Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метафазная сравнительная геномная гибридизация в диагностике хромосомного дисбаланса

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Метафазная сравнительная геномная гибридизация в диагностике хромосомного дисбаланса"

На правах рукописи

Миньженкова Марина Евгеньевна

МЕТАФАЗНАЯ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНОМНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ ХРОМОСОМНОГО ДИСБАЛАНСА

03.02.07 «генетика»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2014

6 НОЯ 2014

005554573

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Кандидат медицинских наук Шилова Надежда Владимировна

Официальные оппоненты:

Жученко Людмила Александровна, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Московской области, заведующая медико-генетическим отделением.

Жилина Светлана Сергеевна, кандидат медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, доцент кафедры неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 8 декабря 2014г. в 14 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1; www.med-gen.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан «Л октября 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор ^ Зинченко Рена Абульфазовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования

Метод анализа дифференциально окрашенных хромосом является «золотым стандартом» в диагностике хромосомных болезней. Однако при использовании этого метода возможна диагностика хромосомных аномалий (ХА) размером 10 и более миллионов пар нуклеотидов (м.п.н.) (Shevell М. et al., 2008). Такая чувствительность не позволяет диагностировать микроделеции и микродупликации, являющиеся в отдельных случаях причиной умственной отсталости, множественных врожденных аномалий и пороков развития. Некоторые микроделеционные синдромы могут быть клинически заподозрены и диагностированы FISH-методом с использованием таргетных локус-специфичных ДНК-зондов (Knight S. et al., 1999; Ranvan J. et al., 2006). Ho подавляющее большинство микрохромосомных перестроек не выявляются при таком направленном, таргетном, подходе. Эффективность диагностики повышается с использованием другого высокотехнологичного молекулярно-цитогенетического метода, позволяющего провести скрининг всего генома в одной реакции - метода сравнительной геномной гибридизации (CGH — Comparative Genomic Hybridization), который обозначают также как молекулярное кариотипирование (Kirchhoff М., 2008; Nowakowska В., 2008; Bartnik М., 2014). Использование метода молекулярного кариотипирования является актуальным не только в диагностике микрохромосомных перестроек, но и в тех случаях, когда методом стандартного цитогенетического исследования невозможно идентифицировать хромосомную перестройку.

Помимо возможности анализа генома в одном эксперименте, преимуществом метода молекулярного кариотипирования является и то, что для проведения анализа не требуется наличия живых, делящихся клеток, нет необходимости в приготовлении хромосомных препаратов пациента, поэтому анализ возможно провести на любом материале, из которого можно выделить ДНК (Kallioniemi А., 1992; Kallioniemi OP., 1993). Это особенно актуально в случаях внутриутробной гибели плода, когда использование метода CGH позволяет определять хромосомный дисбаланс при исследовании образцов ДНК, которые можно получить из любой, доступной для анализа, ткани плода (Kirchhoff М., 1998; Миньженкова М.Е., 2014).

Метод метафазной CGH основан на количественном сравнении результатов конкурентной гибридизации двух образцов ДНК, меченых различными флуорохромами - ДНК нормального индивидуума (контрольной) и ДНК пациента (опытной) с ДНК на хромосомном препарате индивидуума с нормальным кариотипом (Kallioniemi А., 1992). При анализе цифрового изображения хромосом с помощью специальных компьютерных программ оценивается соотношение интенсивностей флуоресцентных сигналов при

гибридизации референсной и опытной ДНК вдоль каждой хромосомы, что графически отображается в виде профиля гибридизации (ПГ). Для оценки ПГ используются установленные фиксированные интервалы (ФиксИ). Многочисленные исследования показали, что чувствительность выявления хромосомных аномалий при использовании ФиксИ составляет 10-12 и более м.п.н. и является недостаточной по сравнению с FISH и даже со стандартным анализом кариотипа, что позволяет применять его лишь при диагностике достаточно крупных хромосомных перестроек (Weiss М., 1999; Nowakowska В., 2008). Возможности стандартной, базовой, компьютерной программы анализа изображений CGH предполагают активацию опции сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения (High Resolution Comparative Genomic Hybridization - HR-CGH) на основе создания собственных стандартных референсных интервалов (СтРИ) (Kirchhoff М., 1998, 2000). Эти интервалы создаются для каждой пары хромосом и строятся на интегрированных результатах анализа изображений последовательных гибридизаций с мечеными ДНК, полученными от индивидуумов с нормальным кариотипом (гибридизация «норма на норму»). В результате создается собственная база индивидуальных ПГ для каждой хромосомы, что позволяет автоматически создать новые, более узкие по сравнению с фиксированными, стандартные референсные интервалы, индивидуальные для каждой пары хромосом. Предполагается, что проведение анализа высокого разрешения CGH позволит увеличить чувствительность и специфичность выявления хромосомных аномалий.

Степень разработанности темы исследования

Метод CGH, особенно aCGH (Array Comparative Genomic Hybridization -микроматричная сравнительная геномная гибридизация) широко применяется в диагностике геномного дисбаланса во многих странах Европы и Америки, являясь скрининговым методом для выявления ХА у пациентов с умственной отсталостью (УО) и врожденными пороками развития (ВПР) (Gijsbers А., 2009; Bartnik М., 2014). К сожалению, В Российской Федерации, этот метод практически не используется. Имеются отдельные, в основном обзорные, сообщения по использованию метода CGH в клинической цитогенетике (Островерхова Н.В., 2002). Тем не менее, метод метафазной CGH в силу своих диагностических возможностей и экономической целесообразности, мог бы найти широкое применение в повседневной цитогенетической практике.

Проблемам повышения эффективности выявления ХА при использовании метода метафазной CGH посвящены только исследования зарубежных авторов. В этих работах заложены фундаментальные основы анализа HR-CGH в онкологии и клинической цитогенетике (Kirchhoff М., 1998, 2000, 2004). Поэтому в нашей работе особое внимание будет уделено активации функции

анализа высокого разрешения — HR-CGH и оценке эффективности выявления хромосомного дисбаланса методом метафазной CGH. В Российской Федерации данной теме посвящена первая диссертационная работа.

Цель исследования:

Основной целью данного исследования явилась оптимизация метода метафазной сравнительной геномной гибридизации для проведения анализа высокого разрешения (HR-CGH) и оценка возможностей метафазной CGH в диагностике хромосомного дисбаланса.

