Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом и их матерей

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом и их матерей"

На правах рукописи

У/

КРАВЕЦ Виктор Сергеевич

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЕТЕЙ С АУТИЗМОМ И ИХ МАТЕРЕЙ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

25 ФЕВ 2015

Белгород - 2015

005559484

005559484

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Юров Иван Юрьевич, доктор биологических наук Официальные оппоненты:

Курило Любовь Фёдоровна, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией генетики нарушений репродукции

Ларионова Валентина Ильинична, доктор медицинских наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет» им. И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения России, профессор кафедры педиатрии и детской кардиологии

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения России

заседании совета по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы,

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобрнауки России и на сайте www.bsu.edu.ru

Защита диссертации состоится «

85

Автореферат разослан « 76 » а^

2015 г.

И.о. ученого секретаря совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 доктор медицинских наук

С.П. Пахомов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время роль генетических факторов в этиологии большей части случаев психических болезней, нарушений психоречевого и психомоторного развития у детей не вызывает сомнения. Изучение генетических аномалий при различных психических заболеваниях у детей является одним из наиболее актуальных направлений в современной психиатрической генетике и биологической психиатрии. Тем не менее, определение генетических изменений, являющихся причиной распространенных заболеваний, связанных с аутистическими расстройствами, чаще всего остаётся невозможным, что может быть объяснено существованием множества различных факторов, способных вызывать признаки аутизма [Levy et al., 2009]. В целом, среди исследователей этой патологии преобладает мнение о генетической природе большинства случаев аутизма (или, по крайней мере, большей их части) [Ворсанова и др., 2006; 2013]. Известно также, что хромосомные синдромы и аномалии сопровождаются нарушением функциональной активности головного мозга и всей нервной системы, и при более 200 из них наблюдаются аутистические расстройства [Betancur, 2011]. Этот факт можно объяснить тем, что развитие и функционирование столь сложной системы, как головной мозг, регулируются не единичными генами, а тысячами различных генов, которые весьма сложным образом взаимодействуют друг с другом.

В спектре всех психических нарушений видное место занимают аутистические расстройства. Клинически аутизм выражается в основном в нарушении социальных контактов и утрате познавательной активности. Впоследствии это ведёт к регрессу и распаду личности, десоциализации, инвалидизации и снижению интеллекта. Частота аутизма значительно варьирует как в разных странах, так и по оценкам разных авторов и составляет 5-90 на 10 000 детского населения [Башина, 1999]. В некоторых исследованиях американских авторов приводятся данные и о более высокой частоте аутизма среди детей: от 1:250 и до 1:88 [Ozand et al., 2009; по данным Центра контроля и профилактики заболеваний /Centers for Disease Control and Prevention, 2012/]. Вполне возможно, что определённый вклад в развитие аутизма вносит ухудшение экологической обстановки. Вероятно также, что многие группы детского населения недостаточно обследованы, и в некоторых когортах детей этот показатель может быть ещё выше. Это особенно актуально для социальных групп и стран, где уровень генетического консультирования низок. Очевидно, что с развитием методов и систем обследования детей с аутизмом эти показатели будут меняться в сторону увеличения. Важно отметить, что у некоторых детей классические признаки аутизма «маскируются» более тяжёлыми симптомами, связанными с другими нарушениями психики. Можно также предположить, что немалое число детей с аутистическими нарушениями психики в Российской Федерации находятся в различных учреждениях для детей-инвалидов и по ряду причин не обследуются клиническими генетиками.

Показано, что хромосомные аномалии являются наиболее частой формой генетической патологии у детей. Систематический поиск специфических и неспецифических хромосомных аберраций и вариаций у детей с психическими заболеваниями является необходимым этапом диагностических исследований. Хромосомные аномалии являются причиной генного дисбаланса и нарушений функциональной активности генома клетки, эпигенетических изменений, связанных, по-видимому, с эффектом положения генов, патологических процессов в клетках головного мозга. Анализ вариаций и аномалий хромосом у детей с психическими заболеваниями, в том числе с аутизмом, представляет несомненный интерес для дальнейшего поиска характерных для этих состояний генетических и эпигенетических изменений, а также для выявления генетических диагностических маркеров.

Современные цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования, направленные на идентификацию хромосомных аномалий среди детей с психическими заболеваниями, позволят не только выявить те или иные численные и структурные аномалии, но также и картировать гены болезней мозга, что необходимо в решении актуальных задач современной генетики. Молекулярно-цитогенетические технологии позволяют проводить анализ структуры и числа хромосом с высокой разрешающей способностью в различных типах клеток, а также на разных стадиях клеточного цикла. Среди современных методов исследования можно назвать флюоресцентную in situ гибридизацию (FISH) и сравнительную геномную гибридизацию (CGH) в её различных вариациях. Данные свидетельствуют о том, что геномная (хромосомная) нестабильность, а также аномалии хромосом наблюдаются при некоторых наследственных нервных и психических заболеваниях, например, при болезни Альцгеймера, атаксии-телеангиэктазии, шизофрении и умственной отсталости, значительно чаще, чем в общей популяции [Ворсанова и др., 2008; Yurov et al., 2001, 2008; Iourov et al., 2009]. Феномен нестабильности генома, как предполагается, может лежать в основе патогенеза и других нервных и психических заболеваний. Актуальность исследований вариабельности генома при аутизме неоднократно отмечалась и заключается в том, что с помощью цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов можно провести детальный анализ структурных особенностей генома в группе лиц с аутистическими расстройствами для обнаружения возможных генетических причин патологических проявлений этого клинически гетерогенного и распостранённого заболевания.

В связи с вышеизложенным были сформулированы цель и задачи исследования.

Цель: выявление и изучение геномных вариаций в виде хромосомных аномалий, соматического мозаицизма (мозаичной анеуплоидии) и гетероморфизма гетерохроматиновых участков хромосом у детей с расстройствами аутистического спектра и их матерей.

Задачи:

1. Определить частоту хромосомных аномалий у детей с аутистическими расстройствами;

2. Оценить вклад мозаичных форм хромосомных аномалий (соматического мозаицизма) в структуру генетической патологии при аутизме;

3. Идентифицировать частоту вариаций гетерохроматиновых участков хромосом в когорте детей, страдающих аутистическими расстройствами;

4. Определить частоту хромосомных аномалий, хромосомной нестабильности и гетерохроматиновых вариантов в группе матерей детей с аутизмом;

5. На основе полученных данных оценить роль хромосомных аномалий, хромосомного мозаицизма (в виде мозаичной анеуплоидии) и гетероморфизма гетерохроматиновых участков хромосом в патогенезе аутизма, а также предложить рекомендации для молекулярно-цитогенетической диагностики с целью повышения эффективности медико-генетического консультирования семей с этим заболеванием.

Научная новизна. Впервые получены данные о частоте хромосомных аномалий при учёте соматических геномных вариаций в российской когорте детей с аутизмом (10,8%). Впервые определена частота хромосомного мозаицизма у детей с аутизмом, достигающая 16,4%. Впервые определена частота вариаций гетерохроматиновых районов хромосом в когорте детей с аутизмом, превысившая таковую в контрольной группе более чем в 9 раз. Впервые цитогенетическими и молекулярно-цитогенетическими методами обследована группа матерей детей с аутизмом с целью обнаружения возможных цитогенетических маркёров заболевания. Впервые представлены неизвестные случаи хромосомных аномалий, ранее не описанных при заболеваниях аутистического спектра.

Практическая значимость. Комплекс современных цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов позволил выявить генетические маркеры аутистических расстройств, в том числе и семейные (повышенная частота гетерохроматиновых вариантов, хромосомный мозаицизм низкого уровня). Полученные данные имеют исключительное практическое значение для последующих исследований в этой гетерогенной группе заболеваний. Предложены рекомендации для проведения обязательных цитогенетических и, по показаниям, молекулярно-цитогенетических исследований у детей с аутизмом, а также разработаны показания к их проведению для медико-генетического консультирования семей с этим заболеванием.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы использовались для исследования хромосомных аномалий у детей с аутистическими расстройствами и их матерей в лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний обособленного структурного подразделения - НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний НЦПЗ РАМН, а также в НОЦ «Нейробиологическая диагностика наследственных психических заболеваний у детей и подростков» ГОУ ВПО Московского городского психолого-педагогического университета.

