Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурных и функциональных нарушенийХ-хромосомы, приводящих к различным формамХ-сцепленной умственной отсталости

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурных и функциональных нарушенийХ-хромосомы, приводящих к различным формамХ-сцепленной умственной отсталости"

РГ6 01

7 5 ДЕК ?т

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Медико-генетический научный центр

На правах рукописи

СТРЕЛЬНИКОВ Владимир Викторович

Изучение структурных и функциональных нарушений Х-хромосомы, приводящих к различным формам Х-сцепленной умственной отсталости

03.00.15 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2000 г.

Работа выполнена в лаборатории клинической цитогенетики НИИ клинической генетики Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Д.В. Залетаев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Ю.А. Ревазова кандидат биологических наук П. А. Сломинский.

Ведущая организация: Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится

в// час, на заседании Диссертационшго Совета Д.001.16.01 по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН. Автореферат разослан

"Л" ИХкЯ^^Я. 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

профессор Л.Ф. Курило

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Умственная отсталость (УО) -распространённое патологическое состояние, встречающееся в популяции с частотой около 3%. Более 50% случаев УО обусловлено генетически, причём значительная часть сцеплена с полом. К Х-сцепленным формам относятся, в частности, синдром Мартина-Белл (СМБ; наиболее распространённая наследственная причина УО; частота 1:2000-1:4000), умственная отсталость, сцепленная с хромосомной ломкостью в участке РЯАХЕ (УО РЯАХЕ, частота 1:50000), численные аномалии Х-хромосомы. Не исключено, что экспансия тринуклеотидного повтора в области ломкого хромосомного участка РЯАХР также приводит к фенотипу УО.

Причинами СМБ и УО РЯАХЕ является экспансия тринуклеотидных повторов (СОО)п в промоторных областях генов РМЯ] и РМЯ2. Экспансия тринуклеотидных повторов - особый класс патогенных мутаций, известный с 1991г. Механизмы возникновения такого рода мутаций изучены недостаточно. Исследование мутационных процессов в области расположения генов РМЯ1 и РМЛ2 является как фундаментальной проблемой, способствующей пониманию закономерностей экспансии тринуклеотидных повторов вообще, так и социально значимой задачей по диагностике, профилактике, скринингу СМБ и УО РЯАХЕ.

Эффективных средств для лечения больных с СМБ и УО РЯАХЕ не существует, поэтому особую значимость приобретают выявление больных и медико-генетическое консультирование родственников. Очевидна также необходимость разработки эффективного протокола скрининга, который позволит снизить распространённость генетических форм УО в популяции. Неонатальный скрининг мальчиков на СМБ, УО РЯАХЕ и численные аномалии Х-хромосомы позволит не только снизить частоту ряда форм УО, но и своевременно оказывать медицинскую и психологическую помощь больным с этими поздно выявляемыми заболеваниями.

Коротко актуальность проблемы можно сформулировать следующим образом:

1. Х-сцепленная умственная отсталость - распространённое патологическое состояние с высокой частотой семейных случаев, что создает предпосылки для эффективной профилактики.

2. Причины мутаций, приводящих к наиболее распространённым X-сцепленным формам УО, изучены недостаточно, а существующие методы лабораторной диагностики несовершенны, дорогостоящи и не могут быть использованы для широкого скрининга.

3. Молекулярная диагностика мутаций, приводящих к Х-сцепленным формам УО, в настоящее время в отечественной лабораторной практике используется недостаточно и малоэффективно.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы является разработка протоколов диагностики и скрининга распространённых форм Х-

сцепленной умственной отсталости на основе изучения структурных и функциональных изменений Х-хромосомы, приводящих к фенотипу УО.

Задачами исследования являются:

1. Провести комплексный анализ области расположения генов РМЯ1, РМЯ2 и ломкого хромосомного участка в районе хромосомы Х(ц27-ц28), включающий: а) блот-гибридизационный анализ с использованием внутригенных ДНК-маркеров; б) анализ метилирования СрО-островков генов РМЯ1, РМВ.2 и ломкого участка РЯАХР\ в) изучение нормального микросателлитного окружения области РЯАХА-РЯАХР.

2. Изучить распределение аллелей динуклеотидных полиморфизмов ОХ5548, РМХАС1, РЯАХАС2, ОХ81691, ОШ123, ОХБШЗ в контингенте нормальных индивидов и в группе больных с СМБ.

3. Определить границы и охарактеризовать свойства области мейотической нестабильности микросателлитов при СМБ в рамках изучения причин экспансии тринуклеотидного повтора (СОО)п в гене FMR^.

4. Разработать методы анализа метилирования СрО-островков, лежащих в области ломких хромосомных участков РЯАХА, РЯАХЕ и РЯАХР для диагностики и скрининга СМБ, УО РЯАХЕ, полных мутаций экспансии в РЯАХР и численных аномалий Х-хромосомы.

5. Разработать протоколы диагностики и скрининга распространённых форм Х-сцепленной умственной отсталости на основе сравнительного анализа существующих и вновь разработанных методик.

Научная новизна. Впервые для обследования большой выборки больных с умственной отсталостью, составляющей 470 пациентов, одновременно применены различные методы лабораторной диагностики X-сцепленных форм УО, что позволило сделать выводы о характере структурных и функциональных изменений Х-хромосомы, приводящих к развитию фенотипов УО. Впервые в России определены популяционные характеристики полиморфных микросателлитных маркёров ОХ8548, РЯАХАС1, РЛАХАС2, ОХБ1691, ОХБП23 и ОШПЗ и возможность их использования в косвенной диагностике СМБ и УО РЯАХЕ. Впервые описаны мутации 1Ш'548, РЯАХАС1 и 1Ш7/23, свидетельствующие о мейотической нестабильности микросателлитов в семьях с СМБ. Разработаны и апробированы методики анализа функционального состояния генов РМК1 и РМЯ2 на основе метилчувствительной ПЦР. Модифицирован протокол диагностики СМБ. Впервые в России проведена успешная молекулярная диагностика УО РЯАХЕ. Исследован характер метилирования СрО-динуклеотидов в промоторной области гена РМЯ2. Разработан метод анализа метилирования СрО-островков РЛАХА, РЛАХЕ и РЯАХР в одной пробирке, предназначенный для выявления больных с СМБ, УО РЯАХЕ, полных мутаций экспансии РЯАХР и числовыми аномалиями Х-хромосомы при неонатальном скрининге мальчиков. Предложен алгоритм неонатального скрининга. На основе комплексного анализа области расположения генов РМЯ1, РМЯ2 и ломкого хромосомного участка РЯАХР в

районе хромосомы Х^27^28) предложена современная гипотеза этиологии экспансии тринуклеотидных повторов.