Задачи исследования:

1. Определить оптимальные условия культивирования лимфоцитов и подготовки хромосомных препаратов - стандартизованной «платформы» для достижения интенсивной равномерной гибридизации на хромосомах при проведении метафазной CGH.

2. Сформировать собственные стандартные референсные интервалы (СтРИ) для проведения HR-CGH на основе анализа результатов серии последовательных гибридизаций с мечеными образцами ДНК, полученными от индивидуумов с нормальным кариотипом (гибридизация «норма на норму»),

3. Определить разрешающую способность метафазной HR-CGH при исследовании образцов ДНК с хромосомными аномалиями известного размера.

4. Сравнить эффективность выявления хромосомных аномалий методом метафазной CGH при использовании для анализа базовых фиксированных интервалов и собственных стандартных референсных интервалов.

5. Провести сравнительный анализ различных методов диагностики хромосомных аномалий при репродуктивных потерях и разработать алгоритм молекулярно-цитогенетического исследования материала плода с использованием метода метафазной CGH для наиболее эффективного выявления геномного дисбаланса при внутриутробной гибели плода на ранних этапах эмбриогенеза.

6. Оценить возможность дополнительного выявления хромосомного дисбаланса при использовании метода HR-CGH в группе пациентов с умственной отсталостью, аномалиями развития и нормальным кариотипом, ранее установленным при стандартном цитогенетическом исследовании.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в РФ в данной работе выполнено активирование опции анализа высокого разрешения метафазной сравнительной геномной гибридизации на основе создания собственных СтРИ для программного обеспечения LUCIA CGH. Впервые, при проведении сравнительного анализа эффективности выявления хромосомного дисбаланса методом CGH при использовании ФиксИ

и собственных СтРИ, индивидуальных для каждой хромосомы, установлено, что метод HR-CGH обладает более высокой чувствительностью и специфичностью. Впервые в РФ метод HR-CGH использован для диагностики ХА, не выявленных при стандартном цитогенетическом исследовании, у пациентов с умственной отсталостью, аномалиями фенотипа и/или врожденными пороками развития, показавший более высокую выявляемость (дополнительно выявлено 20,5%). Впервые разработан оригинальный алгоритм исследования абортивного материала при репродуктивных потерях, позволяющий повысить эффективность диагностики геномного дисбаланса у плода.

Методология и методы исследования

Для проведения исследования в работе использованы различные методы диагностики хромосомных аномалий. Анализ кариотипа пациентов проводили стандартным цитогенетическим методом (GTG-окрашивание). Молекулярно-цитогенетические исследования выполняли с использованием методов FISH и метафазной CGH. Для проведения молекулярного кариотипирования использовали молекулярно-генетический метод - aCGH.

Положения, выносимые на защиту

1. Создание оптимальной «платформы» для CGH как эквивалента матрицы является необходимым и ключевым этапом, повышающим качество и эффективность метафазной сравнительной геномной гибридизации, позволяющим достигнуть стабильных, достоверных результатов исследования.

2. Анализ высокого разрешения (HR-CGH) с использованием СтРИ, созданных на основе собственной базы данных контрольных ПГ, позволяет диагностировать хромосомный дисбаланс размером 4 и более м.п.н.

3. При сравнительной оценке эффективности выявления хромосомного дисбаланса методом метафазной CGH на основе использования базового варианта программы и варианта с активированной опцией анализа высокого разрешения определено, что HR-CGH с полученными СтРИ является более чувствительным и специфичным, чем CGH с установленными ФиксИ.

4. Метод метафазной CGH позволяет эффективно выявлять хромосомный дисбаланс при репродуктивных потерях и у пациентов с умственной отсталостью, аномалиями фенотипа и/или врожденными пороками развития.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Достоверность полученных результатов подтверждена верификацией данных различными диагностическими методами: цитогенетическим — GTG-метод, молекулярно-цитогенетическим - FISH-исследование с различными ДНК-зондами, молекулярным - aCGH. Результаты работы соответствуют данным, представленным в отечественной и зарубежной литературе.

Изложенные в диссертационном исследовании положения, выводы и рекомендации являются достоверными.

Результаты, отражающие основные этапы диссертационной работы, представлены в виде устных докладов на конференциях молодых ученых: на IX научной конференции «Генетика человека и патология: актуальные проблемы современной цитогенетики» (г. Томск, 2011г.); на конкурсе молодых ученых в ФГБУ «МГНЦ» РАМН (I место - г. Москва, 2012г.); в виде стендовых сообщений на 9-й европейской цитогенетической конференции ЕСА (г. Дублин, 2013г.), а также опубликованы в виде тезисов на ежегодных европейских генетических конференциях ESHG (2012-2014 гг.), и на 8-й и 9-й европейской цитогенетической конференции ЕСА (2011г., 2013г.), на конкурсной конференции молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН (г. Москва, 2012г.). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара ФГБУ «МГНЦ» РАМН 17 сентября 2014 года.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования явились образцы ДНК (п=226), выделенные из периферической крови здоровых мужчин с нормальным кариотипом (п=113), пациентов с различными хромосомными аберрациями известного размера (п=19), пациентов с умственной отсталостью, аномалиями развития и нормальным кариотипом при стандартном цитогенетическом исследовании (п=34), а также из клеток ворсин хориона плодов, внутриутробно погибших на ранних этапах эмбриогенеза (п=60). Геномная ДНК во всех образцах получена путем химической экстракции фенол-хлороформом с использованием протеиназы К по стандартному протоколу как из свежей, так и из замороженной крови.

Анализ кариотипа пациентов проводили на препаратах метафазных хромосом лимфоцитов периферической крови, культивируемых in vitro в соответствии со стандартной методикой (GTG-анализ). Анализ кариотипа плодов при неразвивающейся беременности проводили из клеток ворсин хориона на «прямых» и «полупрямых» препаратах по стандартному протоколу.

Для культивирования Т-лимфоцитов периферической крови с целью получения растянутых метафазных хромосом использовали метод синхронизации культуры лимфоцитов периферической крови метотрексатом с набором «Cell Synchronization Kit» по протоколу производителя (Biological Industries, Израиль). Ингибирование процесса конденсации хромосом бромистым этидием проводили по соответствующему протоколу (Ikeuchi Т., 1984). Приготовление культуры лимфоцитов с использованием питательной среды RPMI-1640(T) с тимидином в концентрации 0,1 мг/мл проводили в соответствии со стандартным протоколом (Hungerford, 1965). Хромосомные

s

препараты, отобранные для гибридизации и предварительно выдержанные при комнатной температуре в течение 2-5 суток, фиксировали 1% раствором формальдегида в PB S при +4°С, дегидратировали в серии спиртов (70, 85, 100%) и хранили при -20°С. ДНК на хромосомном препарате денатурировали в растворе 70 % формамид / 2><SSC, при 75°С в течение 5 мин и дегидратировали в серии спиртов (70, 85, 96 %).