Апробация работы. Результаты данного исследования неоднократно представлены на различных конгрессах и конференциях в России и за

рубежом: на 54м Съезде американского общества медицинских генетиков (Торонто, Канада, 2004); на ежегодных Конгрессах «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» 2005 - 2014 г. (Москва); на конференции «Современные молекулярно-цитогенетические методы в диагностике хромосомной патологии» (Монпелье, Франция, 2005); на 14м Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Кальяри, Италия, 2006); на 7й-10й Балканской конференции по генетике человека (Скопье, Македония, 2006; Дубровник, Хорватия, 2009; Тимишоара, Румыния, 2011; Блед, Словения, 2013); на конференции «Прогресс в области биологической психиатрии» (Москва, 2007); на Международном рабочем совещании «Геномика и протеомика 2007» (Киев, Украина); на 6й и 7й Европейской цитогенетической конференции (Стамбул, Турция, 2007.; Стокгольм, Швеция, 2009); на научно-практическом симпозиуме «Лабораторная медицина: инновационные технологии в аналитике, диагностике, образовании, организации» (Москва, 2008); на IV съезде медицинских генетиков Украины (Львов, Украина, 2008); на Международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009); на Международной конференции по медицинской генетике (Одесса, Украина, 2009); на научной конференции НОЦ нейробиологической диагностики наследственных нарушений психического развития у детей и подростков ГОУ ВПО МГППУ «Лечение и диагностика синдромов Дауна и Ретта» (Москва, 2009); на Международной научной конференции «Современные методы психологии» (Москва, 2010); на Научно-практической конференции «Биологическая психиатрия -клинической психиатрии» (Москва, 2010); на Международной научной конференции «Современные методы психологии» (Москва, 2010); на VI Съезде Российского общества медицинских генетиков, (Ростов-на-Дону, 2010); на 7й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011); на 15м и 16м Конгрессах педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011; 2012); на международной научно-практической конференции «Эпигенетические болезни» (Харьков, Украина, 2011); на съезде «Геном человека 2011» (Human Genome Meeting 2011) (Дубай, ОАЭ); на 5 съезде Российского психологического общества (Москва, 2012); на Научно-практической конференции «Проблемы наследственной и мультифакторной патологии» (Киев, Украина, 2012); на Европейской конференции по генетике человека (Нюрнберг, Германия, 2012; Милан, Италия, 2014); на 20м Всемирном конгрессе по психиатрической генетике (Гамбург, Германия, 2012); на Научном симпозиуме «Редкие (орфанные) наследственные болезни» (Харьков, Украина, 2012); на Всероссийской научно-практической конференции «Психические расстройства в детском возрасте: мультидисциплинарные аспекты диагностики, лечения и реабилитации» (Москва, 2013); на Конференции «Актуальные проблемы психиатрии, наркологии, психотерапии и клинической психологии» (Саратов, 2013); на 16й Общероссийской научной конференции с международным участием

«Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2013); на 1м Международном форуме «Молекулярная медицина - новая модель здравоохранения XXI века: технологии, экономика, образование» (Санкт-Петербург, 2013).

Апробация диссертационного исследования состоялась на совместном методическом совещании лаборатории цитогенетики и геномики психических заболеваний, лаборатории молекулярной генетики мозга, лаборатории патофизиологии, лаборатории нейроиммунологии, лаборатории клинической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр психического здоровья» Российской академии медицинских наук 20 июня 2014 года.

Личный вклад автора. Соискателем лично сформированы исследуемые выборки, собран первичный материал. Автор самостоятельно осуществлял культивирование лимфоцитов периферической крови, приготовление цитогенетических препаратов, цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования, выполнил статистическую обработку данных, провёл анализ материалов, обобщил результаты исследования. По итогам выполненной работы автором подготовлены основные публикации, проведена апробация результатов исследования, написана и оформлена рукопись.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 36 работ в различных отечественных и зарубежных журналах, из них 6 в журналах из перечня ВАК.

Положения, выносимые на защиту:

1) частота хромосомных аномалий в группе детей с аутизмом выше, чем в общей популяции, что говорит о возможной роли генетических факторов в патогенезе аутизма;

2) показано наличие в группе детей с аутизмом мозаичных форм, связанных с численными аномалиями как хромосомы X, так и некоторых аутосом;

3) применение новых высокоинформативных молекулярно-цитогенетических технологий, основанных на методике сравнительной геномной гибридизации, повышает эффективность выявления хромосомных аномалий в группе детей с аутистическими расстройствами;

4) в группе матерей детей с аутизмом обнаружена высокая частота хромосомных аномалий в виде мозаичной анеуплоидии хромосомы X, в том числе в виде мозаичных форм моносомии и трисомии хромосомы X, а также дополнительных маркерных хромосом, происхождение которых было от хромосомы X, и хромосомная нестабильность в виде неспецифических транслокаций;

5) частота хромосомных (гетерохроматиновых) вариантов в группе детей с аутистическими расстройствами в 9 раз превышает частоту вариантов в общей популяции, что позволяет говорить о вариабельности околоцентромерного гетерохроматина как о возможном маркёре аутизма; также обнаружена более высокая частота хромосомного гетероморфизма

(хромосомных вариантов) у матерей детей с аутистическими расстройствами по сравнению с контрольной группой;

6) цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом и их матерей должны рассматриваться как обязательные для выявления генетических причин аутизма и для корректного медико-генетического консультирования семей, в которых есть дети с расстройствами аутистического спектра.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Материалы изложены на 127 страницах машинописного текста и содержат 12 таблиц и 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 217 наименований, из которых 183 иностранных.

Материалы и методы исследования Клиническая характеристика исследованных групп Для решения поставленных задач были исследованы 3 группы. Группа 1: 204 ребёнка с идиопатическим аутизмом, средний возраст которых составил 6,3 г; максимальный - 18 лет, минимальный - 1 год. Среди обследованных детей было 170 мальчиков и 34 девочки. Соотношение полов составило (М:Ж) 5:1. Все пациенты обследованы по шкалам аутизма и при тестировании по стандартным шкалам аутизма набрали должное число баллов [Schopler et al., 1988; Lord et al., 1994].

Группа 2: Исследования хромосомного мозаицизма у детей с аутизмом проводились в группе из 116 детей (все мальчики). Контрольной группой послужили 60 здоровых детей.

Группа 3: Обследовали репрезентативную группу из 96 матерей детей с аутизмом. Возраст обращения матерей в генетическую консультацию варьировал от 24 до 60 лет (средний - 33,5 лет). Средний возраст в период рождения ребенка с аутизмом составил 27,4 года (от 17 до 45 лет). Контрольную группу составили 60 женщин, не имеющих детей с аутистическими расстройствами, в возрасте от 24 до 48 лет (средний возраст 33,2 года).

Методы исследования

Для обследования группы 1 применялись следующие методы: стандартное цитогенетическое исследование (кариотип), молекулярно-цитогенетические исследования - флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) [Vorsanova et al., 1991] и сравнительная геномная гибридизация (CGH). Для FISH пациенты отбирались по следующим критериям: 1) необходимость уточнения точек разрыва при структурных перестройках хромосом (транслокации, инсерции, кольцевые хромосомы); 2) подтверждение наличия хромосомного мозаицизма (например, 45,Х/46,ХХ). При проведении молекулярно-цитогенетических исследований для выявления возможного хромосомного мозаицизма анализировали не менее 100 метафазных пластинок и 1000 интерфазных ядер. Критериями отбора пациентов для HR

CGH (CGH высокого разрешения) послужило наличие у пациента при нормальном кариотипе выраженной умственной отсталости, пороков и микроаномалий развития и аутизма. HR CGH проводилась по стандартным протоколам [Iourov et al., 2008].

Для FISH исследований использовались центромерные ДНК зонды на хромосомы 1, 17, 18, X и Y. Все исследования с помощью FISH проводились по стандартному протоколу [Соловьёв и др., 1998; Soloviev et al., 1994; Yurov et al., 1996]. ДНК пробы взяты из оригинальной коллекции лаборатории цитогенетики и геномики человека НЦПЗ РАМН и лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний НИКИ педиатрии - обособленного структурного подразделения ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России [Соловьёв и др., 1998; Юров, 1987; Юров и др., 1989; Soloviev et al., 1995; 1997; Yurov et al., 1997].

В работе применяли стандартные методы статистической обработки для медико-биологических исследований. Для анализа достоверности отличия групп пациентов и контрольных групп использовался общепринятый метод дисперсионного анализа [Гланц, 1999]. Исследования одобрены этическим комитетом Научного центра психического здоровья РАМН и проводились с учетом всех международных этических и правовых норм генетических исследований в области психиатрической генетики [Farmer et al., 2000].

Результаты и исследования и их обсуждение I. Результаты исследований в группе 1.

Стандартными цитогенетическими методами обследованы 204 ребёнка. Обнаружено 17 случаев хромосомных аномалий, что составило 8,3% от общего числа пациентов (рис. 1).

ез%

Рис. 1. Удельный вес хромосомной патологии, обнаруженной цитогенетическими методами, в группе детей с аутизмом (п=204).

Структуру патологии составили следующие хромосомные аномалии: транслокации - 3 (1,5% от общего числа пациентов); инверсии эухроматина -2 (1%); синдром FRAXA - 2 (1%); инсерции - 1 (0,5%); дополнительный материал /add/ - 1 (0,5%); мозаичные случаи дополнительной маркерной хромосомы - 3 (1,5%); кольцевая хромосома - 1 (0,5%); численные и структурные аномалии гоносом - 4 (2%). Структура хромосомной патологии в группе 1 (п=204) показывает: 1) в данной когорте отсутствуют случаи делеций больших участков хромосом, что может быть объяснено тем, что клинические проявления у детей с делениями значительно тяжелее, чем при

транслокациях и некоторых численных аномалиях хромосом (например, при анеуплоидиях половых хромосом); 2) причиной аутизма у детей могут быть разнообразные цитогенетические аномалии с участием практически всех хромосом, что ещё раз подтверждает мультифакторную природу аутизма.

