Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Диагностические основы для медико-генетической профилактики синдрома Мартина-Белла (C. Fra (Xq27))

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Диагностические основы для медико-генетической профилактики синдрома Мартина-Белла (C. Fra (Xq27))"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК: 575. 174-616. 056. 7

РАКИШЕВА Зсрс Паяповиа

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДЛЯ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ СИНДРОМА МАРТИНА-БЕЛЛА (С. РЯЛ (Хч27))

03.00.15 - Гсисшка

Л в Т О 1> I- Ф црлт

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1993

Работа выполнена в Институте клинической генетики и профилактики наследственных болезней (директор - профессор Е.К.Гинтер) Медико-генетического научного центра РАМН (директор -член-корреспондент РАМН В.И.Иванов) и в лаборатории пренатальной диагностики Института акушерства и гинекологии РАМН (директор -профессор Э.К.Айламазян)

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Н.П.Кулешов

доктор медицинских наук, профессор В.С.Баранов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

В.А.Бахарев

доктор биологических наук О.В.Евграфов

Ведущая организация: кафедра медицинской генетики

ИI ici итуга усовсршс! 1ствова! шя врачей МЗ РФ

Защита диссертации состоится г.

в /3 часов на заседании Специализированного Совета Д.001.16.01 по адресу: Москва, 115478, ул.Москворечье, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "Ù.." .fê^fiûM.. 1993 г.

Ученый секретарь

Специализированного Совета Л.Ф.Курило

доктор биологических наук

профессор

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теиы. Сцепленная с полом умственная отсталость (синдром специфической ломкости X-хромосомы) после болезни Дауна является одним из наиболее распространенных наследственных дефектов. Заболевание характеризуется широким клиническим полиморфизмом в проявлении умственной отсталости, челюстно-лицевых дизморфий и других нарушений фенотипа, вплоть до их полного отсутствия. Выделение его в отдельную нозологическую форму стало возможным на основе идентификации специфического хромосомного признака - разрыва в дистальной части длинного плеча Х-хромосомы -fra(Xq27) /Sutherland, 1977/, С описанием ЭТОГО Маркера СТЭЛО возможным не только дифференцировать эту форму сцепленной с полом УО от' других форм олигофрении, но и, что особенно важно для генетической профилактики, выявлять признак fra(Xq27) у некоторой части гетерозигот, проводить пренатальную диагностику, предупреждая в части случаев рождение детей с этим тяжелым наследственным заболеванием /Sutherland, 1977; Turner et al., 1987; Howard-Peebles et al,, 1980; К. А. Бедельбаева, 1986/.

В последние годы в связи с развитием технологии ДНК-диагностики и достижениями в картировании Х-хромосомы разработан молекулярно-генетическин анализ, основанный на выявлении ПДРФ последовательностей ДНК, тесно сцепленных с мутантным локусом. Молекулярные исследования области Xq2 7 привели в 1991 году к идентификации самого гена, названного fmr-i (Fragile Mental Retardation) /Verkerk et al./. Было Доказано, ЧТО непосредственной причиной этого распространенного наследственного дефекта являются нарушения экспрессии гена fmr-1. Установлено, что подавляющая часть (около 97%) случаев синдрома обусловлено однотипной мутацией в первом экзоне гена fmr-1, представляющей собой гиперамилифпкацию триплетного повтора cgg, расположенного в непосредственной близости от промоторной части гена. Установлено, что становление мутации происходит в два этапа. Сначала число

повторов достигает 55-120 (в норме их количество варьирует от 2 до 50), при этом экспрессия гена не нарушается. Такое состояние (состояние премутации) характерно для мужчин - бессимптомных трансмиттеров и для матерей пробандов, На втором этапе, т. е. у больных, число триплетов сой увеличивается и достигает 125 и более. В результате блокируется процесс активации (диметилирование) промоторной части гена и последний не экспрессируется. Переход премутации в мутации происходит только в оогенезе у женщин, унаследовавших премутации от своих отцов -бессимптомных трансмиттеров /Уегкегк et а1,, 1991; НакаЬог1 е! а1., 1991; ОЬег1е еЬ а1., 1991; Р1еге1И а1., 1991/. Выяснение молекулярной природы синдрома ^а(Хч27) сделало возможным проведение его точной ДНК-диагностики.