ДНК пациента (опытная) и референсная ДНК (контрольная) мечены в реакции ник-трансляции с SpectrumGreen dUTP и SpectrumRed dUTP соответственно с использованием Nick Translation Reagent Kit по протоколу фирмы производителя (Abbott Molecular, США). Реакцию гибридизации и постгибридизационную отмывку проводили по протоколу фирмы производителя (Abbott Molecular). Для контрокрашивания хромосом использован DAPI I (Abbott Molecular) в растворе Vectashield (Vector Labs) в соотношении 1:20.

Для анализа изображений метафазных хромосом использована программа обработки изображения «LUCIA CGH», установленная в комплексе с эпифлуоресцентным микроскопом «Eclipse 90i» (Nikon) и CCD камерой «ProgRes MF» (JENOPTIK). В каждом случае проанализировано 15-20 метафазных пластинок.

FISH-исследование проводили с соответствующими ДНК-зондами по протоколам фирм-производителей (Abbott Molecular, США; MetaSystems, Германия; Kreatech, Нидерланды).

ArrayCGH проводили на платформе «Affymetrix» в соответствии с протоколом производителя - Applied Biosystems. Анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Chromosome Analysis Suite (ChAS) (версия 2.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оптимизация протокола приготовления хромосомных препаратов ~ «платформы» для CGH Многоэтапность метода CGH и значительное количество мануальных процедур, требуют унификации и стандартизации протоколов исследования на каждом этапе. Показано, что эффективность гибридизации при CGH в значительной степени зависит от качества хромосомных препаратов, на которых происходит гибридизация in situ опытной и контрольной ДНК (du Manoir S., 1995; Karhu R., 1997). Исходя из того, что хромосомный препарат для метафазной CGH является своеобразной «платформой», эквивалентом матрицы, используемой для проведения array-CGH, необходимо максимально стандартизовать условия получения оптимальных для гибридизации препаратов метафазных хромосом. Основными критериями качества хромосомных препаратов для CGH являются наличие достаточного количества метафазных

пластинок с хорошим разбросом, минимальным количеством наложений хромосом друг на друга и одинаковой степенью конденсации хромосом на уровне 400-550 бэндов на стекле. Для получения хромосомных препаратов, отвечающих этим критериям, провели серию экспериментов с использованием различных протоколов культивирования Т-лимфоцитов периферической крови от мужчин с нормальным кариотипом (Табл. 1). Оптимальным оказалось культивирование Т-лимфоцитов в питательной среде с тимидином в концентрации 0,1 мг/мл, что позволило получить хромосомные препараты, отвечающие всем вышеперечисленным критериям.

Таблица 1. Сравнительная оценка хромосомных препаратов, полученных при использовании различных методов культивирования периферической крови.

Метод культивирования Кол-во культур Митотический индекс (М1)* Среднее кол-во метафаз** в препарате Среднее кол-во наложений хромосом в метафазе

1 Синхронизация клеточного цикла метотрексатом 15 высокий Менее 15 Более 4

2 Ингибирование конденсации хромосом бромистым этидием 11 высокий Менее 5 Менее 2

3 ЯРМ1-1640 с тимидином (0,3 мг/мл) 20 низкий Менее 10 Менее 2

4 ЯРМЬ1640/ЯРМ1-1640 с тимидином (0,1 мг/мл) 20 высокий Более 20 Менее 2

Примечание: *Митотический индекс оценивали по формуле М1 = ————— X 10 0%, где (Р+М+А+Т) - сумма клеток, находящихся на стадии

N

профазы, метафазы, анафазы и телофазы; N - общее число проанализированных клеток; М1 < 10% - низкий митотический индекс; М1 > 15% - высокий митотический индекс (Прохорова И.М, 2003); **Метафазные пластинки с хорошим разбросом и одинаковой степенью конденсации на уровне 400-550-бэндов.

Между тем, оптимальные характеристики хромосомного препарата, оцененные при микроскопировании, не всегда гарантируют успешный результат последующей гибридизации. Не только качество хромосомного препарата, но и морфологическая характеристика самих хромосом влияет на эффективность гибридизации. Устойчивость хромосом к воздействию высоких температур при денатурации вариабельна и может быть оценена при проведении денатурирующего теста (денатурация 5 минут при 75°С).

Обеспечение сохранности морфологии хромосом после денатурации важно как для идентификации хромосом и их раскладки, так и для качественной равномерной гибридизации. Первым признаком сверхденатурации считается появление С-сегментации на хромосомах. В этом случае гибридизация на хромосомах проходит избирательно, в районах структурного гетерохроматина, наиболее устойчивого к воздействию высоких температур. Для повышения устойчивости хромосом проводили дополнительный этап постфиксации в 1% растворе формальдегида, что позволило воспризводимо получать равномерную и одинаково интенсивную гибридизацию по всей длине хромосом. Таким образом, условиями стандартизации «платформы» для проведения метафазной CGH являются культивирование лимфоцитов периферической крови с использованием питательной среды с тимидином в концентрации 0,1 мг/мл, постфиксация хромосом на препарате и проведение денатурирующего теста.

Получение стандартных референсных интервалов

и определение разрешающей способности HR-CGH

Для повышения разрешающей способности метафазной сравнительной геномной гибридизации обязательным требованием является формирование собственной базы данных контрольных ПГ. Это необходимо для получения СтРИ в условиях конкретной лаборатории. Очевидно, что чем точнее будет референсный интервал, тем более высокой будет его информативность и вероятность того, что те или иные отклонения будут интерпретированы правильно. Проведено 26 реакций гибридизации образцов ДНК здоровых индивидуумов с нормальным кариотипом, «норма на норму», на основе чего сформирована база данных, состоящая из 12 567 контрольных ПГ. Полученный профиль, индивидуальный для каждой хромосомы, суммарно состоял из более чем 500 ПГ. На основе этой базы данных автоматически сформированы собственные СтРИ (Рис. 1) и таким образом активирована опция анализа высокого разрешения HR-CGH.