Полученные результаты в данной группе детей с аутизмом согласуются с результатами других подобных исследований [Ворсанова, Юров 1999; Bill, Geschwind, 2009]. Выявленные хромосомные аномалии (дополнительный хромосомный материал (add), мозаицизм, структурные перестройки) указывают на необходимость проведения в некоторых случаях дополнительных молекулярно-цитогенетических исследований

(сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения - HR CGH) для выявления хромосомных (геномных) аномалий, которые невозможно обнаружить стандартными цитогенетическими методами, что позволит значительно увеличить эффективность выявления хромосомной патологии в когорте детей с аутизмом. Обнаружение структурных и численных аномалий различных хромосом в исследованной группе детей очевидно указывает на гетерогенную природу аутистических расстройств с участием многих генов, регулирующих развитие нервной системы.

Среди пациентов с нормальным кариотипом были выбраны дети, клинические проявления (выраженная умственная отсталость, пороки и множественные микроаномапии развития) у которых позволяли предположить наличие микроаномалий хромосом (генома). Таким детям (n=l 1) была проведена HR CGH. В результате проведения HR CGH у 5 детей из 11 была обнаружена хромосомная патология (4 субмикроскопические делеции и 1 дупликация) (табл. 1).

Табл. 1. Хромосомные микроаномалии, обнаруженные методом сравнительной геномной гибридизации высокого разрешения (НЯ СйН)_

№ Пол пациента Возраст Результаты CGH

1 мальчик 7 лет cgh del (3Xp21.32-p21.33)

2 мальчик 7 лет cgh del (5Xpl5.33-pter), del(5Xpl5.33-pter)

3 мальчик 4 года cgh del(17Xq25q25)

4 девочка 4 года cßh det(13Xq34-qter)

5 девочка 6 лет cgh dup(22)(qll.2qll.2)

Число обнаруженных геномных аномалий при использовании метода ССН в группе детей с аутистическими расстройствами показывает, что: 1) данный метод весьма эффективен для поиска субмикроскопических хромосомных аномалий в когорте детей с аутистическими расстройствами при отсутствии цитогенетических аномалий при стандартном кариотипировании; 2) чаще встречаются аномалии в виде делеций генома, что говорит об их большей патогенности по сравнению с микродупликациями. На рисунке 2 представлен пример использования метода HR СОН -микроделеция (около 1 млн пн) хромосомы 22 у мальчика 6 лет с аутизмом и задержкой развития.

Кроме того, результаты стандартных цитогенетических исследований заставили предположить у некоторых пациентов наличие мозаичной анеуплоидии хромосом (у них были обнаружены единичные анеуплоидные клетки). Таких пациентов было 11, всем им была проведена флюоресцентная

in situ гибридизация (FISH). У 8 из 11 пациентов (3,9% от общего числа пациентов) была подтверждена хромосомная патология в виде анеуплоидии хромосом, в основном в виде мозаичной анеуплоидии половых хромосом (гоносом). Случаи хромосомной патологии, обнаруженной методом FISH, представлены в таблице 2.

Рис. 2. Исследование методом НЯ СОН, проведённое у мальчика 6 лет с аутизмом и выраженной умственной отсталостью, выявило микродупликацию хромосомы 22 ^Ь аир (22)(Ч11.2Ч 11.2)].

Табл. 2. Мозаичные случаи хромосомной патологии, обнаруженные методом

флюоресцентной гибридизации in situ (FISH).

№ Пол пациента Возраст Результаты FISH

1 девочка 5 лет FISH: 47,XXX[501nuc ish X cen x3f4881/Xcen 2[121

2 мальчик 4 г FISH:45.X[2]/47.XXY[2]/46,XY[196] nuc ish Xcenx2/Ycenx I[281/Xcenxl/Ycenx0[191/Xcenxl/Ycenx2[2]/Xcenxl/Ycenx 1[9511

3 девочка 5 лет FISH:45,XX,-18[1]/46,XX[99] nuc ish Xcen x 2/18cen xl[6]/Xcen x 2/18 cen x 3[2]/Xcen x l/18cen x 2[3]/Xcen x 3/18cen x 2[1]/Xcen x 2/18cenx 2(9881

4 девочка 2 г FISH:45,XX,-18[1]/45,X[1]/46,XX[70] nuc ish Xcen x 2/18cen x 3[38]/Xcen x l/18cen x 2[33]/Xcen x 2/I8cen x l[31]/Xcen x 3/18cen x 2Г121/ХСЯ1 x 2/I8cen x 2[886]

5 мальчик 4 г FISH:45,XY,-15[ 1 ]/47^iY,+mar.der( 15)[ 1 ]/46,X Y[48]/47,XY Y[3]/ 47,XXY[1]/46,XY[50] nuc ish 15cen x 3[I8]/15cen x I[8]/15cen x 4[4]/15cen X 2 [970] nuc ish Xcen x 1/Ycen x 2[28]/Xcen x 2/Ycen x l[231/Xcen x 2/Ycen x 2fl П/Xcen x 1/Ycen x Ц9381

6 мальчик 4 г mos46,X,psu idic(Y)(qter->p 11.3::p 11,3-> pter), 15cenh+[29]/45,X[ 1 ] F!SH:4S,X[6y47(X.idic(Y), idic(Y)/46piMic(YX72] nuc ish Xcen x Ween x 0[42]/Xcen x 1/Ycen x 2[29]/Xcen x 2/Ycen x 1[4]/ Xcen x 1/Ycen x 1[9251

7 девочка 4 г FISH: nuc ish Xcen x 1[7]/Xcen x 3[2]/Xcen x 4[3]/Xcen x 2[988]

8 девочка 3 г subtel mos ish t(l;17)(pter-;pter+)[7]/ish subtel (41x2)[31

Большое число различных аномалий хромосом, обнаруженных при применении FISH, показывает эффективность применения этого метода для уточнения точек разрыва при сложных структурных перестройках, а также для выявления «скрытого» (малопроцентного) мозаицизма при анеуплоидиях различных хромосом, чаще всего — гоносом. Помимо численных аномалий (трисомий) аутосом 13, 18 и 21, чаще всего у живорождённых обнаруживают численные аномалии гоносом. Известно, что при численных аномалиях других аутосом такие эмбрионы погибают почти в 100% случаев. «Скрытый» (малопроцентный) мозаицизм может отличаться долей аномальных клеток

различных тканей, например, в клетках крови доля аномальных клеток мала, а в клетках других тканей (буккальный эпителий, фибробласты кожи и др.) она больше либо такие клетки отсутствуют. Этот обнаруженный нами феномен требует исследований клеток различных тканей. Уже существуют данные о наличии малопроцентного мозаицизма в клетках головного мозга при других психических и нервных заболеваниях (при шизофрении, атаксии-телеангиэктазии и др.) (данные получены в результате исследований постмортальных тканей) [Тиганов и др., 2012]. В нашем исследовании у 22 детей после проведения стандартного цитогенетического анализа определены показания для проведения молекулярно-цитогенетической диагностики методами FISH и CGH. HR CGH проводили тем детям, у которых клиническая картина предполагала наличие хромосомной (геномной) аномалии (выраженная умственная отсталость, пороки развития), но стандартное цитогенетическое исследование не выявило хромосомных перестроек. CGH провели 11 детям (5,4% от общего числа детей), патология выявлена у 5 детей (2,5%) (табл. 1). FISH проводилась для подтверждения хромосомного мозаицизма при цитогенетическом выявлении 1-2 клеток с анеуплоидией хромосомы X (45,X или 47,XXY) или для определения точек разрыва при транслокациях (табл. 2). FISH провели 11 детям (5,4% от общего числа детей), патология обнаружена у 8 детей (3,9%). С учётом подтверждённого хромосомного мозаицизма, доля хромосомной патологии в данной группе составила 10,8%. Таким образом, оба молекулярно-цитогенетических метода исследований показали высокую эффективность в обнаружении низкопроцентных хромосомных перестроек и аномалий.

Гетерохроматиновые участки хромосом были изучены с помощью стандартного метода С-окрашивания. Гетерохроматиновые, или хромосомные, варианты были обнаружены у 110 пациентов из 204 обследованных (53,9%) (рис. 3). Всего вариантов обнаружено 189 (0,92 варианта на индивидуума). Изолированные варианты были обнаружены в 81 случае (39,7% от общего числа пациентов). Сочетанные варианты обнаружены в 52 случаях (25,5% от общего числа пациентов). Среди отдельно взятых вариантов наиболее часто встречались варианты хромосом 1, 9 и 16 (изолированно и в сочетании с другими) (табл. 3).

Рис. 3. Удельный вес вариантов гетерохроматина в группе 1 детей с аутизмом

Табл. 3. Удельный вес наиболее часто встречавшихся гетерохроматиновых вариантов (изолированных и сочетанных) в группе детей с аутизмом (п=204) _

Хромосомный вариант Число пациентов с данным вариантом (доля от общего числа пациентов, %) Число пациентов с сочетанными вариантами (включая данный) Суммарное число пациентов с данным вариантом (включая пациентов с сочетанными вариантами) Доля пациентов с данным вариантом (включая сочетанные варианты) в общем числе пациентов

1рИдЬ 18(8,8%) 25 43 21,1%

9рИрЬ 18(8,88%) 16 34 16,7%

6 (2,9%) 12 18 8,8%

6 (2,9%) 11 17 8,3%

4 (2%) 4 8 3,9%

9чЬ- 2 (1%) 6 8 3,9%

УдЬ- 1 (0,5%) 3 4 2%

Полученные результаты по гетерохроматиновым вариантам хромосом позволяют сделать следующие заключения: частота гетерохроматиновых вариантов в когорте детей с аутизмом более чем в 9 раз превышает таковую в общей популяции (4-6%) [Iоиго\ с1 а1., 2006]; чаще всего встречаются варианты в виде перицентрических инверсий околоцентромерного гетерохроматина хромосом 1 и 9, как изолированные, так и сочетанные; значительное увеличение частоты гетерохроматиновых вариантов может быть фактором риска в данной когорте; эти данные позволяют говорить о новых возможных маркёрах аутизма. Удельный вес отдельных хромосомных вариантов представлен на рисунке 4 (проценты вычислены от числа случаев с вариантами хромосом — п=110).