Цели и задачи исследования. В СССР изучению синдрома

Гга(Хч27) не уделялось большого внимания ни в научном, ни в прикладном отношениях. Исследование, проведенное К.Бедельбаевой с Л.Барановской и Г.Маринчевой /1986/, было направлено на анализ клинического полиморфизма и выяснение факторов, влияющих на экспрессию хромосомного маркера.

Учитывая высокую медицинскую и социальную значимость этого заболевания, отсутствие данных о его распространенности в разных популяциях, недостаточную разработку методических подходов его профилактики, прежде всего подходов к выявлению носительства премутации гена рмй-1 со специфической ломкостью Х-хромосомы, целью планируемой работы явилась разработка комплексного молекулярно-генетического подхода изучения семей больных с синдромом ломкости Х-хромосомы для повышения эффективности его медико-генетической профилактики.

Конкретными задачами исследования были:

1) Оценить долю больных с У0, ассоциирующей с маркером Гга(Хч27) в контингенте детей, состоящих на диспансерном учете в

психоневрологических учреждениях г;Алма-Аты--------на основе -

комплексного клинического и клинико-цитогенетического обследования;

2) Провести цитогенетическое исследование, оценить частоту носительства ломкой Х-хромосомы в семьях (Зольных с снндромом

fтeí{Xq27 );

33 Отработать молекулярный метод диагностики с помощью внегенных ДНК-зондов и к-1х (ПДРФ), а также на основе

использования доступных внутригенных ДНК-зондов;

4) Оценить возможность молекулярной диагностики носительства премутации гена гм1?-1 в семьях высокого риска с целью организации эффективной профилактики этого заболевания.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В ходе работы принципиально изменена программа диагностики сцепленной с полом УО - синдрома Мартина-Белла, основанная на использовании внутригенных ДНК-зондов в системе ЕсоШ/Ох1.9 и Рни/0х0.55. На их основе показана возможность не только точной диагностики самого заболевания у пробандов, но и выявление носительства (премутации) в семьях высокого риска. В результате работы показаны и оценены количественные параметры соотношения вариантов паттерна патологических аллелей у больных с синдромом Иартина-Белла, выявленных с помощью ДНК-зонда 0x1.9, Результаты исследования доказывают отсутствие четкой корреляции ломкости Х-хромосомь: с длиной амплифицпрованного фрагмента ссо-повторов гена РМ1г-1. Показано, что цитогенетический маркер Ггп(х^2 7) экспрессируется не во всех случаях носительства мутантного гена рмк-1, т.е. его диагностическая информативность значительно ниже, чем молекулярных методов исследования.

На основании полученных результатов разработан комплексный метод диагностики синдрома Мартина-Белла и обоснована практическая программа медико-генетической профилактики этого инвалидиэирующего наследственного дефекта.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на vi съезде общества генетиков и селекционеров имени Н.И.Вавилова /октябрь, 1992, г.Минск/, на 2-й Всесоюзной конференции "Геном человека - 91" /Переславль-Залесский, 1991/.

Объеи диссертации. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 97 работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования явились больные с умственной отсталостью и их родственники. Проводилось клинико-генеалогическое изучение таких семей, цитогенетический анализ культивированных лимфоцитов периферической крови и ДНК-диагностика пробандов и членов их семей. Для оценки частоты синдрома Sra^xq2^) в населении Казахстана обследован контингент умственно отсталых детей, находящихся на диспансерном учете в психоневрологических учреждениях г. Алма-Аты. С применением методов молекулярной генетики исследованы также семьи с синдромом ломкой Х-хромосомы, наблюдавшиеся в Институте психиатрии Министерства здравоохранения России и в Медико-генетическом центре г.Донецка, выявленные на основе клинических и цитогенетических методов.