Для определения разрешающей способности метода HR-CGH на основе использования собственных СтРИ проанализировано 14 образцов ДНК с ХА известного размера, установленными методом array CGH (Табл. 2). Размеры хромосомного дисбаланса варьировали от 2,5 до 12,5 м.п.н.

В программе LUCIA CGH при работе с активированной функцией HR-CGH изначально предусмотрены три варианта изменчивости интервалов, в которых с различной вероятностью (99%; 99,5%; 99,9%) границы интервалов опытного образца будут находиться в пределах границ СтРИ. С целью выбора оптимального варианта для СтРИ проанализированы 12 образцов ДНК (случай 1-12 в табл. 2).

Рисунок 1. Стандартные референсные интервалы, созданные на собственной базе данных ПГ из реакций гибридизаций «норма на норму».

Таблица 2. Результаты исследования образцов ДНК с ХА известного размера.

№ ХА Размер ХА (м.п.н.) Результат aCGH Результат HR-CGH

1 dup(8)(p23.1р23.3) 12,5 arr 8p23.1р23.3 (47,173- 12,563,114)x3 ish cgh enh (8)(p21.3p23.3)

2 del(ll)(q24.2q25) 10,0 arr Ilq24.2q25 (124,788.546-134.938,470)x3 ish cgh dim (Il)(q24.2q25)

3 del(9)(p22.3p24.1) 8,7 arr 9p22.3p24.1 (6.175,268-14,846,752)xl ish cgh dim (9)(p22.3p24.1)

4 del(4)(pl6.1pl6.3) 8,6 arr 4pl6. Ipl6.3 (68,345-8,73 l,855)xl ish cgh dim (4)(p 16.1 p 16.3)

5 del(15)(q24. Iq25.2) 8,1 arr 15q24.1q25.2 (74,752,122-82,864,275)xl ish cgh dim (15)(q24.1q25.2)

6 del( 10)(q26.2q26.3) 7,7 arr 10q26.2q26.3 (127,708,904-135,427,143)xl ish cgh dim (10)(q26.2q26.3)

7 dup(15)(qll.2ql3.I) 5,7 arr 15ql 1,2q 13.1 (22,770,421-28,545,355)x3 ish cgh enh (15)(q 11.2ql3.1)

8 del(15)(ql 1.2ql3.1) 5,3 arr 15ql 1.2ql3.1 (23,288.374-28,644,578)xl ish cgh dim (15)(qll.2ql2)

9 del(13)(q33.3q34) 5,2 arr 13q33.3q34 (109,926,221-115,107,733)xl ish cgh dim (13)(q33.3q34)

№ ХА Размер ХА (м.п.н.) Результат аСвН Результат НЯ-СОН

10 ёе1(15)(я11.2я12) 5,0 агг15я11.2я13 (22,969,245-28,013,866)х1 ¡эЬ С£Ь Шга (15)(я11.2д12)

11 с!ир(7)(я36.1я36.3) 4,7 агг 7я36.1я36.3 (151,838,447-156,528,807) хЗ ¡эИ cgh епИ (7)(я36.1я36.3)

12 deK8Kq21.llq21.12) 4 агг 8q21.llq21.12 (74,462,982-78,505,952) х1 ¡эИ cgh сИт (8Kq21.llq21.12)

13 с1е1(15)(я25.2) 2,7 агг 15ц25.2 (83,083.418-85,786,847) х1 N

14 с!е1(22)(Ч11.21) 2,5 агг 22ql 1.21 (18,916,842-21,465,659) х1 N

На рис. 2 представлен фрагмент результатов анализа. При использовании СтРИ (99%) появлялись ложноположительные результаты в виде множества артефактных ХА, а в случае использования для анализа СтРИ (99,9%) -ложноотрицательные результаты, где ХА не выявлены вовсе. И только при анализе с использованием СтРИ (99,5%) ХА идентифицированы корректно, в соответствии с результатами аггауСвН и не сопровождались появлением ложноположительных результатов.

■ ■ Е-ПГ с л : ^ ) С : ■ 1 )( в Ь 1

■ ■ 1 ; г ■ в 8 1 я : I ■ т а Г и

Д> - ■

-; КИЖ ■ .1 : __ 11 о_

А.

11 Е 3 1 Ь 1

Т -- : 1

щ • г!

В.

Рисунок 2. Фрагмент анализа НЯ-СйН образца с ёе1(10)(ц26.2я26.3) размером 7,7 м.п.н. с использованием различных СтРИ. А - СтРИ (99%). Б - СтРИ (99,5%). В - СтРИ (99,9%).

Таким образом, применение доверительных интервалов (99,5%) оказалось наиболее оптимальным для поиска несбалансированных хромосомных

аномалий. Поэтому в HR-CGH для дальнейшего анализа образцов использовали СтРИ (99,5%). Как видно из представленных в табл. 2 данных, метод HR-CGH позволяет диагностировать хромосомный дисбаланс размером 4 м.п.н. и более.

Сравнительный анализ эффективности выявления хромосомных аномалий методом метафазной CGH при использовании ФиксИ и СтРИ

Для сравнительной оценки эффективности выявления ХА методом метафазной CGH при использовании ФиксИ, установленных в программе LUCIA CGH и СтРИ, сформированных на основе собственной базы данных контрольных ПГ, проанализированы 9 образцов ДНК с известными ХА, ранее идентифицированными различными молекулярно-цитогенетическими методами (Табл. 3). Как видно из представленных в таблице 3 данных, в случаях с хромосомным дисбалансом размером менее 11 м.п.н. при анализе CGH с ФиксИ ХА не выявлены.

Таблица 3. Сравнительная оценка эффективности выявления ХА.

