Оптимизация диагностики хромосомных аномалий человека

Гайнер, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оптимизация диагностики хромосомных аномалий человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация диагностики хромосомных аномалий человека"

На правах рукописи

ГАИНЕР ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОПТИМИЗАЦИЯ ДИАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНЫХ АНОМАЛИЙ ЧЕЛОВЕКА

Генетика-03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2004

Работа выполнена в цитогенетической лаборатории медико-генетического отдела (МГО) Государственного Новосибирского областного клинического диагностического центра (ГНОКДЦ) и в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики (ИЦиГ) СО РАН, г.Новосибирск.

Научные руководители:

доктор биологических наук Н.Б. Рубцов Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск,

кандидат биологических наук В.Г. Матвеева Государственный Новосибирский областной клинический диагностический центр

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.С. Жданова Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск,

кандидат медицинских наук О.В. Лисиченко, Новосибирская государственная медицинская академия

Ведущее учреждение: ГУ НИИ медицинской генетики Томского

научного центра СО РАМН, г.Томск

Защита диссертации состоится 2005г на утреннем заседании

диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10. Факс: (3832) 33-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН

Автореферат разослан

2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А.Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Своевременное проведение хромосомного анализа имеет большое значение для выявления причин возникновения и прогнозирования многих наследственных и врожденных пороков развития. В лабораториях медицинской цитогенетики для анализа хромосомных аномалий используются классические методы цитогенетического анализа, базирующиеся на дифференциальном окрашивании хромосом. Эти методы позволяют выявлять все численные нарушения и значительную часть структурных хромосомных перестроек, а также маркерные хромосомы (MX). Однако в ряде случаев разрешающей способности этих методов оказывается недостаточно для успешного проведения их диагностики, например, для идентификации малых сверхчисленных маркерных хромосом или для определения происхождения дополнительного хромосомного материала при несбалансированных транслокациях. Следует отметить, что точный цитогенетический диагноз необходим врачу-генетику для составления правильного медико-генетического прогноза. Современные методы молекулярной цитогенетики позволяют точно описать практически любую хромосомную перестройку. Однако полное и надежное описание хромосомных аномалий может быть получено только при комплексном использовании целого ряда методов молекулярно-цитогенетической диагностики. Поэтому перед исследователем постоянно стоит вопрос о выборе оптимальной стратегии проведения такой диагностики, а также о ее стоимости. В связи с этим, существует потребность в разработке новых, более дешевых и общедоступных методов молекулярно-цитогенетического анализа. Исследование хромосомных аберраций классическими и молекулярно-цитогенетическими методами в сочетании с подробным описанием клинической картины пациентов дадут возможность более детального изучения известных и описания новых хромосомных синдромов, что необходимо для эффективного медико-генетического консультирования.

Цель работы - разработка и адаптация новых методов молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных аберраций и отработка системы взаимодействия обычных диагностических лабораторий с исследовательскими лабораториями для повышения точности и надежности описания хромосомных патологий при проведении клинической диагностики.

Для достижения этой цели были поставлены следующие за дачи;

1. Выявить среди пациентов со структурными хромосомными аномалиями случаи, которые не могли быть однозначно описаны с помощью методов дифференциального окрашивания хромосом и определить частоту данных случаев, требующих уточнения диагноза молекулярно-цитогенетическими методами.

2. Провести анализ сложных случаев хромосомной патологии с помощью комплекса молекулярно-цитогенетических методов.

3. Оценить возможности и ограничения использования различных методов диагностики хромосомных аберраций.

4. Разработать и апробировать новый метод оценки клинического значения сверхчисленных маркерных хромосом человека.

*Н)С. НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА |

5. Оценить эффективность проведения комплексного цитогенетического анализа с использованием различных методов диагностики хромосомных аномалий.

Научная новизна и практическая ценность. В проведенном исследовании предложен и использован новый метод оценки возможного клинического значения сверхчисленных маркерных хромосом. Выявлен и детально описан ряд хромосомных аберраций, в том числе уникальных, не имеющих аналогов в литературе. Определена доля пациентов, имеющих структурные аберрации хромосом и нуждающихся в уточнении диагноза молекулярно-цитогенетическими методами. Предложена и отработана схема эффективного взаимодействия клинических и исследовательских лабораторий при проведении детального анализа хромосомных аномалий. Результаты настоящего исследования используются в медико-генетическом консультировании, пренатальной диагностике. Материалы работы используются в педагогическом процессе в Новосибирской государственной медицинской академии для студентов и при переподготовке врачей различных специальностей.

Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на следующих конференциях:

Конференция «Генетика человека и патология» (19-21 ноября 2002 г., Томск); Конференция «Наследственные болезни и патология человека» (23 октября 2003 г., Новосибирск); Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики» (25-27 ноября 2003 г., Москва).

Вклад автора. Автор работает врачом-лаборантом-генетиком цитогенетической лаборатории МГО ГНОКДЦ. Ею лично с помощью методов дифференциального окрашивания проведен анализ хромосом пятнадцати из двадцати включенных в данную работу пациентов ГНОКДЦ. Автор принимала участие в планировании и проведении молекулярно-цитогенетических исследований, включая получение ДНК проб и FISH, в микроскопическом анализе результатов FISH и в обсуждении полученных результатов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем диссертации. Работа состоит следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы, включающий 141 ссылку. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 22 рисунками и содержит 1 таблицу.

Автор выражает глубокую благодарность руководителям работы д.б.н. Н.Б. Рубцову и к.б.н. В.Г. Матвеевой за ценные советы при проведении исследований и за помощь, оказанную при написании настоящей работы. Автор выражает признательность Т.В. Карамышевой за поддержку и полезные советы и В.В. Шломе за помощь в оформлении работы и постоянную поддержку. Автор благодарит врачей-клиницистов Маслову Е.В., Шорину А.Р., Мельник Н.Г. за любезно предоставленные описания фенотипов пациентов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Работа проводилась на двух базах: в цитогенетической лаборатории МГО ГНОКДЦ и в лаборатории морфологии и функции клеточных структур ИЦиГ СО РАН. Пациенты направлялись врачами-генетиками, ими же проводилось описание фенотипов пациентов. В течение четырех лет проведено цитогенетическое обследование 2266 пациентов. В сложных случаях, когда с помощью дифференциальных окрасок не удавалось определить кариотип, использовались молекулярно-цитогенетические методы исследования. В работу взято 20 таких случаев, еще 3 предоставлены другими организациями: Институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отто РАМН, г. Санкт-Петербург, РФ; Институт исследований генома человека Университет Сан-Пауло, г. Сан-Пауло, Бразилия и Муниципальный Центр планирования семьи и репродукции, г. Новосибирск, РФ.

Материалом для исследования служили препараты, полученные из суспензий фиксированных лимфоцитов периферической крови пациентов, у которых была обнаружена хромосомная патология.

Культивирование лейкоцитов периферической крови, фиксацию клеток, приготовление препаратов хромосом для GTG-окрашивания, FISH и микродиссекции и GTG-окрашивание хромосом проводили согласно стандартным методикам. Хромосомные аберрации описывали согласно Интернациональной Системе цитогенетической номенклатуры человека (ISCN, 1995).

Анализ GTG-окрашенных метафазных хромосом проводили с помощью светового микроскопа "LEICA DME" фирмы "LEICA" (Германия), для регистрации изображения использовали световой микроскоп "Standard 25" фирмы "ZEISS", видеокамеру и программное обеспечение "ВидеоТесТ-Карио 2.0" фирмы "ООО Иста-Видео ТесТ" (г. Санкт-Петербург).

Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном электронноконтролируемым микроманипулятором MR (Zeiss, Германия) и механическим позиционером.

Амплификацию ДНК диссектированного материала проводили в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером MW6 по стандартному протоколу. Мечение микродиссекционных ДНК-библиотек проводили в 17-ти дополнительных циклах DOP-PCR в присутствии biotin-16-dUTP или digoxigenin-11-dUTP.

ДНК-пробы, специфичные эухроматиновым районам хромосом человека получали, используя Inter-Alu ПЦР и амплификацию Alu повтора в ПЦР со специфическими праймерами. ДНК-пробу, специфичную рибосомальной ДНК человека получали ник-трансляцией клонированного фрагмента рибосомальной ДНК человека. ДНК-пробу, специфичную теломерным повторам получали в ПЦР стандартным способом.

Супрессионную in situ гибридизацию меченых ДНК-проб с метафазными хромосомами проводили, как описано у Пинкеля (Pinkel, 1986). Препараты после проведения FISH анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AXIOSCOP 2, для регистрации сигнала использовали CCD-камеру и

программное обеспечение «ISIS3» фирмы METASYSTEMS GmbH (Германия), комплект фильтров 0.2,10,15 (ZEISS).

Для генерации многоцветного бэндинга хромосом проводили двухцветную CISS-гибридизацию. Регистрировали изображения, используя программу «ISIS3» фирмы METASYSTEMS GmbH, а затем обрабатывали полученную информацию с помощью функции МСВ той же программы для генерации псевдоцветов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Первичный цитогенетический анализ хромосомных аномалий.

При анализе кариотипов 2266 пациентов ГНОКДЦ с 2000 по 2003 г с помощью методов дифференциального окрашивания в 191 случае была выявлена хромосомная патология, в том числе в 99 случаях - структурные аберрации хромосом. Разрешающая способность использованных методов в 43 случаях не позволила точно идентифицировать обнаруженные аномальные хромосомы или установить точки разрывов. Таким образом, приблизительно 44% пациентов, у которых были выявлены структурные аберрации хромосом (1,9 % всех пациентов) для установления окончательного диагноза нуждались в молекулярной додиагностике. В настоящее исследование включены 23 случая, из которых первичный цитогенетический анализ хромосом в 20 случаях был выполнен в цитогенетической лаборатории ГНОКДЦ.

Ниже для примера приведено краткое клиническое описание только нескольких пациентов, остальные присутствуют в диссертационной работе.

Случай №1. 33-летний мужнина обратился в медико-генетическую консультацию по поводу бесплодия. Его кариотип: 46,X,del(Y)?(ql1.2). Физическое и психическое развитие пациента в норме. Рост 188 см. Отмечается ожирение по гипоталамическому типу, ложная гинекомастия. Антимонголоидный разрез глаз. Глаза глубоко посажены. Небо высокое, зубы мелкие. Фильтр короткий. Ушные раковины диспластичны. Первичные и вторичные половые органы сформированы по мужскому типу.