16.4%

Рис. 4. Удельный вес различных вариантов хромосом в группе детей с аутизмом Таким образом, доля вариантов гетерохроматиновых участков в группе детей с аутизмом оказалась значительно выше, чем в общей популяции (4-6%) [1оигоу е1 а1., 2006], что может быть объяснено тем, что: 1) гетерохроматиновые варианты могут быть цитогенетическими маркёрами аутизма; 2) в процессе наследования этих вариантов от родителей детям и далее в череде поколений они могут подвергаться некоторым изменениям, чаще количественным, и попадать в поле зрения исследователей именно в виде гетероморфизма гетерохроматиновых районов хромосом, что также может быть фактором, связанным с патогенезом аутизма, так как даже просто количественные изменения хромосомного материала, хотя бы и не участвующего непосредственно в кодировании белковых

последовательностей, могут оказывать эпигенетическое влияние на геном человека; тем более значимое влияние могут оказывать на геном варианты околоцентромерного гетерохроматина в виде его инверсий, так как при них расположенные вблизи с гетерохроматином участки кодирующих последовательностей эухроматина могут быть подвержены гетерохроматинизации, что может нарушать нормальную экспрессию генов в этих участках хромосом [Жимулёв, 1993; Iourov et al., 2006].

При изучении разнообразия гетерохроматиновых вариантов обращает на себя внимание преобладание околоцентромерных инверсий гетерохроматина хромосом 1 и 9, как изолированно, так и в сочетании с другими гетерохроматиновыми вариантами (рис. 4), что может указывать на патогенность этих инверсий благодаря возможной гетерохроматинизации участков эухроматина вблизи точек разрыва при формировании инверсий по сравнению с вариантами в виде увеличения или уменьшения размеров блоков С-гетерохроматина и в виде увеличения коротких плечей акроцентрических хромосом, их спутников и спутничных нитей [Жимулёв, 1993].

II. Результаты исследований в группе 2

Исследования хромосомного мозаицизма у детей с аутизмом проводились в группе из 116 детей (все мальчики). Контрольной группой послужили 60 здоровых детей. Кариотип детей в обеих группах был нормальным. С целью обнаружения стохастической (фоновой) анеуплоидии хромосом была проведена 3-цветная флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) с зондами на 6 случайно отобранных аутосом и половые хромосомы (гоносомы). Всего было проанализировано более 420 ООО клеток у 176 детей. В результате была определена средняя частота стохастической анеуплоидии при аутизме и в контроле: 1) потеря аутосом - 0,6% (0,37%-0,83%) и 0,58% (0,42%-0,75%), соответственно; 2) дополнительные (сверхчисленные) аутосомы - 0,22% (0,14%-0,3%) и 0,15% (0,09%-0,21%), соответственно; 3) дополнительная хромосома X - 1,01% (0,85%-1,17%) и 1,11% (0,9%-1,31%), соответственно. Пример FISH с ДНК зондами на хромосомы X и Y у ребёнка с идиопатическим аутизмом и мозаицизмом по хромосоме X представлен на рисунке 5: видна клетка с нормальным числом гоносом (справа) и с дисомией хромосомы X (слева) у мальчика 6 лет.

Таким образом, у этого ребёнка с аутизмом выявлена дополнительная (сверхчисленная) хромосома X, и данный пациент является носителем мозаичной анеуплоидии по хромосоме X, так как такие клетки обнаружены у ребёнка с аутизмом в определённой доле, превышающей стохастический уровень (6,2%).

Рис. 5. Флюоресцентная in situ гибридизация (FISH) с центромерными ДНК зондами на хромосомы X и Y у мальчика 6 лет с идиопатическим аутизмом.

Частота мозаичной анеуплоидии выше фонового уровня была обнаружена у 19 (16,4%) из 116 детей с идиопатическим аутизмом, а в контрольной группе не было ни одного случая превышения фонового уровня. В частности, было обнаружено 8 случаев дополнительных хромосом 9 и 15 и потери хромосом 15, 16 и 18, а также 11 случаев дополнительной хромосомы X (дисомия X). Все эти случаи были классифицированы как мозаицизм низкого уровня. Анеуплоидия низкого уровня хромосом 1, 17 и Y не была обнаружена: это означает, что мозаичная анеуплоидия при аутизме хромосомоспецифична, и чаще всего встречается в виде дополнительной хромосомы X. Установленная частота случаев мозаичной анеуплоидии (16,4%) у детей с аутизмом заметно отличалась от этого показателя в контрольной группе (0%). Уровень стохастических потерь и приобретения аутосом и дополнительной хромосомы X был примерно одинаков в обеих группах (р=0,83, р=0,39, соответственно, и р=30) (табл. 4).

Табл. 4. Частота мозаичной анеуплоидии у детей с аутизмом и в контрольной группе

Хромосомы (моносомия/трисомия) Спорадическая анеуплоидия (контроль), средний уровень (95%С1); M+3SD Спорадическая анеуплоидия (аутизм); средний уровень <95%CI); M+3SD Малопроцентный мозаицизм у детей с аутизмом (M+3SD)

Моносомия 1 Трисомия1 0,7 (0,4-1,0); 2,7 0,1 (0,1-0,2); 0,4 0,6(0,4-0,8); 1,5 0,1 (0,1-0,2); 0,4 —

Моносомия 9 Трисомия 9 0,5(0,3-0,7); 1,7 0,2(0,1-0,2); 0,5 0,6(0,3-0,8); 1,8 0,3 (0,2-0,5); 0,9 Трисомия 9 (2,1; 3,1)

Моносомия 15 Трисомия 15 0,7 (0,4-0,9); 1,8 0,2 (0,1-0,3); 0,8 0,6 (0,3-0,9); 1,7 0,2(0,1-0,3); 0,5 Моносомия 15 (2,2; 2,6; 4,6) Трисомия 15 (1,2)

Моносомия 16 Трисомия !6 0,6(0,3-0,8); 2,1 0,1 (0,1-0,3); 0,4 0,4(0,2-0,6); 1,3 0,2 (0,1-0,3); 0,5 Моносомия 16(3,0)

Моносомия 17 Трисомия 17 0,3 (0,1-0,2); 1,0 0,1 (0,1-0,2); 0,4 0,4(0,3-0,6); 1,3 0,2 (0,1-0,2); 0,5 z

Моносомия 18 Трисомия 18 0.7 (0,3-0,9); 1,6 0,2 (0,1-0,3); 0,8 1,0 (0,4-1,3); 2,2 0,3 (0,2-0,4); 0,9 Моносомия 18 (2,7)

Дополнительная хромосома X 1,1(0,9-1,3); 3,7 1,0 (0,8-1,2); 3,6 Дополнительная хромосома X (4,0; 4,3; 4,5; 4,8; 5,6; 5,9; 6,2; 7,0; 8,5; 11,0; 11,6)

Потеря хромосомы Y Дополнительная хромосомаY 0,2 (0,0-0,3); 0,5 0,5 (0,3-0,7); 1,5 0,2 (0,0-0,3); 0,8 0,4 (0,2-0,7); 2,0

При рассмотрении данных, полученных при исследовании хромосомного мозаицизма в группе детей с идиопатическим аутизмом, обращает на себя внимание тот факт, что не обнаружены случаи анеуплоидии с превышением

стохастического уровня по некоторым аутосомам. Это может объясняться тем, что анеуплоидии по этим хромосомам, насыщенным генами, даже в мозаичном варианте детальны для эмбрионов, и такие эмбрионы гибнут на ранних этапах внутриутробного развития. Кроме того, интересен факт отсутствия случаев превышения стохастического уровня потери хромосомы У у мальчиков; можно предположить, что хромосома У каким-то образом «устойчива» к потерям; возможно также, что эмбрионы с мозаичной формой нулисомии хромосомы У, как и эмбрионы с моносомией хромосомы X, нежизнеспособны и по большей части гибнут внутриутробно на ранних сроках беременности.

III. Результаты исследований в группе 3.

В связи с ранее опубликованной гипотезой об Х-сцепленной природе аутизма [1оигоу е1 а1., 2007; Уигоу й а1., 2007] и очевидным преобладанием мальчиков среди детей с аутистическими расстройствами было решено провести исследования в группе матерей детей с аутизмом. Была обследована репрезентативная группа из 96 матерей. У детей этих матерей кроме аутизма наблюдалась умственная отсталость различной степени тяжести, ЗПРР/ЗПМР. Возраст обращения матерей в генетическую консультацию варьировал от 24 до 60 лет (средний - 33,5 лет). Средний возраст в период рождения ребенка с аутизмом составил 27,4 года (от 17 до 45 лет). Контрольную группу составили 60 женщин, не имеющих детей с аутистическими расстройствами, в возрасте от 24 до 48 лет (средний возраст 33,2 года). Результаты цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований 70 матерей детей с аутизмом, имеющих хромосомные аномалии и варианты, представлены в таблице 5. У 26 матерей выявлен кариотип 46,XX.