№ Хромосомные аномалии Методы исследования Размер ХА, м.п.н

GTG CGH Идентификация/ верификация

ФиксИ (0,75:1,25) СтРИ 99,5%

1 del(18) (q2I.33q33) 46,XY,del(18) (q21.3-qter) dim( 18) (q21.33q33) dim(8)(q21.33q33) FISH 23

2 del(5) (р 14.3p 15.33) 46,XX, dei(5) (pl4-pter) dim(5) (pl4.3pl5.33) dim(5) (pl4.3p 15.33) FISH 18

3 dup(IO) (q24.2q26.3) 46,XX,add( 10) (q26)? enh(10) (q24.2q26.3) enh(10) (q24.2q26.3) FISH 14

4 dup(8)(p23.1p23.3) del(4)(pl6. Ipl6.3) 46,XY enh(8)(p21.3p23.3) N enh(8)(p21.3p23.3) dim(4)(pl6.1pl6.3) aCGH 12,5 8,6

5 dup( 15) (q22.1q24) 46,XY, add(15)(q26)? N enh( 15)(q22. Iq24) FISH 11

6 del(ll) (q24.2q25) 46,XX N dim( 11)(q24.2q25) aCGH 10

7 del(15) (q24. Iq25.2) 46,XX N dim( 15) (q24.1q25.2) aCGH 8.1

8 de 1( 10) (q26.2q26.3) 46,XY N dim(10) (q26.2q26.3) aCGH 7,7

9 del( 15) (ql 1.2ql2) 46,XX N dim(15)(ql 1.2 q 12) FISH 5

Очевидно, что разрешающая способность метода повышается при использовании более узких, чем ФиксИ, СтРИ. В программе LUCIA CGH существует возможность изменить фиксированные интервалы с границами

(0.75:1.25) на интервалы с границами (0.95:1.05). Механическое сужение ФиксИ позволяет обнаруживать хромосомный дисбаланс более мелкого размера в виде множества артефактных ХА, что существенно снижает специфичность метода и делает некорректным последующий анализ и интерпретацию полученных результатов. На рис. 3 представлен фрагмент результатов сравнительного анализа CGH образцов ДНК с ХА размером менее 11 м.п.н. при использовании ФиксИ с границами детекции (0.75:1.25) и (0.95:1.25) и СтРИ (99,5%). Таким образом, оптимальными для анализа хромосомного дисбаланса размером менее 11 м.п.н. являются СтРИ (99,5%).

Хромосомы dcUI 1 Хч-4 -Ч-Я 10 ч п.и drl(10.Kq26 :q:6.3) 7,7 М П м dcl(15Kqll 3ql3> 5 U ПН

ФиксИ СтРИ (99.5".> Фикс! I СтРИ (99.5®«) ФиксИ СтРИ (99.5-,)

о."< 1 0.951 0? 0.75:1.25 0.95:1 05 öl? 1 ;5 0.95:1 05

в 1 / V 1

а h —4>

9" \ 1 |

■ 10' I г Г* , j 1 I i 1

к ! 11- j 1 1 Г С ш= ( ' ( ' ( ^ ( )| i

i 1 \ ~1Г ■ \ 1 i

■ 13: 1 ) Р

а 1.1- Г' ' "f f; | - | 1 ;

\ ' 1 --} ) ! f

В |4- 1 ' ! ч J

Б 15 = ?1 1 i 1 / : 1 1 V ]

Рисунок 3. Фрагмент сравнительного анализа ССН образцов ДНК с ХА размером менее 11 м.п.н. при использовании ФиксИ с границами детекции (0.75:1.25) и (0.95:1.25) и СтРИ (99,5%).

Примечание: Рамками обозначены делеции, установленные на аггауССН.

Метафазная CGH в диагностике хромосомного дисбаланса при внутриутробной гибели плода на ранних этапах эмбриогенеза Для оценки эффективности выявления ХА при репродуктивных потерях проведено исследование 60 образцов хориона тремя диагностическими методами: стандартное кариотипирование, FISH на интерфазных ядрах и метафазная CGH (Табл. 4).

Таблица 4. Результаты стандартного цитогенетического и молекулярно-цитогенетических исследований: интерфазной FISH и метафазной CGH._

№ Кариотип FISH CGH

1-9 46,XX XX N

10-21 46,XY XY N

22 48,XY,+2,+ D XY,+ 13 +2,+13

23 46,XX,der(D;D),+ D XX,+ 13 +13

24 47,ХХ,+ D XX +15

25-26 47,XY,+ 16 XY +16

27 47,XX,+ 18 XX.+ 18 +18

28 45,X Моносомия X Моносомия X

29 46,XX Моносомия X,+ 18 Моносомия X,+ 18

30-35 — XX N

36-43 - XY N

44 - XX +2

45 - XY +7,+8

46-47 - XY + 15

48 — XX + 15

49 - XX,+21 + 15,+21

50 - XY + 16

51 — XY + 18

52 - XY,+21 +21

53-54 - XX,+21 +21

55 - XX +22

56 - Моносомия X Моносомия X

57-59 - Триплоидия, XXY N

60 — Триплоидия, XXX N

Примечание: N - геномный дисбаланс не обнаружен.

«—» - Цитогенетическое исследование не удалось провести из-за отсутствия митозов.

Хромосомная патология выявлена в 41,6% случаев (25/60). Стандартным подходом в диагностике хромосомного дисбаланса при неразвивающейся беременности является исследование кариотипа плода, при котором определили только 28% (7/25) случаев с ХА. Еще одним стандартным подходом является проведение Р18Н-анапиза на интерфазных ядрах с набором ДНК-

зондов для детекции наиболее частых анеуплоидий у плода, при котором диагностировали 56% (14/25) случаев с ХА. Но так как этот метод является таргетным, ограниченным используемыми ДНК-зондами, его самостоятельное применение является нецелесообразным. Наиболее эффективным оказался метод CGH, который позволил определить хромосомный дисбаланс в 84% (21/25) случаев, однако случаи триплоидии не диагностированы, так как идентификация полиплоидии является одним из ограничений метода.

На рис. 4 представлен результат анализа CGH образца с ХА, выявленной методом CGH и верифицированной FISH с соответствующими ДНК-зондами.

Рисунок 4. Двойная трисомия по хромосомам 7 и 8, выявленная в материале замершей беременности (случай 45).

Примечание: А - Результат CGH с Фикси. Б - Результат FISH с центромероспецифичными ДНК-зондом на хромосому 7. В - Результат FISH с центромероспецифичными ДНК-зондом на хромосому хромосому 8.

Исходя из полученных данных, мы разработали алгоритм исследования абортивного материала с использованием двух молекулярно-цитогенетических методов CGH и FISH с целью получения максимальной информации о хромосомном статусе плода (Рис. 5). Так, в случае отсутствия геномного дисбаланса при CGH исследовании рекомендуется проводить интерфазный FlSH-анализ с ДНК-зондами на любую аутосому и половые хромосомы, что позволяет дифференцировать анеуплоидию от полиплоидии. Такой подход дает возможность выявить все ХА, являющиеся этиологическим фактором неразвивающейся беременности.