Случай №2. Цитогенетический анализ кариотипа 5-летнего мальчика выявил в 42% метафаз наличие небольшой (меньше р-плеча хромосомы 17) метацентрической добавочной хромосомы. Кариотип пробанда: mos 47,XY,+mar[42]/46,XY[5 8].

Случай №3. Сверхчисленная хромосома 6-летней девочки была похожа по морфологии на хромосому i(18)(pl0). Кариотип ребенка: 47,XX,+?i(18)(p10).

Случай №4. В 77% метафазных пластинок 14-летней девочки выявлена маркерная хромосома незначительных размеров. Кариотип ребенка: mos

46,X,+mar[40]/45,X[12]. Выявленные у пробанда нарушения развития включали низкий рост, гипотрофию третьей степени, гипогенитализм, гипоплазию матки, первичную аменорею, дефект межжелудочковой перегородки.

Случай №5. Сверхчисленная хромосома 15-летнего мальчика представляла собой небольшой метацентрик. Кариотип ребенка описан как

47,XY,+mar.

Случай №6. У 16-летнего пациента обнаружена небольшая метацентрическая добавочная хромосома, его кариотип 47,XY,+mar. Кариотип отца нормальный, мать оказалась носительницей маркерной хромосомы.

Случай №7. Пациентка является матерью вышеприведенного пробанда (случай №6). Кариотип пациентки описан как 47,XX,+mar.

Случай №8. Обнаруженная у 18-летней девушки маркерная хромосома была метацентричной со спутничными районами на р- и q-плечах, напоминающей изохромосому. Кариотип пациентки: 47 ,ХХ, +таг. Кариотип отца нормальный, у матери обнаружена похожая маркерная хромосома.

Случай №9. Пациентка являлась матерью описанной выше девушки (случай №8). Ее кариотип: mos 47,XX,+mar[92]/48,XX,+2mar[8].

Случай №10. Первичный цитогенетический анализ кариотипа плода выявил три 21-х хромосомы и, кроме того, небольшую добавочную метацентрическую хромосому, похожую на изохромосому. Кариотип плода: 48, XY,+21,+mar.

Случай №11. При цитогенетическом исследовании амниотических клеток у плода выявлена небольшая (меньше хромосом группы G) маркерная хромосома, по морфологии похожая на кольцевую. Кариотип плода: 47,XY,+mar.

Случай №12. В 79% метафаз 8-летней девочки обнаружена маркерная хромосома, по размеру превышающая размер хромосом группы G. Кариотип ребенка: mos 47,XX,+mar[41]/46,XX[ll]. У пациентки выявлены: гипермобильность суставов, узкое овальное лицо, раннее половое созревание, задержка речевого и интеллектуального развития, снижение памяти, гиперактивность, эмоциональная лабильность, раздражительность, агрессивность.

Случай №13. У 5-летней девочки обнаружена маркерная хромосома, по размеру несколько меньше хромосом группы Е. Кариотип пациентки: 47,ХХ,+таг.

Случай № 14. У 29-летней женщины выявлена сверхчисленная маркерная хромосома, похожая на изохромосому, несущая на р-и q-плечах спутники. Размер ее без спутников существенно меньше хромосом группы G. Кариотип пациентки: 47,XX,+mar. Ее клинические особенности: невынашивание (2 замершие беременности, в одной найдена маркерная хромосома у плода), антимонголоидный разрез глаз, выступающий фильтр, неправильный прикус, микроретрогнатия, высокое небо, диспластичные ушные раковины, добавочные соски, добавочная хорда левого желудочка сердца, избыточное оволосение, гипермобильность I пальца кисти.

Случай №15. Мужчина (возраст - 37 лет) обследован в связи с тем, что у его дочери наблюдались нарушения развития (кариотип дочери оказался нормальным). У пациента выявлена дериватная хромосома 5, его кариотип описан как 46,XY,?del(5)(?q35).

Случай №16. При анализе хромосом 20-летнего пациента обнаружена метацентричная Y-хромосома, высказано предположение о наличии в ней инверсии или делеции. Кариотип пробанда: 46,X,?inv(Y)(pl 1.2ql 1.2).

Случай №17. У юноши (возраст - 18 лет) цитогенетическая диагностика выявила кариотип 46,ХХ. Фенотипические проявления пациента (половые органы, сформированные по мужскому типу) позволяли предположить, что в его кариотипе должна присутствовать хотя бы часть Y-хромосомы. Было высказано предположение, что у него небольшая часть эухроматина р-плеча Y-хромосомы, содержащая тестикул-детерминирующий ген SRY, транслоцирована на одну из других хромосом. У пациента определен кариотип: 46,XX,?t(?;Y).

Случай №18. При первичном цитогенетическом анализе у 3-летнего мальчика выявлена 22 хромосома со значительно увеличенным р-плечом, она выглядела метацентричной. Его кариотип описан как 46,XY,der(22)t(p11.2;?). Кариотип матери нормальный, у отца обнаружена такая же хромосома.

Случай №19. У новорожденной девочки обнаружена дериватная хромосома 10. В результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип: 46,XX,der( 10)t(?2; 10)(?q31;q26).

Случай №20. У 15-летней девочки обнаружена несбалансированная транслокация мозаичного типа, ее кариотип определен как mos 46,XX,der(14)t(14;?14Xq32;?ql 1.2)[38]/46,XX[14].

Случай №21. При первичном цитогенетическом анализе хромосом семилетнего мальчика была выявлена хромосома 7, несущая на q-плече небольшую добавку неизвестного хромосомного материала. У ребенка обнаружен кариотип 46,XY,der(7)t(7;?)(q36;?). С рождения у пробанда отмечается задержка физического и психического развития. Подкожная клетчатка избыточна. Череп крупный правильной формы. Лицо треугольной формы. Гипертелоризм. Фильтр короткий, небо высокое. Зубы крупные резцы, неправильное расположение. Прогения, прохейлия, фильтр широкий. Ушные раковины диспластичны. Нарушение осанки. Половые органы сформированы по мужскому типу. Кариотип отца пациента нормальный, мать - носительница сбалансированной транслокации. Отметим, что возможность определения кариотипа родителей появилась только через 2 года после того, как у их сына была выявлена несбалансированная транслокация.

Случай №22. Пациентка является матерью ребенка - носителя несбалансированной транслокации (случай №21). Ее кариотип описан как: 46,XX,t(7;18)(q36;q21.1).

Случай №23. При первичном цитогенетическом анализе кариотипа восьмилетней девочки обнаружена аномальная хромосома 7, кариотип ребенка: 46,XX,inv(7)?(pll.2qll.23). Аномалии развития, обнаруженные у пациентки: низкий рост, субнанизм, гипотрофия третьей степени, монголоидный разрез глаз, эпикант, широкое переносье, гипоплазия крыльев носа, готическое небо, кифосколиоз, клинодактилия, Х-образное искривление ног, плоскостопие, узкая стопа, гиперэластичность кожи.

Существенную часть включенных в работу случаев составляли маркерные хромосомы( MX).

Анализ организации MX микродиссекнией и in situ гибридизацией ДНК-проб, специфичных MX, а также in situ гибридизацией с ДНК-пробами, специфичными теломерным повторам и рибосомальной ДНК.

Для определения происхождения и состава исследуемых маркерных хромосом были получены и использованы микродиссекционные ДНК-пробы соответствующих хромосом. Супрессионная FISH полученных ДНК-проб была проведена с метафазными хромосомами пациентов и здоровых доноров (рис. 1).

а . mar •4 ' „ • и ^^ л ч б », ' ^ / i ; lfv jr JL и -r f.~1 —>-. " Л -

в «• ,1 ♦ < . "" * ; * / »' /'', . • * ■ % и,- - - ^ - * 1• », ■Л К r « 4. • mar ; * i

Д $ i • i ~J "У ' f ** Л» tv • 4 v- ..t.V »'IM ¥ e * 4 * * » • * . • # 1 ? <» * * r 4 V

Рис.1. FISH ДНК-проб, специфичных маркерным хромосомам (негативное изображение):

с метафазными хромосомами пациента: а) случай №13, б) случай №14, г) случай №2, д) случай №11; с метафазными хромосомами здорового донора: в) случай №5, е) случай №8 (сигналы на р-плечах акроцентрических хромосом).

В результате проведенного исследования кариотипы пациентов-носителей MX были описаны следующим образом: Случай №1.46,X,der(Y)(pl 1.3ql 1.2); Случай №2. mos 47,XY,+der(2Xpl l.lql 1.2)[42]/46,XY[58]; Случай №3.47,XX,+i(18)(plO); Случай №4. mos 46,X,+det{X)(pl l.lql 1.1)[40]/45Д[12]; Случай №5.47,XY,+der(22)(pl3ql 1.21); Случай №6.47,XX,+invdup (15)(pter-ql 1.2); Случай №7.47,XY,+invdup (15)(pter-ql 1.2); Случай №8.47,XX,+invdup(13 or 14 or 15 or 21 or 22);

Случай №9. mos 47,XX,+invdup(13 or 14 or 15 or 21 or 22)[92]/48,XX,+2invdup(13 or 14 or 15 or 21 or 22)[8];

Случай №10.4 8,XY,+21 ,+invdup( 13 or 14 or 15 or 21 or 22); Случай №11.47, XY.+mar;

Случай №12. mos 47,XX,+invdup(15)(pter-ql4) [41]/46,XX[11] Случай № 13.47,XX,+invdup (15)(pter-ql4); Случай № 14.47,XX,+ invdup{14)( pter-ql 1.1).

Во всех случаях, за исключением случая №11, была получена информация о происхождении и составе маркерных хромосом. CISS-гибридизация ДНК-пробы пациента №11 интенсивно окрашивала маркерную хромосому пациента, но не дала значимого сигнала ни в одном из районов хромосом пациента и здорового донора. Анализ данной MX, проведенный в Институте исследований генома человека Университета Сан-Пауло, не выявил в ее составе альфоидной ДНК. Несмотря на С-негативную природу этой MX, она не окрашивалась ни одной из хромосомоспецифических ДНК-проб. Происхождение маркерных хромосом с неоцентромерами до настоящего времени остается загадкой. Обычно у их носителей выявляются аномалии развития. Описанная нами MX с неоцентромерой представляет собой второй в истории анализа хромосомных патологий человека случай MX, ДНК-проба которой не дает специфического сигнала ни в одном районе хромосом человека. Для определения ее состава и происхождения требуются дополнительные исследования.