Всех обследованных больных разделили на три группы: 1)группа детей с умственной отсталостью, взятые в общем потоке обратившихся семей в диспансер; 2)дети из вспомогательных специализированных учреждений; 3)больные с синдромом ?га^27), ранее диагносцированные клиническими и цитогенетическими методами.

Для цитогенетического исследования с целью идентификации признака кровь культивировали в условиях дефицита

фолатов, Для этого использовали два варианта; 1)культивирование клеток на среде 199 с минимальным содержанием фолиевой кислоты (0,01 мг/л) и 2)на среде Игла с добавлением в качестве ингибитора

в

фолиевой кислоты 5-фтордезоксиуридина в концентрации 0; 02 мкг/мл за 48 часов до окончания культивирования. Полученные препараты окрашивали по g-методу и анализировали по 100-200 метафаз.

Молекулярно-генетическая диагностика осуществлялась

гибридизационным методом. ДНК пациентов и их родственников выделяли из 15-20 мл венозной крови, рестрицировали специфическими эндонуклеазами (EcoRl, Hindlll, Taql, Pstl) 6-16 часов, проводили электрофорез в 0,8% агарозном геле и осуществляли щелочной перенос по Саузерну на капроновый фильтр "Хийу Калур" /Таллинн/.

На начальном этапе работы были использованы внегенные зонды st-14 и f-ix. В ходе работы появилась возможность использования двух внутригенных ДНК-зондов ОхО.55 и 0x1.9, любезно предоставленных Д-ром Кэй Дявис /Оксфорд/ профессору В. С.Баранову.

Мечение препаратов ДНК-зондов фосфором проводили методом ник-трансляции (удельная активность меченных зондов составляла 2*1 о8 - 4*108 имп/мкг 32Р ДНЮ.

Реакцию гибридизации вели по методу, предложенному Маниатисом с модификациями. Результаты анализировали по радиоавтографам и выполненным по ним фотографиям. •

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка частоты синдрома fra(xq27) на основе кттко - итоге не тичес кого исследования

Для выяления популяционной частоты синдрома ломкой Х-хромосомы в населении г.Алма-Аты, характеризующегося своеобразным этническим составом, демографическими процессами и популяционно-генетической структурой /Е.У.Куандыков, Г.С.Святова, 1989/, был изучен контингент умственно отсталых детей.

Так как заболевание характеризуется Х-сцепленным типом наследования, то обследовались только лишь больные мальчики, По данным психо-неврологического диспансера в выборке детей в возрасте 5-10 лет (1985-1980 гг. рождения) выявлено 585 умственно

отсталых мальчиков, что составляет 0,53% от общего количества родившихся за этот период. Эти данные ниже оценок, приводимых другими авторами. Так, по имеющимся в литературе данным частота олигофрении в Англии оценивается от 0,86 до IX, во Франции - 4,3%, США - 3-5%, по СССР - 0,5% /из книги В. П. Эфроимсона и М.Г.Блюминой, 1978/. Такая вариабельность объясняется многими причинами, включая различие критериев диагностики. В нашем примере отмечается значительная разница в количестве умственно отсталых больных мальчиков по годам. Если в 10-летнем возрасте их выявлено 229, то в возрасте 5 лет - только 22. И лишь у 30% (у 175 из 585 детей с У0) был выставлен диагноз, так что более 70% всех случаев с У0 были с т.н. недифференцированной формой У0.

