Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический и молекулярный анализ хромосомных перестроек, ассоциированных с нейропсихиатрическими заболеваниями человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Тентлер, Дмитрий Генрихович, Уппсала

62 12/38

Диссертация на звание доктора философии (Медицинский факультет) специальность «Клиническая генетика»

Цитогенетический и молекулярный анализ хромосомных перестроек, ассоциированных с нейропсихиатрическими заболеваниями человека

Дмитрий Тентлер

АСТА ЦМУЕКБ1Т АТ1Б 11Р8А1ЛЕЫ818 УППС АЛА 2001

Диссертация на звание доктора философии (Медицинский факультет) по клинической генетике представленная в Уппсальском университете в 2001 году.

Резюме

Тентлер Д. 2001. Цитогенетический и молекулярный анализ хромосомных перестроек, ассоциированных с нейропсихиатрическими заболеваниями человека. Acta Universitatis Upsaliensis. Полные резюме уппсалъских диссертаций Медицинского факультета 1091. 56 стр. Уппсала. ISBN 91-554-5149-7.

Генетические факторы играют большую роль в этиологии нейропсихиатрических заболеваний. Анализ хромосомных аберраций ассоциированных с этими заболеваниями может дать информацию о специфических локусах, необходимую для идентификации задействованных генах и в последствии для понимания процессов развития и функционирования мозга.

Цитогенетический и молекулярный анализ двух сестер с кариотипом 46,XY, а также врожденной умственной отсталостью, судорогами и синдромом андрогенной нечувствительности показал наличие в их генотипе микроделеции в районе Xqll-ql2. С помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ на ДНК-фибриллах (fibre-FISH) мы смогли вычислить, что размер делеции примерно 1,1 Mb. Было показано, что делетированный участок захватывает ген андрогенового рецептора и ген OPHN1. Исходя из клинических и цитогенетических данных, ген OPHN1 участвует в процессах развития мозга, и нарушение его функций ведет к развитию умственной отсталости.

Микроделеция в районе 19ql3.2 была обнаружена у пациента с анемией Даймонда-Блекфена, аномалиями развития скелета и умственной отсталостью. С помощи методов флуоресцентной in situ гибридизации на метафазных хромосомах и ДНК-фибриллах было показано, что делеция захватывает участок ДНК размером 3,2 Mb. Делетированный участок включает в себя ген RPS19, который является ответственным за анемию Даймонда-Блекфена, однако его мутации не приводят к умственной отсталости. Результаты исследования свидетельствуют, что данный случай является новым мультигенным синдромом, и что делетированный участок содержит не известный ранее ген, ответственный за умственную отсталость.

Был проведен цитогенетический и молекулярный анализ пациентов с признаками аутизма, ассоциированными со сбалансированными транслокациями t(5;7), t(17;19) и t(13;17). Анализ сбалансированной транслокации t(5;7) методом FISH показал, что точка разрыва на хромосоме 7 совпадает с предполагаемым локусом аутизма, описанным в предыдущих работах по анализу сцепления. Мутационный анализ двух ближайших к точке разрыва генов T2R3 и SSBP,

2

проведенный на пробах ДНК из ряда независимых пациентов с аутизмом, не выявил аллелей ассоциированных с заболеванием. Метилирование ДНК 7-й хромосомы пациента с t(5;7) не отличалось от контрольных образцов.

У двух пациентов с легкой формой аутизма, синдромом Аспергера, были обнаружены транслокации t(17;19) и t(13;17). Картирование точек разрыва на хромосоме 17 показало, что они находятся на расстоянии в 250-300 kb друг от друга. Данный район содержит 13 известных генов. Экспрессия девяти из этих генов была проанализирована на лимфобластоидной РНК из пациентов с транслокациями. Показано, что уровни экспрессии данных генов у пациентов не отличались от экспрессии в контрольных образцах, взятых из здоровых людей. Дальнейший структурный и функциональный анализ генов расположенных поблизости от точек разрыва на хромосоме 17 может выявить последовательности, ответственные за синдром Аспергера.

Ключевые слова: Врожденная умственная отсталость, аутизм, синдром Аспергера, хромосомные аберрации.

Dmitry Tentier, Department ofGenetics and Pathology, Unit of Clinical Genetics, Rudbeck Laboratory, Uppsala University, SE-751 85 Uppsala, Sweden

© Dmitry Tentier 2001

ISSN 0282-7476 ISBN 91-554-5149-7

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6

Хромосомы человека и нормальный кариотип 7

Основные хромосомные аберрации у человека 8

Численные аберрации 8

Структурные аберрации 9

Транслокации 9

Робертсоновские транслокации 9

Реципрокные транслокации 10

Инсерционные транслокации 12

Делеции и дупликации 13

Терминальные делеции 15

Инверсии 16

Изохромосомы и изодицентрики 17

Кольцевые хромосомы 18

Маркерные хромосомы 18

Частота хромосомных аберраций у человека 18

Общие механизмы возникновения структурных аберраций 19

Фенотипические аномалии, вызванные хромосомными перестройками 21

Цитогенетические методы исследования хромосомных аберраций 23

Методы окрашивания хромосом 23

Флуоресцентная гибридизация in situ 25

Различные методики FISH и их применение 26

Многоцветная (multicolour) FISH 28

Сравнительная геномная гибридизация 29

FISH к интерфазным ядрам 29

FISH на фибриллах (fibre-FISH 30

ВВЕДЕНИЕ К ПРЕДСТАВЛЯЕМОЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ 31

Неспецифическая умственная отсталость 31

Генетическая составляющая аутизма 34

Аутистический фенотип 34

Генетические исследования аутизма 35

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ 37

РЕЗУЛЬТАТЫ 37

Статья I 37

Статья II 39

Статья III 39

Статья IV 41

ОБСУЖДЕНИЕ 44

ВЫВОДЫ 49

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 50

ОТТИСКИ СТАТЕЙ, ВКЛЮЧЕННЫХ В РАБОТУ 57

Список сокращений

ПЦР Полимеразная цепная реакция

УО Умственная отсталость

ADHD Синдром дефицита внимания и гиперактивности (attention

deficit/hyperactivity disorder)

ASD Заболевания аутистического спектра (autism spectrum disorders)

ВАС Искусственная бактериальная хромосома (bacterial artificial chromosome)

CAIS Синдром полной андрогенной нечувствительности (complete androgen insensitivity syndrome)

CGH Сравнительная геномная гибридизация (comparative genomic hybridisation)

CMT1A Болезнь Шарко-Маритута типа 1A (Charcot-Marie-Tooth disease type 1 A)

DA Дистамицин A

DAPI 4,6-диамино-2-фенилиндол

DNA-PK ДНК-зависимая протеинкиназа

EBV Вирус Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus)

Fibre-FISH Флуоресцентная гибридизация in situ на хроматиновых фибриллах

FISH Флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescent in situ hybridisation)

HNPP Наследственная невропатия со склонностью к параличам от сдавления

(hereditary neuropathy with liability to pressure palsies)

ISCN Интернациональная система номенклатуры генетики человека (International

System for Human Cytogenetic Nomenclature)

MRI Магнитно-резонансная томография

NSMR Неспецифическая умственная отсталость (non-specific mental retardation)

OCD Обсессивно-компульсивное расстройство (obsessive-compulsive disorder)

OMIM Менделевское наследование у человека в сети Интернет (Online Mendelian Inheritance in Man)

РАС Искусственная хромосома из бактериофага PI (PI-derived artificial

chromosome)

STS Короткая уникальная секвенированная последовательность генома

(sequence-tagged site)

TSA Тирамидная амплификация сигнала (tyramide signal amplification)

XLMR Умственная отсталость, сцепленная с Х-хромосомой (X-linked mental retardation)

YAC Искусственная дрожжевая хромосома (yeast artificial chromosome)

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В связи со значительным прогрессом проекта секвенирования человеческого генома и увеличивающимся числом экспрессируемых последовательностей, полученных из различных библиотек кДНК, мы можем ожидать, что в течение нескольких лет все человеческие гены будут секвенированы и картированы. Следующей задачей генетики человека является выявление функций этого большого числа генов и определение взаимосвязи между их функцией и фенотипом человека.

Возможности применения большинства методов классической генетики, таких как анализ сцепления и мутационный анализ, сильно ограничены как по чисто биологическим причинам, так и по этическим соображениям. Цитогенетика может дать важную информацию о взаимосвязи между генотипом и фенотипом человека. Хромосомные аномалии человеческого генома, их ассоциация с врожденными наследственными заболеваниями и методы их изучения будут рассмотрены в данном обзоре.

Хромосомы человека и нормальный кариотип

Хромосомы представляют собой нуклеопротеиновые комплексы, которые обеспечивают структурную организацию молекул ДНК в ядре, защищают ядерную ДНК от энзиматического расщепления, регулируют экспрессию, репликацию и распределение наследственной информации. Хромосомы имеют очень сложную структуру, изменяющуюся в процессе клеточного цикла. Каждый элемент хромосомы важен для ее правильного функционирования. К настоящему времени, структура хромосомы изучалась главным образом на делящихся клетках, в которых хромосомы наиболее сконденсированы и, следовательно, доступны для визуализации. Прогресс в исследованиях хромосомной структуры в интерфазном ядре и его влияния на экспрессию отдельных генов был достигнут только недавно с развитием современных молекулярных методов (Cremer and Cremer, 2001).

и

'»¡»Л фФ

13

19

14

щ т

А Л

15

20

,ж цд. Шш

21

$ А

22

11

17

12

18

Рис. 1. Нормальный мужской кариотип человека. Хромосомы окрашены методом О-бандирования (0-ЬапсИп£). Номера хромосом указаны под изображениями.

Цитогенетические исследования делящихся клеток включают в себя блокирование деления на стадии метафазы и ингибирование образования веретена деления. На стадии поздней метафазы хромосомы присутствуют в виде двух хроматид, соединенных в районе центромеры. Центромера разделяет каждую хромосому человека на короткое р-плечо и длинное q-плeчo. Выделяют три типа хромосом согласно положению центромеры и, следовательно, длинам плеч. У метацентрических хромосом центромера располагается посередине. У акроцентрических хромосом центромера расположена очень близко к одному из концов, при этом р-плечо очень короткое и обычно оканчивается особыми структурами, называемыми сателлитами. Субметацентрические хромосомы имеют р- и я-плечи разной длины.

Число хромосом в клетках организма называется кариотипом. Нормальный кариотип человека - 46,ХУ для мужчин и 46,XX для женщин. Описанные ниже методы дифференциальной окраски хромосом позволяют идентифицировать каждую хромосому в кариотипе по набору светлых и темных полос (Рис. 1). Комбинация полос индивидуальна для каждой хромосомы и изменение структуры окраски указывает на то, что произошла

некая хромосомная перестройка. В следующих главах мы обсудим возможные аномалии числа и структуры человеческих хромосом, а так же методы их изучения.

Основные хромосомные аберрации у человека

Разработка методов дифференциальной окраски хромосом (Caspersson et al., 1968) и последующее составление цитогенетических и физических карт человеческого генома стимулировало открытие хромосомных перестроек разных типов и сделало возможным точное картирование точек разрыва хромосом.

У человека обнаружено множество типов хромосомных аберраций (см. обзор Shaffer and Lupski, 2000). Прежде всего, выделяют аномалии числа хромосом (численные) и хромосомной структуры (структурные).

Численные аберрации

Аномалии числа хромосом являются результатом ошибок их распределения в процессе деления клетки. Такие аномалии приводят к изменению числа копий многих генов и могут вызывать комплексный или летальный фенотип в случае возникновения в мейозе или на ранних стадиях эмбрионального развития. Большинство моносомий летальны. Единственная часто встречающаяся моносомия является результатом потери одной половой хромосомы и приводит к появлению индивидуума с одной Х-хромосомой. Дополнительные копии Х-хромосомы также встречаются достаточно часто, тогда как только немногие аутосомные трисомии (хромосом 13, 18 и 21) до некоторой степени жизнеспособны. Иногда у предположительно нормального кариотипа обнаруживается неравный вклад родительских хромосом, в случае если обе копии одной из хромосом наследованы от одного родителя. Во-первых, такие аномалии могут возникать из-за потери лишней копии хромосомы из трисомической зиготы (Strachan and Read, 1996). В таком случае (партеногенетическая дисомия) у ребенка представлены оба гомолога одного из родителей. Во-вторых, дупликация хромосомы может происходить в зиготе для компенсации моносомии (изодисомия). Ни партеногенетическая дисомия, ни изодисомия не изменяют копийность генов, однако они могут менять нормальную систему импринтинга. Получившийся фенотип зависит от материнского либо отцовского происхождения гомологов. Партеногенетическая дисомия и изодисомия не диагностируются цитогенетически, для их обнаружения требуется применение молекулярных методов, таких как анализ полиморфных микросателлитов.