Для уточнения и более детального анализа организации вовлеченных в данное исследование MX были проведены дополнительные эксперименты, включающие FISH с ДНК-пробой, содержащей фрагмент рДНК человека (рДНК-проба) и с меченной ДНК теломерного повтора (TTAGGG)n (Tel-ДНК-проба). Кластеры рибосомальной ДНК были выявлены у всех MX, представляющих собой инвертированные дупликации коротких плеч акроцентрических хромосом (рис. 2а). Не было выявлено сигнала при проведении FISH рДНК-пробы с MX в случае № 5 (рис. 26). Это позволило дать окончательное описание данной MX как der(22)(p11q11.21). В результате FISH с Tel-ДНК-пробой было показано отсутствие кластеров теломерных повторов в хромосомах der(X)(pll.lql 1.1), der(2)(p11.1q11.2), а также в MX с неоцентромерой, что позволяет предположить их кольцевую организацию (рис. 2в). MX der(Y)(pll.3qll.2), которую на основании морфологического анализа ранее рассматривали как кольцевую, несла два кластера теломерных повторов,

что указывает на ее линейную организацию (рис. 2г). В случае №12, на основании анализа морфологии MX, было высказано предположение о том, что она представляет собой invdup по коротким плечам одной из акроцентрических хромосом. При FISH с использованием хромосомоспецифичной пробы Hsal5 был выявлен сигнал на двух гомологах хромосомы 15 и на MX, с использованием хромосомоспецифичной пробы Hsa22 - на гомологах хромосомы 22 и слабый сигнал только в ЯО-районе MX. Поэтому данная MX была описана как invdup(15).

Рис. 2. FISH рДНК- (а, б) и Tel- (в, г) проб с метафазными хромосомами пациентов: случай №7 (а), случай №5 (б), случай №2 (в) и случай №1 (г) (негативное изображение). Стрелки указывают на MX.

Проведенные исследования по созданию ДНК-проб MX и их FISH с метафазными хромосомами пациентов и здоровых доноров позволили прийти к заключению, что хромосомы der(Y)(pll.3qll.2), der(2)(p1L1q1L2), i(18)(p10), der(22)(p!3qlL21), invdup(15)(pter-ql4) (случаи №12 и №13), и MX с

неоцентромерой содержали эухроматиновые районы, тогда как хромосомы der(X)(pl l.lql 1.1) и invdup(14)(pter-ql 1.1) их не содержали.

Следует отметить, что решение вопроса о наличии или отсутствии эухроматиновых районов в составе MX, представляющих собой инвертированные дупликации коротких плеч акроцентрических хромосом, может быть затруднено наличием в прицентромерных районах хромосом 13, 15, 21 и 22 крупных кластеров дуплицированных последовательностей. В случае их присутствия в MX специфичная ей ДНК-проба может окрашивать содержащие их районы нормальных хромосом, имитируя присутствие в составе MX небольшого района эухроматина. Учитывая результаты FISH с ДНК-пробами MX и наличие MX у пациентов №№ 6,7, 8 и 9 в двух поколениях, мы пришли к заключению об отсутствии в этих MX «крупных» эухроматиновых районов. Возможно, это справедливо и в случае MX пациента №10. Его аномалии, вероятно, обусловлены трисомией хромосомы 21.

Таким образом, микродиссекция в большинстве случаев позволила нам определить происхождение маркерной хромосомы и районы локализации точек разрыва при ее образовании.

Детекция эухромат иновых районов в маркерных хромосомах.

Наиболее важным пунктом при исследовании MX является решение вопроса о наличии или отсутствии в ее составе эухроматиновых районов. В случае отсутствия в составе маркерной хромосомы эухроматиновых районов вопрос о ее происхождении становится академическим, так как такая MX не приводит к врожденным нарушениям развития у ее носителя. В связи с этим, представляется целесообразной разработка относительно простой и недорогой системы анализа маркерных хромосом, позволяющей дифференцировать MX по наличию или отсутствие в их составе эухроматиновых районов.

Так как Alu повторенные последовательности характерны для эухроматиновых районов хромосом человека (их концентрация в С-гетерохроматиновых районах, по крайней мере, в 50 раз ниже) мы апробировали использование ДНК-пробы, гомологичной Alu повтору, а также ДНК-пробы, представляющую собой продукт Inter-Alu-PCR (IAP), для специфического окрашивания эухроматиновых районов в нормальных хромосомах человека и в исследуемых MX. Следует отметить, что кроме эухроматиновых районов хромосом человека Alu повторенные последовательности в небольшом числе представлены в ядрышкообразующих районах хромосом.

FISH IAP-пробы, проведенная с супрессией гибридизации повторенных последовательностей, и Alu-ДНК-пробы окрасила все эухроматиновые районы хромосом, но не дала сигнала в районах С-гетерохроматина. При проведении FISH данных ДНК-проб с ранее охарактеризованными MX - дериватами двуплечих хромосом окрашенные районы были выявлены только в MX, наличие эухроматиновых районов з которых было определено в предварительных исследованиях с созданием микродиссекционных ДНК-проб и их FISH с хромосомами человека. Какого-либо сигнала не было выявлено при FISH IAP- и Alu-ДНК-проб с хромосомой der(X) (pll .lql 1.1), которая не содержала эухроматиновых районов. В MX, представляющих собой инвертированные дупликации коротких плеч акроцентрических хромосом, были выявлены

сигналы в ядрышкообразующих районах, которые, однако, были легко отличимы от окраски эухроматиновых районов длинных плеч акроцентрических хромосом, в случае присутствия последних в MX. Примером MX с отсутствием сигнала за границами ядрышкообразующих районов может служить invdup(14)(pter-qll.l). К сожалению, результаты FISH IAP- и Alu-ДНК-проб с MX invdup(15) (случаи №6 и №7) и invdup(13 or 14 or 15 or 21 or 22) (случаи № 8, 9 и 10) не позволили прийти к однозначному заключению. Как и ожидалось, были выявлены сигналы в ЯО-районах, содержащих Alu-повторы. Однако, очень слабые сигналы были выявлены и за пределами ядрышкообразующих районов. Возможно, они были обусловлены наличием в этих MX крупных кластеров дуплицированных последовательностей. Ответить на вопрос, превышает ли свечение флуорохрома в районе возможной локализации эухроматинового района фоновый уровень, оказалось невозможно. В результате FISH LAP- и Alu-ДНК-проб с MX invdup(15) (случаи №12 И 13) был выявлен четкий сигнал в центральной части MX (рис. 3). Таким образом, было показано, что в центре этой MX присутствует «крупный» эухроматиновый район. Слабый сигнал наблюдался также в ЯО-районе. Эти данные указавают, что крупные эухроматиновые районы в invdup(15) могут быть выявлены с помощью LAP- и Alu-ДНК-проб.

Рис. 3. FISH Alu-ДНК-пробы с метафазными хромосомами пациентки (случай №12): а) сигналы FISH Alu-ДНК-пробы с метафазными хромосомами, представленными на рисунке 26 (негативное изображение); б) окрашивание хромосом DAPI (негативное изображение). Стрелка указывает на MX.

Полученные результаты позволяют рассчитывать, что использование в качестве ДНК-пробы меченной ДНК Alu-повтора позволит провести оценку присутствия в MX эухроматиновых районов. Однако окончательное заключение возможности использования такого подхода требует проведения исследований на значительно большем числе хорошо охарактеризованных MX.

Анализ предполагаемых делений с помощью методов микродиссекпии и обратного пэйнтинга.

Случай №15 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип 46,XY,?del(5)(?q35)). Методом микродиссекции с помощью DOP-PCR из дериватной хромосомы 5 была получена хромосомоспецифичная ДНК-библиотека. ДНК-пробу, полученную на ее основе, использовали для CISS-гибридизации с хромосомами здорового донора и пациента. При гибридизации с хромосомами здорового донора сигнал был выявлен в районах 5pter->q31.1 и 20qll.2->qter (рис.4а), с хромосомами пациента - в тех же районах и на дериватной хромосоме 5. Данные результаты позволяют описать der(5) как der(5)t(5;20)(q31.1;qll.2) и указывают на наличие в кариотипе пациента хромосомы der(20)t(5;20)(q31.1;qll.2). Для подтверждения данного заключения с хромосомами пациента была проведена FISH ДНК-проб, специфичных хромосомам 5 и 20, меченных biotin-16-dUTP и digoxigenin-11-dUTP, соответственно. Результаты однозначно показали, что кариотип пациента представляет собой 46,XY,t(5;20)(q31.1;qll.2). Таким образом, в данном случае вместо предполагаемой делеции у пациента была обнаружена сбалансированная транслокация. Полученный диагноз согласуется с фенотипом пациента, не имеющего серьезных аномалий развития.

Случай №16 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип 46,X,?inv(Y)(pLL2qLL2). Методом микроманипуляционного сбора Y-хромосомы была получена Y-специфичная ДНК-библиотека. После мечения полученную ДНК-пробу использовали для CISS-гибридизации с хромосомами пациента и здорового донора. Анализ результатов гибридизации показал, что хромосома inv(Y)(pll.2qll.2) не имеет делеции, по размерам превышающей 2 Mb. Для уточнения морфологической организации Y-хромосомы требуются дополнительные исследования, так как использованный метод не позволяет выявлять инверсии.

Анализ хромосомных транслокаций с помощью гибридизации с хромосомоспепифичными зондами.