Вен изученные больные но г.Алма-Ате были подразделены на две группы: 1)группа детей с недифференцированной олигофренией, взятых на обследование из общего потока обратившихся семей (30 семей); 2)дети, находящиеся во вспомогательных детских учреждениях для умственно отсталых (639 детей), В первой группе больных, отбор которых произведен по критерии наличия недифференцируемой У0 и по критерии половой принадлежности, был осуществлен клинико-цитогенетический и молекулярно-генетический анализ. Во второй группе больных из школ-интернатов, детского сада и дома инвалидов для цитогенетического исследования отобрано 63 ребенка путем предварительного клинического и генетического обследования. Методическим обоснованием скрининг-программы в этой группе явилась работа Е.Семановой с соавт., проведенная в Чехословакии (1989). После ознакомления с медицинской документацией и предварительного осмотра из выборки были исключены случаи с ухе установленными причинами умственной отсталости, такие как болезнь Дауна, ф^нилкетонурия, другие нарушения метаболизма, перинатальная патология, неврологические заболевания, множественные пороки развития. В результате осталось 452 мальчика с недифференцированной формой олигофрении, среди которых и был проведен клинический скрининг с учетом наиболее выраженных при синдроме Мартина-Белла диагностических признаков. Так, по

имеющимся - в литературе данным, были — выделены следующие--------

анамнестические и фенотипические особенности: увеличенная масса тела при рождении, позднее развитие речи и ее нарушения в виде персевераций, "специфическое" лицо (высокий лоб, клювовидно загнутый кончик носа, выступающий подбородок, уплощенная средняя треть лица, большие оттопыренные ушные раковины), увеличенные кисти и стопы, гиперподвижность мелких суставов, макроорхидизм, аутизм. При наличии трех и более признаков больные подвергались цитогенетичеокому исследованию. Таких больных оказалось 63.

Всего в обеих группах цитогенетнчески обследовано 93 умственно отсталых мальчиков (30 - в 1-й группе и 63 - во второй) и выявлено только 2 больных с наличием маркера Гга(Хч27) - по одному случаю в каждой группе. Таким образом, по самым осторожным оценкам результатов клинико-цитогенетического исследования 2-й группы детей частота синдрома ^а(Хч27) составляет 15,87 на 1000 мальчиков с недифференцируемой УО.

2. Оценка частоты синдрома ("га(хч27) по данным молекулярно - генетического обследования

Молекулярно-геннтичнское исследование проведено в первой группе больных с использованием ДНК-зонда 0x1.9 и рестриктазы ЕсоШ, т. е. применена молекулярно-генетическая система ЕсоШ/0x1.9. В результате обследования этой группы при цитогенетическом анализе (30 семей) был выявлен только один ребенок с наличием маркера ^а(Хч27). В результате проведенной молекулярно-генетической диагностики 26 пробандов обнаружено 11 больных, т.е. гемизигот по мутации гена рмл-1, что составляет 42,3% . Молекулярно-генетический анализ оказался, как видно из результатов, почти на порядок выше по своей диагностической информативности, чем цитогенетический.

Учитывая индивидуальные различия длины вариабельной части гена в норме (от 2-х до 50 ссс-повторов) метод блот-гибридизации по Саузерну в системе Есот/Ох1.9 позволяет идентифицировать в

контрольных образцах ДНК фрагменты 5,1-5,2 т.п.о. Из 26 образцов ДНК, исследованных нами с помощью зонда- 0x1.9, фрагменты нормальных размеров были зарегистрированы в 15 случаях. У остальных 11 больных обнаружены 4-варианта паттерна патологических аллелей:

1) Множественные фрагменты ДНК разного молекулярного веса, имеющие на электрофореграмме вид размытой широкой полосы (т.н. шмер).

2) Единичный фрагмент большего, чем в норме молекулярного веса.

3) Несколько больших дискретных фрагментов.

4) Фрагмент нормального размера (5,2 т.п.о.) плюс шмер.

ВАРИАНТЫ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ АЛЛЕЛЕЙ, ВЫЯВЛЯЕМЫХ ПРИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ В СИСТЕМЕ ЕсоН1/ох1.9

Разиер нориального Фрагмента, т. п. о.

