молекулярным формам по 1Т52 и С01-Н. Более того, выявлено и несоответствие митотипов и молекулярных форм по 1Т52, что не подтверждает ранние исследования. Обнаружены два новых митотипа XI (в Кыргызстане и Туркменистане) и Х2 (в Кыргыстане).

ГЛАВА IV. ФАУНИСТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработанный нами молекулярно-генетический подход был использован для уточнения видового состава комплекса Ап. тасиИрепп/з на территории России и сопредельных государств: Грузии, Армении, Азербайджана, Кыргызстана, Казахстана, Узбекистана, Таджикистана, Белоруссии.

При анализе 75 кладок комаров, собранных в Азербайджане в Ленкоранской низменности (с. Пенсар Астаринского р-на), в одной были обнаружены яйца, сходные по рисунку экзохориона с яйцами Ап. те/апооп. Согласно данным, полученным в 30-40 г.г. и основанным на традиционных морфологических исследованиях, Ап. те1апооп являлся одним из основных переносчиков малярии в Ленкоранской низменности (Киясов, 1970, 1973, Ременникова, 1953, 1958). Для определения видовой принадлежности самки, отложившей кладку, были проведены молекулярно-генетические исследования. Сравнение последовательности нуклеотидов, полученной в результате секвенирования продукта амплификации (ОепВапк: АМ409777), с последовательностями, размещенными в банке данных ОепВапк, показало, что первичная структура исследованной последовательности имеет полное (100%) сходство с нуклеотидными последовательностями (ОепВапк: АУ137847-АУ137817) недавно описанного на севере Ирана вида Ап. реп1еп818 (Зес^Ьа! е1 а1, 2003). Таким образом, мы впервые обнаружили на территории Азербайджана новый для фауны стран СНГ вид - Ап. реШепя!!. Эта находка подтвердилась при исследовании материала, полученного из соседнего района (с. Герматук Ленкоранский р-н) в 2009 г. (ОепВапк: РЫ665794). Очевидно, что ранние находки Ап. те1апооп (=зиЬа1ртиз) в Ленкоранской районе не относятся к Ап. религия«. Последний выявлен только на юге Азербайджана и встречается с низкой частотой. Эпидемиологическое значение Ап. регз1ет1з как переносчика малярии остается неясным.

В 2005 г. в Кыргызстане был описан Ап.аПет1е\1 (Гордеев и др., 2005). Последовательность нуклеотидов второго внутреннего транскрибируемого спейсера этого вида отличается на 9% от последовательности наиболее близкого ему вида Ап.тасиИрептз, а кариотипы обоих видов идентичны. Яйца Ап.аПет1еу1 похожи с яицами

Лп.$аскаго\,1 и Ап.таШпшз. Ареал этого нового вида до настоящего времени оставался практически не изученным. Чтобы восполнить этот пробел, мы проанализировали материал, полученный из Казахстана, Кыргызстана и Узбекистана с целью выявления Ап.аПет1еУ1. Был использован метод ПЦР-ПДРФ с последующим секвенированием продуктов амплификации. В результате было показано, что Ап. аг1ет1еу1 в пределах Кыргызстана распространен по всему Приферганью: Джалал-Абадская обл., нижнее течение р. Нарын (гг. Кара-Куль, Ташкумыр), г. Майлуу-Суу; Ошская обл., окрестности г. Узген, предгорья Алайского хребта (Кара-Суйский р-н., пос. Лангар, Алайский р-н., пос. Гульча), Баткенская обл., пос. Кара-Токой (граница с анклавом Узбекистана Сох), вдоль границы области с Таджикистаном: пос. Кара-Бак (Баткенский р-н.), пос. Алга (Ляйлякский р-н.). Также этот вид обилен в Таласской обл. от г. Талас до пос. Кизил-Адыр (среднее течение р. Талас). Самка этого вида отмечена на западе Нарынской обл. (пос. Угют, среднее течение р. Нарын) на высоте 1600 м над у.м.

В Западном Узбекистане этот вид был обнаружен в Ферганской, Ташкентской и Кашкадарской областях. Ранее в этих регионах были отмечены Ап. тасиЧрептз и Ап. хасНагоУ! (Чинаев, 1945, Таджиева, 1949). Нам не удалось обнаружить эти виды в проанализированном материале. Поэтому распространение Ап.тасиЧрептя и ЛиласЛагоу/ на указанной территории нуждается в дополнительной проверке. Нельзя исключить, что находки этих видов относятся к Ап.аПепиеУ!.

В Таджикистане Ап.аНет1е\1 отмечен в Согдийской области (Джаббад-Расуловском районе (уч. Дехмой); окрестности Худжанд (уч. Ева); Исфаринский р-н).

Ап.аг1ет1еУ1 был впервые обнаружен нами также на территории Казахстана (ЮжноКазахстанская область). Проведение дальнейших исследований позволит уточнить его ареал в этой стране.

Мы также уточнили распространение Ап. те1апооп, впервые применив молекулярно-генетические методы анализа. Комары этого вида были найдены в Западной Грузии и Абхазии. Ранние находки в этих республиках Ап-тенеаг, который был определен по окраске яиц (Каландадзе, Сагателова, 1938, Сичинава, 1973), вероятно, также соответствуют Ап.те!апооп, поскольку эти виды не различаются по морфологии яиц. Распространение Ап.те1апооп в Восточной Грузии пока нами не установлено, хота ранее этот вид единично находили в Алазанской долине (Каландадае, Сагателова, 1938). Представляется интересным в будущем с использованием методов молекулярно-генетического анализа подтвердить здесь присутствие Ап.те!апооп, т.к., возможно, именно в Восточной Грузии проходит восточная граница ареала вида, а все его находки в Прикаспийской низменности относятся к Ап.регз1епз1з. Остается нерешенным вопрос о распространении Ап.те!апооп на юге РФ. Ранее его отмечали на юге Краснодарского края (Калита, 1939), в Кабардино-Балкарии (Маркович, 1936) и Дагестане (Калита, 1939). В ходе работы обнаружить этот вид не удалось.

Специальные исследования были посвящены анализу распространения основных переносчиков в Закавказье; к числу таких переносчиков относятся Ап.тасиЧрептз и Ап.засИагоу1. Результаты подтвердили данные, полученные ранее: Ап. тасиЧрептз распространен по всей территории Грузии, а Ап.йаскагоу! - только в Восточной ее части (Канчавели, 1955).

Результаты изучения комплекса Ап.тасиЧрептз в Армении согласуются с данными других исследователей. Согласно этим данным на территории Армении распространены только комары Ап.тасиЧрептз и Ап.яаскагоу! (Чубкова, 1949).

Результаты молекулярно-генетического анализа, касающиеся распространения и относительной численности Ап.тасиЧрептз и Ап.засЧагоУ! в Азербайджане, совпадают с имеющимися в литературе сведениями (Лемер,1948; Киясов, 1970; Ануфриева и др.,1975). Ап.засЧаго\1 преобладает на сухих и теплых равнинах Азербайджана, Ап.тасиЧрептз тяготеет к горным районам, а также встречается на севере страны в Самур-Дивичинской низменности.

Северная граница ареала Ап.$аскагоу1 вероятно проходит на юге России, где его отмечали только в Дагестане (Шипицина, 1936). К сожалению, мы не имели возможность изучить фауну этой республики.

На территории России Ап.тасиНрептз обнаружен во всех изученных областях европейской части, что подтверждает результаты предыдущих исследований (Поликарпова, 1936; Покровский, Муратова, 1936; Беклемишев, Желоховцев,1937; Данилова, Лаппин, 1937; Данилова, Будымко, 1938; Калита,1937, 1938; Зима, 1964; Шаркова, 1964). Неясным пока остается вопрос о северной границе распространения Ап.тасиНрепп1$. Вероятно, Ап.тасиИрептз викарирует на некоторой территории с Лл.6еА:/етийеу| в районе 55-60 градусов с.ш., а далее полностью замещается /4и.6г№/ииЛеу/ (Новиков, Алексеев, 1989). Последний вид найден нами на территории Алтайского края, что соответствует литературным данным (Стегний, 1991, Горностаева, 1998). В азиатской части Российской Федерации распространен именно Ап. Ьек1ет1я)геУ1, которого ранее не отличали от Ап. тасиНрептз из-за сходства в окраске яиц (Стегний, 1991).

Ап.а1горагуиз чаще встречается в приморской части Ростовской обл. и севера Краснодарского края; на восток доходит вплоть до Волгорадской области, и на юг - до Черкесска и Гудаутского р-на (с. Приморский) Абхазии, что соответствует литературным данным (Беклемишев, Желоховцев, 1937; Данилова, Лаппин, 1937; Калита, 1937, 1938). Несмотря на довольно большой проанализированный материал из Белоруссии, этот вид не был найден нами в этой стране, хотя ранее Ап.Шгораптя там отмечали (Волкова, 2006).

Ап.теззеае является самым распространенным видом в Палеарктике, он отмечен нами во всех исследованных регионах на территории России и Белоруссии. Остается нерешенным вопрос о самой южной границе его ареала на территории европейской части РФ. Вероятно, уже начиная от Адлера- 43°4'с.ш. распространен только Ап.те!апооп, который проникает далее в страны Закавказья. На территории Средней Азии в соответствии с полученными нами данными Ап.тенеае распространен в Иссык-Кульской обл. (гг. Балыкчи, Чолпон-Ата, Караколь), на севере Нарынской обл. (пос. Кочкорка, наиболее высокая точка, где нами встречен данный вид - 1879 м н.у.м.), в Чуйской обл. (пос. Мраморное, окрестности аэропорта "Манас"). Не обнаружен в Таласской области и не проникает в южный регион Кыргызстана.