Случай №17 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип 46,ХХ). Была проведена in situ гибридизация с HSAY специфичной ДНК-пробой. Поскольку в Х-хромосоме есть псевдоаутосомные области, содержащие ДНК, гомологичную ДНК Y-хромосомы, при такой гибридизации с хромосомами нормального донора (46,ХХ) достаточно интенсивный сигнал наблюдается в терминальной части р-плеча X хромосом. В случае нашего исследования, при гибридизации HSAY специфичной ДНК-пробы с хромосомами пациента такие сигналы наблюдались в терминальных районах р-плечей обеих Х-хромосом. Однако на одном из гомологов интенсивность сигнала была существенно выше, чем на другом. Это позволило нам предположить, что у пациента небольшая часть Y-хромосомы транслоцирована на р-плечо одной из Х-хромосом. Для точного подтверждения транслокации и определения точки разрыва в Y-хромосоме требуются дополнительные исследования, выходящие за рамки данной работы. Вероятно, кариотип пациента представляет собой 46,X,der(X)t(X;Y)(p22.3;?).

Рис. 4. FISH ДНК-проб с метафазными хромосомами здорового донора (негативное изображение): а) ДНК-пробы, специфичной хромосоме der(5) (случай №15), б) ДНК-пробы, специфичной хромосоме der(lO) (случай № 19).

Случай №18 (в результате первичного цигогенетического анализа определен кариотип 46,XY,der(22)t(pll.2;?)). Для выяснения вопроса о наличии у пациента несбалансированной транслокации были проведены две гибридизации in situ с хромосомами пациента. В первой гибридизации использовалась ША22-специфичная ДНК-проба, во второй - ДНК-проба, специфичная р-плечам акроцентрических хромосом. Анализ результатов гибридизаций показал, что р-плечо аномальной 22 хромосомы содержит только материал 22р. Вероятно, увеличение размеров короткого плеча 22 хромосомы в данном случае объясняется резким увеличением числа повторенных последовательностей, содержащихся в р-плече этой хромосомы. Наличие несбалансированной транслокации, таким образом, не подтвердилось. Кариотип пациента был описан как 46,XY,22p?h+.

Анализ хромосомных транслокаций методами микролиссекпии и обратного

пэйнтинга.

Случай №19 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип С помощью

микродиссекции была получена проба исследуемой хромосомы. Полученая «10q+» пэйнтинг-проба была использована для in situ гибридизации с метафазными хромосомами пациентки и здорового донора (Рис.4б). Результаты гибридизации подтвердили предположение о несбалансированной транслокации между второй и десятой хромосомами и позволили уточнить районы точек разрыва. Таким образом, носительница транслокации имеет трисомию по району и моносомию по району Кариотип пациентки может

быть представлен как 46,XX,der(10)t(2;10)(q32;q26).

Случай №20 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип mos 46,XX,der(14)t(14;?14)(q32;?ql 1.2)[38]/46,XX[14]). Была получена пэйнтинг-проба хромосомы der(14). При ее гибридизации с хромосомами здорового донора сигнал был выявлен в районе и в

районе с хромосомами пациентки - в тех же районах и на хромосоме

der(14). Таким образом, пациентка является носительницей несбалансированной транслокации между хромосомами 4 и 14 и имеет частичную трисомию по хромосоме 4 и частичную моносомию по хромосоме 14 (район

В результате проведенного нами исследования кариотип девочки был описан как mos 46,XX,der(14)t(4;14)(q24;q32)[38]/46,XX[14].

Случай №21 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип 46,XY,der(7)t(7;?)(q36;?)). С помощью микродиссекции была получена пэйнтинг-проба аномальной хромосомы der(7). При гибридизации этой ДНК-пробы с хромосомами здорового донора сигнал наблюдался на хромосомах 7 в районе и на хромосомах 18 в районе

q2I.l->qter, с хромосомами пациента - в тех же районах и на хромосоме der(7). Таким образом, мальчик является носителем несбалансированной транслокации между 7 и 18 хромосомами, вследствие чего у него имеется моносомия по району и трисомия по району В результате

проведенного исследования кариотип ребенка описан как 46,XY,der(7)t(7; 18)(q36;q21.1).

Случай №22 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип 46,ХХ, t(7;18)(q36;q21.1)). Необходимо отметить, что мать пациента - носителя дериватной хромосомы 7 (случай № 21) была кариотипирована только через два года после того, как ей сообщили о выявленной хромосомной патологии у сына. К этому времени сыну уже была сделана молекулярная додиагностика. При исследовании кариотипа матери была выявлена сбалансированная транслокация t(7; 18). Для проверки разрешающей способности методов микродиссекции и обратного пэйнтинга была получена пэйнтинг проба аномальной хромосомы der(18)t(7;18). При гибридизации с хромосомами пациентки данной пробы сигнал был выявлен на дериватной хромосоме 18 и на нормальной хромосоме 18 в районе pter-q21.1. При гибридизации этой же пэйнтинг пробы с хромосомами здорового донора сигнал наблюдался только в районе pter-q21.l хромосом 18. В обоих случаях не

наблюдалось сигнала в районе q36-qteг хромосомы 7, хотя его следовало ожидать. Видимо, это связано с тем, что этот район слишком мал для детекции с помощью данного метода. Эту проблему можно решить с помощью использования теломерспецифических зондов. Они коммерчески доступны. В результате, кариотип пациентки описан как 46,XX,t(7;18)(q36;q21.1). Анализ инверсии хромосомы 7 с помощью многоцветного бэндинга (МСВ).

Случай №23 (в результате первичного цитогенетического анализа определен кариотип 46,XX,mv(7)?(pЦ.2qlL23)). При использовании метода многоцветного бэндинга для получения псевдоцветов индивидуальных районов соотношения интенсивностей сигналов микродиссекционных ДНК-проб переводятся в псевдоцвета в каждой точке изображения. Нами было получено две микродиссекционных ДНК-пробы, обеспечивающие необходимый профиль интенсивности сигнала в пределах района инверсии. Каждая районоспецифичная ДНК-проба была мечена своим флуорохромом. При генерации многоцветного бэндинга в 1^(7) не было выявлено изменения порядка бэндов соответствующих псевдоцветов, как этого можно было бы ожидать. Вместо этого было выявлено изменение размера ряда бэндов, локализованных в пределах инверсии и прилежащих к ней. Моделирование генерации псевдоцветов при данной инверсии привело к результату, полностью согласующемуся с полученным в ходе эксперимента. Это позволило сделать заключение, что при анализе инверсии небольших районов (1-2 бэнда) с помощью МСВ на базе двух флуорохромов изменение паттерна МСВ может быть ограничено изменением ширины бэндов в районе инверсии. Разрешающая способность МСВ может быть увеличена при использовании прометафазных хромосом и большего числа ДНК-проб, меченных разными флуорохромами при проведении такого анализа. Тем не менее, анализ профилей сигналов районоспецифичных ДНК-проб позволил уточнить районы разрывов. В результате кариотип пациентки был описан как 46,XX,inv(7)(pll.lq21). Насколько нам известно, это первый описанный случай инверсии района р 11.1 q21 в хромосоме 7.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании вышеизложенного следует, что существует проблема уточнения предварительного цитогенетического диагноза. Как показывают наши данные, приблизительно 44 % пациентов, у которых выявлены структурные нарушения хромосом, нуждаются в таком уточнении.

В России первичный анализ хромосомной патологии традиционно проводится в медико-генетических консультациях, далее при необходимости в сложных и спорных случаях - в специализированных центрах. Перечисленные выше варианты хромосомных нарушений исследуются в мире целым набором разнообразных молекулярно-цитогенетических методов. Решающими факторами их эффективности являются точность, быстрота и простота исполнения, а также стоимость. Потребность в использовании таких методов в медико-генетической службе Новосибирской области составляет примерно 2 % от общего количества пациентов. Ежегодно двумя лабораториями области кариотипируется 1500-2000 человек. Для такого количества исследований (3040 в год) вряд ли экономически целесообразно создание самостоятельной молекулярно-

цитогенетической лаборатории. Представляется разумным передача подобных сложных случаев хромосомной патологии в специализированные центры (в г.Томске и г.Москве) или организация дальнейшего сотрудничества с лабораториями Институтов Российской Академии Наук, использующих в своих исследованиях современные методы молекулярно-цитогенетического анализа. Использованные нами методы уточнения первичного цитогенетического диагноза позволили на самом высоком уровне и в кратчайшие сроки установить окончательный диагноз, что дало возможность оптимизировать медико-генетический прогноз. Это позволяет рекомендовать эти методы для использования в вышеуказанных центрах.

ВЫВОДЫ

1. С помощью методов дифференциального окрашивания проведено исследование хромосом 2266 пациентов. Выявлен 191 случай хромосомной патологии, что составило 8,4% от общего числа пациентов. Из них 99 случаев составляют структурные нарушения хромосом. Установлено, что около 44% пациентов, у которых были выявлены структурные аномалии, нуждаются в молекулярной додиагностике.

2. С помощью комплекса молекулярно-цитогенетических методов детально описано 23 различных хромосомных аномалии, в том числе 6 уникальных, не имеющих аналогов в литературе.

3. С использованием методов молекулярной цитогенетики детально охарактеризованы маркерные хромосомы в кариотипе 14 пациентов. Предложен новый метод (FISH IAP- и Alu-ДНК-проб) оценки клинического значения сверхчисленных маркерных хромосом человека. Предложенный метод является более дешевым и простым в исполнении, чем другие методы исследования маркерных хромосом.

4. При использовании методов микродиссекции и обратного пэйнтинга проведена корректировка первичного диагноза двух пациентов с изменением типа хромосомной перестройки.

5. Методами молекулярного анализа проведена идентификация и локализованы точки разрывов при формировании транслокаций у пяти пациентов.

6. На примере анализа инверсии хромосомы 7 проведена оценка разрешающей способности метода многоцветного бэндинга (МСВ) хромосом. Показано, что МСВ на базе двухцветной FISH мало эффективен в случае инверсий размером менее 2 бэндов метафазной хромосомы.

8. Проведена оценка возможностей и ограничений использования различных методов определения хромосомных патологий, позволяющих оптимально проводить диагностику сложных хромосомных аномалий для медико-генетического консультирования.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Саблина О.В., Сосницкая СВ., Гайнер ТА Рубцов Н.Б. Микродиссекционные технологии в диагностике врожденных аномалий хромосом человека: опыт медицинских и научно- исследовательских учреждений. // Материалы научного совета Подпрограммы "Геном человека", сборник отчетов за 2000 год. Москва 2001. С.97.