9 - множественные фрагменты ДНК разного молекулярного веса (шмер)

«и ум»

&

7 - единичный фрагмент большего, чей в норие молекулярного веса

6,2 -

5 - несколько больших дискретных фрагментов

12 3 4 5 678 9

Рисунок 1.

Соотношение этих вариантов в данной группе составило 3:0,5:1:1. -Чаще других (6 из 11)- у больных мальчиков отмечалось отсутствие четкого фрагмента и наблюдалась картина шмера. Оказались наиболее удобными для диагностики варианты 2 и 3; варианты 1 и 4 требуют высокого качества автографов и представляют известную сложность для молекулярной идентификации. Более четкую картину в этих случаях можно получить при гибридизации зонда 0x1.9 с более крупным фрагментом ДНК после рестрикции образца эндонуклеазой Bgin, что позволяет "сжать" шмер и сделать его более отчетливым

/Rousseau et al., 1991; Hirst et al., 1991/.

Результаты данного исследования не могут быть использованы для точной оценки частоты синдрома. Однако можно видеть, что данные молекулярного исследования дополнительно выявили 10 больных с этим синдромом. По осторожной оценке можно думать, что частота синдрома, оцениваемая ДНК-зондами, почти в 10 раз выше показателя, получаемого в ходе цитогенетического обследования. Это означает, что частота больных с синдромом Мартина-Белла составит примерно 1 случай на 1200-1500 рождений мальчиков.

3. Результаты цитогенетического и ыолекулярно-генетического обследования семей, отягощенных синдромом fr«(Xq27)

Комплексное цитогенетическое и молекулярное обследование осуществлено в 18 семьях с ранее установленным диагнозом синдрома fга(Xq27). На первом этапе осуществлено цнтогенетнческое исследование. Выявляемость маркера fra(xq27) у больных и их матерей с последующей ДНК-диагностикой в системе ecoR1/ox1.9 показана в таблице JÍ1. . _ _

До идентификации гена FMR-1 В 1991 ГОДУ /Verkerk et al./, молекулярная диагностика была основана, главным образом, на выявлении полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) последовательностей ДНК, сцепленных с локусом Xq2 7. Этот подход использован и нами в первой группе семей, а именно, в 4-х семьях по пробам ДНК F-ix и st-14 с целью оценки их информативности и пригодности в качестве ДНК-маркеров ломкой Х-хромосомы.

Таблица 1

РЕЗУЛЬТАТЫ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ СИНДРОМА МАРТИНА-БЕЛЛА

Я Цитогенетический ДНК- л Цитогенетический ДНК-

семьи анализ анализ семьи анализ анализ

1 СБ) + О 10 СБ) + +

СМ) - + СМ) - +

2 СБ) + + 11 СБ) + +

СМ) • + - СМ) - -

3 СБ) + + 12 (Б) + +

СМ) - + СМ) + +

4 СБ) + + 13 СБ) + +

СМ) + + СМ) + +

5 СБ) + + 14 СБ) + +

СМ) + + СМ) - +

6 СБ) + + 15 СБ) + +

СМ) О О СМ) - +

7 СБ) ♦ + 16 СБ) + +

СМ) - + СМ) + -

8 СБ) + + 17 СБ) +/- _

СМ) О + СМ) - -

9 (Б) + + 18 СБ) +/- _

СМ) + + СМ) - -

Примечание:

(Б) - больной # +

(УО - мать

+/ О

- положительный диагноз

- отрицательный диагноз — сомнительное заключение

- диагностика не проведена

Оба зонда -оказались информативными для трех проанализированных семей. Установлено носительство мутантного гена у больных мальчиков и их матерей с вероятностью более 95% . Лишь в одном случае при обследовании больного ребенка, его матери, тети и двоюродной сестры, по-видимому, произошел кроссннговер между Р-1Х и 81-14. В системе ПДРФ Б(:-14/т^1 аллельный фрагмент 4,2 т. п. о. , сцепленный с ломкостью Х-хромосомы, был определен не только у пробанда и его матери, но и у тетки с двоюродной сестрой, которые по другим параметрам не обнаруживали €га(х)- синдром. В дальнейшем с использлванием зонда 0x0.55 подтверждено наличие мутации у пробанда и отсутствие ее у тетки.