Рисунок 5. Алгоритм молекулярно-цитогенетического исследования при спонтанном аборте.

НИ-ССН в диагностике хромосомного дисбаланса у пациентов с умственной отсталостью, аномалиями развития и нормальным

кариотипом

Для диагностики геномного дисбаланса у пациентов с УО проведен анализ НЯ-СОН 34 образцов ДНК. Основными критериями отбора пациентов для исследования являлось наличие УО средней или тяжелой степени, аномалий фенотипа и/или ВПР и нормальный кариотип, установленный при стандартном цитогенетическом исследовании. При использовании НЯ-СвН ХА выявлены в 7 случаях из 34, что составило 20,5%. Метод НЯ-ССН позволил выявить у этих пациентов геномный дисбаланс в виде делеций и дупликаций, а также определить их размеры, которые варьировали от 5 до 21 м.п.н. (Табл. 5). Дополнительные исследования при Р18Н-анализе позволили определить структуру и происхождение этого дисбаланса, а также верифицировать все выявленные ХА.

Таблица 5. Результаты исследования пациентов с ХА, выявленными методом

HR-CGH.

№ Карио- тип (GTG) Результат HR-CGH Размер XA (м.п.н) Подтверждающие методы

Ревизия GTG FISH

I 46,XX ish cgh dim(15)(ql I.2ql 1.2) de novo 5 46,XX ish del(15)(q 11.2) (D15S11-)

2 46,XY ish cgh dim(13)(ql2.1 lql3.11), enh(14)(ql I.2ql2) pat 5,5 8,5 46,XY ish der( 14)t(13; 14) (wcpl4+;wcpl3-f)

3 46,XX ish cgh dim(17)(pl 1.2pl2) de novo 8 del(17) (pll.2-pl2) ish del(17)(p 11.2) (RAI1-)

4 46,XX ish cgh dim(13)(q33.1q34) de novo 10,5 46,XX ish del(13) (q34)(D13S327-)

5 46,XY ish cgh enh(6)(q25.2q27), dim(ll)(q24.1q25) pat 16 12 46,XY ish der(l l)t(6;l 1) (6QTEL54+, D11S1037-)

6 46,XX ish cgh enh( 10)(q26. Iq26.3) de novo 7,9 46,XX ish dup(10) (q26.1-q26.3)

7 46.ХХ ish cgh dim(4)(q32.3q35.2) de novo 21 del(4) (q32-qter) ish del(4)(q35) (D4S2930-)

На следующих рисунках представлены результаты анализа некоторых хромосомных аномалий, диагностированных методом HR-CGH и верифицированных FISH с соответствующими ДНК-зондами.

Рисунок 6. Случай 1. Интерстициальная делеция del(15)(ql 1,2-ql2)de novo, ассоциированная с синдромом Прадера-Вилли.

Примечание: А - Результат HR-CGH. Б - Результат FISH с ДНК зондом сер 15/D15S11, критический район (D15S11) Spectrum Orange, контрольный район -Spectrum Green.

Рисунок 7. Случай 6. Терминальная дупликация dup(10)(q26.1-q26.3)de novo. Примечание: А - Результат HR-CGH. Б - Результат mBANDl 0.

Метод HR-CGH является эффективным для выявления ХА в группе пациентов с У О средней и тяжелой степени и аномалиями развития. Однако, определение структуры этого дисбаланса возможно только при использовании дополнительных молекулярно-цитогенетических методов исследования. Следовательно, только комплексный подход с использованием различных методов позволяет выявить полный спектр ХА и установить окончательный диагноз. Разработана схема обследования пациентов с УО средней и тяжелой степени, аномалиями фенотипа и/или ВПР для эффективной диагностики ХА (Рис. 8). Стоит отметить, что данная схема может быть использована только после исключения синдромальных форм моногенных заболеваний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе выполнено активирование опции анализа высокого разрешения метафазной сравнительной геномной гибридизации (HR-CGH) на основе создания собственных СтРИ для программного обеспечения LUCIA CGH. Проведенные исследования позволили установить, что анализ с использованием СтРИ (99,5%) является наиболее оптимальным для поиска несбалансированных хромосомных аномалий. При анализе образцов ДНК с

хромосомными аномалиями известного размера от 2,5 до 12,5 м.п.н. определено, что метод НЯ-ССН с использованием собственных СтРИ позволяет диагностировать хромосомные аберрации размером 4 м.п.н. и более.

Рисунок 8. Этапы обследования пациентов с УО, аномалиями фенотипа и/или ВПР.

Установлено, что оптимальными условиями стандартизации «платформы» для проведения метафазной СвН являются культивирование лимфоцитов периферической крови с использованием питательной среды с тимидином в концентрации 0,1 мг/мл. Обязательными этапами подготовки и отбора хромосомных препаратов в качестве «платформы» для гибридизации являются постфиксация хромосом на препарате и проведение денатурирующего теста.

При сравнительном анализе эффективности выявления ХА методом СОН с использованием ФиксИ и НЯ-СОН с использованием СтРИ показано, что для оценки хромосомного дисбаланса размером менее 11 м.п.н. оптимальными являются СтРИ (99,5%). Следовательно, НЯ-СвН является более чувствительным методом для выявления хромосомного дисбаланса.

В работе представлены результаты исследования образцов ДНК хориона при неразвивающейся беременности и образцов ДНК пациентов с УО, аномалиями фенотипа и/или ВПР методом метафазной ССН. На основании полученных данных разработаны соответствующие алгоритмы исследования для наиболее эффективной диагностики ХА.

Для оценки эффективности выявления ХА при репродуктивных потерях проведено исследование 60 образцов хориона. Все образцы абортивного материала исследованы тремя диагностическими методами: стандартное кариотипирование, FISH на интерфазных ядрах и метафазная CGH. Наиболее эффективным оказался метод CGH, который дал возможность определить ХА, представленные анеуплоидиями. Однако случаи триплоидии не удалось диагностировать, так как идентификация полиплоидии является одним из ограничений метода CGH. Для повышения эффективности диагностики хромосомных аномалий при неразвивающейся беременности разработан алгоритм исследования абортивного материала с комплексным использованием методов CGH и FISH. Такой подход дает возможность выявить все числовые ХА, являющиеся этиологическим фактором неразвивающейся беременности.