2. Н.Б.Рубцов, Т.В. Карамышева, В.Г.Матвеева, О.В.Саблина, С.В.Сосницкая, О.ВАндреенкова, ТА Гайнер, М.М.Дегтярева. Обратная IN SITU гибридизация ДНК-зондов аномальных хромосом в диагностике хромосомных патологий. // Генетика. 2001. Т.37. С.1545-1552.

3. Н.Б.Рубцов, Т.В.Карамышева, ТАГайнер. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных патологий человека: возможности и перспективы. // "Генетика человека и патология", Сборник научных трудов, Выпуск 6, Российская Академия Медицинских Наук, Сибирское Отделение, Томский Научный Центр, НИИ Медицинской Генетики, 2002. С. 157-164.

4. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер ТА Сверхчисленные маркерные хромосомы. // Медицинская генетика. 2003. №6. С.248-258.

5. Гайнер ТА, Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Рубцов Н.Б. Молекулярно-цитогенетическая диагностика врожденных хромосомных патологий // Современные диагностические технологии на службе здравоохранения: Сборник научных трудов. Под ред. В.Г. Колоколова, П.Г. Малькова, П.И. Заварзина. Омск: ГУЗ «Омский диагностический центр». 2003. С. 317-318.

6. Гайнер Т.А., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Матвеева В.Г. Диагностика хромосомной патологии: эффективность и возможности ее повышения. // Сборник "Наследственные болезни и патология человека" Новосибирск. 2003. С. 27.

7. Карамышева Т.В., Гайнер Т.А., Матвеева В.Г., Рубцов Н.Б. Диагностика малых сверхчисленных маркерных хромосом человека. // Сборник "Наследственные болезни и патология человека" Новосибирск. 2003. С. 27.

8. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер ТА, Шкляева ОА Анализ маркерных хромосом: ДНК пробы для оценки возможного клинического значения маркерной хромосомы. // Медицинская генетика. 2003. Т.2. №12. С.520-527.

9. Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, ТА Гайнер. "ГЛАВА 6. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и диагностика хромосомных патологий" в книге "Геномика - медицине". Москва. 2005 г. "Академкнига". С. 219-244.

¿2 72 3 1

Подписано к печати 08.12.2004г.

Формат бумаги 60х90. Печ.л. 1. Уч. изд.л. 0,7.

Тираж 100 экз. Заказ 151.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гайнер, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Этапы развития цитогенетики человека.

1.2. Хромосомные аберрации.

1.2.1. Численные хромосомные аберрации.

1.2.2. Структурные хромосомные аберрации.

1.3. Методы цитогенетического анализа.

1. 3.1. Методы дифференциального окрашивания хромосом.

1.3.2. Метод in situ гибридизации нуклеиновых кислот.

1.3.2.1. ДНК-пробы, используемые в гибридизации in situ.

1.3.2.2. Супрессионная гибридизация in situ и обратный пэйнтинг.

1.3.2.3. Интерфазный FISH-анализ.

1.3.2.4. Многоцветная in situ гибридизация.

1.3.2.4.1. M-FISH.

1.3.2.4.2. Спектральное кариотипирование (SKY- Spectral Karyotyping).

1.3.2.4.3. RxFISH.

1.3.2.4.4. Многоцветный бэндинг индивидуальных хромосом (МСВ - Multi Color Banding).

1.3.2.5. Сравнительная геномная гибридизация.

1.3.2.6. Методы идентификации маркерных хромосом.

1.3.2.6.1. AcroM-FISH.

1.3.2.6.2. SubcenM-FISH.

1.3.2.6.3. CenM-FISH.

1.3.2.7. Методы пренатальной цитогенетической диагностики.

1.4. Сравнение возможностей использования различных методов цитогенетического анализа для целей диагностики хромосомной патологии человека.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Получение препаратов метафазных хромосом.

2.1.1. Культивирование лейкоцитов периферической крови.

2.1.2. Фиксация митотических клеток.

2.1.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом для GTG-окрашивания.

2.1.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH.

2.1.5. Приготовление препаратов метафазных хромосом для микродиссекции.

2.2. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом.

2.3. Микродиссекция метафазных хромосом.

2.3.1. Подготовка микропипеток и игл для микродиссекции.

2.3.2. Проведение микродиссекции хромосом.

2.4. Полимеразная цепная реакция с частично вырожденным праймером (degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction - DOP-PCR).

2.5. Мечение ДНК микродиссекционных ДНК - библиотек.

2.6. Получение Cot-2 ДНК из плаценты человека.

2.7. Супрессионная in situ гибридизация.

2.8. Детекция на цитологических препаратах меченых ДНК-проб.

2.8.1. Детекция на цитологических препаратах биотин-16-дУТФ меченых ДНК-проб.

2.8.2. Выявление ДНК-проб, меченых дигоксигенин-11-дУТФ.

2.9. Создание ДНК-пробы, специфичной теломерным повторам всех хромосом человека методом ПЦР.

2.10. Получение ДНК-пробы, специфичной ядрышкообразующим районам всех хромосом человека.

2.11. Получение ДНК-пробы, гомологичной Alu повтору, с помощью ПЦР.

2.12. Получение ДНК-проб, специфичных эухроматиновому материалу хромосом, методом Inter-Alu ПЦР.

2.13. Одновременное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб.

2.14. Многоцветный бэндинг хромосом.

2.15. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Первичный онтогенетический анализ хромосомных аномалий.

3.2. Анализ маркерных хромосом с помощью молекулярно-цитогенетических методов.

3.2.1. Анализ организации маркерных хромосом (MX) микродиссекцией и in situ гибридизацией ДНК-проб, специфичных MX, а также in situ гибридизацией с ДНК пробами, специфичными теломерным повторам и рибосомальной ДНК.

3.2.2. Детекция эухроматиновых районов хромосом человека.

3.2.2.1. ДНК-пробы для выявления эухроматиновых районов.

3.2.2.2. Распределение Alu и LINE1 повторенных последовательностей ДНК в хромосомах человека.

3.2.2.3. ДНК-пробы, основанные на повторенных диспергированных последовательностях.

3.2.2.4. FISH с метафазными хромосомами человека меченного Alu повтора и продукта Inter-Alu-PCR.

3.2.2.5. FISH IАР- и Alu-ДНК-проб с MX человека.

3.3. Анализ делеций с помощью методов микродиссекции и обратного пэйнтинга.

3.4. Анализ транслокаций молекулярно-цитогенетическими методами.

3.4.1. Анализ хромосомных транслокаций с помощью гибридизации с хромосомоспецифичными зондами.

3.4.2. Анализ хромосомных транслокаций методами микродиссекции и обратного пэйнтинга.

3.5. Анализ инверсии хромосомы 7 с помощью многоцветного бэндинга.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация диагностики хромосомных аномалий человека"

Актуальность проблемы. Своевременное проведение хромосомного анализа имеет большое значение для выявления причин возникновения и прогнозирования многих наследственных и врожденных пороков развития. В России в практическом здравоохранении исследования кариотипа проводятся с 1966 года. В лабораториях медицинской цитогенетики для анализа хромосомных аномалий используются классические методы цитогенетического анализа, базирующиеся на дифференциальном окрашивании хромосом. Эти методы позволяют выявлять все численные нарушения и значительную часть структурных хромосомных перестроек, таких как транслокации, инверсии, делеции, а также присутствие в клетках пациентов малых сверхчисленных маркерных хромосом. Однако в ряде случаев разрешающей способности этих методов оказывается недостаточно для успешного проведения диагностики хромосомных аномалий, например, для идентификации метариала малых сверхчисленных маркерных хромосом, для точного определения границ точек разрывов при инверсиях и транслокациях, для определения происхождения дополнительного хромосомного материала при несбалансированных транслокациях. При выявлении подобных случаев сложной хромосомной патологии необходима их передача в специализированные федеральные центры, которые используют молекулярно-цитогенетические методы для уточнения диагноза. Следует отметить, что точный цитогенетический диагноз необходим врачу-генетику для составления правильного медико-генетического прогноза. Современные методы молекулярной цитогенетики позволяют точно описать практически любую хромосомную перестройку. Однако полное и надежное описание хромосомных аномалий может быть получено только при комплексном использовании целого ряда таких методов. Поэтому перед исследователем постоянно стоит вопрос о выборе оптимальной стратегии проведения молекулярной диагностики, а также о ее стоимости. В связи с этим, существует потребность в разработке новых, более дешевых и общедоступных методов молекулярно-цитогенетического анализа. Исследование хромосомных аберраций классическими и молекулярно-цитогенетическими методами в сочетании с подробным описанием клинической картины пациентов дадут возможность более детального изучения известных и описания новых хромосомных синдромов, что необходимо для эффективного медико-генетического консультирования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и адаптация новых методов молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных аберраций и отработка системы взаимодействия обычных диагностических лабораторий с исследовательскими лабораториями для повышения точности и надежности описания хромосомных аномалий при проведении клинической диагностики.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

3. Оценить возможности и ограничения использования различных методов диагностики хромосомных аберраций.

Научная новизна и практическая ценность. В проведенном исследовании предложен и использован новый метод оценки возможного клинического значения сверхчисленных маркерных хромосом. Выявлен и детально описан ряд хромосомных аберраций, в том числе уникальных, не имеющих аналогов в литературе. Определена доля пациентов, имеющих структурные аберрации хромосом и нуждающихся в уточнении диагноза молекулярно-цитогенетическими методами. Предложена и отработана схема эффективного взаимодействия клинических и исследовательских лабораторий при проведении детального анализа хромосомных аномалий. Результаты настоящего исследования используются в медико-генетическом консультировании, пренатальной диагностике. Материалы работы используются в педагогическом процессе в Новосибирской государственной медицинской академии при подготовке и переподготовке врачей различных специальностей и студентов.

Апробация работы. Результаты данного исследования были доложены на следующих конференциях:

Конференция «Генетика человека и патология» (19-21 ноября 2002 г., Томск)

Конференция «Наследственные болезни и патология человека» (23 октября 2003 г., Новосибирск)

Всероссийская научно-практическая конференция «Современные достижения клинической генетики» (25-27 ноября 2003 г., Москва)

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 работ:

1. Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Саблина О.В., Сосницкая С.В., Гайнер Т.А, Рубцов Н.Б. Микродиссекционные технологии в диагностике врожденных аномалий хромосом человека: опыт медицинских и научно- исследовательских учреждений. // Материалы научного совета Подпрограммы "Геном человека", сборник отчетов за 2000 год. Москва 2001. С.97.