Практическая значимость работы. Проведена ДНК-диагностика у 470 больных с УО и у 49 родственников. Осуществлено 9 пренатальных диагностик СМБ в 8 семьях; в 5 случаях поставлен диагноз СМБ. В результате выполненного исследования разработаны подходы для молекулярно-биологической диагностики СМБ, УО РЯАХЕ и полных мутаций экспансии РЯАХР у больных с умственной отсталостью и диагностики носительства у родственников. Проведен дизайн олигонуклеотидных праймеров для анализа метилирования Срв-островков РЯАХА, РЯАХЕ и Р1ЫХР. Разработан протокол неонатального скрининга мальчиков для выявления больных с СМБ, УО РЯАХЕ, полных мутаций экспансии РЯАХР и численными аномалиями Х-хромосомы. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с повышением эффективности лабораторной диагностики, пренатальной диагностикой, ранней диагностикой, скринингом и профилактикой Х-сцепленной УО.

Положения, выносимые па защиту.

1. Проведён комплексный молекулярно-генетический анализ области расположения генов РМЯ1, РА№2 и ломкого хромосомного участка РЯАХР в районе хромосомы Х^27-д28) в норме и у больных с СМБ, УО РЯАХЕ, численными аномалиями Х-хромосомы у мужчин с УО.

2. Разработаны протоколы лабораторной диагностики СМБ, УО РЯАХЕ и метод диагностики полных мутаций экспансии РЯАХР.

3. Определены популяционные характеристики динуклеотидных полиморфизмов ОХБ548, РЯАХАС1, РЯАХАС2, 0X81691, 0X31123 и £Ж7775 в норме и у больных с СМБ в России. Описаны мутации маркёров ОХБ548, РЯАХАС1 и ИХБ! 123, свидетельствующие о мейотической нестабильности микросателлитов в семьях с СМБ.

4. Предложен алгоритм скрининга для выявления больных с СМБ, УО РЯАХЕ, полными мутациями экспансии РЯАХР и численными аномалиями Х-хромосомы.

5. Предложена и обоснована гипотеза нестабильности микросателлитных повторов в области отсроченной репликации на Х^27.3-428).

Апробация работы. Материалы исследования докладывались на международных конференциях: на 30-й Европейской ежегодной конференциии по генетике человека (Лиссабон, 1998), на 11-й и 12-й ежегодных конференциях общества генетики человека Германии (Нюрнберг, 1999; Любек, 2000); на 2-й европейской цитогенетической конференции (Вена, 1999), на международной конференции «Геном человека» (Ванкувер, 2000); на 1-ой Всероссийской конференции "Медико-генетическое консультирование в профилактике наследственных болезней" в 1997, на конференциях ГНТП «Геном человека» в 1998 и 1999 гг. и межлабораторных семинарах МГНЦ РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 138 ссылок. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты поступали из НПО МГНЦ РАМН, психоневрологических отделений Российской детской клинической больницы МЗ РФ, Института педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, медико-генетических консультаций г. Москвы и федеральных медико-генетических центров. Было обследовано 485 пробандов с подозрением на СМБ, 49 родственников больных и 9 образцов плодного материала из отягощенных семей. Основными критериями служили фенотипические признаки, наличие умственной отсталости и Х-сцепленное наследование в семьях. Цитогенетическая экспрессия фолатчувствительного ломкого участка в длинном плече Х-хромосомы документирована для 17 больных. Цитогенетический анализ хромосомной ломкости проводился в лаборатории клинической цитогенетики МГНЦ РАМН, в лаборатории молекулярной цитогенетики Института педиатрии и детской хирургии МЗ РФ и в цитогенетических лабораториях по месту жительства. Все пациенты были обследованы с использованием высокоразрешающих методов хромосомного анализа в лаборатории клинической цитогенетики МГНЦ РАМН. В 15 случаях выявлены различные варианты хромосомных аномалий, не имеющих отношения к СМБ. Образцы ДНК больных с хромосомной патологией были исключены из дальнейшего исследования.

Для получения ДНК необходимой, степени чистоты и достаточного молекулярного веса геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови стандартным методом (Sambrook et al., 1989).

Рестрикцию ДНК и электрофорез проводили стандартными методами (Sambrook et al., 1989).

Для проведения блот-гибридизапии с радиоактивно меченным зондом ДНК из геля переносили на мембрану HybondN фирмы "Amersham" (Великобритания). Перенос осуществляли методом вакуумного блоттинга (Sambrook et al., 1989) при помощи прибора "VacuGeneXL" фирмы "Pharmacia" (Швеция). Включение изотопа dCTP[P32] в двунитевую плазмидную ДНК проводили методом ник-трансляции, используя "Nicktranslation kit" фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия). Изотоп dCTP[P32] получали из АО ГНЦ РФ ФЭИ (Обнинск), с удельной активностью 3000 Кю/ммоль. Процедуру гибридизации проводили по протоколам фирмы на приборе "Hybridiser НВ-2" фирмы "Techne" (Великобритания). Для радиоавтографии использовали рентгеновскую пленку фирмы "Туроп".

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили по стандартной схеме (Saiki, 1989) при помощи программируемого термоциклера МС-2 фирмы

"DNA-Technology LTD" (Россия) с использованием термофильной ДНК-полимеразы Taq фирмы "MBI" и праймеров, синтезированных на приборе ASM102U фирмы "Биоссет" (Новосибирск). Для нерадиоактивной детекиии ДНК использовали разработанную в нашей лаборатории модификацию метода AgNCb-окраски ДНК (Lieberman, 1990; Яценко, 1996).

Реакцию автоматического прямого ' секвенирования проводили по протоколу "DNA Sequencing System" фирмы "Promega". Электрофорез, регистрацию и обработку результатов сиквенса проводили на приборе ALFTM DNA Sequencer фирмы "Pharmacia Biotech".

Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили при помощи программ Genbank Pustell, Genepro, WIN-SUN, Autogene 1.1, Oligo 4.O.; анализ хроматограмм отсеквенированных последовательностей - с помощью программ Executor и Chromas. Для статистического анализа результатов исследования использована программа RxC.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Цитогенетнческая и ДНК-диагностика С МБ. Питогенетическая диагностика СМБ основана на выявлении фолатчувствительного ломкого участка FRAXA в хромосомном сегменте Xq27.3. Фолатчувствительные ломкие участки содержат полиморфные тринуклеотидные повторы (CGG). In vitro фолатчувствительные ломкие участки экспрессируются при дефиците фолиевой кислоты. В нашей выборке пациентов цитогенетическая экспрессия фолатчувствительного ломкого участка в длинном плече X-хромосомы документирована для 17 из 470 больных. При использовании молекулярно-генетических методов анализа, были признаны ложноположительными 3 из 17, т.е. 18% диагнозов СМБ, поставленных на основании выявления фолатчувствительных ломких хромосомных участков. Ложноотрицательных диагнозов, поставленных на основании выявления хромосомной ломкости, не отмечено.

ДНК-диагностика СМБ. Наиболее достоверные на сегодняшний день методы лабораторной диагностики СМБ основаны на данных о структурно-функциональной организации области расположения ломкого хромосомного участка FRAXA. В 1991г. был клонирован ген FMR1, содержащий ломкий участок FRAXA. Ген содержит 17 экзонов и занимает около 38 т.п.н. геномной ДНК. В состав первого экзона FMR1 входит протяжённый тринуклеотидный повтор CGG, расположенный в области CpG-островка гена.

Обнаружение у больных с СМБ делеций, захватывающих кодирующую и промоторную области FMR1 и внутригенных точковых мутаций подтверждает предположение об участии гена FMR1 в фенотипической экспрессии синдрома. Однако, количество описанных точковых мутаций в гене FMR1 невелико и исчисляется единицами. У подавляющего

большинства больных с СМБ этиопатогенез заболевания определяет структура тринуклеотидного повтора Свв в гене РМЯ1.

Подобно многим другим повторяющимся последовательностям в геноме человека, повтор ССЮ РМЯ1 характеризуется полиморфизмом длины в нормальной популяции. У нормальных индивидов его длина варьирует в пределах от 2 до 54 триплетов. Увеличение длины повтора (от 52 до 230 триплетов), не сопровождающееся экспрессией патологического фенотипа, получило название премутации. Дальнейшая экспансия повтора (свыше 230 копий) ассоциируется с клиническими проявлениями СМБ и называется полной мутацией. Полная мутация, как правило, характеризуется аномальным метилированием промоторной области гешРМШ.

Детекция экспансии тринуклеотидного повтора Свв методом блот-гибридизации. Экспансия тринуклеотидного повтора Свй РМЯ1 приводит к появлению увеличенных рестрикционных фрагментов, которые могут быть выявлены методом блот-гибридизации по Саузерну с использованием соответствующих молекулярных зондов.

Нами были использованы зонды рР2 и 0x1.9. Гибридизация этих зондов с контрольными образцами геномной ДНК, предварительно обработанной рестриктазой НтсП.И, приводит к выявлению фрагмента длиной 5.2 т.п.н. У больных и носителей СМБ приращение длины этого фрагмента соответствует приращению длины Свв-повтора (рис.1).

12345678

Рис.1. Анализ гипервариабелыюго района гена РМШ, содержащего ССС-повтор, методом блот-гибридшации. Геномную ДНК обрабатывали рестриктазой НтЛИ и гибридизовали с зондом Ох1.9.1-5 - больные мужского пола. 7 - мать одного из больных, у которой выявлен премутационный аллель. 6,8 - контрольные здоровые индивиды соответственно мужского и женского пола.

В общей сложности методом блот-гибридизации обследовано 210 пробандов с подозрением на СМБ. В 22-х случаях (18 мальчиков и 4 девочки) диагноз был подтверждён. По результатам молекулярно-генетического исследования их можно разделить на 2 группы: у 15 больных, что составляет 2/3, выявлялся один фрагмент повышенного молекулярного веса, в то время как у 1/3 больных имел место набор фрагментов различной длины, либо шмер, состоящий из множества неразличимых полос (табл.1, рис. 1).

Таблица 1. Частота выявления различных гибридизационных сигналов у больных с СМБ, носителей и нормальных индивидов. Б - нормальный аллель, в* -иремутационный аллель. Ь - аллель с полной мутацией.

Индивиды Фрагменты Всего обследовано

в Ь вм-ь Более двух утяжелённых фрагментов или шмер

Контрольные 188 . - _ 188

Больные мужского пола - 10 - 3 - 5 18

Больные женского пола - - - 3 - 1 4

Женщины-носители в семьях с СМБ 10 11 8 8 27

Выявление экспансии тринуклеотидного повтора СвС в первом экзоне гена РМЯ1 позволяет подтвердить наличие у пациента синдрома Мартина-Белл. Однако, степень выраженности УО при СМБ коррелирует напрямую не со степенью экспансии повтора, а с уровнем метилирования СрО-островка гена РМЯ1.

Анализ метилирования СрО-островка гена РМШ методом блот-гибридизации. Для анализа метилирования этой области образцы ДНК обрабатывали метилчувствительными рестриктазами, не проявляющими эндонуклеазной активности в области метилированных СрО-островков, характерных для промоторов генов в неактивном состоянии.

1 2 3 4 5 6 7

Рис.2. Анализ ДНК здоровых и больных индивидов, обработанной рестриктазами НтЛII и Есщ\, методом гибридизации по Саузерну с ДНК-зондом Ох1.9. 1,2,4,6 - матери больных СМБ (в дорожке 6 - шмер, соответствующий полной мутации). 3,5 - больные мужского пола. 7 - здоровая женщина.

Для совместного анализа состояния метилирования СрО-островка FMДi и экспансии СОв-повтора образцы ДНК обрабатывали рестриктазой НтШХ, а затем - чувствительной к метилированию рестриктазой Еа§\, один

из участков узнавания которой расположен в промоторной области гена РМШ. Гибридизация обработанных таким образом контрольных образцов ДНК с зондом 0x1.9 выявляет один фрагмент длиной 2,8 т.п.н., соответствующий единственной Х-хромосоме, у мужчин, и два фрагмента длиной 2,8 и 5,2 т.п.н., соответствующих активной и инактивированной X-хромосомам, у женщин. У больных и носителей СМБ приращение длины этих фрагментов соответствует приращению длины ССй-повтора (рис.2).

Гибридизация по Саузерну — наиболее популярный в настоящее время метод диагностики СМБ, однако он не лишён ряда недостатков. Это дорогостоящий, трудоёмкий метод, связанный с использованием радиоактивного изотопа. Выполнение анализа требует больших затрат времени и биологического материала. Результаты анализа в ряде случаев неоднозначны, их трудно или невозможно интерпретировать.

Анализ метилирования промотора гена РМЮ метолом ГПТР. Нами разработан метод анализа состояния метилирования промотора гена в

полимеразной цепной реакции с матрицы, обработанной чувствительной к метилированию рестриктазой НкаI. Выбранный участок промотора содержит сайты узнавания этой рестриктазы, поэтому продукт ПЦР получается только с молекул ДНК, содержащих метилированные СрС-динуклеотиды. Т.о., у больных с СМБ выявляется продукт ПЦР, соответствующий метилированному промотору гена РМШ, в норме же этот продукт отсутствует. В качестве внутреннего контроля амплификации использован участок СрС-островка гена МеСР2, расположенного в Xq28, не содержащий сайтов узнавания Ша\ (рис.3).

123456789 316 п.н. - 'р^^Р!!', ' -ГЛШСрв

105 н.н. - - МеСР2 СрС

Рис.3. ПЦР-тест иа метилирование промоторной области гена РМШ. 1 -Маркер молекулярной массы. 2,3 - Здоровая женщина. 4,5 и 8,9 - Здоровые мужчины 6,7 - Больной мужского пола. В нечетных дорожках - матрицей для ПЦР служили образцы геномной ДНК, предварительно обработанной НкаI, в четных - в качестве матрицы использована интактная геномная ДНК.

Предложенный метод диагностики апробирован в контрольных группах и показал не меньшую чувствительность и специфичность по сравнению с блот-гибридизацией. В то же время, для ПЦР-анализа метилирования достаточно 300 мкл крови, результаты анализа могут быть получены в течение 2-х рабочих дней, метод не требует использования радиоактивных изотопов, а результаты анализа интерпретируются просто и

однозначно. Стоимость анализа, проведённого методом метилчувствительной ПЦР, на порядок ниже, чем при использовании гибридизации по Саузерну.

Косвенная Д РЖ-диагностика СМБ. ПЦР-анализ метилирования промотора FMR1 не позволяет выявлять носителей среди родственников больных. Чтобы максимально исключить метод блот-гибридизации из протокола лабораторной диагностики СМБ, для выявления носительства мы воспользовались анализом сцепления в семьях. На рис. 4 схематично представлено расположение полиморфных маркеров, использованных в косвенной диагностике синдрома: DXS548, FRAXAC1 и FRAXAC2. Чтобы определить применимость указанных маркеров для косвенной диагностики СМБ в России мы провели определение некоторых характеристик этих маркеров в нормальной популяции и в семьях с СМБ.

150 , 7 10 , ,5, 700 , ,70

.....-Ч ~*ri*-1 Г—*:

сеп-

DXS548 FRAXAC1 _I_1_

FRAXAC2

DXS1691 DXS1123 DXS1113

У/—Н-4h

I

РМЯ? (ССС)п ™/?2 (СБС)п РКДХР (ССССТС)п(ССС)п

I.-+->1

600 1200

Рнс.4. Схема расположения некоторых микросателлитных маркёров в днстальной части длинного плеча Х-хромосомы. Расстояния указаны в т.п.н.

Определение гетерозиготности маркёров проведено на 117 неродственных контрольных хромосомах и 35 неродственных хромосомах больных с полной мутацией в гене РМЯ1. Гетерозиготность ИХ5548 и РЯАХАС1 составила соответственно 30% и 32% в контрольной группе против 65% и 63% у больных. Низкая гетерозиготность не позволяет получать достаточно информативные результаты при использовании только одного маркёра, а требует анализа гаплотипов по всем трём маркёрам - ОХ8548, РКАХАС1 и РЯАХАС2. Х-сцепленный характер наследования СМБ облегчает анализ сцепления в семьях, поскольку в большинстве случаев пробандом является больной с УО мужского пола и гаплотип его единственной X-хромосомы представляет собой гаплотип хромосомы с мутацией в рыт. Повышенная гетерозиготность микросателлитных маркёров на хромосомах больных также повышает информативность анализа сцепления. Однако повышенная гетерозиготность наводит на мысль о возможной нестабильности микросателлитных маркёров, фланкирующих область РИАХА, у больных с СМБ. Для определения стабильности наследования этих маркёров в норме и при СМБ мы провели анализ мейозов в 35 контрольных семьях и 35 семьях больных. В контрольных семьях наблюдался менделевский характер наследования всех трёх маркёров. В семьях с СМБ маркёр БХБ548 наследовался нестабильно в 3 из 54, а маркёр РЯАХАС! - в 4 из 54 женских мейозов (рис.5, рис.6). Аллели РЛАХАС2 в 100% мейозов наследовались стабильно. В общей сложности выявлено 7 случаев

мейотической нестабильности СА-повторов, расположенных в пределах 16 т.п.н. от ГЛЛХА, в 2 из 35 семей с СМБ.

I

II

III

IV

6' ф2 й7^

>>3 /ЯЪА

П-1 Ш-1 Ш-2 11-2 1-1 IV-! П1-3 111-4 111-5 Ш-6 П-4 П-5

20/20 20 20/20 20/20 20/20 21 21/25 21/25 20/20 21 20/20 20

.....амашш^^

............

213 30 40 50

СТТСТЬААСССАСАСАСАСаСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСЛС АБАКАМ?

ЩСЬгота* ЯШ

•г* ' » }"* ь'г *т > „ ' < ,4* » Г'. % /ч < + - » я *

«деДО . Г.! * * ....... •^Гн'г*" *4 ■

ГСТТСТРААСССАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСАСЛСОСААБСАСОСААТАТАЯСССССАС X II АС А

! ' .,,,„„ 11,1ЧА.Ы,. ¡11

Рис.5. Два случая мейотической нестабильности микросатсллитного маркёр; ОХ£548 в семье П. Вверху - родословная семьи П. В центре - электрофореграмма ( обозначением аллелей маркёра ОХ5548 у членов семьи. Внизу - результаты прямой секвенирования аллелей ОХБ548 у членов семьи 1-1 (20 СА-повторов) и Ш-4 (21 СА повтор). Стрелками отмечены границы повторов. Одна из мутаций, проявивших« изменением числа СА-повторов в 0X5548, произошла в мейозе у П-4, другая вероятнее всего, у 1-1 при передаче к И-З, поскольку обе дочери 11-3 наследуют мутантный аллель 21. ДНК члена семьи П-З для анализа недоступпа.

Нестабильность микросателлитных маркёров должна учитываться прк интерпретации результатов анализа сцепления, особенно при определении

носительства родственникам больных и в пренаталыгой диагностике, поскольку может приводить к диагностическим ошибкам. Однако, при довольно высоких значениях нестабильности микросателлитов в семьях с СМБ (от 3% до 5.5%), вероятность ошибочной диагностики оказывается значительно ниже, поскольку мутации этих повторов легко распознаются при анализе сцепления.

Ш-З П-1 И-2 Ш-2 1П-1 III-4 IV-!

26 26/20 25/26 20 25/20 26/20 26

Рис. 6. Случай мейотической нестабильности микросателлитного маркёра ИХ3548 в семье М. Вверху - родословная семьи М. Внизу - электрофореграмма с обозначением аллелей маркёра ИХ5548 у членов семьи. Мутация, проявившаяся изменением числа СА-повторов в /)А'£548, произошла в мейозе у Н-2, при передаче к Ш-2.

В общей сложности с использованием описанных методов (блот-гибридизации, метилчувствительной ПНР и анализа сцепления) обследовано 470 пробандов с УО. Диагноз СМБ подтвержден в 48 случаях, что составляет около 10%. Обследованы матери больных, а также 27 родственников больных по материнской линии. Выявлено 15 носительниц СМБ.

Пренатальная диагностика СМБ. В настоящее время эффективных способов лечения синдрома не существует. Поэтому основным видом медицинской помощи семьям является пренатальная диагностика носителям премутаций и полных мутаций.

Нами осуществлена пренатальная ДНК-диагностика для 9 носительниц в 8 семьях. Определение пола плодов проводилось путём амплификации У-сцепленного гена Ж К В 7 из 9 случаев был определён мужской пол плода. Пренатальная диагностика осуществлялась в 4 случаях на материале биоптата хориона и в 5 случаях на клетках периферической крови плода,

полученной путём кордоцентеза. Использованные методы и результаты анализов приведены в табл. 2.

Таблица 2. Примеры пренатальной ДНК-диагностики СМБ.

№ диагностики п/п Способ получения материала для ДНК-диагностики. Пол плода (ЯВУ) Использованные методы диагностики СМБ Результаты исследований Заключение о наличии СМБ у плода

1 Кордоцентез на 22 неделе беременности жен. Блот- гибридизация Выявлены аллели виЪ +

Анализ сцепления (маркёры 0X5548, ПиХАС1) Подтверждено наследование мутантного аллеля F^í^í^

2 Кордоцентез на 23 неделе беременности жен. Блот- гибрнднзация Выявлены аллели в, в* и Ь +

Анализ сцепления (маркёры БХв548, К1АХАС1, 0X81123,0X81691, 0X81113) Подтверждено наследование мутантного аллеля РМЯ1

3 Кордоцентез на 22 неделе беременности муж. Блот- гибрвдизация Выявлен аллель Ь +

4 Кордоцентез на 22 неделе беременности муж. Блот- гибрндизация Выявлен аллель 8 -

Метил- чувствительная ПЦР Метилировави я промотора ТМЯ.1 не выявлено

5 Кордоцентез на 23 неделе беременности муж. Метил- чувствительная ПЦР Метилировани я промотора не выявлено -

Анализ сцепления (маркёры 0X8548, ВПАХАС1, охвпгз) Подтверждено наследование нормального аллеля ¥МЯ1

6 Биопсия ворсин хориона муж. Блот- гнбридизацин Выявлен аллель Ь +

7 Биопсия ворсин хориона муж. Блот- гибридизация Выявлен аллель в -

Анализ сцепления (маркёры 1Ж>548, БТ1АХАС1, ОХвШЗ) Подтверждено наследование нормального аллеля РМЯ1

8 Биопсия ворсин хориона муж. Блот- гибридизация Выявлен аллель 8 -

9 Биопсия ворсин хориона муж. Блот- гибридизация Выявлен аллель Ь +

Протокол лабораторной диагностики СМБ. Проведенный сравнительный анализ подходов к ДНК-диагностике СМБ позволяет рекомендовать следующий протокол лабораторной диагностики заболевания:

1. Исследование кариотипа пробанда для исключения хромосомной патологии, не имеющей отношения к СМБ.

2. Анализ состояния метилирования промоторной области гена FMR1 у больных без выраженной хромосомной патологии: методом метилспецифической ПЦР для больных мужского пола и методом блот-гибридизации по Саузерну в системе двойной рестрикции EcoRl {Hind III)+£agI/Oxl.9(pP2) или аналогичной для больных женского пола.

3. Анализ ДНК родственников выявленных больных с СМБ с целью выявления носителей премутаций и полных мутаций. Методом выбора следует считать анализ сцепления по микросателлитным маркёрам DXS548, FRAXAC1 и FRAXAC2. В случае неинформативности перечисленных маркёров или выявления микросателлитной нестабильности в обследуемой семье анализ ДНК родственников проводится методом блот-гибридизации в системе двойной рестрикции ЕсоШ (Hind Юх1.9(рР2) или аналогичной.

4. Пренатальная диагностика для носительниц, которая может осуществляться на любом сроке беременности методом анализа сцепления по микросателлитным маркёрам DXS548, FRAXAC1 и FRAXAC2. В случае пеинформативности перечисленных маркёров или обнаружения микросателлитной нестабильности в обследуемой семье анализ ДНК плода проводится методом блот-гибридизации в системе двойной рестрикции £coRJ {Hind III)+Z?agI/Ox 1.9(рР2) или аналогичной. В случае мужского пола плода возможно проведение экспресс-диагностики методом метилчувствительной ПЦР на ДНК из клеток амниотической жидкости или лимфоцитов периферической крови плода..

Совместный анализ метилирования CpG-островков. прилежащих к ломким участкам FRAXA, FRAXE и FRAXF. FRAXA - не единственный фолатчувствительный ломкий участок в дистальной части длинного плеча X-хромосомы, экспрессия которого ассоциирована с УО. Экспрессия FRAXE (Xq28) приводит к неспецифической УО. Экспрессия расположенного дистальнее в Xq28 фолатчувствительного ломкого участка FRAXF, возможно, также ассоциирована с фенотипом УО.

Цитогенетический анализ не всегда позволяет точно определить расположение ломкого участка на хромосоме.

Среди больных с документированной ломкостью Х-хромосомы, для которых нами была проведена ДНК-диагностика, в 3 из 17 случаев диагноз СМБ не подтвердился ни при использовании блот-гибридизации, ни в метилчувствительной ПЦР. Для исключения возможного участия ломких сайтов FRAXE и FRAXF в генезе умственной отсталости у этих больных, нами разработан протокол метилчувствительной ПЦР, позволяющий определять состояние метилирования CpG-островков всех трёх участков -FRAXA, FRAXE и FRAXF - в одной пробирке, поскольку существующие

протоколы диагностики БКАХЕ и РИАХР излишне сложны, дороги и трудоёмки. Праймеры для анализа метилирования БЯАХА, фланкирующие участок в 316 п.н., уже применялись нами для анализа метилирования промотора гена РМЯ1. Праймеры для анализа метилирования Срв-островков РКАХЕ и FRAXF, обеспечивают амплификацию участков геномной ДНК длиной соответственно 231 п.н. и 271 п.н: У индивидов с полной мутацией экспансии СОв-повтора в одном из анализируемых ломких участков наблюдается появление соответствующего ПЦР-продукта (рис.7).

123456789

316 п.н

271 п.н

231 п.н

Рис. 7. Анализ метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF в одной пробирке.

1 - маркёр молекулярной массы. 2,3 - здоровая женщина. 4,5 - больной с СМБ мужского пола. 6,7 - больной с УО FRAXE мужского пола. 8,9 - здоровый мужчина.

В нечетных дорожках - матрицей для ПЦР служили образцы геномной ДНК, предварительно обработанной Hhal, в четных - в качестве матрицы использована шггактная геномная ДНК.

Метод показал достаточную чувствительность при анализе ДНК 8-ми больных с УО FRAXE, полученной от проф. Jacobs (Великобритания). Это первый успешный опыт диагностики УО FRAXE в России, причём осуществлена диагностика значительно проще, чем это делается в настоящее время за рубежом.

Совместный анализ метилирования CnG-островков. прилежащих к ломким участкам FRAXA. FRAXE и FRAXF как метод неонатального скрининга. Совместный анализ метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF позволяет эффективно выявлять среди умственно отсталых больных не только таковых с СМБ, УО FRAXE, и полными мутациями FRAXF. В таблице 3 представлен список генетических заболеваний и состояний, сопровождающихся аномальным метилированием этих трёх CpG-островков у мужчин.

В целом, метилчувствительная ПЦР как метод скрининга позволяет выявлять генетические аномалии приблизительно у 1 на 500 обследованных мужского пола. Большинство этих аномалий сопровождается различными фенотипами умственной отсталости и требует ранней коррекции, а также обследования родственников с целью дальнейшего эффективного планирования семьи. Поскольку в целом фенотип таких больных при рождении обычно не отличается от нормального, ранняя диагностика возможна только благодаря молекулярно-генетическим методам скрининга.

_____________________лаыилкыиша и состоянии, которые мо1уг быть выявлены при неонаталыюм скрининге

методом мстилчувствительной ПЦР.

Заболевание (состояние) Кариотип Этиология Краткая характеристика Необходимость неонатальной диагностики Популяциоиная частота

СМБ 46, ХУ, &а(Хя27.3) Экспансия тринуклеотидно го повтора ССО в гене ¥МЯ1 УО, признаки дисморфогенеза Коррекция УО, своевременное планирование семьи 1:1500-1:5000

УОБЯАХЕ 46, ХУ, Экспансия тринуклеотидно го повтора ССй в гене КЛ«2 Неспецифическая УО Коррекция УО, своевременное планирование семьи 1:50000

РИАХР 46, ХУ, fra(Xq28) Экспансия тринуклеотидно го повтора СОО в области Р11ЛХК ? Создание базы данных ?

Синдром Клайнфель- тера 47, ХХУ 48, ХХХУ Нерасхождение хромосом в мейозе Сниженный интеллект, нарушенная коммуникабельность,. трудности в обучении, бесплодие. Психологическая коррекция, гормональная терапия. 1:500-1:800 1:2500

Тетрасомия X у мальчиков 49, ХХХХУ Нерасхождение хромосом в мейозе Глубокая УО, сильное недоразвитие половых органов, радиоульнарный синостоз Психологическая коррекция, гормональная терапия. 1:85000

Кариотип 46,ХХ у мужчин 46, XX ? Низкий рост, интеллект не снижен. Повышенный риск возникновения гонадобластомы. Гормональная терапия 1:30000

Всего 1:400-1:500

Неонатальный скрининг мальчиков с последующим каскадным скринингом в популяции - единственный реальный на сегодняшний день способ снижения популяционной частоты СМБ.

Изучение механизмов экспансии тринуклеотидных повторов. Экспансия тринуклеотидных повторов лежит в основе наиболее распространённых форм Х-сцепленной УО. Существующие теории объясняют механизмы экспансии либо с точки зрения структурно-функциональных особенностей тринуклеотидных трактов как таковых, либо с точки зрения особенностей функционирования систем репарации у больных с экспансией тринуклеотидных повторов. При этом не учитывается, что у каждого такого больного экспансия происходит только в пределах одного локуса. Очевидно, что для каждой конкретной болезни экспансии необходим анализ хромосомного окружения области тринуклеотидного повтора. Для анализа хромосомного окружения области FRAXA-FRAXE-FRAXF на Х-хромосоме мы изучили некоторые свойства микросателлитных маркёров, расположенных в этой области. Эксперимент проведён на 117 неродственных контрольных хромосомах и 35 неродственных хромосомах больных с полной мутацией в гене FMR1.

Гаплотипы DXS548-FRAXAC1-DXS1113 в контрольной группе и группе больных с СМБ. Исследованы 6 микросателлитных полиморфизмов: DXS548, FRAXAC1, FRAXAC2, DXS1691, DXS1123, DXS1113, первый из которых расположен в 150 т.п.н. проксимальнее FRAXA, а последний - в 70 т.п.н. дистальнее FRAXF (рис. 5). Как уже говорилось, в группе больных с СМБ расчетные значения гетерозиготности маркёров DXS548 и FRAXAC1 вдвое превышают соответствующие значения для контрольной группы. Это может объясняться как эффектом родоначальника для СМБ, так и микросателлитной нестабильностью в области FRAXA. Для решения вопроса о вкладе этих явлений в генетику СМБ мы изучили распределение аллелей DXS548 и FRAXAC1 в исследуемых группах. В контрольной группе и в группе больных выявлено 6 аллелей DXS548 и 4 аллеля FRAXAC1.

о о. с

100 80 60 40 20

0

19 20 21 22 23 24 25 26 аллели DXS548

В контрольные хромосомы ■ СМБ-хромосомы !

Рис. 8. Частоты аллелей маркёра ИХ5548, определённые в контрольной группе и в группе больных с СМБ.

Наиболее распространённые аллели ОХ5548 - 20 в контрольной группе, 20 и 25 в группе больных; для РЯАХАС! - 18 в контрольной группе, 18 и 20 в группе больных (рис. 8, рис. 9).

18 19 20

аллели FRAXAC1

I контрольные хромосомы ЯСМБ-хромосомы '

J

Рис. 9. Частоты аллелей маркёра РИАХАС1, определённые в контрольной группе и в группе больных с СМБ.

Сдвиг характера распределения частот аллелей в группе больных в сторону бимодальности отражает общую тенденцию к повышению гетерозиготности этих маркёров на хромосомах с экспансией. Различия в распределении частот аллелей видны на диаграммах и статистически доказаны. В общей сложности выявлено 12 гаплотипов DXS548-FRAXAC1. Достоверные различия в обследованных группах наблюдаются между частотами двух гаплотипов: 20-18 и 25-20. Большинство контрольных хромосом характеризуются гаплотипом 20-18. Хромосомы больных характеризуются, главным образом, четырьмя гаплотипами: 20-17, 21-17, 2118 и 25-20; однако достоверные различия частот выявлены только для гаплотипа 25-20, причём частота этого гаплотипа у больных в пять раз превышает ожидаемое значение (табл. 4).

Для решения вопроса о роли эффекта основателя в таком распределении гаплотипов мы изучили в тех же группах распределение аллелей микросателлитного маркёра DXS1113, расположенного приблизительно в 2-х м.п.н. от FRAXA. В контрольной группе выявлено 9 аллелей, а в группе больных - 6 аллелей DXS1113 (рис. 10).

Частоты аллелей маркёра в двух группах в целом статистически не различаются, однако 7-й аллель достоверно чаще встречается у больных. При этом чётко прослеживается ассоциация 7-го аллеля с гаплотипом 25-20 DXS548-FRAXAC1: более половины хромосом больных с 7-м аллелем DXS1113 характеризуются гаплотипом 25-20. Частота гаплотипа 25-20-7 на хромосомах больных достоверно превышала ожидаемую. Мы полагаем, что имеем в этом случае дело с относительно молодым гаплотипом родоначальника, включающим в себя 7-й аллель DXS1113,

Т.о., мы предполагаем, что различия в распределении аллелей DXS1113 объясняются скорее незначительным возрастом первичной экспансии CGG-повтора, сцепленной с гаплотипом 25-20, чем нестабильностью микросателлита DXS1113. Эту гипотезу подтверждает и отсутствие различий

Таблица 4. Распределение ганлотипов ОХЯ54&-РВАХЛС1 на контрольных и СМБ-хромосомах.

Аллели 1)ХЯ548 1 #СА | Г 17 Я А 18 X А С 20 1 21 Всего

19 СМБ Контроль 1 (2.9) 2(1.7) 1(2.9) 2(1.7)

20 СМБ Контроль 5(15.2) 8 (6.8) 13 (37.1)* 84 (71.8) 1(0.9) 1 (2.9) 19(54.3) 93 (79.5)

21 СМБ Контроль 3 ( 8.6) 5(4.3) 3 (8.6) 7(6.0) 6 (17.1) 11 (9.4)

24 СМБ Контроль 1(2.9) 1(0.9) 1(2.9) 1(0.9)

25 СМБ Контроль 2(1.7) 7(20.0)** 1(0.9) 1(0.9) 7 (20.0)** 5(4.3)

26 СМБ Контроль 1(2.9) 5(4.3) 1(2.9) 5(4.3)

Всего СМБ Контроль 8 (22.9)* 13 (11.1) 18(51.4)* 96(82.1) 8 (22.9)** 7(6.0) 1(2.9) 1(0.9) 35 (100) 117(100)

Частоты гаплотипов сравнивались по критерию у': *Р<0.05, **Р<0.001.

рассчитанных нами значений гетерозиготности ОХБШЗ в обеих группах: 75% на контрольных хромосомах против 73% на хромосомах больных. Не обнаружив свидетельств нестабильности 1Ж7773, мы тем самым не отвергли гипотезу о нестабильности микросателлитов в исследуемом локусе, а лишь обозначили её примерную дистальную границу.

1 23456789 10 аллели ОХв! 113

| В контрольные хромосомы ЩШБ-хромосомы I

Рис. 10. Частоты аллелей маркёра ОХБ1113, определённые в контрольной группе и в группе больных с СМБ.

Анализ наследования аллелей микросателлитных маркёров в контрольных семьях и семьях с СМБ. Проксимальнее этой границы мы изучили характер наследования семи микросателлитных маркёров в 35 контрольных семьях и 35 семьях с СМБ. Исследованы маркёры DXS548, FRAXAC1, FRAXAC2, DXS1691, DXS1123, DXS1113 и тринуклеотидный повтор гена андрогенового рецептора.

В контрольных семьях наблюдался менделевский характер наследования всех семи маркёров. В семьях с СМБ, кроме уже упомянутых 7-ми мутаций DXS548 и FRAXAC1, обнаружена нестабильность маркёра DXS1123 в 2 из 54 женских мейозов в 1 из 35 семей. Остальные маркёры проявили менделевский характер наследования. В общей сложности выявлено 9 мутаций в области FRAXA-FRAXF. Все мутации описаны впервые.

Поскольку определённая нами область микросателлитной нестабильности совпадает с зоной отсроченной репликации, обнаруженной ранее у больных с СМБ (рис.11), не исключена взаимосвязь между этими двумя явлениями. Распространение зоны очень поздней репликации на участок геномной ДНК, содержащий структурные гены и протяжённые повторяющиеся последовательности может затруднять работу системы репарации неспаренных нуклеотидов, приводя к закреплению естественным образом возникающих мутаций.

Причин расширения зоны ОПР при СМБ может быть несколько. Во-первых, эта зона может расширяться в эмбриогенезе при установлении временных параметров репликации доменов. Различия в положении дистальной границы зоны ОПР могут объясняться практическим отсутствием в Xq27.3 структурных генов (кроме FMR1): присутствие жизненно важных генов обеспечило бы отрицательный отбор клеток с расширенной зоной ОПР.

Второй вариант связывает распространение зоны ОПР с перестройками генетического материала в нормальной зоне ОПР на Xq27. Такими перестройками могут быть, например, дупликации или транслокации гетерохроматиноподобного материала. В таком случае задержка репликации FMR1 будет представлять собой типичный пример эффекта положения. Проверка этой гипотезы может быть осуществлена относительно просто с помощью блот-гибридизации и/или FISH.

Возможен и третий сценарий расширения зоны ОПР, отводящий главную роль транс-действующему фактору. Расширение зоны ОПР при СМБ напоминает естественный процесс распространения зон поздней репликации на инактивированной Х-хромосоме, которое, как показано, происходит по «релейному» типу, что означает, что инициация инактивации транскрипционных доменов происходит не в одной, а в нескольких точках на Х-хромосоме. Возможно, что изменение свойств транскрипта XIST или другого транс-действующего фактора с подобными функциями может привести к сдвигу границ естественных областей поздней репликации на активной Х-хромосоме (Hansen et al.,1997).

S й.

as

Mb 0 5.2 9

Нормальная зона ОПР

Н6, TL01D, СЗБ81, and Н7 lymphoblasts

Зона отсроченной репликации

Рис.11. А. Области с различным временем репликации на X(q27-q28). Зона ПР -нормальная зона поздней репликации; Зона ОПР - нормальная зона очень поздней репликации. Зона отсроченной репликации в культурах клеток разных больных с СМБ дана по Hansen et al., 1997. Б. Границы области отсроченной репликации в двух лимфобластоидных клеточных линиях больных с СМБ (по Subramanian et al.,1996). В. Мейотическая нестабильность FRAXAC2 (Zhong et al.,1993). Г. Мейотическая нестабильность DXSS48, выявленная нами в семье М. Д. Границы области мейотической нестабильности микросателлитов, выявленной нами в семье П.

Итак, не отрицая роли внутренних свойств тринуклеотидного повтора FMR1{CGG)n в определении степени его стабильности, современная теория экспансии должна выявлять, прежде всего, внешние причины, способствующие изменению его длины в ряду поколений. Эти причины кроются в недостаточности системы репарации неспаренных нуклеотидов, вызванной необычно широким распространением зоны очень поздней репликации.

Зона ОПР может расширяться либо случайно, не испытывая отрицательного давления отбора в эмбриогенезе, либо под влиянием перестроек генетического материала в нормальной зоне ОПР на Xq27. Сочетание экспансии зоны ОПР и внутренних свойств тринуклеотидного

повтора, предрасполагающих к его нестабильности, и приводит к возникновению премутации и дальнейшему развитию событий, дающих в конечном итоге фенотип СМБ.

Не исключено, что подобный сценарий характерен для начальных этапов и других болезней экспансии. По крайней мере, для УО РЛАХЕ, описана зона отсроченной репликации, захватывающая тринуклеотидный повтор РШ2( ССО)п.

ВЫВОДЫ

1. Проведён комплексный молекулярный анализ образцов крови 470 больных с предполагаемым диагнозом СМБ. Диагноз подтверждён в 48 случаях (10,2%). В 18% (3 из 17) случаев цитогенетически определённой ломкости хромосомы Х(д27.3-д28) диагноз СМБ исключён. Исследовано 9 образцов плодного материала из семей с СМБ; в 5 случаях выявлены изменения, характерные для СМБ.

2. Разработан и успешно апробирован метод одновременного анализа метилирования Срв-островков генов FMг/ и РМЯ2 и фолатчувствительного ломкого участка РЯАХР. Новый метод позволяет выявлять, наряду с СМБ, УО Р11АХЕ и полных мутаций экспансии РЯАХР(СОО)п, численные аномалии Х-хромосомы у больных мужского пола. Совокупная расчетная частота выявляемой Х-сцепленной патологии составляет 1:500, что позволяет рекомендовать метод для неонатального скрининга мальчиков.

3. Впервые охарактеризованы частоты аллелей микросателлитных маркёров ОХБ548, РЯАХАС1 и 0X81113, картированных в области расположения генов РМН1, РМЯ2 и ломкого участка РЯАХР, и распределение гаплотипов ОХБ548-РКАХАС1-ОХ81113 в контрольной группе (117 хромосом) и в группе больных с СМБ (35 хромосом). Выявлены достоверные различия в распределении аллелей и гаплотипов указанных маркёров. Повышенная расчетная гетерозиготность микросателлитов ОХ8548 и РЯАХАС1 в группе больных с СМБ указывает на их нестабильность при заболевании.

4. Анализ наследования аллелей микросателлитных маркёров ОХБ548, Р1ЫХАС1, РКАХАС2, ОШ691, ИХЕШЗ и Ш57Ш в семьях с СМБ позволил выявить 3 мутации БХ8548, 4 мутации РЯАХАС1 и 2 мутации ОХ31123. Границы области микросателлитной нестабильности совпадают с границами области отсроченной репликации в районе хромосомы Х^27.3-Я28) у больных с СМБ. Предложено и обосновано объяснение механизма экспансии ССв-повтора, приводящей к заболеванию.

5. Разработан протокол лабораторной диагностики СМБ, включающий: исследование кариотипа пробанда, анализ метилирования промоторной области гена РМШ, анализ ДНК родственников больных и пренатальную диагностику.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Стрельников В.В., Немцова М.В., Гнетецкая В.А., Демина H.A., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. //Молекулярный анализ нетипичных случаев синдрома Мартина-Белл. //Тезисы докладов 1-ой Всероссийской конференции "Медико-генетическое консультирование в профилактике наследственных болезней". Москва, 12-13 ноября 1997, с. 212.

2. Стрельников В.В., Немцова М.В., Дёмина H.A., Галкина В.А., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. //Молекулярная диагностика синдрома Мартина-Белл // Тезисы докладов 8-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1998, с. 73-74.

3. Strelnikov, Y; Nemtsova, M; Démina, К; Galkina, V; Kuleshov, N; Zaletayev, D. //DNA Testing for Fragile X Syndrome.// Abstracts of the 30th Annual Meeting of ESHG, Lisbon, Portugal, 10-13 May 1998

4. Стрельников B.B., Немцова M.B., Чеснокова Г.Г., Залетаев Д.В. //Современные методы молекулярной диагностики и скрининга синдрома Мартина-Белл.// Тезисы докладов МНИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, Москва, ноябрь 1998 г., с. 50-51.

5. В.В. Стрельников, М.В.Немцова, Г.Г.Чеснокова, НЛ.Кулешов, Д.В.Залетаев //Анализ структурно-функциональных изменений 5'-UTR гена FMR1 у больных с синдромом ' Мартина-Белл.// "Молекулярная Биология", 1999, т.ЗЗ, №2 с. 330-336.

6. Strelnikov Y.V., Nemtsova M.V., Chesnokova G.G., Kuleshov N.P., Zaletayev D.V. // A simple multiplex FRAXA, FRAXE and FRAXF PCR assay convenient for wide screening programs.// Human Mutation, 1999, N 2 p.

7. Strelnikov V, Nemtsova M, Zaletayev D. //New method for DNA screening of the Fragile X Syndrome.// Medizinische Genetik, Marz 1999, N 1 p. 209.

8. Стрельников B.B., Немцова M.B., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. //Современные методы молекулярной диагностики и скрининга X-сцепленных форм умственной отсталости.// Тезисы докладов 9-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1999, cl 13-114.

9. D.V.Zaletayev, V.V.Strelnikov, M.V.Nemtsova. //Cytogenetic and molecular approaches to diagnosis of FRAX before and after birth.// Abstracts of the 2nd European cytogenetics conference. Vien, 1999, p. 68.

lO.Strelnikov V. // Haplotype analysis at the FRAXA-FRAXF locus in Russia: identification of a new DXS548-FRAXAC1 founder haplotype and no evidence of microsatellite instability at DXS1113. // Medizinische Genetik, Marz 2000, Nl,p.l43.

11. Strelnikov V., Nemtsova M., Zaletayev D. // FRAXA population genetics in Russia: further evidence that fragile X mutations were not originally associated with microsatellite instability. Abstracts of HGM 2000, Vancouver, Canada, 2000, p.46.

12.В.В.Стрельников, М.В.Немцова, О.Е.Блинникова, Г.Г.Чеснокова, Н.П.Кулешов, Д.В .Залетаев// Современные методы ДНК-диагностики синдрома Мартина-Белл.// Педиатрия, 2000, №4, с. 21-25.

166-169.