ВЫВОДЫ

1. В результате исследований уточнен видовой состав комплекса Ап.тасиИреппм: на территории России выявлено 4 вида (Ап.Шгорати, Ап.Ьекктйкеу!, Ап.тасиИрепт5, Ап.теззеае), в Ближнем зарубежье - 7 (Ап аКорапих, Ап.апет1е\ч, Ап.тасиИрептз, Ап.те1апооп, Ап.тазеае, Ап. реп1егии, Ап.хасИагохч). Впервые обнаружен новый для фауны стран СНГ вид - Ап. рег51еп513. Доказана неправомерность выделения АпЛааае в качестве самостоятельного вида.

2. На основании анализа кариотипов Ап.теззеае на территории Русской равнины выделены три зоны: центральная, юго-восточная и юго-западная. Комары центральной зоны характеризуется более высоким уровнем инверсионного полиморфизма по всем хромосомам, кроме плеча ЗЪ. Для комаров южной зоны отмечена высокая частота инверсии ХЬо, наблюдается полное отсутствие гомо- и гетерозигот по инверсии 2Я] и высокая доля особей с инверсией 31.1. Особенностью комаров юго-восточной зоны является увеличение частоты гомо - и гетерозигот по инверсиям ЗЯ] и ЗЬь

3. По первичной структуре второго внутреннего транскрибируемого спейсера Ап.тасиИрепгм, Ап.а1горат1, Ап.аг1ет'!е\ч, Ап.рететхз, Ап.те1апоп, Ап^аскагоУ! мономорфны на изученной территории, Ап.теяхеае является полиморфным на внутривидовом и внутригеномном уровнях. Разработан молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комплекса Ап.тасиИрептз.

4. На Европейской части России, Абхазии и Беларуси комплекс An.c¡aviger представлен единственным видом - An.claviger. Для вида характерен инсерционно-делеционный внутривидовой и внутригеномный полиморфизм первичной структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов.

5. Выявленные на территории Кыргызстана и Туркменистана морфологические формы и митотипы Лп.$ирегр1с1т не соответствуют молекулярным формам по ГО>2 и С01-И. Обнаружены два новых митотипа XI (в Кыргысгане и Туркменистане) и Х2(в Кыргыстане).

6. Уточнены ареалы Ап.техзеае, Ап.аПет1еУ1, Ап.те1апооп и Ап^асИагоУ!. Южная граница распространения Ап.теххеае проходит по территории Южного Казахстана и северного Кыргызстана; северная граница ареала Ап.аПет1е\ч находится на территории южного Казахстана, а северная граница ареала Ап. ретепот доходит до Ленкоранской низменности на территории Азербайджана. Подтверждены ареалы Ап.те1апооп, Аплас/гагоу/ Ап.теззеае, Ап тасиИрептя, Ап.Шгората.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bezzhonova OV, Gorvacheva II. Intragenomic heterogeneity of rDNA internal transcribed spacer 2 in Anopheles messeae (Díptera: Culicidae).// J Med Entomol. 2008 May;45(3):337-41.

2. Gordeev M., Zvantsov A., Goriacheva I, Shaikevich E., Bezzhonova O.V. Mosquitoes of the genus Anopheles (Diptera, Culicidae) in countries of the WHO European Region confronted with resurgence of malaria // World Health Organization Regional Office for Europe, Copenhagen. 2008. 34 p.

3. Безжонова O.B., Бабуадзе .А., Гордеев M. И., Горячева И. И., Званцов А. Б., Ежов М. Н.,Имнадзе П., Иосава М., Курцикашвили Г. Малярийные комары комплекса Anopheles maculipemis (Diptera, Culicidae) Грузии // Мед. паразитол. 2008. Вып.3:32-6.

4. Безжонова О.В., Горячева И.И. Изучение видового состава комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) юга европейской части России и стран Закавказья // В сб.: Тезисы I Всероссийское Совещание по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, Россия, 24-27 октября 2006 г.) Санкт-Петербург: Изд-во ЗИН, 2006. - С. 20-22.

5. Безжонова О.В., Иваницкий А.В., Федорова М.В. Ночная активность нападения комаров (Diptera, Culicidae) в Волгограде и его окрестностях // Мед. паразитол. 2004. Вып. 4. С. 5-27.

6. Гордеев М.И., Безжонова О.В. , Горячева И.И., Шайкевич Е.В., Званцов А.Б., Мамедов С., Мутдалибов Н., Гасымов Э., Ежов М.Н. Молекулярно-генетический анализ малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) Азербайджана//Мед. паразитол. 2010. Вып. 4:43-5.

7. Горячева И.И., Званцов А. Б., Гордеев М. И., Безжонова О.В. , Усенбаев Н.Т., Ежов М. Н. Изучение переносчиков малярии в Кыргызстане An. superpictus, An messeae и An. artemievi методами ПЦР-ПДРФ и прямого секвенирования // Мед. паразитол. 2011. Вып. 1:34-8.

8. Кешишьян А. , Гордеев М. И., Безжонова О.В., Горячева И.И., Шайкевич Е.В., Званцов А. Б., Ежов М. Н. Генетический анализ малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) Армении// Мед. паразитол. 2009. Вып. 3. С. 24-28

9. Лопатина Ю.В., Безжонова О.В., Федорова М.В., Булгакова Т.В., Платонов А.Е. Комплекс кровососущих комаров (Díptera, Culicidae) в очаге лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. III Виды, питающиеся на птице и человеке, и ритмы их ночной активности. // Мед. паразитол. 2007. Вып. 4. :37-43.

10. Львов Д.Н., Щелканов М.Ю., Джаркенов А.Ф., Галкина И.В., Колобухина Л.В., Аристова, В.А., Альховский C.B., Прилипов А.Г., Самохвалов Е.И., Дерябин П.Г., Воронина Ф.Г., Васильев A.B., Безжонова О.В., Львов Д. К. Популяционные взаимодействия вируса Западного Нила (Flaviviridae, Flavivirus) с членистоногими переносчиками, позвоночными животными, людьми в среднем и нижнем поясах дельты Волги, 2001-2006 гг. // Вопросы вирусологии. 2009. №.54. Вып.2. С.36-43.

11. Платонова О.В., Федорова М.В., Лопатина Ю.В., Безжонова О.В., Булгакова Т.В., Платонов А.Е. Комплекс кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) в очаге лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. II Особенности питания комаров в разных биотопах // Мед. паразитол. 2007. Вып. 2.:49-52.

12. Федорова М.В., Лопатина Ю.В., Безжонова О.В., Платонов А.Е. Комплекс кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) в очаге лихорадки Западного Нила в Волгоградской области. I Видовой состав, сезонный ход численности // Мед. паразитол. 2007. Вып. 1:41-6.

13. Федорова М.В., Безжонова О.В., Щелканов М.Ю., Львов Д.Н., Бушкиева Б.Ц., КуликоваЛ.Н. Орнитофильные комары (Diptera, Culicidae) России // Веб.: Тезисы XII Международной орнитологической Конференции (Ставрополь, Россия, 31 января - 5 февраля 2006 г.). - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006,- С.528.

14. Федорова М.В., Безжонова О.В., Щелканов М.Ю. Орнитофильные комары Северо-Западного Прикаспия: видовой состав и сезонный ход численности // В сб.: Тезисы XII Международной орнитологической Конференции (Ставрополь, Россия, 31 января - 5 февраля 2006 г.). - Ставрополь: Изд-во СГУ, 2006.-С. 526-528.

15. Яшкова С.Е., Пашкович В.В., Себут Н.С., Самойлова Т.И., Ерофеева Н.И., Верещак Н.С., Волкова Т.В., Якович ММ., Сибатаев А.К., Храброва Н.В., Бухарская Е.Д., Безжонова О.В., Камлюк Г.Г. Энтомологический надзор за акаро-элтомофауной и другими биологическими объектами, имеющими энтомологическое значение в республике Беларусь. Информационно-аналитический бюллетень ГУ «Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» Министерства здравоохранения Республики Беларусь. 2008. Минск. 36 с.

Подписано в печать:

07.09.2011

Заказ № 5868 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Безжонова, Оксана Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. АНАЛИЗ ДАННЫХ ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.MACULIPENNIS.

1.1Л. Морфологические исследования видов-двойников комплекса

An. maculipennis.

1.1.2. Эколого-биотопические различия видов комплекса

An. maculipennis.

1.1.3. Гибридологический анализ видов KOMnjiQKcaAn.maculipennis.

1.1.4. Цитогенетический анализ видов комплекса An.maculipennis.

1.1.5. Анализ полиморфизма белков видов комплекса An.maculipennis.

1.1.6. Молекулярно-генетические маркеры видов комплекса

An. maculipennis.

1.2. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.CLAVIGER.

1.3. КОМПЛЕКС ВИДОВ-ДВОЙНИКОВ AN.SUPERPICTUS.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Места сбора.

2.2. Цитогенетический анализ.

2.3. Молекулярно-генетические методы.

ГЛАВА III. СИСТЕМАТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

III. 1. Морфологические признаки, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности комаров комплексами, maculipennis.

III. 1.1. Морфология яиц у комаров комплекса An.maculipennis.

III. 1.2. Цитогенетический анализ комаров комплекса An.maculipennis.

III. 1.3. Видовая идентификация комаров комплексами, maculipennis методами молекулярно-генетического анализа.

III. 1.3.1. Первичная структура ITS2 у Комаровой, maculipennis, An.atroparvus,

An.sacharovi, An.persiensis, An.artemievi.

III. 1.3.2. Первичная структура ITS2 у An.messeae.

III. 2. Молекулярно-генетические особенности комаров An. claviger.

III.3. Морфологические и молекулярно-генетические особенности

An.superpictus.

ГЛАВА IV. ФАУНИСТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Комплексы видов кровососущих комаров рода Anopheles (Diptera, Culicidae) России и ближнего зарубежья"

До настоящего времени малярия остается одним из самых распространенных трансмиссивных заболеваний: ежегодно в мире этой инфекцией болеют около 300 миллионов человек, а количество летальных случаев исчисляется сотнями тысяч (WHO, 2009, 2010).

В результате интенсивных мероприятий на европейском континенте и на всей территории СССР передача малярии была практически прервана к 1950г., и в 1955г. ВОЗ объявила об окончательной ликвидации этого заболевания в Европе (Mendis et al, 2009). Однако во многих странах европейского региона ВОЗ плотность популяций переносчиков малярии, комаров рода Anopheles, оставалась высокой. Это создавало условия для возобновления местной передачи на основе завозных случаев или вследствие активизации местных остаточных очагов, и привело к развитию полномасштабных эпидемий малярии в Азербайджане и Таджикистане с середины 90-х годов (Касумов, Гусейнов, 2001; Сабатинелли, 2002). Местная передача малярии быстро распространилась в Армении, Грузии, Кыргызстане, Туркменистане и Узбекистане (Имнадзе, 2001; Аветисян, 2004; Ежов и др., 2004). Спорадические местные случаи регистрировали и продолжают регистрировать в Беларуси, Молдове, Казахстане, Российской Федерации, Украине, а также Болгарии, Греции, Италии (Sokolova, Snow, 2002; Баранова, 2004; Сыскова,2004; Баранова, Сергиев, 2007;). В связи со сложившейся ситуацией ВОЗ была разработана программа «Обратим малярию вспять», которая вступила в действие в 1998г. Одной из центральных задач программы стала ревизия фауны малярийных комаров с целью уточнения основных переносчиков заболевания и контроля их численности (Региональная стратегия, 2006).

К середине прошлого столетия на территории бывшего СССР было выявлено 9 видов малярийных комаров (Гуцевич и др., 1970). Из них наиболее эффективными переносчиками в европейской части страны считались An.atroparvus, An. messeae, An.sacharovi, An. s up erp ictus, а в азиатской - An.sacharovi, An.superpictus {An.atroparvus, An. messeae, и An.sacharovi в то время в СССР рассматривали как подвиды An.maculipennis). В последующие годы в результате развития цитогенетических и молекулярно-генетических методов были описаны новые виды {An.beklemishevi, An.artemievi, An.martinius, An.sinensis), а другие сведены в синонимы, например, An.subalpinus и An.melanoon (Стегний, 1991; Гордеев, 1997; Гордеев и др., 2005; Linton et al., 2002). Новые виды малярийных комаров были найдены также на территориях соседних государств: в Румынии - An.daciae (Nicolescu et al., 2004), в Иране - An.persiens is (Sedaghat et al., 2003). В Иране, кроме того, было описано несколько молекулярных форм An.superpictus, которые возможно являются самостоятельными видами (Oshagi et al, 2007а).

Таким образом, за последние годы список видов малярийных комаров, которые могут быть потенциальными переносчиками малярии в РФ и ближнем зарубежье, существенно изменился. С другой стороны, ареалы видов, выявленных ранее отечественными исследователями, изучены недостаточно и нуждаются в уточнении, а данные о распространении в РФ и других странах СНГ новых видов, описанных в соседних регионах, полностью отсутствуют. Все это определяет необходимость проведения новых исследований фауны основных переносчиков малярии на указанных территориях. Главная сложность таких фаунистических исследований заключается в том, что вновь описанные виды морфологически мало или вовсе не отличаются от известных ранее близкородственных видов, т.е. входят в состав комплексов видов - двойников, и для их идентификации требуется применение специальных методов. Задача осложняется тем, что часть видов была описана цитогенетическими методами, а часть - на основе молекулярно-генетических маркеров. В связи с этим представляется актуальным проведение сравнительного фаунистического анализа видов переносчиков с помощью разных методов и разработка единого диагностического подхода для идентификации видов, входящих в состав комплексов. В нашей работе предпринята попытка разработать единый диагностический подход на основе молекулярно-генетических методов, которые позволяют использовать в качестве диагностического признака межвидовой полиморфизм в структуре определенного участка генома.

Цель и задачи исследования

Целью работы была ревизия видового статуса комаров комплексов Ап.тасиИргптз, Ап.с1ау\^ег и Лп.хирегрШт, их распространения на территории России и Ближнего зарубежья и оценка области второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов (1Т82) как универсального маркера для идентификации видов указанных комплексов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) уточнение видового состава.комаров комплекса Ап.тасиНрептз на территории России и некоторых стран СНГ методами морфологического, цитогенетического и молекулярно-генетического анализа;

2) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (1Т82) кластера рибосомных генов комаров комплекса Ап.тасиНрептБ',

3) разработка молекулярно-генетического ключа для идентификации видов комплекса Ап.тасиИрептБ',

4) оценка внутривидовой изменчивости первичной структуры области второго внутреннего транскрибируемого спейсера (1Т82) кластера рибосомных генов комаров комплекса An.claviger;

5) изучение комаров комплекса Ап.БирегрШиз методами морфологического и молекулярно-генетического анализа.

Теоретическое и практическое значение работы. Данные о внутривидовом и межвидовом полиморфизме в комплексах видов-двойников Ап.тасиИрептБ, An.claviger и Ап.зирегрШш по изученным маркерам являются важными для дальнейших систематических и эволюционных исследований, а также мониторинга биоразнообразия. Разработанный молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комаров комплекса Ап.тасиИрептз успешно применяют для изучения переносчиков по программе «Обратим малярию вспять» ВОЗ и в центрах эпидемиологии (Акт о внедрении от 21.04.2004 г.) Полученные результаты внесли изменения в видовой состав и распространение переносчиков малярии на территории РФ и некоторых стран ближнего зарубежья.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований были представлены в виде докладов на 3 международных и 1 российской конференциях: Международном семинаре «Генетика репродукции насекомых и ее практическое применение» (Москва, 2006), XII Международной орнитологической Конференции (Ставрополь, 2006), I Всероссийском Совещании по проблемам изучения кровососущих насекомых (Санкт-Петербург, 2006), III международном совещании "Молекулярная и популяционная биология комаров и других переносчиков заболеваний" (Колимбари, Крит, Греция, 13-20 июля 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатные работы, в том числе 10 статей, из которых 9 - в журналах, рекомендованных ВАК.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю глубочайшую благодарность научным руководителям кандидату биол. наук М В. Федоровой и кандидату биол. наук И. И. Горячевой. Особую благодарность выражаю члену-корресполнденту РАН доктору биол.наук И.А. Захарову-Гезехусу за всестороннюю помощь и поддержку при выполнении работы в руководимой им лаборатории. Я благодарю профессора, доктора биол. наук М.И. Гордеева и кандидата биол. наук Е.В. Шайкевич за совместную работу. Я искренне признательна за предоставление материала А.Б. Званцову, доктору биол. наук М.Ю.Щелканову, А.Бабуадзе, кандидатам биол. наук А. Кешишьян, Т.В.Волковой, Н.К. Потаповой. Я очень благодарна за всестороннюю помощь и профессиональные советы доктору биол. наук Н. А. Тамариной, кандидатам биол. наук Н.Я. Маркович и P.M. Горностаевой.

Работа финансировалась Глобальным фондом по борьбе со СПИДом, туберкулезом и малярией, Европейским региональным бюро Всемирной Организации Здравоохранения, а также по грантам РФФИ 05-04-49047, 0504-49035, 06-04-08347, 08-04-01674-а; по грантам Президента РФ НШ-827.2003.4; НШ-15.2003.4; НШ-10122.2006.04, по программе РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

Заключение Диссертация по теме "Энтомология", Безжонова, Оксана Владимировна

ВЫВОДЫ

В результате исследований уточнен видовой состав комплекса Ап.тасиЫрептБ: на территории России выявлено 4 вида (An.atropa.rvus, Ап.ЪеЫегтзке^г, Ап.тасиИрептз, Ап.тенхеае), в Ближнем зарубежье - 7 (An.atropa.rvus, An.artem.ievi, Ап.тасиИрептБ, Ап.те1апооп, Ап.теББеае, Ап. рег81етг8, An.sacharoví). Впервые обнаружен новый для фауны стран СНГ вид - Ап. регБ1ет18. Доказана неправомерность выделения Ап.с1аЫае в качестве самостоятельного вида.

На основании анализа кариотипов Ап.тезБеае на территории-Русской равнины выделены три зоны: центральная, юго-восточная и юго-западная. Комары, центральной зоны характеризуется более высоким уровнем инверсионного' полиморфизма по всем хромосомам, кроме плеча ЗЬ. Для комаров южных зон отмечена высокая частота инверсии ХЬо, наблюдается полное отсутствие гомо- и гетерозигот по инверсии 21^1 и высокая доля особей с инверсией 31^. Особенностью комаров юго-восточной зоны является увеличение частоты гомо - и гетерозигот по инверсиям ЗЯ] и 31^.

По первичной структуре второго внутреннего транскрибируемого спейсера Ап.тасиЫрептБ, Ап.аЬгоратт, An.artemievi, Ап.рег$1еп$18, Ап.те1апоп, An.sacharovi мономорфны на изученной территории, Ап.теяйеае является полиморфным на внутривидовом и внутригеномном уровнях. Разработан молекулярно-генетический ключ для идентификации видов комплекса Ап.тасиНрептз. На Европейской части России, Абхазии и Беларуси комплекс Ап.с1а^щег представлен единственным видом - An.claviger. Для вида характерен инсерционно-делеционный внутривидовой и внутригеномный полиморфизм первичной структуры второго внутреннего транскрибируемого спейсера кластера рибосомных генов.

5. Выявленные на территории Кыргызстана и Туркменистана морфологические формы и митотипы Ап.БирегрШиБ не соответствуют молекулярным формам по 1Т82 и С01-П. Обнаружены два новых митотипа XI (в Кыргыстане и Туркменистане) и Х2(в Кыргыстане).

6. Уточнены ареалы Ап.техйеае, Ап.аНет1ет, An.mela.noon и Ап.засИагоуг. Южная граница распространения Ап.техБеае проходит по территории Южного Казахстана и северного Кыргызстана; северная граница ареала Ап.аМетгеуг находится на территории южного Казахстана, а северная граница ареала Ап. регБгетгз доходит до Ленкоранской низменности на территории Азербайджана. Подтверждены ареалы Ап.те1апооп, Ап.яас11агоу1 Ап.теявеае, Ап.тасиНрептз, Ап.аКорагут.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ переносчиков малярии необходим с точки зрения организации эпидемиологических мероприятий, особенно в связи с недавним широким распространением этого заболевания на территории СНГ. Большинство видов - переносчиков относятся к комплексам криптических видов и с разработкой новых методических подходов число таковых возрастает с каждым годом. Проведенные исследования показали, какие идентификационные подходы наиболее приемлемы. Применение морфологических признаков для идентификации всех видов комплекса Ап.тасиНрептя затруднено из-за наличия промежуточных вариантов окраски экзохориона яйца и схожести морфологии яиц у некоторых видов. Применение анализа структуры политенных хромосом для идентификации видов ограничено существованием гомосеквентных видов. Впервые мы посмотрели фауну на новых территориях с использованием молекулярно-генетических методов. Последний оказался самым эффективным по сравнению с морфологическим и цитогенетическим. Более того, мы несколько усовершенствовали данный подход, что не только удешевило его, но и вовлекло в молекулярный ключ большее число видов. Скрининг видов малярийных комаров показал, что необходимо исследование не только внутривидовой, но и внутригеномной изменчивости маркера. Найденный внутригеномный полиморфизм 1Т82 у Ап.теБяеае показал неправомерность выделения-недавно описанного вида АпМаЫае. Другие исследованные виды комплекса Ап.тасиНрептз оказались мономорфными по этому маркеру. Использование молекуляро-генетических методов позволило выявить новый вид для фауны СНГ — Ап.регзгепягя и уточнить ареалы следующих видов: Ап.теязеае, Ап.тасиНрептв, An.atropa.rvus, Ап.аПетгем1, Ап.те1апооп и An.sacharovi.

В ходе цитогенетических исследований впервые получены данные по кариотипической структуре популяций Ап.теззеае Русской равнины, где выявлены три четко дифферинциированные зоны по кариотипическому составу.

Впервые показана внутригеномная изменчивость и другого вида -переносчика малярии An.claviger. Абхазская популяция значительно отличалась от Беларусской и Германской, что дает основу для дальнейшей исследоательской работы как на популяционном уровне, так, возможно, и на уровне комплекса видов.

Показано, что морфологические формы Ап.БирегрШт не соответствуют молекулярным формам по ГГ82 и С01-П. Выявлено несоответствие митотипов и молекулярных форм по 1Т82, что не подтверждает ранние исследования. В Туркменистане и Кыргыстане преобладал митотип X, наряду с ним, в Турменистане отмечен митотип У в небольшом количестве. Обнаружены два новых митотипа XI (в Кыргыстане и Туркменистане) и Х2(в Кыргыстане). Молекулярно-генетический анализ этого вида на исследованной территории проведен впервые.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Безжонова, Оксана Владимировна, Москва

1. Аветисян JI. М. Современное состояние эпидемиологического надзора за важнейшими паразитозами в республике Армения // Мед. паразитол. 2004. № 1. С. 21-24.

2. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. М.: ИКЦ «Академкнига», 2003. 431с.

3. Ануфриева В. Н., Суворова Э. И., Дробозина В. П., Рыбалка В. М., Алиев М. Некоторые вопросы экологии устойчивых к ДДТ Anopheles maculipennis sacharovi Favre,1903 в населенных пунктах Азербайджанской- ССР // Мед. паразитол. 1975. Вып. 1. С. 33-42.

4. Банникова А. А. Молекулярные маркеры и современная филогенетика млекопитающих//Журн. общ. биол. 2004. Т. 65. №4. С. 278-305.

5. Баранова А. М. Последствия завоза малярии в Россию и меры профилактики. // Мед. паразитол. 2004. №4. С. 8-11.

6. Баранова А. М., Сергиев В. П. Эпидемиология малярии. Научно-практическое руководство по малярии (эпидемиология, систематика, генетика). Томск.: Томский государственный университет. 2007. С. 4-28.

7. Беклемишев В. Н. Виды Anopheles СССР и сопредельных стран Азии. Их распространение и участие в переносе малярии // Мед. паразитол. 1948. Т. 17. вып. 2. С. 201-208.

8. Беклемишев В.Н. Экология малярийного комара. М.: Медгиз, 1944. 299с.

9. Беклимишев В. Н., Желоховцев А. Н. Географическое распространение обыкновенного малярийного комара (Anopheles maculipennis) и его подвидов в пределах СССР // Мед.паразитол.1937. Т. 6. вып. 6. С. 819-833.

10. Бубликова JI. И. Фауна, синантропизация и эпидемиологическое значение кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) Северного Тянь-Шаня. Докторская диссертация. М.: МГУ, Биологический ф-т. 2001.306 с.

11. Н.Бубликова JI. И. Экология An.claviger в Чуйской долине Кыргызстана // Здравоохранение Кыргыстана. 1993. № 2. С. 6-10.

12. Волкова М. С. Малярийные комары урбанизированных ландшафтов Беларуси. // В сб.: Тезисы Международной научной конференции. Фауна, биология, морфология и систематика паразитов (Москва, Россия, 1921 апреля 2006 г.). Москва, 2006. С. 65-67.

13. Гакетт JI. В., Барбер М. А. Заметки о разновидностях Anopeles maculipennis в СССР //Мед.паразитол. 1935. Т.4, вып.З. С.188-199.

14. Гершкович И. Генетика. М., 1968. 700с.

15. Глаголева Е.М. Материалы по экологии личинок Anopheles в Таджикистане. III. Биотопы Anopheles bifurcates L. И их химизм // Мед. паразитол. 1944. Т. 13. Вып. 5. С. 47-52.

16. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. М.: Мир, 1988.

17. Гордеев М. И. Адаптационные стратегии в популяции, малярийных комаров. Дис.докт.биол.наук. М., 1997. 304с.

18. Гордеев М. И., Ежов М. Н., Званцов А. Б., Перевозкин В. П. Малярийные комары Москвы и Московской области: цитогенетический анализ // Мед. паразитол. 2005. № 2. С.30-33.

19. Гордеев М. И., Званцов А. Б., Горячева И. И., Шайкевич Е. В., Ежов М. Н.

20. Горячева И. И., Шайкевич Е. В., Званцов А. Б., Ежов М. Н. Малярийные комары

21. Горностаева Р. М. Анализ современных данных о фауне и ареалах малярийных комаров (Diptera, Culicidae: Anopheles) на территории России // Паразитология.2003. Т. 37. вып. 4. С. 298-305.

22. Горностаева Р. М. Новый список комаров (Diptera: Culicidae) России // Мед. паразитол. 2009. Вып. 1. С. 60-62.

23. Горностаева Р. М. Список комаров (сем. Culicidae) азиатской части России // Паразитология.2000. Т. 34. вып. 6. С. 477-485.

24. Горностаева Р. М., Данилов А. В. Об ареалах малярийных комаров (Diptera, Culicidae: Anopheles) комплекса maculipennis на. территории России. // Паразитология. 2002. Т. 36. вып. 1. С. 233-247.

25. Гуцевич А. М., Мончадский А. С., Штакельберг А. А. Комары. Семейство Culicidae // Фауна СССР. Насекомые двукрылые. Л.: Наука, 1970. Т.З. вып. 4. 384 с.

26. Данилова М. И., Будымко Ф. А. Виды малярийных комаров и их эпидемиологическая роль в условиях Адыгейской автономной области // Мед. паразитол. 1938. Т. 7. вып.6. С. 874-877.

27. Данилова М: И., Лаппин Г. И. К вопросу о видах Anopheles и подвидах An.maculipennis в Азово-Черноморском крае // Мед.паразитол. 1937. Т. 6. вып. 4. С. 546-549.

28. Денисова 3. М. Вариации гипопигеев самцов некоторых подвидов малярийного комарами, maculipennis II Энтомологическое обозрение. 1964. Т. 43. №4. С. 815-822.

29. Денисова 3. М. Материалы по изучению вариаций гипопигиев самцов An.maculipennis atroparvus Tiel и An. maculipennis sacharovi Favre // Мед.паразитол. 1948. Т. 17. вып. 2. С. 221-227.

30. Денисова М. Автогенное развитие яичников у Anopheles bifurcatus у Алма-Атинской популяции // Мед.паразитол. 1946. Вып.1. С. 40-42.

31. Ежов М. Н., Званцов А. Б., Сергиев В. П. Возврат малярии в страны Европейского региона ВОЗ: уроки истории и современная ситуация в Закавказье и Турции // Мед. паразитол. 2004. №4. С. 16-19.

32. Желоховцев А. Н. Заметки по систематике рода Anopheles II Мед.паразитол. 1937. Т.6. вып. 5. С. 707-709.

33. Зб.Зима Г. Г. История ликвидации малярии в Волгоградской области // Проблемы мед. паразитол. и профилактики инф. (ред. Ш. Д. Мошковский). М.,1964. С. 143-152.

34. Имнадзе П. Малярия в Грузии // Мед. паразитол. 2001. №1. С. 20-21.

35. Казанцев Б. Фауна кровососущих комаров Самарканда и сопредельных районов//Мед. паразитол. 1940. Т.10, вып.З. С.130-136.

36. Каландадзе Л. П., Сагателова И. С. Материал к распространению подвидов Anopheles maculipennis в Грузии // Мед.паразитол. 1938. Т.7. вып. 6. С. 878-880.

37. Калита С.Р. Обнаружение Anopheles mac. subalpinus Hack, et Lewis на Черноморском побережье Краснодарского края // Мед.паразитол. 1939. Т.8. вып. 3. С. 35-36.

38. Калита С.Р. Подвиды Anopheles maculipennis Mg. степной зоны Краснодарского края // Мед.паразитол. 1938. Т.7. вып. 4. С. 611-614.

39. Калита С.Р. Разновидности Anopheles maculipennis Mg. южной части Азово-Черноморского края//Мед.паразитол. 1937. Т.6. вып. 5. С. 710-714.

40. Канчавели Г.И. К изучению фауны, биологии и эпидемиологического значения различных видов малярийных комаров в Грузинской ССР.// Тр. НИИ малярии и мед. паразитологии им. С.С. Вирсаладзе. 1955. Вып. 1-2. С. 130145.

41. Касумов В. К., Гусейнов Ф. 3. Современная ситуация по малярии в Азербайджане//Мед. паразитол. 2001. №1. С. 18-19.

42. Кимура М. Молекулярная эволюция: теория нейтральности. М.: Мир, 1985. 398 с.

43. Киясов А. Я. Малярийные комары Азербайджана и их географическоераспространение // Матер. 1-ой Респуб.конфер.по мед. географии. Баку, 1970. С. 62-64.

44. Лемер М. К. Фенология Anopheles maculipennis Meig в Западном и Восточном Закавказье //Мед.паразитол. 1948. Т. 17, вып. 2. С. 209-221.

45. Мамедниязов О. Кровососущие комары (Diptera,Culicidae) Туркменистана и интегрированная система борьбы с ними. Ашхабат.: Ылым, 1995. — 374с.

46. Мамедниязов О., Ерохин П. Иллюстрированный определитель малярийных комаров (Culicidae, Anophelinae) Центральной Азии. Ашхабад: Издательство ГКПТ, 2005. 68с.

47. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 480с.

48. Манукян Д. В. Энтомологическая оценка маляриогенной обстановки в Армянской ССР после применения персистентных хлорорганических инсектицидов. Автореф. дис. канд. биол. наук. Ереван, 1975. 30с.

49. Маркин А. В. К вопросу о подвидах An. maculipennis на Среднем Урале // Мед.паразитол.1938. Т. 7. вып. 4. С. 610.

50. Маркович Н. Я. Биология родникового малярийного комара Anopheles bifurcates. Кандидатская диссертация: М.: МГУ, Биологический ф-т, 1951.223 с.

51. Маркович Н. Я. Типы анофелогенных водоемов равнинной части Большой Кабарды//Мед.паразитол. 1936. Т.5. вып. 1. С. 24-40.

52. Маркович Н.Я. Новые данные по биологии Anopheles bifurcatus (наблюдения на северном Кавказе) // Мед. паразитол. 1941. Т. 10. Вып. 1. С. 24-39.

53. Маркович Н.Я. Созревание яиц у Anopheles- bifurcates L. без имагинального питания // Мед. паразитол. 1938. Т. 7. Вып. 6. С. 897-899.

54. Мельникова З.А. Наблюдения над Anopheles bifurcatus в Кара-Калинском районе в ранене-весенний период // 1943. Т. 12. Вып. 1. С. 56-58.

55. Муха Д.В., Вигманн Б.М., Шал К. Сальтационные изменения в структуре кластера рибосомальных генов в процессе эволюции тараканов рода Blattela II Доклады Академии наук. 1999. Т. 364. № 1. С. 134-139.

56. Новиков Ю. М., Алексеев А. Н. О северо-восточной границе ареала Anopheles maculipennis и юго-западной — Anopheles beklemishevi II Мед.паразитол. 1989. №1. С.16-19.

57. Новиков Ю. М., Шевченко А. И., Ваулин О. В. О молекулярно-генетической дивергенции криптических видов таксона Anopheles messeae (Díptera: Culicidae) и филогении комплекса maculipennis // Вестн. Томск, гос. ун-та. 2004. №10. С.69-77.

58. Региональная стратегия: От борьбы к элиминации малярии в Европейском регионе ВОЗ 2006-2015 гг. Копенгаген: Европейское региональное бюро ВОЗ. 2006. 44 с.

59. Рейнгард JI. В.,Топчиев А. Г. Возможность спаривания и скрещивания между различными подвидами An. maculipennis в лабораторных условиях // Мед.паразитол. 1955. № 3. С. 267-269.

60. Ременникова В. М. Видовой состав Anopheles и разновидности Anopheles maculipennis в различных ландшафтных зонах южной приморской части Азербайджана//Мед.паразитол. 1953. №1. С. 10-18.

61. Ременникова В. М. О некоторых факторах, определяющих эпидемиологическую роль Anopheles maculipennis subalpinus в условиях отдельных районов Азербайджанской ССР // Мед.паразитол. 1958. Т. 27. вып. 3. С. 283-290.

62. Сабатинелли Г.Ситуация по малярии в Европейском регионе ВОЗ // Мед. паразитол. 2002. № 2. С. 4-8.

63. Селене Ю.Е. Подвиды An.maculipennis Meig. в районе Одесской железной дороги//Мед.паразитол. 1953. вып.6. С.556-557.

64. Сичинава Ш.Г. Фауна кровососущих комаров (Diptera, Culicidae) Грузинской ССР // Тр. НИИ малярии и мед. паразитологии им. С.С. Вирсаладзе. 1973. Т.4,вып.19.С. 53-55.

65. Стегний В. Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск, 1991. 136с.

66. Стегний В. Н. Проблемы систематики малярийных комаров комплекса Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae). Современные данные цитогенетики // Сб.:Кариосистематика беспозвоночных животных. JI.,1979. С.29-35.

67. Стегний В. Н., Кабанова В. М. Хромосомный анализ малярийных комаров Anopheles atroparvus и A. maculipennis (Diptera, Culicidae) II Зоол. ж. 1978. T. 57. №4. С. 613-619.

68. Стегний В. Н., Кабанова В. М., Новиков Ю. М., Плешкова Г. Н. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anopheles messeae. I. Распространение инверсий по ареалу вида // Генетика. 1976. Т. 12. № 4. С.47-55.

69. Стегний В. Н., Новиков Ю. М., Кабанова В. М. Цитогенетический анализ и распространение малярийного комара Anopheles beklemishevi II Зоол. ж. 1978. Т. 57. № 6. С. 875 876.

70. Стегний В. Н., Сичинава Ш. Г., Сипович Н. Г. Гибридологический анализ и биология малярийных комаров Anopheles maculipennis (Diptera, Culicidae) Западной Грузии II Зоол. журн. 1984. Т.63. вып.2. С.300-302.

71. Стегний В.Н., Русакова A.M. Генетическая диагностика малярийных комаров Палеарктического комплекса «maculipennis». Научно-практическое руководство по малярии (эпидемиология, систематика, генетика). Томск.:

72. Томский государственный университет, 2007. С. 229- 236.

73. Сыскова Т. Г. Паразитарные заболевания в Российской Федерации в условиях миграции населения // Мед. паразитол. 2004. №1. С.3-5.

74. Таджиева B.C. Обнаружение Anopheles mac. maculipennis Meig. В Узбекистане // Мед. паразитол. 1979. Вып. 4. С. 63-65

75. Туркина А.П. Наблюдения за Anopheles bifurcates L. в окрестностях Горького //Мед. паразитол. 1948. Т. 17. Вып. 6. С. 524-527.

76. Устинов A.A. Наблюдения над Anopheles bifurcatus L. в Абхазии // Мед. паразитол. 1946. Вып. 2. С. 50-53.

77. Устинов A.A. Об эпидемиологическом значении разных видов Anopheles Абхазии//Мед.паразитол. 1945.вып.6. С.14-19.

78. Чинаев П. П. Летная активность и нападение на человека различных видов Anopheles и Culicini в природных условиях Узбекистана // Мед. паразитол. 1945. Т. 14. Вып. 5. С. 15-35.

79. Чубкова А. И. К вопросу о подвидах Anopheles maculipennis в Армении // Мед.паразитол. 1948. Т.17. вып. 4. С. 365-368.

80. Шаркова К. Д. Ликвидация малярии в Волгограде // Проблемы мед. паразитол. и профилактики инф. М.,1964. С.277-283.

81. Шингарев А. И. Заметки по Culicidae // Русск.ж. троп. мед. 1928. № 1. С.47-53.

82. Шипицина Н. К. Водоемы Прикаспийской низменности и их маляриогенное значение // Мед. паразитол. 1936. Т.5. вып. 1. С. 3-24.

83. Шипицина Н. К. Энтомологические предпосылки эпидемиологии малярии в районе г. Адлера//Мед.паразитол. 1941. Т. 10. вып. 1. С.9-24.

84. П1ипицина Н.К. Энтомологические предпосылки эпидемиологии малярии в районе гор. Адлера//Мед. паразитол. 1941. Т. 10. Вып. 1. С. 9-24.

85. Шленова М.Ф. Наблюдения над биологией малярийных комаров окрестностей Сочи // Мед. паразитол. 1938. Т. 7. Вып. 4. С. 514-529.

86. Шуваликов В. Б. Полиморфизм популяций малярийных комаров комплекса An.maculipennis Meig. В юго-западной части и центре европейской части СССР. Авторефират диссертации на соискание к. б. н. Киев : Ин-т зоологииим. И. И. Шмальгаузена, 1986. 24 с.

87. Ясюкевич В.В. Возможность различать личинок видов-двойников Anopheles sacharovi Favre,1903 и Anopheles martinius Schingarev, 1926 // Мед.паразитол. 1991. №1. С. 8-10.

88. Яценко Ф., Тищенко О. Материалы к изучению разновидностей малярийных комаров Anopheles maculipennis на Украине // Мед. паразитол. 1936. Т. 5. вып.4. С. 12-13.

89. Aitken Т. Н. G. The Culicidae of Sardinia and Corsica (Diptera) // Bull. Ent. Res. 1954. Vol.45. P.437-494.

90. Aitken Т. H. G. Studies on the anopheline complex of Western America // Univ. Cal. Pub. Ent. 1945. V. 7 N. 11. P. 273-364.

91. Amani H. Studies on fauna and laraval habitats of malaria vectors, and epidemiological reasons for presence of malaria in Aligodarz // MSPH Thesis. Tehran University of Medical Sciences. 1999. N. 2753. P. 117. (Persian language).

92. Arensburger P., Kim Y.J., Orsetti J., Aluvihare C., O'Brochta D.A., Atkinson P.W. An active transposable element, Herves, from the African malaria mosquito Anopheles gambiae II Genetics. 2005. V. 169. N. 2. P. 697-708.

93. Banerjee A.K., Arora N., Murty U. S. How far is ITS2 reliable as a phylogenetic marker for mosquito genera? // Electronic Jornal of Biology. 2007. V. 3.P. 61-68.

94. Barik Т.К., Sahu В., Swain V. A review on Anopheles culicifacies: from bionomics to control with special reference to Indian subcontinent // Acta Trop. 2009. V. 109. N. 2. P. 7-97.

95. Bates M. Hybridization experiments with Anopheles maculipennis II Am. J. Hygiene. 1939. Vol.29. N.l. P. 1-6.

96. Bates M. The nomenclature and taxonomic status of the mosquitoes of the Anopheles maculipennis complex // Ann. Entomol. Soc. Am. 1940. Vol.33. P.343-356.

97. Beebe N.W., Saul A. Discrimination of all members of the Anopheles punctulatus complex by polymerase chain reaction—restriction fragment length polymorphism analysis // Am J Trop Med Hyg. 1995. V. 53. N. 5. P. 478-481.

98. Beebe, N. W., R. D. Cooper, D. H. Foley, Ellis J. T. Populations of the southwest Pacific malaria vector Anopheles farauti s.s. revealed by ribosomal DNA transcribed spacer polymorphisms // Heredity 2000. V. 84. P. 244-253.

99. Bianchi U. Sulla tassonomia di Anopheles labranchiae ed Anopheles atroparvus II Riv. di Parasitol. 1968. Vol.29. N.3. P.221-226.

100. Bikandi J., San Millan R., Rementeria A., Garaizar J. In silico analysis of complete bacterial genomes: PCR, AFLP-PCR, and endonuclease restriction // Bioinformatics. 2004. V. 22. N. 20(5). P. 798-799.

101. Buxton P. A. Applied entomology of Palestine, being a report to the Palestine government // Bulletin of Entomological Research. 1924. V. 24. P. 289-340.

102. Collins F. H., Paskewitz S. M. A review of the use of ribosomal DNA (rDNA) to differentiate among cryptic Anopheles species // Insect Mol. Biol. 1996. V.5. P.l-9.

103. Collins F. H., Paskewitz S. M., Finnerty V. Ribosomal RNA genes of the Anopheles gambiae complex // Adv. Dis. Vector. Res. 1989. Vol.6. P.1-28.

104. Collins F. H., Porter C. H., Cope S. E. Comparison of rDNA and mtDNA in the sibling species Anopheles freeborni and An.hermsi II Am. J. Trop. Med. Hyg. 1990. Vol.42. P.417-423.

105. Collins, F. H., M. A. Mendez, M. O. Rasmussen, P. C. Mehaffey, N. J. Besansky, and V. Finnerty. A ribosomal RNA gene probe differentiates member species of the Anopheles gambiae complex // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1987. V. 37. P. 37-41.

106. Collins, F. H., S. M. Paskewitz, and V. Finnerty. Ribosomal RNA genes ofthe Anopheles gambiae species complex // Adv. Dis. Vector Res. 1989. V.6. P. 128.

107. Coluzzi M. Le forme di Anopheles clanger Meigen indicate con i nomi missirolii e petragnanii sono due specie riproduttivamente isolate // Rendiconti Acad Nazionale Lincei. 1963. V. 32. P. 1025-1030.

108. Coluzzi M., Sabatini A., Torre A., Di Deco M.A., Petrarca V. A. Polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex // Science. 2002. V.15. P.1415-1418.

109. Coluzzi, M. Morphological divergences in the Anopheles gambiae complex // Riv Malariol. 1964. V.43. P. 197-232.

110. Crozier R.H., Crozier Y.C. The mitochondrial genome of honeybee Apis melifera: complete sequence and genome organization // Genetics. 1993. V.133. P. 97-117.

111. De Buck A., Schoute E., Swellengrebel N. H. Racial differentiation of iiA.maculipennis''> in the Netherlandsvand its relation to malaria // Riv.Malariol. 1930. V.9. N.2. P.133-137.

112. Del Vecchio G. Sulle varieta di Anopheles claviger {bifurcates) II Riv Parassitol. 1939. V. 3. P. 27-37.

113. Di Luca M., Boccolini D., Marinucci M., Romi R. Intrapopulation polymorphism in Anopeles messeae {An.maculipennis complex) inferred by molecular analysis // J. Med. Entomol. 2004. V.41. N.4. P.582-586.

114. Dover, G. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution // Nature. 1982. V. 299. P. 111-117.

115. Ejov. M. Scaling up the response to malaria. Progress towards curbing an epidemic 2000-2004. 2005. WHO Regional office for Europe, Copenhagen, Denmark. 59 p.

116. Evans A. M. On the differentiation of Anopheles maculipennis in Great Britain, with special reference to a form occurring on the coast of north Wales // Ann. Trop. Med. Parasitol. 1934. Vol.28. P.131-140.

117. Fairley, T. L., C. W. Kilpatrick, and J. E. Conn. Intragenomic heterogeneity of internal transcribed spacer rDNA in Neotropical malaria vector Anopheles aquasalis (Diptera: Culicidae) // J. Med. Entomol. 2005. V. 42. P. 795-800.

118. Falleroni D. Fauna anophelica italiana e suo "Habitat" // Riv. Malarion. 1926. Vol.5. P.553 593.

119. Fontenille D., Cohuet A., Awono-Ambene P., Kengne P., Antonio-Nkondjio C., Wondji C., Simard F. Malaria vectors: from the field to genetics // Research in Africa. Rev Epidemiol Sante Publique. 2005. V. 53. N. 3. P. 283-290. Review. French.

120. Fritz G. N., J. Conn, A. Cockburn, and J. Seawright. Sequence analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 from populations of Anopheles nuneztovari (Diptera: Culicidae) // Mol. Biol. Evol. 1994. V. 11. P. 406-416.

121. Frizzi G. Etude cytogenetique $ Anopheles maculipennis en ltalie // Bulletin of the World Health Organisation. 1953. V. 9. P. 335-344.

122. Frizzi G. Salivary gland chromsomes of Anopheles II Nature. 1947. V. 160. P. 226-229.

123. Gerbi S.A. Evolution of ribosomal DNA. // In R.J. Mclntyre, Editor, Molecular Evolutionary Genetics, Plenum, New York, 1985. P. 419-517.

124. Ghavami M. B., Djadid N.D., Haniloo A. Molecular characteristics of Anopheles maculipennis Meigen in Zanjan, North West of Iran, inferred from ITS2 sequence analysis // Pak. J. Biol. Sci. 2008. V. 11. P. 539-545.

125. Gordeev M., Zvantsov A., Goriacheva I., Shaikevich E., Bezzhonova O.V. Mosquitoes of the genus Anopheles (Diptera, Culicidae) in countries of the WHO

126. European Region confronted with resurgence of malaria // World Health Organization Regional Office for Europe, Copenhagen, 2008. 34 p.

127. Gramiccia G. Anopheles claviger in the Middle East // Bull. World Health Org. 1956. V.15.P. 816-821.

128. Guidelines for the treatment of malaria. Geneva, Switzezerland: WHO, 2010.194 p.

129. Hackett L. W. Recent findings bearing on the epidemiology of malaria in Europe //Mefl.napa3HTOJi. 1935. T.4, Bbin.1-2. C.39-43

130. Hackett L. W., Lewis D. J. A new variety of Anopheles maculipennis in southern Europe // Riv. di Malariol. 1935. Vol.14. P.377-383.

131. Hackett L. W., Missiroli A. The varieties of Anopheles maculipennis and their relation to the distribution of malaria in Europe // Riv. Malariol. 1935. Vol.14. P.45-109.

132. Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.

133. Harbach RE. The classification of genus Anopheles (Diptera: Culicidae): a working hypothesis of phylogenetic relationships // Bull Entomol Res. Dec. 2004.V. 94. N. 6. P. 537-553.

134. Jaenson T.G.T., Lokki J., Saura A. Anopheles (Diptera: Culicidae) and malaria in Northern Europe, with special reference to Sweden // J.Med.entomol. 1986. V.23. N.l. P.68-75.

135. Kampen H. Integration of Anopheles beklemishevi (Diptera: Culicidae) in a PCR assay diagnostic for palaearctic Anopheles maculipennis sibling species // Parasitol Res. 2005a. V. 97. P. 113-117.

136. Kampen H. The ITS2 ribosomal DNA of Anopheles beklemishevi and further remarks on the phylogenetic relationships within the Anopheles maculipennis group of species (Diptera: Culicidae) // Parasitol Res. 2005b. V. 97. P. 118-128.

137. Keller A, Förster F, Müller T et al Including RNA secondary structures improves accuracy and robustness in reconstruction of phylogenetic trees.// Biol Direct. 2010. V. 5 (Database Issue) D. 4.

138. Kitron U., Spielman A. Suppression of transmission of malaria through source reduction: antianopheline measures applied in Israel, the United States, and Italy // Rew. of infection diseases. 1989. V. 2. N. 3. P. 394-406.

139. Kittayapong P. Malaria and dengue vector biology and control in Southeast Asia. // BGJ Knols, C Louis (eds), Bridging Laboratory and Field Research for Genetic Control of Disease Vectors, Wageningen UR Frontis Series, Springer,

140. Dordrecht, 2006. P. 111-128.

141. Kitzmiller J. B. Mosquito cytogenetics // Genetics of insect vectors of disease. Amsterdam, 1967. P. 133 150.

142. Koetschan C., Förster F., Keller A., Schleicher T., Ruderisch B., Schwarz R., Euller T., Wolf M. & Schultz J. The ITS2 Database III sequences and structures for phylogeny II Nucleic Acids Res. 2010.V. 38 (Database Issue) D. 275-279.

143. Korvenkontio P., Lokki J., Saura A.,Ulmanen I. Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) in Northern Europe: species diagnosis by egg structure and enzyme polymorphism // J. Med. Entomol. 1979. Vol.l6.N.2. P. 169170.

144. Krzywinski J, Sangare D, Besansky NJ. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae II Genetics. 2005. V. 169. N.l.P. 185-196.

145. Kumar N.P., Rajavel A.R., Jambulingam P. DNA barcodes can distinguish species of Indian mosquitoes (Diptera: Culicidae) // J. Med. Entomol.2007.V.44. P. 1-7.

146. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software // Bioinformatics. 2001. V. 17. P. 12441245.

147. Lambrechts L., Haibert J., Durand P., Gouagna L.C., Koella J.C. Host genotype by parasite genotype interactions underlying the resistance of anopheline mosquitoes to Plasmodium falciparum II Malar J. 2005. V. 11. N.4. P. 3.

148. Levine R.S., Peterson A.T., Benedict M.Q. Distribution of members of Anopheles quadrimaculatus s.l. (Diptera: Culicidae) and implications for their rolesin malaria transmission in the United States // J Med Entomol. 2004. V. 41. N. 4. P. 607-613.

149. Levinson, G., and G. A. Gutman. Slipped-strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4.P. 203-221.

150. Li, C., and R. C. Wilkerson. Intragenomic rDNA ITS2 variation in the Neotropical Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis complex (Diptera: Culicidae) // J. Hered. 2007. V. 98. P. 51-59.

151. Linton Y.-M., Samanidou-Voyadjoglou A., Smith L., Harbach R.E. New occurrence records for Anopheles maculipennis and An.messeae in northern Greece based on DNA sequence date // Europ. Mosq. Bull. 2001. N.l 1. P.31-36.

152. Linton Y.-M., Smith L., Harbach R. E. Observations on the taxonomic status of Anopheles subalpinus Hackett et Lewis and An.melanoon Hackett // Europ. Mosq. Bull. 2002. N.13. P.l-7.

153. Linton, Y.-M., A. S. Lee, and C. Curtis. Discovery of a third member of Maculipennis group in SW England // Eur. Mosq. Bull. 2005. V. 19. P. 5-9.

154. Lupascu G. Contributo alio studio della biologia larvale di A. claviger II Rend. 1st. San. Pub. 1940. P. 894-925.

155. Lupascu G. SulPesistenza di due varieta di An. claviger II Riv. Di Parassitol. 1941. V.5.P. 25-44.

156. Ma H. C., Chang T. L. Observations on maxillary teeth of Anopheles hyrcanus var. sinensis Wiedemann in Shanghai Region // Lingnan Sci. J. 1935. Vol.14. N.4. P.611-615.

157. Ma Y., Li S., Xu J. Molecular identification and phylogeny of the Maculatus group of Anopheles mosquitoes (Diptera: Culicidae) based on nuclear andmitochondrial DNA sequences // Acta Trop. 2006. V. 99 N. 2-3. P. 272-280.

158. Manonmani A.M., Sahu S.S. Utility of the rDNA-lTS2-PCR assay in detecting the life stages of species S of Anopheles fluviatilis complex // Indian J Med Res. 2008. V. 128. N. 5. P. 630-633.

159. Mariani M., Bruno-Smiraglia C., Caravaglios N. Ricerche sulla intrerspecificita labranchiae-atroparvus II Riv. di Malariol. 1964. Vol.63.N.1-3. P.37-50.

160. Marinucci M., Romi R., Mancini P., Di Luca M., Severini C. Phylogenetic relationships of seven palearctic members of the maculipennis complex inferred ITS2 sequence analysis // Insect Mol. Biol. 1999. Vol.8. N.4. P.469-480.

161. Mendis K., Rietveld A., Warsame M., Bosman A., Greenwood B., Wernsdorfer W.H. From malaria control to eradication: The WHO1 perspective // Trop Med Int Health. 2009. V. 14. N. 7. P.802-809.

162. Missiroli A., Hackett L. W., Martini E. Le razze di Anopheles maculipennis e la loro importanza nella distribuzione della malaria in alcune regioni d'Europa // Riv. Malariol. 1933. Vol.12. N.l. P.l-58.

163. Moreno M., Salgueiro P., Vicente J.L., Cano J., Berzosa P.J., de Lucio A., Simard F., Caccone A., Do Rosario V.E., Pinto J., Benito A. Genetic population structure of Anopheles gambiae in Equatorial Guinea // Malar J. 2007. V. 15. N. 6. P. 137.

164. Muhlens P. Bericht über eine Malaria expedition nach Jerusalem // Zentralbl Bakt Mikrobiol Hyg. 1913. V. 69. P. 41-85.

165. Muir, D, A. & Keilany, M. Anopheles claviger Meigen as a malaria vector in Syria //WHO/MAI. 7272.757 (mimeographed document)

166. Norris D.E. Genetic markers for the study of anopheline vectors of human malaria// Int J Parasitol. 2002. V. 32. P. 1607-1615.

167. Okara R.M., Sinka M:E., Minakawa N., Mbogo C.M:, Hay S.I., Snow R.W. Distribution of the main malaria-vectors in Kenya // Malar J. 2010. V. 4. N. 9 P. 69.

168. Onyabe D.Y., Conn J. E. Intragenomic heterogeneity of a ribosomal DNA spacer (ITS2) varies regionally in the neotropical malaria vector Anopheles nuneztovary (Diptera: Culicidae) // Insect Mol. Biol. 1999. Vol.8. N.4. P.435-442.

169. Oshaghi M. A., Shemshad K., Yaghobi-Ershadi M. R., Vatandosst H., Abaie M. R., Zare Z., Amani H. Ribosomal DNA-ITS2 genotypes of malaria vector Anopheles superpictus (Diptera: Culicidae) from Iran //Acta Medica Iranica. 2007b. V. 45. N. 4. P. 257-262.

170. Oshaghi M.A.,Yaghobi-Ershadi M.R., Shemshad Kh., Pedram M., Amani H. The Anopheles superpictus complex: Introduction of a new malaria vector complex in Iran // Bull.Soc.Pathol.Exot. 2008. V.101. P. 429-434.

171. Park S., Choochote W., Jitpakdi A., Junkum A., Kim S., Jariyapan N., Park

172. J., Min G. Evidence for a conspecific relationship between two morphologycally and cytologically different forms of Korean Anopheles pullus mosquito // Mol. Cells. 2003. V.16. N.3. P.354-360.

173. Paskewitz S. M, Wesson D. M, Collins F. H. The internal transcribed spacers of ribosomal DNA in five members of the Anopheles gambiae species complex // Insect Mol Biol. 1993. V.2. N.4. P. 247-257.

174. Porter C. H., Collins F. H. Species-diagnostic differences in a ribosomal DNA internal transcribed spacer from the sibling species Anopheles freeborni and Anopheles hermsi (Diptera: Culicidae) // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1991. Vol.45. P.271-279.

175. Postiglione M., Smiraglia C. B., Lavagnino A., Gokderk C., Ramsdale C. A preliminary note on the occurrence in Turkey of the subalpinus form of the A.maculipennis complex // Riv. di parassitol. 1970. Vol.31. N.2. P.155-158.

176. Proft J., Maier W. A., Kampen H. Identification of six sibling species of the Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) by a polymerase chain reaction assay // Parasitol. Res. 1999. Vol.85. P.837-843.

177. Rafael, M. S., W. P. Tadei, and S. M. Recco-Pimentel. Location of ribosomal genes in the chromosomes of Anopheles darlingi and Anopheles nuneztovari (Diptera, Culicidae) from the Brazilian Amazon // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2003. V. 98. P. 629-635.

178. Ramsdale, C. D. Internal taxonomy of the Hyrcanus group of Anopheles (Diptera: Culicidae) and its bearing on the incrimination of vectors of malaria in the west of the Palaearctic Region // Eur. Mosq. Bull. 2001. V. 10. P.l-8.

179. Ribeiro H., Ramos H. C., Pires C. A., Capela R. A. Research on the mosquitoes of Portugal (Diptera, Culicidae) // Garcia de Orta, Ser.zool. 1980. Vol.9. N.l-2. P.129-138.

180. Rice J. B., Barber M. A. The varieties of Anopheles maculipennis in a region of Greek Macedonia //Bull. Entomol. Research. 1937. Vol.28. P.489-497.

181. Rich S.M., Rosenthal B.M., Telford S.R. 3rd, Spielman A., Hartl D.L., Ayala

182. F.J.Heterogeneity of the internal transcribed spacer (ITS-2) region within individual deer ticks // Insect Mol Biol. 1997. V. 6. N. 2. P. 123-129.

183. Roehrdanz R.L. An improved primer for PCR amplification of mitochondrial DNA in a variety of insect species // Insect Mol. Biol. 1993 .V. 2. P. 89-91.

184. Romi R., Boccolini D., Hovanesyan I.,Grigoryan G., Di Luca M., Sabatinelli

185. G. Anopheles sacharovi (Diptera: Culicidae):a remerging malaria vector in the Ararat valley of Armenia // J.Med.Entomol. 2002. V.39. P.446-450.

186. Rona L.D., Carvalho-Pinto C.J., Mazzoni C.J., Peixoto A.A. Estimation of divergence time between two sibling species of the Anopheles (Kerteszia) cruzii complex using a multilocus approach // BMC Evol Biol. 2010. V. 31. N. 10. P. 91.

187. Sabatini A., Coluzzi M., Boccolini D. Field studies on inversion polymorphism in Anopheles superpictus from southern Italy // Parassitologia. 1989. V. 31. N. l.P. 69-87.

188. Sallum M. A. M.; T. R. Schultz; P. G. Foster; K. Aronstein; R. A. Wirtz & R. C. Wilkerson // Phylogeny of Anophelinae (Diptera: Culicidae) based on nuclear ribosomal and mitochondrial DNA sequences // Systematics Entomology. 2002. V. 27. P. 361-381.

189. Samanidou-Voyadjoglou A., Harbach R. E. Key to the adult female mosquitoes (Culicidae) of Greece // Europ. Mosq. Bull. 2001. N.10. P. 13-20.

190. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors //Biotechnology. 1992. V. 24. P. 104-108.

191. Schaffner F., Angel G., Geoffroy B., Hervy J.P., Rhaiem A., Brunhes J. The Mosquitoes of Europe/Les moustiques d'Europe. An Identification and .Training Programme (CD-Rom), Montpellier, France: IRD Editions & EID Mediterrance, 2001.

192. Schaffner F., Marquine M., Pasteur N., Raymond M. Genetic differentiation of Anopheles claviger s.s. in Europe // J Med Entomol. 2003. V. 40. N. 6. P. 865875.

193. Schaffner F., Raymond M., Pasteur N. Genetic differentiation of Anopheles claviger s.s. in France and neighbouring countries // Med Vet Entomol. 2000. V. 14. N. 3. P. 264-271.

194. SchlOtterer, C., and D. Tautz. Slippage synthesis of simple sequence DNA // Nucleic Acids Res. 1992.V. 20. P. 211-215.

195. SchlOtterer, C., M.-T. Hauser, A. von Haeseler, and D. Tautz. Comparative evolutionary analysis of rDNA ITS regions in Drosophila II Mol. Biol. Evol. 1994.V. 11. P. 513-522.

196. Schultz J., Muller T., Achtziger M., Seibel P.N., Dandekar T., Wolf M. The internal transcribed spacer 2 database- A web server for (not only) low level phylogenetic analyses // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. (Database Issue) D. 704707.

197. Schultz J., Maisel S., Gerlach D., Muller T., Wolf M. A common core of secondary structure of the internal transcribed spacer 2 (ITS2) throughout the Eukaryota // RNA 2005.V. 11. P. 361-364.

198. Scott J.A., Brogdon W.G., Collins F.H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction // Am J Trop Med Hyg. 1993. V. 49. N. 4. P. 520-529.

199. Sedaghat M. M., Linton Y.-M., Oshaghi M. A., Vatandoost H., Harbach R. E. The Anopheles maculipennis complex (Diptera: Culicidae) in Iran: molecular characterization and recognition of a new species // Bull. Entomol. Research. 2003. Vol.93. P.527-535.

200. Selig C., Wolf M., Mueller T., Dandekar T., Schultz J. The ITS2 database II: homology modelling RNA structure for molecular systematics // Nucl Acids Res. 2008. V. 36 (Database Issue) D. 377-380.

201. Senevet G. e Andarelli L. Races et variétés de L'Anopheles claviger Meigen, 1804 //Arch. Inst. Pasteur d'Algerie. 1955. V. 33. P. 128-137.

202. Service M. W. The biology of Anopheles claviger (Mg.) (Dipt., Culicidae) in southern England // Bulletin of Entomological Research. 1973. V. 63. P. 347-359.

203. Service M. W. Medical entomology for students. Third edition. Cambridge University Press. 285p.

204. Sokolova M. I., Snow K. R. Malaria vectors in European Russia // Europ. Mosq. Bull. 2002. N.12. P. 1-6.

205. Swet W.C., Rao B. Races of Anopheles stephensi Linton, 1901.1ndian Medical Gazette. 1937. V.72. P. 665-674.

206. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. // Molecular Biology and Evolution. 2007. V. 24. P. 1596-1599.

207. Tang, J., L. Toe, C. Back, and T. R. Unnasch. Intraspecific heterogeneity of the rDNA internal transcribed spacer in the Simulium damnosum (Diptera: Simuliidae) complex // Mol. Biol. Evol. V. 13. 1996. P. 244-252.

208. Tripet F., Dolo G., Lanzaro G.C. Multilevel analyses of genetic differentiation in Anopheles gambiae, s.s. reveal patterns of gene flow important for malaria-fighting mosquito projects // Genetics. 2005. V. 169. N.l. P. 313-324.

209. Wesson, D. M.,. C. H. Porter, and F. H. Collins. Sequence and secondary structure comparisons of ITS rDNA in mosquitoes (Diptera, Culicidae) // Mol. Phylogenet. Evol. 1992.V. 1. P. 253-269.

210. White G. B. Systematic reappraisal of the Anopheles maculipennis complex // Mosq. syst. 1978. V. 10. N.l. P.13-44.

211. Wiemers M., Keller A., Wolf M. ITS2 secondary structure improves phylogeny estimation in a radiation of blue butterflies of the subgenus Agrodiaetus (Lepidoptera: Lycaenidae: Polyommatus ) //BMC Evol Biol. 2009. V. 26. N. 9. P.300.

212. Wolf M., Achtziger M., Schultz J., Dandekar T., Müller T. Homology modeling revealed more than 20,000 rRNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) secondary structures //RNA. 2005. V.l 1 N. 11. P. 1616-1623.

213. World Malaria Report 2009. Geneva, Switzezerland: WHO, 2009.190 p.

214. Wrigh W. R. On the effects of exposure to raised temperatures upon the la rva of certain British mosquitos // Bull. Ent. Res. 1927. V. 18. P. 91-94.

215. Zahar, A.R. Review of the ecology of malaria vectors in the WHO eastern Mediterranean Region // Bull. WHO. 1975. V. 50. P. 427-440.121