2. Н.Б.Рубцов, Т.В. Карамышева, В.Г.Матвеева, О.В.Саблина, С.В.Сосницкая, О.В.Андреенкова, Т.А. Гайнер, М.М.Дегтярева. Обратная IN SITU гибридизация ДНК-зондов аномальных хромосом в диагностике хромосомных патологий. // Генетика. 2001. Т.37. С. 1545-1552.

3. Н.Б.Рубцов, Т.В.Карамышева, Т.А.Гайнер. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомных патологий человека: возможности и перспективы. // "Генетика человека и патология", Сборник научных трудов, Выпуск 6, Российская Академия Медицинских Наук, Сибирское Отделение, Томский Научный Центр, НИИ Медицинской Генетики, 2002. С. 157-164.

4. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер Т.А. Сверхчисленные маркерные хромосомы. // Медицинская генетика. 2003. №6. С.248-258.

5. Гайнер Т.А., Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Рубцов Н.Б. Молекулярно-цитогенетическая диагностика врожденных хромосомных патологий // Современные диагностические технологии на службе здравоохранения: Сборник научных трудов. Под ред. В.Г. Колоколова, П.Г. Малькова, П.И. Заварзина. Омск: ГУЗ «Омский диагностический центр». 2003. С. 317-318.

8. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер Т.А., Шкляева О.А. Анализ маркерных хромосом: ДНК пробы для оценки возможного клинического значения маркерной хромосомы. // Медицинская генетика. 2003. Т.2. №12. С.520-527.

9. Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, Т.А. Гайнер. "ГЛАВА 6. Современные методы молекулярно-цитогенетического анализа и диагностика хромосомных патологий" в книге "Геномика - медицине". Москва. 2005 г. "Академкнига". С. 219244.

Вклад автора. Автор работает врачом-лаборантом-генетиком цитогенетической лаборатории медико-генетического отдела (МГО) Государственного Новосибирского областного клинического диагностического центра (ГНОКДЦ). Ею лично с помощью методов дифференциального окрашивания проведен анализ хромосом пятнадцати из двадцати включенных в данную работу пациентов ГНОКДЦ. Автор принимала участие в планировании и проведении молекулярно-цитогенетических исследований, включая получение ДНК проб и FISH, в микроскопическом анализе результатов FISH и в обсуждении полученных результатов. Исследования проводились на базе цитогенетической лаборатории медико-генетического отдела ГНОКДЦ и лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Гайнер, Татьяна Александровна

выводы

5. Методами молекулярного анализа проведена идентификация и локализованы точки разрывов при формировании транслокаций у пяти пациентов. У одного пациента обнаружена транслокация между половыми хромосомами, что позволило существенно скорректировать прогноз.

7. В 14 из 23 случаев молекулярно-цитогенетической додиагностики уточнение диагноза позволило провести сравнение фенотипа пациентов-носителей сложной хромосомной патологии со сходными случаями, описанными в литературе, что имеет значение для медико-генетического консультирования. 8. Проведена оценка возможностей и ограничений использования различных методов определения хромосомных патологий, позволяющих оптимально проводить диагностику сложных хромосомных аномалий для медико-генетического консультирования.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Присутствие небольших сверхчисленных маркерных хромосом приводит к нарушению баланса входящих в них хромосомных районов. Если это нарушение ограничивается С-гетерохроматиновыми и ЯО-районами, присутствие такой маркерной хромосомы не сказывается на фенотипе пациента. Маркерные хромосомы, представляющие собой изохромосомы по коротким плечам двуплечих хромосом, достаточно просты для идентификации и ассоциированы с развитием хорошо описанных синдромов. В случае присутствия в небольших маркерных хромосомах даже небольшого эухроматинового сегмента велика вероятность формирования врожденных пороков развития. Для наиболее изученных маркерных хромосом, таких как inv dup(15) и inv dup(22), проблема оценки их роли в формировании врожденных пороков развития несколько упрощена, благодаря выявлению и локализации горячих точек хромосомных перестроек, вовлеченных в генерацию этих хромосом. Оценка возможного клинического значения маркерных хромосом, имеющих другое происхождение, значительно осложнена.

Предлагаемый нами метод (FISH IAP- и Alu-ДНК-проб) может быть использован для оценки клинического значения маркерных хромосом.

Методы классической цитогенетики позволяют выявить у пациента несбалансированную транслокацию, однако, как правило, не дают возможности идентифицировать ее. Вопрос о том, трисомия по какому району присутствует у пациента, имеет чрезвычайно важное значение для медико-генетического консультирования. В этом случае необходимо проведение молекулярной додиагностики с использованием 24-цветной FISH или микродиссекции с обратной гибридизацией. Как показывает наш опыт, метод микродиссекции является быстрым и эффективным способом идентификации таких транслокаций.

Этот же метод позволяет идентифицировать делеции. Как показало наше исследование, в ряде случаев использование данного метода позволяет изменить ранг хромосомной перестройки. Выявленная с помощью методов дифференциального окрашивания делеция может оказаться сбалансированной транслокацией. Такое уточнение цитогенетического диагноза может иметь существенное значение для пациента, так как сбалансированные транслокации, в отличие от делеций, как правило, не приводят к существенным нарушениям развития. В то же время, они влияют на репродуктивное здоровье пациента.

Инверсии являются самыми сложными для точной идентификации хромосомными перестройками. Установить точки разрыва при инверсии нельзя ни с помощью 24-цветной FISH, ни методом микродиссекции. Точное установление районов инверсии возможно с помощью МСВ, однако перед исследователем при ипользовании этого метода возникает вопрос о количестве используемых проб и флюорохромов. Как показывает настоящая работа, если инверсия захватывает небольшой район (порядка 1-2 бэндов), то при использовании всего двух флюорохромов изменение образца МСВ выражается лишь в изменении ширины бэндов в районе инверсии. Чтобы обнаружить инвертирование порядка бэндов для подобных инверсий, вероятно, необходимо использование большего количества флюорохромов.

Потребность в использовании таких методов в медико-генетической службе Новосибирской области составляет примерно 2 % от общего количества пациентов. Ежегодно двумя лабораториями области кариотипируется 1500-2000 человек. Для такого количества исследований (30-40 в год) вряд ли экономически целесообразно создание самостоятельной молекулярно-цитогенетической лаборатории. Представляется разумным передача подобных сложных случаев хромосомной патологии в специализированные центры (в г.Томске и г.Москве) или организация дальнейшего сотрудничества с лабораториями Институтов Российской Академии Наук, использующих в своих исследованиях современные методы молекулярно-цитогенетического анализа. Избранные нами методы уточнения первичного цитогенетического диагноза позволили на самом высоком уровне и в кратчайшие сроки установить окончательный диагноз, что дало возможность оптимизировать медико-генетический прогноз. Это позволяет рекомендовать эти методы для использования в вышеуказанных центрах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гайнер, Татьяна Александровна, Новосибирск

1. Доклад научной группы ВОЗ. Борьба с наследственными болезнями. // Женева. 1997.С. 1-129.

2. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека (атлас). // М.:«Медицина». 1982. 263с.

3. Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Шорина А.Р., Рубцов Н.Б. Клинический и молекулярно-цитогенетический анализ редкого случая мозаицизма по частичной моносомии Зр и частичной трисомии 10q у человека. // Генетика. 2001. Т.37, №6. С.811-816.

4. Назаренко С.А., Яковлева Ю.С. Цитогенетика человека и хромосомные болезни. //Под. ред. В.П. Пузырева. Томск: SST. 2001. 84с.

5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. // М: «Наука». 1985. С.241-243.

6. Островерхова Н.В. Молекулярно-цитогенетическая диагностика хромосомной патологии в Томском НИИ медицинской генетики. // Медицинская генетика. 2002. Т.1. №3. С.133-140.

7. Пузырёв В.П. Генетика человека и патология. // Томск. 1997. С. 1-299.10. «Регистр хромосомных болезней человека» (сборник научных трудов). // Под ред. д.м.н. Н.П. Кулешова, к.м.н. И.В. Лурье. Москва. 1984. 220 с.

8. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В. Цитогенетнческая диагностика онкологических заболеваний. // Клиническая онкология и гематология. 2000. №2. С.7-21.

9. Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Гайнер Т.А., Шкляева О.А. Анализ маркерных хромосом: ДНК пробы для оценки возможного клинического значения маркерной хромосомы. // Медицинская генетика. 2003. Т.2. №12. С.520-52.

10. Самнер А.Т. Дифференциальное окрашивание хромосом. // Световая микроскопия в биологии. Методы. М. 1992. С.395-436.

11. Фогель Ф. Мотульски А. Генетика человека. // Изд. «Мир» 1989. С.97-103.

12. Aller V., Albisqueta J.A., Martin М.А., Goday С., D.el Mazo J. A case of trisomy 8 mossaicism 47,XY,+8/46,XX. // Clin. Genet. 1975. V.7. P.232-237.

13. Andrle M, Erlach A, Rett A. Partial trisomy 4q in two unrelated cases. // Hum. Genet. 1979. V.49. №2. P. 179-183.

14. Best RG, Diamond D, Crawford E, Grass FS, Janish C, Lear TL, Soenksen D, Szalay AA, Moore CM. Baboon/human homologies examined by spectral karyotyping (SKY): a visual comparison. // Cytogenet Cell Genet. 1998. V.82. P.83-87.

15. Bicknell D.C., Markie D., Spurr N.K., Bodmer W.F. The human chromosome content in human x rodent somatic cell hybrids analyzed by a screening technique using Alu PCR.//Genomics. 1991. V.10. №1. P.186-192.

16. Bolzer A., Craig J.M., Cremer Т., Speicher M.R. A complete set of repeat-depleted, PCR-amplifiable, human chromosome-specific painting probes. // Cytogenet. Cell. Genet. 1999. V.84. №3-4. P.233—240.

17. Boue J., Barichard F., Deluchat C., Der Sarkissian H., Galano P., Boue A. Diagnostic prenatal des anomalies de la structure chromosomique. 226 observations. // La Nouvelle Presse Medicale. 1981. V. 10. P.3299-3301.