Табл. 5. Результаты цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований матерей детей с аутизмом (п=70). _

№ Возраст (*) Показания к исследованию Кариотип

Мате ри детей с хромосомными аномалиями и вариантами хромосом

1 32года(25) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 47.ХХХ/46.ХХ

2 47лег(35) мать ребенка с ранней формой аутизма 45,Х, 10Ь-,9рЬд11,16чЬ-/46,ХХ, 1 дЬ-,9рЬч11,16чЬ-

3 29лет (21) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,ХХ,с1ир(21 Хч21 ч21)

4 27лег (23) мать ребенка с задержкой речи до 4л, аутизмом и относит, сохран. интеллектом; у матери - дисфункция яичников 45.Х/46.ХХ Обнаружена хромосомная нестабильность

5 32года (28) мать ребенка с ранней формой аутизма 45Д/47ЛХ,+ша1<аег(Х))/4«ЛХ

6 42года (26) мать ребенка с аутизмом и умственной отсталостью 47ДХХ/45.Х/46ЛХ

7 35лет(31) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 45Д/46ДХ

8 31 год (22) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 45Л,9рЬдЬ/47ЛХХ,9рЬч11/46,ХХ,9р11д11

9 32года (28) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 45Д,9рЫ47ДХХ,9рЫ48ДХХХ,9рЬ/46ДХ,9рЬ

10 29лет(25) мать ребенка с ранней формой аутизма; у матери - высокий рост, микроцефалия, микрогнагия 45Л1 р1цЬ/46,ХХ, 1 рЬцЬ

11 35лег(27) мать ребенка с ранней формой аутизма 47ДХХ/46.ХХ

12 ЗЗгода(29) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 45.Х/46.ХХ

13 35лег (29) мать ребенка с ранней формой аутизма 45,Х Д2рз1к+/47 ДХ,+18,22р51к+/47,ХХХ,22р51к+/ 45.ХХ.-18, 22р!Лк+/46,ХХ,22рЯк+

14 27лет (22) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 45.Х, 1 рЬчЬ/46,ХХ, 1 рЬчЬ

15 29лег(25) мать ребенка с атипичной формой аутизма 45 Д ,21 рБ5/46,ХХ,21 рее

16 37лет(33) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 45Д,9дЬ-/47ДХХ,9д11-/46ЛХ,9р11-

Мате эи детей с вариантами хромосом, без хромосомных аномалий

17 ЗОлет(28) мать ребенка с аутизмом и MAP 46,XX,lqh-

18 27лет(21) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,lphqh

19 27лет(23) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,lphqh

20 38лет(29) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,lphqh

21 34года (29) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,lphqh

22 27лет(22) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,XX,lphqh

23 34года(27) мать ребенка с умственной отсталостью и признаками аутизма 46,XX,lphqh

24 ЗЗгода(27) мать ребенка с аутизмом, ЗПРР, MAP 46IXX,lphqh

25 29лет(22) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46,XX,lphqh

26 ЗОлет(22) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46,XX,9qh+

27 40лет(35) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46ЛХ,9рЬ

28 ЗОлет(25) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46,XX,9qh-

29 47лет(23) мать ребенка с синдромом Аспергера 46,XX,9qh-

30 31 год (27) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46,XX,9phqh

31 37лет(30) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46,XX,9phqh

32 35лет(27) мать ребенка с синдромом Аспергера и аномалиями кистей 46,XX,9qh-

33 32года(25) мать ребенка с ЗПР и аутизмом 46,XX,9qh+

34 ЗОлет(27) мать ребенка с ЗПР и аутизмом 46,XX,9phqh

35 ЗОлет(26) мать ребенка с ЗПР и аутизмом 46,XX,9phqhqh+

36 31 год (26) мать ребенка с ЗПР и аутизмом 46,XX,9phqh

37 26лег(23) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,XX,9phqh

38 27лет(22) мать ребенка с аутизмом и пороком головного мозга 46,XX,9qh+

39 43года (36) мать ребенка с аутизмом и умственной отсталостью 46,XX,9phqh

40 40лет(34) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,16qh-

41 41год (33) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,l6qh-

42 28лет(25) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46.XX,16qh-

43 24года(21) мать ребенка с аутизмом и MAP 46 ДХ, 16qh-

44 35лет(30) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46ДХ, 13pstk+

45 32года (26) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46JCX,13pstk+

46 40лет(38) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46ДХ, 15cenh+

47 25пет(21) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,XX,l5phqh

48 25лет(19) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46,XX,20ph+

49 26лет(17) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46.XX.2 lps+

50 35лет(32) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,lphqh,9phqh

51 24года (20) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46.XX, 1 phqh,9phqh, 16qh-

52 48лет(45) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XX,lphqh,9phqh,9phqh

53 38лет(33) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,XX,lphqh qh-,9qh-,21pstk+

54 35лет(29) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46ДХ, 1 qh-,9qh-, 15pss, 16qh-

55 32года(23) мать ребенка с идиопатическим аутизмом; хронич. пиелонефритом, косоглазием, дальнозоркостью, ожирением, микроцефалией (обучалась в интернате для детей-инвалидов) 46.XX, 1 phqh, 16qh-

56 39лет(36) мать ребенка с ранней формой аутизма, гидронефрозом, ЗФР; косоглазием, преждеврем. старением, гирсутизмом рук, ВПС 46,XX,lphqM5ceiih+

57 39лет (34) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,XX,lqh-,22ceiih+

58 Зблет(25) мать ребенка с ранней формой аутизма, лицевыми аномалиями, микроцефалией 46,XX, 1 phqh, 12cenh+

59 ЗЗгода(27) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46,XY,1 phqh,9phqh, 13pss, 14pss, 17ph+

60 29лет(23) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46 Д Y, 1 phqh, 14pstk+, 15pss

61 31 год (26) мать ребенка с ранней формой аутизма 46,XX,lphqh,9phqh

62 34года (27) мать ребенка с ЗПРР и аутизмом 46 ДХ ,9phqh, 16qh+

63 34года (27) мать ребенка с ранней формой аутизма 46J(X,9qh+,9phqh,16qh-

64 34года (29) мать ребенка с ранней формой аутизма 46JCX,9qh+,22pstk+

65 ЗОлет(23) мать ребенка с идиопатическим аутизмом 46^X,9ph,9phqh

66 31 год (27) мать ребенка с ранней формой аутизма MAP 46^iX,9phqh,9qh+

67 37лет(27) мать ребенка с аутизмом, MAP, сниженным интеллектом 46,XX,9phqh,13ps+pstk+

68 ЗЗгода(29) мать ребенка с ранней формой аутизма 46J(X,9qh-,l6qh-

69 Зблет(32) мать ребенка с ранней формой аутизма 46^X,14pss,15pstk+

70 29лет(25) мать ребенка с аутизмом и MAP 46ЛХ, 15cenh+, 15phqh

(*) Возраст матери в момент рождения ребенка

После проведения цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований в группе матерей детей с аутизмом был определён удельный вес хромосомных аномалий и гетерохроматиновых вариантов, что представлено на рисунке 6.

□ I - матери с хромосомньми аномалиям

□ II - матери с хромосомньми аномалиям и вариантами

□ III - матери с хромосомньми вариантами

□ IV- матери с нормальньм кариотапом

Рис. 6. Удельный вес хромосомных аномалий, вариантов и их сочетания у матерей детей с аутизмом.

В группе 3 были обнаружены хромосомные аномалии в 16,6% случаев, из них 8,3% с вариантами, а гетерохроматиновые варианты - в 64,6% случаев, из них 8,3% с аномалиями хромосом. При изучении результатов цитогенетических и молекулярно-цитогенетических исследований в группе матерей детей с аутизмом можно заключить следующее: 1) обнаружена высокая частота хромосомных аномалий у матерей детей с аутизмом, в основном в виде мозаичных форм численных аномалий хромосомы X, в том числе в виде мозаичных форм синдрома Шерешевского-Тернера, трисомии хромосомы X, а также дополнительных маркерных хромосом, происхождение которых было от хромосомы X; кроме того, у одной из этих матерей обнаружена дупликация хромосомы 21 в участке ц21 во всех клетках, у другой - моносомия хромосомы 18 в одном из 5 мозаичных клонов, причём клоны присутствовали в небольшой доле клеток - от 4 до 25%; в одном случае хромосомной аномалии как у матери, так и у ребёнка выявлена и хромосомная нестабильность в виде дополнительных неспецифических транслокаций; 2) в половине из всех случаев хромосомных аномалий обнаружены ещё и хромосомные варианты, и в 3 случаях хромосомные аномалии у матерей и детей были идентичны; 3) идентичная у матери и её ребенка нестабильность хромосом в виде неспецифических моносомий, транслокаций и делеций наблюдалась в 2 случаях; 4) обнаружена высокая частота хромосомного гетероморфизма (хромосомных вариантов) у матерей детей с аутистическими расстройствами по сравнению с контрольной группой (5%); эти изменения выявлены у 62 матерей (64,6%), включая 8 матерей с аномалиями хромосом; сочетанные варианты встречались в 22 случаях, максимальное число вариантов у индивидуума — 5; число вариантов на индивидуума в среднем 1,58; 5) определение геномных изменений у больных

8,3%

58,3%

детей и их матерей значимо для идентификации генетических и нейробиологических маркёров аутистических расстройств; 6) при анализе корреляций «генотип-фенотип» обнаружены когнитивные нарушения и спонтанные аборты у матерей детей с аутизмом, имеющих хромосомные аномалии, а также умственная отсталость, смерть в раннем возрасте и нарушения репродуктивной функции у родственников этих женщин; 7) обнаружены пороки развития у родственников тех матерей детей с аутизмом, у которых обнаружены хромосомные варианты; 8) цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования матерей и детей с аутизмом должны рассматриваться как обязательные для выявления возможных генетических причин аутизма и для генетического консультирования семей, в которых есть дети с заболеваниями аутистического спектра.

В группе матерей детей с аутизмом преобладают различные гетерохроматиновые варианты хромосом 1 (12% от общего числа пациентов, с учётом сочетанных вариантов - 25,5%) и 9 (17%, с учётом сочетанных вариантов - 37,8%). Это может быть объяснено следующим: 1) варианты этих хромосом вообще чаще всего встречаются в любой популяции, так как гетерохроматиновые блоки этих хромосом чаще всего варьируют в размерах и подвержены перицентрическим инверсиям (инверсии гетерохроматина хромосомы 16 не встречаются); 2) варианты других хромосом довольно редки. Сочетанные хромосомные варианты наиболее часто включают в себя различные изменения гетерохроматиновых участков хромосом 1 и 9. Удельный вес каждого из сочетанных хромосомных вариантов указан на рисунке 7. Высокая частота изолированных и сочетанных вариантов хромосом 1 и 9 может служить дополнительным маркёром риска нарушений психики в группе матерей детей с аутизмом. В контрольной группе хромосомные варианты в виде ЦЬ+ и 9цЬ+ встречались в 3 (5%) из 60 случаев. Общая частота гетерохроматиновых вариантов в контрольной и обследованных группах достоверно отличались друг от друга (р<0,05).

Суммируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что определение геномных изменений у больных детей и их матерей значимо для идентификации маркёров аутистических расстройств. Обнаружено повышение частоты когнитивных нарушений у 9 матерей (9,4%) и спонтанных абортов у 23 (24%) матерей детей с аутизмом, а также увеличение в семье случаев умственной отсталости (в 5 раз), смерти в раннем возрасте (в 4-5 раз) и нарушений репродуктивной функции (в 2 раза) в родословных матерей детей с аутизмом, имевших хромосомные аномалии. Выявлены пороки развития в родословных матерей с хромосомными вариантами. Все это может свидетельствовать в пользу сегрегации случаев хромосомной (геномной) патологии в этих семьях. Несомненно, цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования матерей и детей с аутизмом должны рассматриваться как обязательные для выявления возможных генетических причин аутизма и для генетического консультирования семей, в которых имеются дети с аутистическими расстройствами. Проведён анализ

Кариотш 6езхрспосошмх*ар1шао! ■

сортам» ирнипы п гарнакты по:

^омгхож« 1 ■

Ч»ГЮСОЖ«3 °

эроНосом« 13 ■

ЗфОШХОЖ« в

ЧЮМОСОМС 16 О

ДОПЭЮК« X □

зтожэсоже 21 Н

}ДОЮсолге22 В

Рис. 7. Удельный вес каждого хромосомного варианта у матерей детей с аутизмом, наследуемости по материнской линии хромосомных аномалий (мозаицизма) и вариантов, нестабильности хромосом в семьях детей с аутизмом (рис. 8). На рисунке представлен анализ матерей детей с аутизмом с хромосомными аномалиями (мозаицизм) и вариантами и нестабильностью хромосом (генома): если ребёнок наследовал одну из клеточных линий (при мозаицизме), хромосомные варианты или хромосомную (геномную) нестабильность от матери, то это обозначено в соответствующих клетках. Из рисунка видно, что подобные случаи встречались в данной группе весьма часто - у 39 матерей (40,6% от общего числа матерей).

Выявление цитогенетических аномалий и моногенный характер некоторых заболеваний, связанных с аутизмом, указывает на генетическую гетерогенность и различные закономерности их наследования в отдельных семьях. Вероятно, для идиопатического аутизма, то есть случаев с неизвестной причиной, возможны моногенные, полигенные и мультифакторные механизмы наследования. Можно предположить, что для изучения природы аутистических расстройств необходимо рассматривать эти заболевания как в контексте взаимодействия генов, так и эпигенетических механизмов.

В настоящее время роль генетических факторов в возникновении большой части случаев идиопатического аутизма у детей не вызывает сомнения. Известно, что хромосомные перестройки и аномалии являются наиболее частой формой наследственной патологии у детей. Поиск различных специфических и неспецифических хромосомных аномалий и вариаций у детей с аутизмом является необходимым этапом диагностических исследований. Хромосомные аномалии являются причиной нарушения генного баланса и функциональной активности генома клетки, эпигенетических изменений, связанных, по-видимому, с эффектом положения генов, и часто

1 2 3 1 2 3 12 :

:

Е

Рис. 8. Наследуемость по материнской линии хромосомных аномалий (мозаицизма), вариантов и хромосомной нестабильности в семьях с аутизмом. Вертикальный ряд 1 — хромосомные аномалии (мозаичные формы); 2 — хромосомные варианты; 3 — нестабильность хромосом. Горизонтальные ряды соответствуют наложению признаков (1, 2, 3) в паре ребенок-мать. Серым цветом обозначены случаи, когда ребенок от матери наследовал одну из клеточных линий (в случае мозаицизма) или один из хромосомных вариантов. Черным цветом — у ребенка наблюдались те же клеточные линии (в случае мозаицизма); такие же варианты и/или хромосомная нестабильность матери.

инициируют патологические процессы в клетках головного мозга. Современные цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования, направленные на идентификацию хромосомных аномалий среди детей с аутизмом, позволят не только выявить те или иные численные и структурные аномалии, но и картировать гены психических болезней. Сложный, трудный в изучении феномен нестабильности генома может лежать в основе патогенеза наследственных нервных и психических заболеваний, в том числе и аутизма. Актуальность исследований генома очевидна и заключается в том, что с помощью этих методов можно провести детальный анализ структурных особенностей генома в группе лиц с аутизмом для обнаружения возможных генетических причин патологических проявлений, входящих в перечень признаков данного заболевания. Нами было проведено исследование с помощью данных методов в группах детей с аутизмом и их матерей, что позволило выявить причину части случаев аутизма. После проведения этих исследований в когорте детей с аутизмом и в группе матерей

таких детей было обнаружено, что во всех 3 исследованных группах численные и структурные хромосомные аномалии, а также гетерохроматиновые варианты хромосом встречаются с частотой, большей чем в общей популяции. В первой группе детей с аутизмом обнаружены хромосомные аномалии в 10,8% случаев, что превышает частоту аномалий в общей популяции (до 1%), и сравнимо с частотой хромосомных аномалий в когорте детей с умственной отсталостью [Ворсанова и др., 2006]. Среди обнаруженных в I группе детей с аутизмом встречались разнообразные структурные аномалии хромосом как в виде транслокаций, инверсий эухроматина, дополнительного материала хромосом, маркерных хромосом, кольцевой хромосомы 22, так и в виде численных аномалий, чаще хромосомы X; отмечен очень редкий случай, где у мальчика с аутизмом, аномалиями поведения и микрогематурией обнаружена сложная хромосомная аномалия, сочетающая в себе структурную перестройку в виде псевдоизодицентрической хромосомы У с численными мозаичными аномалиями в виде потери и удвоения данной перестроенной хромосомы У (рис. 9).

if ft

д -

3 т.

I II I

О Я и II it Si Н 4V ЛЙ п

6 7 8 9 10 11 12

№ 13 Эй •• m 14 «1 и 15 1« 2а м 18

SS 18 «в АЬ ! ии«х ^

Рис. 9. Хромосомная аномалия (псевдоизодицентрическая хромосома Y) у мальчика с аутизмом, сниженным интеллектом, аномальным поведением и микрогематурией -кариотип: 46,X,psu idic(Y).

Определён удельный вес хромосомных, или гетерохроматиновых, вариантов в группе детей с аутизмом. Частота изолированных и сочетанных вариантов значимо превышает частоту гетерохроматиновых вариантов в общей популяции, что позволяет выдвинуть гипотезу об определённой роли гетерохроматиновых вариантов в генезе аутизма. Эта проблема требует дальнейшего всестороннего изучения с применением различных современных технологий.

Следует отметить, что большую долю (50-60%) хромосомных аномалий у новорождённых составляют численные аномалии хромосом [Jacobs, Hassold, 1995; Iourov et al., 2006]. При аномалиях такого рода необходимо цитогенетическое исследование, но мозаичные формы анеуплоидий сложны

для выявления этим методом «скрытого» низкопроцентного хромосомного мозаицизма. Для выявления хромосомного мозаицизма проведены исследования с применением флюоресцентной in situ гибридизации (FISH) во всех трёх группах: в 1-ой группе той части пациентов, где FISH-метод был необходим для уточнения хромосомной патологии; во 2-ой группе для поиска возможного хромосомного мозаицизма; в 3-ей группе матерей детей с аутизмом для поиска мозаицизма хромосомы X и генетических маркёров аутизма. Были также обнаружены случаи малопроцентного мозаицизма различных аутосом, причём уровень такого мозаицизма превышал стохастический. У довольно большой части группы матерей детей с аутизмом (16,6%) обнаружен малопроцентный хромосомный мозаицизм, причём не только хромосомы X, но и мозаицизм аутосом (хромосома 18). Таким образом, хромосомный мозаицизм - новый генетический фактор аутизма. В отдельных случаях проводили молекулярно-цитогенетические исследования (HR CGH). Отбор пациентов для этих исследований основывался на наличии у них аутизма, выраженной умственной отсталости, множественных микроаномалий при нормальном кариотипе [Iourov et al., 2008]. Данный метод показал высокую эффективность в обнаружении субмикроскопических хромосомных (геномных) перестроек, которые невозможно обнаружить классическими цитогенетическими методами. Таким образом, на основании проделанных исследований можно сделать соответствующие выводы. Выводы:

1) определена частота хромосомных аномалий в российской когорте детей с аутистическими расстройствами, которая составила 10,8%;

2) определён вклад мозаичных форм хромосомной патологии в виде малопроцентного хромосомного мозаицизма в группе мальчиков с идиопатическим аутизмом, не выявляемого при цитогенетическом анализе, составляющий 16,4%;

3) определена частота хромосомных вариаций в виде гетероморфизма гетерохроматиновых участков хромосом в когорте детей, страдающих аутизмом, составляющая 53,9%;

4) в группе матерей детей с аутизмом обнаружена высокая частота хромосомных аномалий (16,6%) в виде мозаичных форм численных аномалий хромосомы X, в том числе в виде мозаичных форм синдрома Шерешевского-Тернера, трисомии хромосомы X, дополнительных маркерных хромосом - дериватов хромосомы X, и хромосомная нестабильность, что указывает на высокую частоту генетической предрасположенности к заболеваниям в семьях детей с аутизмом;

5) обнаружена высокая частота хромосомных вариаций в виде гетероморфизма гетерохроматиновых участков хромосом (хромосомных вариантов) у матерей детей с аутистическими расстройствами, составляющая 64,6%;

6) на основе полученных данных предложена гипотеза о связи вариаций гетерохроматиновых участков генома с аутистическими расстройствами;

7) показано, что применение современных высокоинформативных молекулярно- цитогенетических методов необходимо для эффективного выявления хромосомных (геномных) аномалий в группе детей с аутистическими расстройствами;

8) оценён вклад хромосомных аномалий, хромосомного мозаицизма (в виде мозаичной анеуплоидии) и гетероморфизма гетерохроматиновых участков хромосом в этиологию аутизма, а также предложены рекомендации для внедрения молекулярно-цитогенетической технологий в практику медико-генетического консультирования.

Список сокращений ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЗПМР - задержка психомоторного развития ЗПРР - задержка психоречевого развития MAP — микроаномалии развития пн - пары нуклеотидов

HR CGH — high resolution comparative genomic hybridization (сравнительная геномная гибридизация высокой степени разрешения) FISH - fluorescent in situ hybridization (флюоресцентная in situ гибридизация) Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Vorsanova, S.G. Non-disjunction of chromosome 21, alphoid DNA variation, and sociogenetic features of Down syndrome / S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, A.K. Beresheva, I.A. Demidova, V.V. Monakhov, V.S. Kravets, O.B. Bartseva, E.A. Goyko, I.V. Soloviev, Y.B. Yurov // Цитология и Генетика. -2005. - T.39, №6. - С. 30-36.

2. Vorsanova, S.G. Analyses cytogenetiques et FISH d'une population clinique d'un hopital pediatrique / S.G. Vorsanova, Y.B. Yurov, I.V. Soloviev, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, A.D. Kolotii, V.S. Kravets, V.V. Monakhov, I.Y. Iourov // Medecine Science. - 2006. - Vol.22. - Hors de serie №2. - P. 57.

3. Ворсанова, С.Г. Идентификация генетических маркеров аутистических расстройств: хромосомные варианты и аномалии у детей с аутизмом [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, В.Ю. Воинова-Улас, B.C. Кравец, НЛ. Горбачевская, Ю.Б.Юров // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Материалы российской научной конференции с международным участием. - Том I. - Курск: КГМУ. - 2006. -С. 457-460.

4. Vorsanova, S.G. Molecular cytogenetic study of low-level chromosomal mosaicism in children with autism by interphase FISH / S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, V.Y. Voinova-Ulas, N.L. Gorbachevskaya, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.V. Monakhov, V.S. Kravets, A.D. Kolotii, Y.B. Yurov // Proceedings of the 7th Balkan Meeting of Human Genetics. - 2006. - P.32. - Balkan Journal of Medical Genetics.2006.Vol.9, N 3&4,- P.61.

5. Vorsanova, S.G. Increased rate of low-level chromosomal mosaicism in autism: an interphase FISH survey / S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, V.Y. Voinova-Ulas, N.L. Gorbachevskaya, A.D. Kolotii, A.K. Beresheva, I.A. Demidova, V.S.

Kravets, V.V. Monakhov, Y.B.Yurov // American Journal of Medical Genetics Part B: Neuropsychiatric Genetics. - 2006. - Vol.l41B. - Issue 7. - P. 770.

6. Кравец, B.C. Необычная ломкость хромосом у ребенка с умственной отсталостью [Текст] / B.C. Кравец, С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, М.В. Прыткина, Н.С. Айрапетова, Ю.Б. Юров // Материалы V Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». -2006. - С.57.

7. Кравец, B.C. Хромосомная нестабильность, связанная с анеуплоидией хромосомы X и полиплоидией, у матери ребенка с синдромом Дауна [Текст] / B.C. Кравец, И.Ю. Юров, А.К. Берешева, Ю.Б. Юров, С.Г. Ворсанова // Материалы V Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - 2006. - С.57-58.

8. Ворсанова, С.Г. Вариабельность гетерохроматиновых районов хромосом и хромосомные аномалии у детей с аутизмом: идентификация генетических маркеров аутистических расстройств [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, В.Ю. Воинова-Улас, B.C. Кравец, И.В. Соловьев, H.JI. Горбачевская, Ю.Б. Юров // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 2006. - Т. 106, №6. - С.52-57.

9. Ворсанова, С.Г. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, B.C. Кравец, А.К. Берешева, В.Ю. Воинова-Улас, H.JI. Горбачевская, В.В. Монахов, А.Д. Колотий, Ю.Б. Юров // Сборник материалов XI Конгресса Педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». - Изд.: ГОЭТАР-Медиа. - 2007. - С.147.

10. Yurov, Y.B. Frequency of mosaic aneuploidy in children with idiopathic autism / Y.B. Yurov, S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.S. Kravets, V.V. Monakhov, A.D. Kolotii, V.Y. Voinova-Ulas, N.L. Gorbachevskaya // European Journal of Human Genetics. - 2007. - Vol.15. -Suppl. 1. - P.102.

11. Yurov, Y.B. Aneuploidy and confined chromosomal mosaicism in the developing human brain / Y.B. Yurov, I.Y. Iourov, S.G. Vorsanova, T. Liehr, A.D. Kolotii, S.I. Kutsev, F. Pellestor, A.K. Beresheva, I.A. Demidova, V.S. Kravets, V.V. Monakhov, I.V. Soloviev // PLoS (Public Library of Science) ONE. - 2007. -Vol.2. - Issue.6. - e558.

12. Vorsanova, S.G. Idiopathic autism is frequently associated with low-grade chromosomal mosaicism / S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.S. Kravetz, A.D. Kolotii, O.S. Kurinnaya, V.Y. Voinova-Ulas, N.L. Gorbachevskaya, Y.B. Yurov // Chromosome Research. - 2007. - Vol. 15. - Suppl. l.-P. 28.

13. Yurov, Y.B. Unexplained autism is frequently associated with low-level mosaic aneuploidy / Y.B. Yurov, S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.S. Kravetz, V.V. Monakhov, A.D. Kolotii, V.Y. Voinova-Ulas, N.L. Gorbachevskaya // Journal of Medical Genetics. - 2007. - Vol.44. -Issue.8. - P. 521-525.

14. Vorsanova, S.G. Variability in the heterochromatin regions of the chromosomes and chromosomal anomalies in children with autism: identification of genetic markers of autistic spectrum disorders / S.G. Vorsanova, I.Yu. Yurov, I.A. Demidova, V.Yu. Voinova-Ulas, V.S. Kravets, I.V. Solov'ev, N.L. Gorbachevskaya, Yu.B. Yurov // Neuroscience and Behavioral Physiology. - 2007. - Vol.37, N 6. - P. 553-558.

15. Iourov, I.Y. Molecular neurocytogenetic survey of intercellular genomic variations manifesting as aneuploidy in the human brain / I.Y. Iourov, S.G. Vorsanova, T. Liehr, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, A.D. Kolotii, V.S. Kravets, V.M. Vostrikov, V.V. Monakhov, N.A. Uranova, I.V. Soloviev, F. Pellestor, Y.B. Yurov // European Journal of Human Genetics. - 2007. - Vol.15. - Suppl. 1. -P.116-117.

16. Ворсанова, С.Г. Современные молекулярно-цитогенетические технологии в диагностике аутизма у детей [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, А.К. Берешева, А.Д. Колотий, B.C. Кравец, В.В. Монахов, В.Ю. Воинова-Улас, H.JI. Горбачевская, Ю.Б. Юров // Материалы VI Российского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». - 2007. - С. 57.