Для диагностики геномного дисбаланса у пациентов с умственной отсталостью, аномалиями фенотипа и/или ВПР и нормальным кариотипом проведено исследование 34 образцов ДНК методом HR-CGH. Эффективность выявления ХА в этой группе составила 20,5%. Результаты проведенного исследования показали, что метод HR-CGH наиболее целесообразно использовать для выявления хромосомного дисбаланса размером более 4 м.п.н. в группе пациентов с УО, аномалиями фенотипа и/или ВПР. Однако, определение структуры этого дисбаланса возможно только при использовании дополнительных молекулярно-цитогенетических методов исследования. Поэтому оптимальным для исследования данной группы пациентов является комплекс молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов, который позволяет выявлять все клинически значимые ХА, являющиеся причиной умственной отсталости, аномалий фенотипа и/или ВПР у пациентов.

Суммируя все вышесказанное можно сделать заключение, что метод метафазной сравнительной геномной гибридизации, как с использованием в качестве границ детекции СтРИ (HR-CGH), так и с ФиксИ (CGH), эффективен для выявления хромосомного дисбаланса в различных группах пациентов. Тем не менее, только комплексный подход с использованием дополнительных методов исследования позволяет полностью идентифицировать структуру ХА и, таким образом, поставить окончательный цитогенетический диагноз. Определение основного этиологического фактора того или иного заболевания является ключевым моментом диагностики, поскольку позволяет корректно проводить медико-генетическое консультирование семей, касающееся прогноза и оценки генетического риска.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном анализе различных протоколов культивирования Т-лимфоцитов периферической крови и проведении подготовительных этапов хромосомных препаратов - «платформы» для CGH, определены оптимальные условия для достижения интенсивной равномерной гибридизации на хромосомах: культивирование лимфоцитов периферической крови с использованием питательной среды с тимидином в концентрации 0,1 мг/мл, постфиксация хромосом на препарате и проведение денатурирующего теста.

2. При проведении серии гибридизаций «норма на норму» создана собственная база данных, состоящая из 12 567 профилей гибридизации проанализированных хромосом, что позволило сформировать стандартные референсные интервалы и проводить анализ высокого разрешения (HR-CGH).

3. При анализе образцов ДНК с хромосомными аномалиями известного размера, установленного методом arrayCGH, определено, что пороговое значение размера геномного дисбаланса, который может быть диагностирован методом HR-CGH, составляет 4 м.п.н.

4. При анализе образцов ДНК с известными хромосомными аномалиями определено, что HR-CGH с полученными стандартными референсными интервалами (99.5%) является более чувствительной и специфичной, чем CGH с установленными фиксированными интервалами (0.75:1.25).

5. При исследовании образцов ДНК плодов, внутриутробно погибших на ранних этапах эмбриогенеза, комплексный подход с использованием методов метафазной CGH и FISH, в отличие от стандартного подхода, позволил выявить хромосомный дисбаланс размером более 4 м.п.н. с эффективностью 100%.

6. При анализе образцов ДНК пациентов с умственной отсталостью, аномалиями фенотипа и/или врожденными пороками развития и нормальным кариотипом, методом HR-CGH дополнительно выявлено 20,5% ХА, ранее не диагностированных при стандартном цитогенетическом исследовании.

ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Для проведения качественной и эффективной метафазной сравнительной геномной гибридизации необходимо использовать стандартизованную «платформу» — хромосомные препараты, приготовленные по оптимизированному протоколу культивирования, с обязательным этапом постфиксации хромосом на препарате.

2. Метод метафазной CGH внедрен в практику Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук и рекомендуется для комплексной диагностики геномного дисбаланса при внутриутробной гибели плода на ранних этапах эмбриогенеза.

3. Метод HR-CGH рекомендован для выявления геномного дисбаланса у пациентов с умственной отсталостью, аномалиями фенотипа и врожденными пороками развития.

4. Алгоритм молекулярно-цитогенетического исследования при репродуктивных потерях опубликован в научно-практическом журнале «Медицинская Генетика».

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СтРИ - динамические стандартные референсные интервалы

ВПР - врожденные пороки развития

м.п.н. - миллион пар нуклеотидов

т.п.н. - тысяч пар нуклетидов

УО - умственная отсталость

ХА — хромосомные аномалии

ФиксИ - фиксированные интервалы

Array Comparative Genomic Hybridization (arrayCGH - aCGH) - микроматричная сравнительная геномная гибридизация

Comparative Genomic Hybridization (CGH) - сравнительная геномная гибридизация

Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) - флуоресцентная in situ гибридизация GTG - G-бэндинг при использовании Tiypsin-Giemsa

High Resolution Comparative Genomic Hybridization (HR-CGH) - сравнительная геномная гибридизация высокого разрешения

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК МОН РФ:

1. Золотухина, Т.В. Использование FISH метода для диагностики и характеристики конституциональных хромосомных аберраций / Т.В. Золотухина, Н.В. Шилова, М.Е. Миньженкова, Ю.О. Козлова, Т.Г. Цветкова, Ж.Г. Маркова, В.Г. Антоненко // Медицинская генетика. - 2011. -Т.10 № 11(113).-С.3-8.

2. Миньженкова, М.Е. Молекулярно-цитогенетическая диагностика необычного хромосомного мозаицизма / М.Е. Миньженкова, Н.В. Шилова, Ю.О. Козлова, Ж.Г. Маркова, Т.Г. Цветкова, Н.А. Демина, Т.В. Золотухина // Медицинская генетика. - 2012. - Том 11 №3 (117). - С. 38-40.

3. Золотухина, Т.В. Пренатальная диагностика редких хромосомных аномалий / Т.В. Золотухина, Н.В. Шилова, Е.В. Юдина, М.Е. Миньженкова, Козлова Ю.О. // Медицинская генетика. - 2012. - T.l 1 № 9 (123). - С.19-24.

4. Миньженкова, М.Е. Получение и применение динамических стандартных референсных интервалов для анализа результатов сравнительной геномной гибридизации / М.Е. Миньженкова, Н.В. Шилова, Ж.Г. Маркова, В.Г.

Антоненко, И.Н. Лебедев, Ю.О. Козлова, В.В. Землякова, Т.В. Золотухина // Генетика. -2013. - Том 49 № 10. - С. 1229-1235.

5. Min'zhenkova, М.Е. Generation and Application of Dynamic Standard Reference Intervals for Analyzing Results of Comparative Genomic Hybridization / M.E. Min'zhenkova, N.V. Shilova, Zh.G. Markova, V.G. Antonenko, I.N. Lebedev, Yu.O. Kozlova, V.V. Zemlyakova, T.V. Zolotukhina // Russian Journal of Genetics.-2013 - Vol. 49 No. 10 - P. 1072-1077.

6. Антоненко, В.Г. Три случая синдрома Смит-Магенис у детей первого года жизни с врождёнными пороками сердца / В.Г. Антоненко, М.Е. Миньженкова, Ю.О. Козлова, Ю.Ю. Коталевская, Е.А. Шестопалова, О.А. Кисленко, И.А. Казанцева, Н.В. Шилова, Т.В. Золотухина // Медицинская генетика. - 2013. - Т. 12 № 8. - С.44-48.

7. Миньженкова, М.Е Эффективность различных методов диагностики хромосомных аномалий при репродуктивных потерях / М.Е. Миньженкова, Н.В. Шилова, Ж.Г. Маркова, Ю.О. Козлова, Т.В. Золотухина // Медицинская генетика. - 2014. - Том 13 №2 (140). - С. 25-30.

Публикации в других изданиях

8. Миньженкова, М.Е Необычный случай мозаицизма по изохромосоме 18 и транслокации t(18;21), диагностированный с использованием FISH метода / М.Е. Миньженкова, Н.В. Шилова, Ю.О. Козлова, Ж.Г. Маркова, Т.Г. Цветкова, Т.В. Золотухина // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. — Ростов-на-Дону, 2010. -С.115.

9. Шилова, Н.В. Использование различных вариантов FISH-метода в диагностике хромосомных болезней: выбор тактики исследования / Н.В. Шилова, М.Е. Миньженкова, Ю.О. Козлова, Ж.Г. Маркова, Т.В. Золотухина // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. — Ростов-на-Дону, 2010.-С.196.

10. Zolotukhina, Т. Results of cytognetic studies in pre- and postnatal cases with a complex congenital heart disease and dismorphic features / T. Zolotukhina, N. Shilova, V. Antonenko, N. Kotlukova, Y. Kozlova, M. Minzhenkova // Chromosome Research. - 2011. - Vol. 19. - P. 18.

11. Миньженкова, М.Е Интерстициальная делеция 8p, идентифицированная с помощью метода сравнительной геномной гибридизации / М.Е. Миньженкова, Ю.О. Козлова, Н.В. Шилова, Ж.Г. Маркова, В.Г. Антоненко, Т.В. Маркова, Т.В. Золотухина // Сборник научных трудов «Генетика человека и патология. Актуальные проблемы современной цитогенетики». - Томск, 2011. - Выпуск 9. - С. 110-111.

12. Zolotukhina, Т. Structural chromosomal aberrations diagnosed by FISH / T. Zolotukhina, N. Shilova, J. Kozlova, M. Minzhenkova, J. Markova // Eur. J. Hum. Genet. - 2012. - Vol. 20. - P. 123.

13. Миньженкова, M.E Молекулярно-цитогенетическая диагностика двух маленьких сверхчисленных маркерных хромосом у плода / М.Е. Миньженкова, Н.В. Шилова, Ю.О. Козлова, Ж.Г. Маркова, Т.В. Золотухина // Материалы V Всероссийской конференции с международным участием «Пренатальная диагностика и генетический паспорт - основа профилактической медицины в век нанотехнологий». - С.-Петербург, 2012. - С. 75.

14. Козлова, Ю.О. Использование интерфазной FISH при диагностике некоторых хромосомных синдромов / Ю.О. Козлова, М.Е. Миньженкова, Ж.Г. Маркова, И.В. Мирошникова, О.С. Борзова, Н.В. Шилова // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. - Новосибирск, 2012. -Выпуск 18. — С.26-34.

15. Золотухина, Т.В. Молекулярно-цитогенетическая диагностика малых сверхчисленных маркерных хромосом у плода / Т.В. Золотухина, Н.В. Шилова, М.Е. Миньженкова, Ю.О. Козлова, Ж.Г. Маркова, Т.Г. Цветкова // Архив клинической и экспериментальной медицины. - Донецк, 2012. - Том 21 №2. -С. 164-167.

16. Миньженкова, М.Е Интерстициальные делеции, идентифицированные с помощью метода сравнительной геномной гибридизации / М.Е. Миньженкова, Ж.Г. Маркова, Н.В. Шилова, В.Г. Антоненко, Н.Ю. Кузина, Ю.О. Козлова, Т.В. Золотухина // Архив клинической и экспериментальной медицины. - Донецк, 2012. - Том 21 № 2. - С.174-176.

17. Миньженкова, М.Е Сравнительная геномная гибридизация высокого разрешения на метафазах / М.Е. Миньженкова // Сборник тезисов Конференции молодых ученых ФГБУ «МГНЦ» РАМН. - Москва, 2012. - С.8.

18. Minzhenkova, М. Identification of unbalanced translocation 4;8 characterized by metaphase CGH / M. Minzhenkova, N. Shilova, Z. Markova, S. Korostelev, Y. Kozlova, T. Zolotukhina // Eur. J. Hum. Genet. - 2013. - Vol 21. - P. 489.

19. Shilova, N. Characterization of 42 small supernumerary marker chromosomes by FISH method / N. Shilova, M. Minzhenkova, Zh. Markova, Y. Kozlova, V. Antonenko, T. Tsvetkova, T. Zolotukhina // Eur. J. Hum. Genet. - 2013. -Vol 2.-P. 603.

20. Zolotukhina, T. Molecular cytogenetic diagnosis of rare structural chromosomal abnormalities on fetuses / T. Zolotukhina, N. Shilova, E. Chirkova, E. Judina, M. Minzhenkova, Y. Kozlova // Chromosome Research. - 2013. - Vol. 21. -P. 5.

21. Minzhenkova, M. The use of CGH in the analysis of first-trimester spontaneous abortion / M. Minzhenkova, N. Shilova, Y. Kozlova, Z. Markova, E. Korovkina, E. Okuneva, T. Zolotukhina // Chromosome Research. -2013. - Vol. 21. -P. 6.

22. Shilova, N. Unbalanced interchromosomal insertions detected by molecular cytogenetic techniques / N. Shilova, M. Minzhenkova, Zh. Markova, E. Chirkova, Yu. Kozlova, T. Tsvetkova, E. Okuneva, O. Makienko, T. Zolotukhina // Chromosome Research. - 2013. — Vol. 21. - P. 7.

Подписано в печать:

08.10.2014

Заказ № 10259 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56

www.autoreferat.ru