С применением внутригенных ДНК-зондов были обследованы все 18 семей. В 16 семьях доказано наличие синдрома ломкой Х-хромосомы, а в 2-х - диагноз снят. Эти две семьи были направлены с подозрением на данный синдром; в одном случае при обследовании в медико-генетической консультации обнаружен 1% егя(Хч27 )-клеток, а вторая семья обратилась с целью пренатальной диагностики при отрицательных цитогенетических результатах. В подтвержденных семьях при анализе полученных данных у больных пальчиков на радиоавтографах наблюдался один из вариантов проявления мутации гена гмк-1. У 7 облигатных носительниц мутантного гена с цитогенетически отрицательными результатами молекулярной диагностикой показано наличие состояния прнмутации. При молекулярном обследовании облигатных носительниц премутацин гена рмй-1 возможны несколько вариантов аллелей. В типичном случае на электрофореграмме определяется два фрагмента, причем один из них заметно большего молекулярного веса, чем в норме. Однако нередко разница между нормальным и премутантным аллелями генов гмн-1 на двух Х-хромосомах бывает столь незначительна, что граница между ними теряется. Возникает один широкий бэнд, либо бэнд, соответствующий нормальным аллелям. В таких случаях, по-видимому, отмечается небольшое число избыточных ссс-повторов, и такая инсерция не регистрируется системой Есот/0х1.9, выявляющей фрагменты большого размера. Более информативной в этих случаях

оказалась система детекции Рзъ1/0х0.55, выявляющая в норме фрагмент 970 п. о. Применение этой системы позволяет не только более точно определить состояние премутации, но по разнице молекулярного веса нормального и премутантного аллелей рассчитать число избыточных сйс-повторов. Таким образом, зонды 0x1.9 и 0x0.55 аддитивны для выявления состояния премутации. И если первый из них весьма информативен в случае больших инсерций, то второй - при малых.

На рисунке 2 приведен пример молекулярной диагностики в семье, имеющей больного ребенка с синдромом Мартина-Белла.

12 3

' МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА СИНЛРОМА МАРТИНА-БЕЛЛА (с использованием ДНК-зонда 0x1.9)

Рисунок 2

Обобщенный материал (табл.2) по обследованию семей с высоким риском рождения детей с синдромом -Мартина-Белла, полученный в лаборатории клинической цитогенетики /Москва/ и в лаборотарии пренатальной диагностики /Санкт-Петербург/, дали следующие результаты. В 26 семьях, где диагноз синдрома основывался на

цитогенетическом обследовании, ДНК - зондовая диагностика

подтвердила диагноз синдрома Мартина-Белла. В 27 семьях, отобранных по клиническому заключению, диагноз синдрома Мартина-Белла удалось подтвердить молекулярным методом лишь в 11 семьях. Во всех 37 семьях с пробандом с синдромом Мартина-Белла обследовано 52 сибса и других близких родственников. Состояние лремутации гена рмн-1 выявлено у 34 родственников и отвергнуто у 18 родственников. Таким образом, видно, что примененные нами ДНК-маркеры гена Рмц-1 оказались высоко информативными и для идентификации состояния премутации этого гена, т.е. для выявления в семьях с высоким риском трансмиттеров.

Таблица 2

ОБОБЩЕННЫЙ МАТЕРИАЛ ЛАБОРАТОРИИ КЛИНИЧЕСКОЙ 11ИТ0ГЕНЕТИКИ И ЛАБОРАТОРИИ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ДНК - ДИАГНОСТИКИ В СЕМЬЯХ С ПРОБАНДОМ С СИНДРОМОМ МАРТИНА-БЕЛЛА, ОТОБРАННЫХ НА ОСНОВЕ КЛИНИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ ИЛИ КЛИНИЧЕСКОГО И 11ИТ0ГЕНЕТИЧЕСК0Г0 ИССЛЕДОВАНИЯ

Метод обоснования диагноза, предшествовавшего ДНК -диагностике Изучено семей ДНК - диагностика

Диагностировано больных Выявлено носителей премутации Носителей премутации не выявлено

Клиническое обоснование синдрома 24 11 9 14

Клиническое + цитогенетическое обоснование 26 26 25 4

Клиническое + сомнительное цитогенетическое заключение 3 0 0 0

4. Пренатальная диагностика синдрома 1Гга(Хя27)

На первом этапе работы составлен регистр из более чем 30 семей, проходивших обследование в лаборатории клинической цитогенетики в разные годы и имевших заключение о наличии больного ребенка с синдромом *га^27). Часть из этих детей наблюдалась в НИИ психиатрии МЗ РФ в медико-генетическом отделении (рук. Г.С.Маринчева). Из числа этих семей после неоднократного медико-генетического обследования обратились на пренатальную диагностику 2 семьи. Дополнительно 4 семьи были направлены на ПД из различных медико-генетических консультаций России в связи с цитогенетически установленным у пробанда синдромом Гга(Хч27) или с У0, сцепленной с полом, без подтверждающей цитогенетической диагностики. Синдром ¿га^27) установлен в двух случаях у плодов мужского иола, - беременность прервана. В трех семьях диагноз снят, но две женщины прервали беременность по причине наличия в семье сцепленной с полом У0 и установления пола плода, а одна женщина родила здорового мальчика. Впоследствии с использованием методов молекулярной диагностики у неб снят диагноз носительства мутантного гена Рми-г.

Первые 3 семьи обратились за медико-генетической помощью на этапе работы, когда были освоены лишь методы цитогенетического обследования. Поэтому пренатальная диагностика осуществлена на основе идентификации хромосомного маркера Гга^27). Последние 3 случая проведены с применением молекулярных методов диагностики. Ниже описан последний случай пренатальной диагностики в семье КБ, обратившейся к нам за медико-генетической помощью (см. родословную на рис.3). В семье сын страдал У0, по данным обследования в МГК МГНЦ РАМН у больного цитогенетически и клинически определялся типичный синдром Мартина-Белла с экспрессией маркера фрагильности Х-хромосомы. Дочь, беременная на 18-20 неделях беременности, обратилась на ПД. У беременной женщины, ее матери и брата взяты образцы крови, часть которой использована для выделения ДНК, другая часть - для повторного

цитогенетического исследования: Произведен кордоцентез, получен образец крови для выделения ДНК и для постановки культуры лимфоцитов. Результаты обследования представлены в табл.2.

Рисунок 3. Родословная семьи КБ

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ОБСЛЕДОВАНИЯ И ДНК - ДИАГНОСТИКИ СЕМЬИ КБ

член родословной цитогенетическое исследование, наличие 1га(Хя27) ДНК-диагностика

11.1, Ж 15% +

1.2, ж 0 У. +

11.2, м 12% + +

III. 4 , м их + +

Примечание: 1) (+5 - состояние премутации 2) (++) - состояние мутации

Цитогенетически (варианты культур на среде 199 и на среде Игла, с использованием "тимидинового шока") лишь у матери беременной женщины не обнаружено хромосомного маркера {та.(х<12Т). У беременной его частота достигала 15%, у её взрослого брата - 12%, у плода - 11% (в 7 из 65 клеток). ДНК-диагностикой в системе Есот/0х1.9 и Рз1:1/0х0.55 у плода и у брата беременной доказано наличие полной мутации (паттерн из нескольких больших дискретных фрагментов), а у беременной женщины (11.1) и у ее матери (1.2) -наличие состояния премутации гена рмн-1. Но если у 1.2 обнаружены два фрагмента размером 5,2 и 5,4 кВ, то у 11.1 второй фрагмент оказался значительно большего размера (5,8 кВ), что говорит о большей избыточности у беременной женщины числа сса-повторов. Не исключено, что с таким состоянием премутантного аллеля гена рмй-1 у этой женщины ассоциирует появление в части клеток хромосомного маркера 1т&(Хц2Т).

выволы

1) Частота умственной отсталости, оцениваемая по данным регистра Алма-Атинского городского психоневрологического диспансера по группе мальчиков 9-10 лет, составляет 21,3 на 1000 рождений мальчиков. В этиологической структуре доля недифференцированных случаев У0 составляет 70% .

2) Среди 5-10 - летних мальчиков с недифференцированной умственной отсталостью частота синдрома Гга(хд27), диагностируемого методами хромосомного анализа, составляет 15,9 на 1000 мальчиков.

3) Выявляемость мутации гена РМ11-1 молекулярно-генетическими методами в системе ЕсоК1/0х1.9 и Рэгг/ОхО.55 значительно (в 10 раз) повышает эффективность диагностики синдрома Мартина-Белла по сравнению с существующими методами цитогенетического анализа.

4) Частота носителей мутантного гена рмя-1 (гемизигот), оцениваемая молекулярными методами с применением внутригенных ДНК-зондов 0x1.9 и 0x0.55, составляет в среднем 1 случай на 1200-1500 рождений мальчиков.

5) На основе применения диагностических систем Есот/0х1.9 и Рзг1/0х0.55 показана возможность точной диагностики не только самого заболевания, но и выявления носительства гена кми-1 в состоянии премутации в семьях высокого риска.

6) У больных с синдромом гга(Хч27) диагностическая система Есог1/0х1.9 обнаруживает 4 варианта паттерна патологических аллелей: 1) множественные фрагменты ДНК разного молекулярного веса (шмер), 2) один фрагмент большего размера, чем в норме, 3) несколько больших дискретных фрагментов, 4) один фрагмент нормального размера + шмер.

7) Разработанный комплекс методов диагностики сцепленной с полом умственной отсталости позволяет обосновать практическую программу медико-генетической профилактики широко распространенного синдрома Ггп^27). В основе этой программы должны лежать: 1) создание регистра семей, отягощенных сцепленной с полом УО; 2) скрининг пробандов и пораженных членов родословной по критерии "семейная отягощенность УО + черепно-лицевые аномалии + макроорхидизм"; 3) тестирование семей больных с признаками синдрома Мартина-Белла цитогенетическимн методами исследования; 4) обследование больных с клиническими и анамнестическими признаками синдрома методами ДНК-диагностики; 5) выявление молекулярными методами носителей премутации гена РМГ1-1 и бессимптомных трансмиттеров заболевания среди родственников иробанда; 6) организация рациональной профилактики синдрома Гга(Хя27) путем проведения пренатальной диагностики и

медико-генетического консультирования носителей премутации гена fmr-1 среди родственников пробанда.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ракишева 3.Б. Комплексная диагностика синдрома fra(Xq27) // vi съезд общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Минск. 1992. Тезисы докладов. С. 130.

2. Баранов B.C., Асеев М. В., Ракишева 3. Б., Кулешов Н.П., Маринчева Г.С., Бычкова А.М. , Зукин В. Д. , Ледащева Е. А. , Амоаший Д.С. , Кузнецова Т.В. , Вахарловский В.Г. Молекулярная диагностика синдрома фрагильной Х-хромосомы Ссин. Мартина-Белла) у больных отечественных популяций // Генетика, 1992.

3. Ракишева 3.Б., Асеев М. В., Баранов B.C., Кулешов Н.П., Кузнецова Т. В. Диагностика геми- и гетерозиготного носительства мутантного гена fmr-i // ш конференция "Геном человека - 93", Москва. 1993. Тезисы докладов.