18. Buhler E.M., Btihler U.K., Stalder G.R. et.al. Chromosome deletion and multiple cartilaginous exostoses. // Europ. J. Pediat. 1980. V.133. P.163-166.

19. Camargo M, Cervenka J. Pattern of chromosomal replication in synchronized lymphocytes. 1. Evaluation and application of methotrexate block. // Hum. Genet. 1980. V.54. P.47-53.

20. Caspersson Т., Lomakka G., Zech L. The 24 fluorescence patterns of human metaphase chromosomes distinguishing characters and variability. // Hereditas. 1971. V.67. P.89-102.

21. Cervenka J, Djavadi GR, Gorlin RJ. Partial trisomy 4q syndrome: case report and review. // Hum. Genet. 1976. V.34. №1. P. 1-7.

22. Chaudhary R, Raudsepp T, Guan et al. Zoo-FISH with microdissected arm specific paints for HSA2, 5,6,16, and 19 refines known homology with pig and horse chromosomes. // Mammalian Genome. 1998. V.9. P.44-49.

23. Chen CP, Chern SR, Chang TY, Tzen CY, Lee CC, Chen WL, Lee MS, Wang W. Prenatal diagnosis of de novo terminal deletion of chromosome 7q. // Prenat. Diagn. 2003. V.23. №5. P.375-379.

24. Chudoba I., Plesch A., Loerch Т., et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosmes. // Cytogenet Cell Genet 1999a. V.84. P.156-160.

25. Chudoba I., Senger G., Plesch A., Claussen U. New developments in clinical cytogenetics. // E.C.AS. News Letter. 1999b. N.3. P.3-6.

26. Comings DE, Kavacs BW, Avelino E, Harris DC. Mechanisms of chromosome banding. V. Quinacrine banding. // Chromosoma. 1975. V.50. P.l 15-145.

27. Creasy M.R., Crolla J.A., Alberman E.D. A cytogenetic study of human spontaneous abortions using banding techniques. // Hum. Genet. 1976. V.31. P. 177-196.

28. Cremer Т., Lichter P., Borden J., et al. Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. // Hum Genet. 1988. V.80. P.235-246.

29. Crolla JA, Howard P, Mitchell C, Long FL, Dennis NR. A molecular and FISH approach to determining karyotype and phenotype correlations in six patients with supernumerary marker(22) chromosomes. // Am. J. Med. Genet. 1997. V.72. № 4. P.440—7.

30. Crolla JA, Long F, Rivera H, Dennis NR. FISH and molecular study of autosomal supernumerary marker chromosomes excluding those derived from chromosomes 15 and 22: I. Results of 26 new cases. // Am. J. Med. Genet. 1998. V.75. № 4. P.355—66.

31. De Brackeleer M, Keushnig M, Lin C. A high resoluion C-banding technique. // Canadian. J. Gene. Cytol. 1986. V.28. P.317-322.

32. Drumheller Т., McGillivray ВС., Behrner D. Precise localisation of 3p25 breakpoints in four patients with the 3p-syndrome. // J. Med. Genet. 1996. Oct.33. V.10. P.842-847.

33. Du Manoir S. Speicher MR., Joos S. Et al. Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic hybridization. // Hum Genet. 1993. V.90. P. 590-610.

34. Edelmann L., Pandita R.K., Spiteri E., Funke В., Goldberg R., Palanisamy N.,

35. Chaganti R.S., Magenis E., Shprintzen R.J., and Morrow B.E. A common molecular basis for rearrangement disorders on chromosome 22qll. // Hum. Mol. Genet. 1999. V.8. P.l 157—1167.

36. Edwards J. H., Harnden J.C., Cameron A.H., Crosse V.M., Wolff O.H. A new trisomic syndrome. // Lancet. 1960. V.I. P.787.44. von Eggeling F., Spielvogel H. Applications of random PCR. // Cellular and Molecular Biology. 1995. V.41. № 5. P. 653-670.

37. Evans HJ, Buckton KE, Spowart G, Carothers AD. Heteromorphic X1.chromosomes in 46,XX males: evidence for the involvement of X-Y interchange. // Hum. Genet. 1979. V.49. №1. P.l 1-31.

38. Ford C.E., Hamerton J.L. The chromosomes of man. // Nature. 1956. V.178. P. 1020-1023.

39. Frints SG, Schrander-Stumpel CT, Schoenmakers EF, Engelen JJ, Reekers AB, Van den Neucker AM, Smeets E, Devlieger H, Fryns JP. Strong variable clinical presentation in 3 patients with 7q terminal deletion. // Genet. Couns. 1998. V.9.№1.P.5-14.

40. Gall J. G., Pardue M. L. Molecular hybridisation of radioactive DNA to the DNA of the cytological preparations. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1969. V.64.P.600-604.

41. German J., Archibald R., Bloom D. Chromosomal breakage in a rare and probablygenetically determined syndrome of man. // Science. 1965. V.148. P.506.

42. Giardino D, Finelli P, Russo S, Gottardi G, Rodeschini O, Atza MG, Natacci F, Larizza L. Small familial supernumerary ring chromosome 2: FISH characterization and genotype-phenotype correlation. // Am. J. Med. Genet. 2002. 111. №3.P.319-23.

43. Goetze A., MiBbach D., Beck C., Wieacker P., Stumm M. FISH on unculturedamniocytes is a highly reliable screening method for aneuploidies. // Medgen. 2000. V.12. P.63.

44. Goodpasture С., Bloom S.E. Visualization of nucleolar organizer regions. III. Mammalian chromosomes using silver staining. // Chromosoma. 1975. V.53. P.37-50.

45. Gorski JL, Uhlmann WR, Glover TW. A child with multiple congenital anomalies and karyotype 46,XY,del(14)(q31q32.3): further delineation of chromosome 14 interstitial deletion syndrome. // Am. J. Med. Genet. 1990. V.37. №4. P.471-474.

46. Graf MD, Schwartz S. Molecular approaches for delineating marker chromosomes. // Methods Mol. Biol. 2002. V.204. P.211—8.

47. Guan X.-Y., Meltzer P.S., Cao J., Trent J.M. Rapid generation of region-specific genomic clones by chromosome microdissection: isolation of DNA from a region frequently deleted in malignant melanoma. // Genomics. 1992. V.14. P.680-684.

48. Guan X.-Y., Trent J.M., Meltzer P.S. Generation of band-specific painting probes from single microdissected chromosome. // Hum. Mol. Genet. 1993. V.2. P.l 117-1121.

49. Hatziioannou AG, Krauss CM, Lewis MB, Halazonetis TD. Familial holoprosencephaly associated with a translocation breakpoint at chromosomal position 7q36. // Am. J. Med. Genet. 1991. V.40. №2. P.201-205.

50. Heller A., Starke H., Trivonov V., Rubtsov N. Multicolor banding (MCB) of human chromosomes based on region specific YAC clones and/or microdissection libraries. // Medgen. 2000. V.12. №.1. P.92.

51. Horvath JE, Bailey JA, Locke DP, Eichler EE. Lessons from the human genome: transitions between euchromatin and heterochromatin. // Hum. Mol. Genet. 2001. V.10. №20. P.2215—23.

52. ISCN (1995). An International System for Human Cytogenetic Nomenclature. // Cytogenetic and Cell Genetics. 1995 P. 1-111.

53. Johnston K, Schonberg S, Littman V, Gregory T, Gelbart S, O'Donnell J, Cox DR. De novo X;Y translocation associated with imperforate anus and retinal pigmentary abnormalities. //Am. J. Med. Genet. 1987. V.27. №3. P.603-611.

54. Kakati S., Nihill M., Sinah A. An attempt to establish trisomy 8 sindrome. // Hum. Genet. 1973. V.19. P.293-300.

55. Kim SS, Jung SC, Kim HJ, Moon HR, Lee JS Chromosome abnormalities in a referred population for suspected chromosomal aberrations: a report of 4117 cases. // J Korean Med Sci. 1999. № 14(4). P.373-376.

56. Langer S, Fauth C, Rocchi M, Murken J, Speicher MR. AcroM fluorescent in situ hybridization analyses of marker chromosomes. // Hum. Genet. 2001. V.109. № 2. P. 152—8.

57. Lauristen J.G. Genetic aspects of spontaneous abortion. // 1977. University of Aarhus, Laegeforeninges.

58. Lejeune J., Gautier M., Turpin M.R. Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. // CR Acad. Sci. (Paris). 1959. V.248. P.1721-1722.

59. Lejeune J., Lafourcade J., Berger R., Viallate J., Roeswillwald M., Seringe P., Turpin R. Trois cas de deletion partielle du bras court d'un chromosome 5. // CR Acad. Sci. (Paris). 1963. V. 257. P.3098-3102.

60. Lengauer C., Speicher M.R., Popp S., Jauch A. Chromosomal bar codes produced by multicolor fluorescence in situ hybridization with multiple YAC clones and whole chromosome painting probes. // Hum. Mol. Genetics. 1993. V.2. №.5. P.505-512.

61. Leonard NJ, Harley FL, Lin CC. Terminal deletion of chromosome lOq at band 26.1: follow-up in an adolescent male with high-output renal failure from congenital obstructive uropathy. // Am. J. Med. Genet. 1999. V.86. №2. P.115-117.

62. Lichter P., Cremer Т., Borden J.,Manuelidis L., Ward D.C. Delineation ofindividual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ supression hybridization using recombinant DNA libraries. // Hum Genet. 1988. V.80. P. 224-234.

63. Lukusa T, Fryns JP. Pure distal monosomy 10q26 in a patient displaying clinical features of Prader-Willi syndrome during infancy and distinct behavioural phenotype in adolescence. // Genet. Couns. 2000. V.l 1. №2. P.l 19126.

64. Lundin C, Zech L, Sjors K, Wadelius C, Anneren G. Trisomy 4q syndrome: presentation of a new case and review of the literature. // Ann. Genet. 2002. V.45. № 2. P.53-57.

65. Macville M., Schroeck E., Padilla-Nash h., et al. Comprehensive and definitive molecular cytogenetic characterization of HeLa cells by spectral karyotiping. // Cancer Res. 1999. V.59. P.141-150.