Структурные аберрации

Транслокации, делеции, дупликации, инсерции и инверсии являются структурными аберрациями. Они происходят в результате ошибок процессов рекомбинации и синтеза ДНК. Рекомбинация ДНК происходит в значительном числе клеток человека. Мейоз, дифференцировка лимфоцитов и репарация двунитевых разрывов ДНК включают рекомбинацию как часть процесса. Различного рода ошибки возможные при прохождении данных процессов приводят к разнообразным перестройкам. Классификация структурных перестроек построена на количестве вовлеченных хромосом, числе точек разрыва и расположении точек разрыва в хромосоме.

Транслокации

Транслокациями называются перемещения хромосомного материала в другой локус на той же или на другой хромосоме. Выделяют робертсоновские, реципрокные и инсерционные транслокации.

Робертсоновские транслокации

Робертсоновские транслокации представляют собой обмен целыми хромосомными плечами, произошедшим между двумя акроцентрическими хромосомами (Рис. 2А). Транслокации этого типа вероятнее всего происходят в результате гомологичной рекомбинации между нуклеотидными повторами, которые в большом количестве присутствуют в коротких плечах акроцентрических хромосом. Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что большинство робертсоновских транслокаций -дицентрики. Только одна из центромер является функциональной в этих диценрических хромосомах.

Были обнаружены все возможные комбинации таких транслокаций между акроцентрическими хромосомами человека (13, 14, 15, 20 и 21), и молекулярные исследования (Sullivan et al., 1996) показали, что они гетерогенны по структуре. Расположение точек разрыва может варьировать, но большинство из них обнаруживаются в ДНК сателлита III (Sullivan et al., 1996).

Различные комбинации встречаются с разной частотой. Большинство робертсоновских транслокаций это rob(13q;14q) и rob(14q;21q) (Shaffer and Lupski, 2000). Такое неравное распределение может отражать различия и сходство вариантов ДНК повторов в р-плечах акроцентрических хромосом.

я

я

К

W

xs¿¡> W

Рис. 2. Структурные хромосомные аберрации: (А) робертсоновская транслокация; (В) реципрокная транслокация; (С) инсерция; (D) инверсия.

Реципрокные транслокации

Реципрокные транслокации происходят в результате одиночного разрыва на каждой из участвующих хромосом (Рис. 2В). Это может являться следствием рекомбинации между гомологичными последовательностями, расположенными на негомологичных хромосомах. Многие точки разрыва действительно были картированы в пределах низкокопийных или высококопийных повторах человека. Исследование относительно распространенной транслокации t(ll;22)(q23;qll) показало, что точки разрыва на обеих вовлеченных в транслокацию хромосомах находятся в АТ-богатых палиндромых районах (Edelmann et al., 2001). Подобная же АТ-богатая последовательность была описана в исследовании новой реципрокной транслокации t(17;22)(qll;qll) в семье с нейрофиброматозом первого типа. В данном случае обмен произошел между гомологичными АТ-богатыми последовательностями (Kehrer-Sawatzki et al., 1997). Транслокация t(ll;22)(q23;qll) является наиболее частой из повторяющихся транслокаций, и ее наиболее вероятной причиной служит нестабильность АТ-богатых последовательностей, которая способствует гомологичной рекомбинации между ними. Однако степень гомологии, которая требуется для рекомбинации, остается невыясненной, и, вероятно, существуют другие механизмы кроме гомологичной рекомбинации, приводящие к подобным перестройкам. В целом ряде рекомбинаций, у которых были клонированы точки разрыва, в нормальных хромосомах обнаружена гомология лишь по нескольким парам оснований (Budarf et al., 1995, Millar et al., 2000). Столь незначительная гомология недостаточна для стимулирования гомологичной рекомбинации, что

свидетельствует о том, что причиной большинства реципрокных транслокаций является негомологичная рекомбинация. Механизмы этого процесса будут рассмотрены ниже. Изучение реципрокных транслокаций, ассоциированных с человеческими заболеваниями, представляет особый интерес для генетики человека, поскольку хромосомные перестройки этого типа затрагивают всего два вполне определенных района, и анализ точек разрыва может дать прямые сведения о причинах заболевания. Однако сбалансированные транслокации могут и не иметь фенотипического эффекта, если транслокация напрямую не затрагивает функционирование какого либо гена. Получившиеся в результате таких транслокаций производные хромосомы успешно проходят через митоз. Серьезные проблемы возникают в процессе первого деления мейоза, в котором произв