17. Yurov, Y.B. Genomic instability in the schizophrenia brain: highlighting new mechanism for pathopsychophysiology of brain diseases / Y.B. Yurov, I.Y. Iourov, S.G. Vorsanova, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.S. Kravets, V.V. Monakhov, A.D. Kolotii, I.V. Soloviev, V.M. Vostrikov, N.A. Uranova, T. Liehr // International Journal of Psychophysiology. - 2008. - Vol.69. - Issue.3. - P. 241.

18. Vorsanova, S.G. Interindividual and intercellular genomic variations significantly contributes to pathophysiology of autism / S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.Y. Voinova-Ulas, V.S. Kravets, A.D. Kolotii, V.V. Monakhov, O.S. Kurinnaya, I.V. Soloviev, N.L. Gorbachevskaya, Y.B. Yurov // International Journal of Psychophysiology. - 2008. - Vol.69. -Issue.3. - P. 288-289.

19. Ворсанова, С.Г. Возможные причины нерасхождения хромосом в половых и соматических клетках: поиск экзогенных факторов, влияющих на возникновение анеуплоидии [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, А.К. Берешева, А.Д. Колотий, B.C. Кравец, В.В. Монахов, И.В. Соловьев, О.С. Куринная, Ю.Б. Юров //Материалы VII Российского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва. - 2008. - С.72-73.

20. Кравец, B.C. Редкий случай дисомии хромосомы Y [Текст] / B.C. Кравец, О.В. Шатохина, И.Ю. Юров, И.В. Соловьев, С.Г. Ворсанова // Материалы VII Российского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва. - 2008. - С.83.

21. Vorsanova, S.G. Somatic chromosomal abnormalities in spontaneous abortions: a case-control study of 600 consecutive cases / S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, A.D. Kolotii, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, E.A. Kirillova, V.S. Kravets, V.V. Monakhov, O.S. Kurinnaya, E.A. Saprina, I.V. Soloviev, Y.B. Yurov // Paediatria Croatica. - 2009. - Vol. (Godiste) 53. - Suppl. 2. - P.34-35.

22. Yurov, Y.B. Chromosomal rearrangements, mosaicism and heteromorphism in children with idiopathic autism / Y.B. Yurov, S.G. Vorsanova, I.Y. Iourov, V.S. Kravets, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, A.D. Kolotii, V.Y. Voinova-Ulas, N.L. Gorbachevskaya // Chromosome Research. - 2009. - Vol. 17. - Suppl. 1. - S176.

23. Yurov, Y.B. Molecular neurocytogenetic survey of variations in chromosome numbers and arrangement in the schizophrenia brain / Y.B. Yurov, I.Y. Iourov, S.G. Vorsanova, A.K.Beresheva, I.A. Demidova, A.D. Kolotii, V.S. Kravets, V.V. Monakhov, I.V. Soloviev, V.M. Vostrikov, T. Liehr // European Journal of Human Genetics. - 2009. - Vol. 17. - Suppl. 2. - P.102.

24. Ворсанова, С.Г. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования аутистических расстройств: идентификация семейных диагностических маркеров [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, В.Ю. Воинова, О.С. Куринная, И.А. Демидова, B.C. Кравец, А.К. Берешева, Е.А. Саприна, И.В. Соловьев, Ю.Б. Юров // Вопросы Диагностики в Педиатрии. -2009.-Том 1, №3. - С. 20-25.

25. Кравец, B.C. Редкий случай маркерной хромосомы — деривата хромосомы 14 у ребенка с задержкой психоречевого развития и пороками развития [Текст] / B.C. Кравец, С.Г. Ворсанова, Г.Ю. Семина, В.Ю. Воинова, И.Ю. Юров, В.В. Монахов, Ю.Б. Юров // Материалы VIII Российского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва. - 2009. - С. 75.

26. Кравец, B.C. Диагностика наследственных форм аутизма у детей [Текст] / B.C. Кравец, С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, В.Ю. Воинова, Н.Л. Горбачевская, И.А. Демидова, Ю.Б. Юров, А.Д. Колотий, П.В. Новиков, А.К. Берешева, И.В. Соловьев // Материалы международной научной конференции-семинара «Современные методы психологии» Москва. — 2010. -С. 57-60.

27. Ворсанова, С.Г. Применение современных молекулярно-цитогенетических технологий для оценки хромосомной нестабильности в пре- и постнатальном периодах: возможные механизмы образования мозаицизма у детей с умственной отсталостью и аутизмом [Текст] / С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, А.Д. Колотий, И.А. Демидова, А.К. Берешева, О.С. Куринная, B.C. Кравец, В.В. Монахов, И.В. Соловьев, Ю.Б. Юров // Материалы IX Российского конгресса: «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии», Москва. - 2010. -С.87.

28. Юров, И.Ю. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом [Текст] / И.Ю. Юров, С.Г. Ворсанова, О.С. Куринная, И.А. Демидова, А.К. Берешева, B.C. Кравец, Ю.Б. Юров // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии. Материалы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Курск: КГМУ. - 2011. - С.121-122. (ISBN 978-57487-1484-6)

29. Kolotii, A.D. Rare case of 46,X,idic(X)(pl 1.2)/46,XX mosaicism in autistic child with developmental delay: a karyotypic marker of X chromosome isodisomy and an X-linked mutation / A.D. Kolotii, S.G. Vorsanova, V.Y. Voinova, O.S.

Kurinnaia, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.S. Kravets, I.V. Soloviev, Y.B. Yurov, I.Y. Iourov // European Journal of Human Genetics. - 2011. - Vol. 19. -Suppl. 2.-P.154.

30. Iourov, I.Y. Non-malignant aneuploidization of the human brain is a susceptibility factor for complex neuropsychiatric diseases / I.Y. Iourov, S.G. Vorsanova, A.D. Kolotii, T. Liehr, I.A. Demidova, A.K. Beresheva, V.S. Kravets,

0.5. Kurinnaia, I.V. Soloviev, Y.B. Yurov // Abstract book - The 9th Balkan congress of medical genetics, Timisoara, Romania — L05 / Keynote Lecture / Balkan Journal of Medical Genetics. - 2011. - Vol. 14. - Suppl. - P.9-10.

31.Кравец, B.C. Редкий случай дупликации хромосомы 22 у ребенка с задержкой психоречевого и физического развития [Текст] / B.C. Кравец, Е.А. Николаева, И.Ю. Юров, А.Д. Колотий, Т. Лиер, С.Г. Ворсанова // Материалы X Российского конгресса: «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва. - 2011. - С.82-83.

32. Кравец, B.C. Тетрасомия хромосомы X у мальчика 6 месяцев с задержкой психомоторного развития [Текст] / B.C. Кравец, С.Г. Ворсанова, А.Д. Колотий, О.С. Куринная, И.Ю. Юров // Материалы XI Российского конгресса: «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Приложение к журналу Российский Вестник Перинатологии и Педиатрии, Москва. - 2012. - Том 57, №5(2). - С.111.

33. Колотий, А.Д. Мозаичные форма хромосомных аномалий у детей с умственной отсталостью и задержкой полового развития: цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования [Текст] / А.Д. Колотий, С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, О.С. Куринная, B.C. Кравец, Ю.Б. Юров // Кшшчна Генетика i Перинатальая Дтгностика. - 2012. - №1(1). -С.55-66.

34. Iourov, I.Y. Mosaic copy number variation in the autism and schizophrenia brain: providing a basis for a new (mitotic) theory of neuropsychiatric diseases /

1.Y. Iourov, S.G. Vorsanova, I.A. Demidova, O.S. Kurinnaia, A.D. Kolotii, V.S. Kravets, M.A. Zelenova, T. Liehr, Y.B. Yurov // European Journal of Human Genetics. - 2013. - Vol. 21. - Suppl. 2. - P. 194.

35. Кравец, B.C. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования детей с аутизмом и их матерей [Текст] / B.C. Кравец, С.Г. Ворсанова, И.Ю. Юров, И.А. Демидова, А.Д. Колотий, О.С. Куринная, В.О. Шаронин, М.А. Зеленова, В.Ю. Воинова, М.И. Яблонская, Ю.Б. Юров // Материалы XII Российского конгресса: «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Раздел: Педиатрия. Приложение к журналу Российский Вестник Перинатологии и Педиатрии, Москва. - 2013. - Том 58, №5. - С.93-94.

36. Юров, Ю.Б. Нарушение регуляции клеточного цикла и апоптоза у детей с умственной отсталостью и аутизмом [Текст] / Ю.Б. Юров, С.Г. Ворсанова, И.А. Демидова, О.С. Куринная, А.Д. Колотий, B.C. Кравец, И.Ю. Юров // Сборник материалов XVII Конгресса педиатров России с международным участием «Актуальный проблемы педиатрии». Москва. -2014. - С.398. (ISSN: 1682-5527)

Подписано в печать 05.02.15 Гарнитура Times New Roman. Усл. п.л. 1,75 Формат 60x84/16 Заказ №256 Тираж: ЮОэкз.

Типография ООО "КОПИМАСТЕР" ИНН 7718871342 КПП 771801001 119049, г. Москва, Калужская площадь, дом 1, корпус 1 Телефон:(495) 229-56-62