66. Masuno M, Fukushima Y, Sugio Y, Ikeda M, Kuroki Y. Two unrelated cases of single maxillary central incisor with 7q terminal deletion. // Jinrui Idengaku Zasshi. 1990. V.35. №4. P.311-317.

67. Matsui S-I., Sasaki M. Differential staining of nucleous organizers in mammalian chromosomes. //Nature. 1973. V.246. P.148-150.

68. McElreavey K, Cortes LS. X-Y translocations and sex differentiation. // Semin. Reprod. Med. 2001. V.2. P. 133-139.

69. Meltzer P.S., Guan X.-Y., Burgess A, Trent J.M. Rapid generation of region specific probes by chromosome microdissection and their application. // Nature Genet. 1992. V.l.P.24-28.

70. Mertens DJ, De Die-Smulders CE, Kampschoer PH, Offermans JP, Engelen JJ, Hamers AJ, Lammens M, Schrander-Stumpel CT. 14q terminal deletion: prenatal diagnosis in a child with severe congenital anomalies. // Genet. Couns. 2000. V. 11. №4. P.341-346.

71. Meschede D, Exeler R, Wittwer B, Horst J. Submicroscopic deletion in 14q32.3 through a de novo tandem translocation between 14q and 21p. // Am. J. Med. Genet. 1998. V.80. №5. P.443-447.

72. Mewar R, Kline AD, Harrison W, Rojas K, Greenberg F, Overhauser J. Clinical and molecular evaluation of four patients with partial duplications of the long arm of chromosome 18. //Am. J. Hum. Genet. 1993. V.53. № 6. P.1269-1278.

73. Mikelsaar RV, Lurie IW, Ilus ТЕ. "Pure" partial trisomy 4q25-qter owing to a de novo 4;22 translocation. // J. Med. Genet. 1996. V.33. №4. P.344-345.

74. Moorhead P.S., Nowell P.C., Mellman W.J., Battips D.M., Hungerford D.A. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. // Exp. Cell Res. 1960. №20. P.613-616.

75. Moyzis R.K., Torney D.C., Meyne J., Buckingham J.M., Wu J.R., Burks C., Sirotkin K.M., Goad W.B. The distribution of interspersed repetitive DNA sequences in the human genome. // Genomics. 1989. V.4. №3. P.273—289.

76. Mueller S, O'Brien PC, Ferguson-Smith MA., Wienberg J. Cross-species colour segmentating: a novel tool in human karyotipe analysis. // Cytometry. 1998. V.33. P.445-452.

77. Mueller S, Rocchi M, Ferguson-Smith M., Wienberg J. Toward a multicolor chromosome bar code for the entire human karyotype by fluorescence in situ hybridization. // Hum Genet. 1997. V.100. P.271-278.

78. Natarajan A.T., Zwanenburg T.S.B. Mechanisms for chromosomal aberrations in mammalian cells. // Mutation Research. 1982. V.95. P. 1-6.

79. Niebuhr E. Triploidy in man. // Hum. Genet. 1974. V.21. P.103-125.

80. Noweell P.C., Hungerford D.A. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. // Science. 1960. V.132. P.1497.

81. Ohno S., Wolf U. and Atkin N. B. Evolution from fish to mammals by gene duplication. // Hereditas. 1968. V.59. P. 169-187.

82. Ostroverkhova NV, Nazarenko SA, Rubtsov NB, Nazarenko LP, Bunina EN. Characterization of a small supernumerary ring marker derived from chromosome 2 by forward and reverse chromosome painting. // Am. J. Med. Genet. 1999. V.87. № 3. P.217—20.

83. Patau K. The identification of individual chromosomes, especially in man. // Am. J. Hum. Genet. V.12. P.250-276.

84. Petit C, de la Chapelle A, Levilliers J, Castillo S, Noel B, Weissenbach J. An abnormal terminal X-Y interchange accounts for most but not all cases of human XX maleness. // Cell. 1987. V.49. №5. P.595-602.

85. Petit P, Devriendt K, Azou M, Gewillig M, Fryns JP. Terminal deletion of chromosome 10q26: delineation of two clinical phenotypes. // Genet. Couns. 1998. V.9. №4. P.271-275.

86. Philipps ME., Latif F., Prowse A. et al., Molecular genetic anlysis of the 3p-syndrome. // Hum. Mol. Genet. 1994. Jun.3 (6). P.903-908.

87. Pinkel D, Straume T, Gray JW. Cytogenetic analysis using quantitative high sensitivity fluorescence hybridization. // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. V.83. P.2934-2938.

88. Ramser J., Hildman Т., Riesselman L. et al. The complete clone map and gene catalogue of human chromosome 21 open new avenues for molecular medicine and Down Syndrome research. // MedGen. 2000. №1. P.91.

89. Saitoh Y., Laemli U.K. Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly AT-rich Scaffold. // 1994. V.76. P.609-622.

90. Schinzel A. Autosomale Chromosomenaberrationen. // Archiv. filr Genetik. 1979. V.52. P. 1-204.

91. Schinzel A. Catalogue of unbalanced chromosome aberrations in man. // New York. 1984. P.604-639.

92. Schrander-Stumpel C, Schrander J, Fryns JP, Hamers G. Caudal deficiency sequence in 7q terminal deletion. // Am. J. Med. Genet. 1988. V.30. №3. P.757-761.

93. Schroeck E., Manoir S., Veldman T. et al. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. // Science. 1996. V.273. P.494-497.

94. Schroeder T.M., Anschiitz F., Knopp A. Spontane Chromosomenaberrationen bie familiarer Panmyelopathy // Hum. Genet. 1964. V.I. P. 194-196.

95. Speicher M.R., Ballard S.G., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. //Nature Genet. 1996. V.12. P.368-375.

96. Sperling K. Frequency and origin of chromosome abnormalities in man. // In: Obe B. (ed.), Mutation in man. 1984. Spinger, Berlin, Heidelberg, New York. P.128-146.

97. Spruijt L, Van Der Blij-Philipsen M, Engelen JJ, Schrander-Stumpel CT. An adult patient with a distal interstitial 14q deletion: clinical report and literature review. // Genet. Couns. 2000. V.l 1. №4. P.335-340.

98. Stora-de Novion H, Petit C, Raynaud S, Ayraud N. Prenatal diagnosis of a translocation (X;Y) and genetic counseling. // J. Genet. Hum. (Article in French). 1989. V.37. №3. P.263-267.

99. Taysi К, Strauss AW, Yang V, Padmalatha C, Marshall RE. Terminal deletion of the long arm of chromosome 10: q26 to qter. Case report and review of literature. // Ann. Genet. 1982. V.25. №3. P.141-144.

100. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by single degenerate primer. // Genomics. 1992a. V.13.P.718-725.

101. Teo SH, Tan M, Knight L, Yeo SH, Ng I. Pericentric inversion 9-incidence and clinical significance. // Ann Acad Med Singapore. 1995. № 24(2). P.302-304.

102. Thompson MW, Mclnnes RR, Willard HF. Philadelphia. // Genetics in Medicine. 1991.

103. Tjio H.L., Levan A. The chromosome numbers of man. // Hereditas. 1956. V.42. P.l-6.

104. Turleau C, Chavin-Colin F, de Grouchy J. 413 couples with spontaneous abortions. // Eur. J. Obstet .Gynecol. Reprod. Biol. 1979. V.9(2). P.65-74.

105. Van Dilla M.A., Deaven L.L.,et al., Human chromosome-specific DNA libraries: Construction and availability. // Biotechnology. 1986. V.4. P.537-552.

106. Verma R.S., Babu A. Human chromosomes. Principles and techniques. // New York. 1994. P.72-172.

107. Waggoner DJ, Chow CK, Dowton SB, Watson MS. Partial monosomy of distal lOq: three new cases and a review. // Am. J. Med. Genet. 1999. V.86. №1. P.l-5.

108. Wandstrat AE, Schwartz S. Isolation and molecular analysis of inv dup(15) and construction of a physical map of a common breakpoint in order to elucidate their mechanism of formation. // Chromosoma. 2000. V.109. № 7. P.498—505.

109. Waterston R.H., Lander E.S., Sulston J.E. On the sequencing of the human genome. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V.99. №6. P.3712—3716.

110. Webb T, Hardy CA, King M, Watkiss E, Mitchell C, Cole T. A clinical, cytogenetic and molecular study of ten probands with supernumerary inv dup (15) marker chromosomes. // Clin. Genet. 1998. V.53. № 1. P.34—43.

111. Weisblum B. de haseth PI. Nucleotide specificity of the quinacrine staining reaction for chromosomes. // Chromosomes Today. 1973. V.4. P.35-51.

112. Wilson W.G., Shan H., Wyandt H.E. Intertitial deletion of 8q in a patient with multiple exostoses and developmental delay. // Am. J. Hum. Genet. 1981. V.33. P.96.

113. Wright F.A., Lemon W.J., Zhao W.D., Sears R., Zhuo D., Wang J.P., Yang H.Y., Baer Т., Stredney D., Spitzner J., Stutz A., Krahe R., Yuan B. A draft annotation and overview of the human genome. // Genome Biol. 2001. V.2. №7. P. 1-18.

114. Wu KH, Yu MT, Tsai FJ, Peng CT, Tsai CH. Monosomy of chromosome 10q26 with mild psychomotor retardation: report of one case. // Acta Paediatr. Taiwan. 2002. V.43. №3. P.153-156.

115. Yen PH, Tsai SP, Wenger SL, Steele MW, Mohandas TK, Shapiro LJ. X/Y translocations resulting from recombination between homologous sequences on Xp and Yq. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1991. V.88. №20. P.8944-8948.

116. Yokoyama Y., Ohsugi K., Kozaki Т., SakuragawaN. Microdissection-mediated selection of chromosome region-specific cDNAs. // Cytogenet. Cell Genet. 1997. V.77. №3-4. P.192—196.

117. Yunis JJ. New chromosome techniques in the study of human neoplasia. // Hum. Pathol. 1981. V.12. P.540-549.

118. Yunis JJ., Sawyer JR., Ball DW. The characterization of high resolution G banded chromosomes of man. // Chromosoma. 1978. V.67. P.293-307.

Информация о работе

Гайнер, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.15

Диссертация

Оптимизация диагностики хромосомных аномалий человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы