Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический анализ политенных хромосом питающих клеток ооцитов мутанга OVARIAN TUMOR DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический анализ политенных хромосом питающих клеток ооцитов мутанга OVARIAN TUMOR DROSOPHILA MELANOGASTER"

? \ Ü * л \ 0 № да

На правах рукописи УДК (576.316.352:575.224):595.773.4

МАЛЬЦЕВА НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ПИТАЮЩИХ КЛЕТОК ООЦИТОВ МУТАНТА OVARIAN TUMOR DROSOPHILA MELANOGASTER.

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук,

И.Ф. Жимулев

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Л.В. Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

кандидат биологических наук, Л.В. Омельянчук Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится_3 а>у^^^а._ 1997 г.

на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д - 002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

Автореферат разослан_<30 _

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

А .Д. Груздев

Введение.

Актуальность проблемы. В тканях многах организмов встречаются клетки, в которых несколько циклов репликации ДНК протекает без клеточного или ядерного деления. Ядра таких клеток содержат множество копий хромосом и в большинстве случаев являются эндополи-плоидными, то есть после репликации хромосомы отделяются друг от друга, формируя характерную ретикулярную структуру ядра. Наибольший интерес, однако, представляют клетки, в ядрах которых многочисленные копии каждой хромосомы остаются плотно соединенными друг с другом, формируя таким образом гигантские политенные хромосомы с характерным рисунком чередующихся светлых и темных полос (дисковым рисунком). Такие хромосомы являются замечательной моделью для изучения структуры и функций интерфазных хромосом эукариот, позволяя проводить тонкое цитогенетическое картирование, часто невозможное для митотических хромосом. На переход от эндополиплоидного состояния ядер к политенному могут влиять как генетические, так и внешние факторы (Bier, 1957; Beermann, 1962; Nagl, 1982; Ribbert, 1979; King et. al., 1981; обзоры: Жимулев, 1992; Zhimulev, 1996).

Вопрос о том, насколько сходной является структура политенных хромосом в тканях, различающихся по своим физиологическим функциям, остается спорным уже более 60 лет. Клеточная дифференцировка может приводить к различным функциональным состояниям политенных хромосом, причем наибольших различий можно ожидать при сравнении хромосом клеток зародышевого пути и соматической ткани.

В онтогенетическом смысле клетки слюнных желез являются конечным этапом дифференцировки, в то время как клетки зародышевого пути дают начало новым клеточным поколениям. У самок Drosophila melanogaster питающие клетки ооцитов являются сестринскими клетками яйцеклетки, по сути клетками зародышевого пути. Их функция заключается в синтезе практически всех РНК и белков, необходимых для созревания яйца и последующего раннего эмбрионального развития (King, 1970; Mahowald, Kambysellis, 1980; Spradling, 1993). Ядра питающих клеток эндополиплоидны и на ранних этапах развития содержат первичные политенные хромосомы, которые, однако, позднее диспергируются, в результате чего приобретают характерную для интерфазы ретикулярную структуру.

Одним из эффектов мутации ovarian tumor (otu), вызывающей серьезные нарушения в процессе оогенеза, является образование в питающих клетках ооцита вторичных политенных хромосом с характерным дисковым рисунком (King et. al., 1981). Однако, долгое время эти хромосомы оставались практически неисследованными из-за их

плохой морфологии и нечеткости дискового рисунка в большинстве клеток. Данная работа посвящена изучению процесса формирования политенных хромосом в питающих клетках мутантов ош, описанию морфологических свойств этих хромосом и выявлению факторов, влияющих на их структуру.

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлась разработка новой цитогенетической модели для изучения структурно-функциональной организации интерфазных хромосом. Такой моделью являются полигонные хромосомы питающих клеток ооцитов мутантов ош ОгозоркИа melanogaster. Необходимым этапом работы было сравнение морфологических и некоторых функциональных характеристик политенных хромосом питающих клеток имаго и клеток слюнных желез личинки. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологические особенности политенных хромосом питающих клеток ооцитов у мутантов, несущих различные аллели локуса о/и, с целью выявить аллели или их комбинации, вызывающие формирование политенных хромосом наиболее пригодных для цито-генетического анализа.

2. Подобрать оптимальные условия развития мутантов, способствующие формированию в питающих клетках ооцитов политенных хромосом с четко выраженным дисковым рисунком.

3. Составить цитологические карты политенных хромосом питающих клеток.

4. Провести сравнительный морфологический анализ эу- и гетерохроматиновых районов политенных хромосом питающих клеток и клеток слюнных желез.

5. Получить ряд характеристик функциональной организации хромосом питающих клеток:

а). Изучить возможность индукции пуфинга в хромосомах питающих клеток.

. б). Выяснить, проявляется ли в этих клетках эффект положения мозаичного типа.

В результате

проведенного исследования впервые разработана методика получения политенных хромосом питающих клеток, близких по качеству к хромосомам клеток слюнных желез, позволившая построить фотографические карты политенных хромосом питающих клеток и провести сравнительный анализ политенных хромосом слюнных желез личинки и питающих клеток ооцита мутанта ош11. В хромосомах питающих клеток было обнаружено сильное ослабление свойств прицентромер-ного и интеркалярного гетерохроматина. С помощью эу- гетеро-

хроматиновых перестроек показано сильное ослабление проявления эффекта положения мозаичного типа в питающих клетках ооцнтов по сравнению с клетками слюнных желез.

Таким образом, основным результатом проведенного исследования является разработка новой цитогенетической модели для изучения структурно-функциональной организации хромосом - политенные хромосомы питающих клеток ооцитов имаго. Полученные в ходе работы результаты имеют теоретическое значение для дальнейшего анализа структурно-функциональной организации ннтерфазных хромосом и эукариотического генома.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IX международной конференции по молекулярной генетике дрозофилы (Крит, Греция, 1994г.), на Второй международной конференции по организации гетерохроматина дрозофилы (Гонолулу, США, 1995г.), на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (1996г) и в стендовом сообщении на ХП Всероссийском симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Санкт-Петербург, Россия, 1996г.).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов исследования, выводы и список литературы (194 наименования). Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка и 4 таблицы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Материалы и методы исследования

Анализируемые линии мух содержались в стандартных условиях при температуре 16°С. В работе использовались линии дрозофил, несущие 7 и 11 аллели otu, из коллекции лаборатории молекулярной цитогенетики ИЦиГ СО РАН:

FM3/otu7 х otu7'/Y и FM3/y w sn3 otu11 x у w sn3 otu"/Y, и, кроме того, линия со сцепленными X и Y хромосомами, где X хромосома несет мутации у w sn3 и otu11, a Y хромосома маркирована Для изучения эффекта положения мозаичного типа были выбраны две перестройки Dp(l;l)pn2b и Dp(l;f)1337 (Belyaeva, Zhimulev, 1991) и введены в линию FM3/y w sn3 otu11. Описание мутаций, маркирующих линии, и балансерных хромосом содержится в справочнике "The genome of Drosophila melanogaster" (Lindsley and Zimm, 1992).

третьего возраста выделяли в растворе Эфрусси-Бидла (Ephrussi, Beadle,

1936), затем переносили на 20 минут в каплю ацетоорсеина. Окрашенные железы раздавливали на предметном стекле в капле 55% молочной кислоты. Районы хромосом идентифицировали по картам Бриджеса (Lindsley and Zimm, 1992) и Лефевра (Lefevre, 1976). Пуфовые стадии хромосом определяли согласно описанию Эшбернера (Ashburner, 1972). Для получения политенных хромосом из питающих клеток ооцитов отбирали недавно вылупившихся самок и помещали их вместе с самцами на содержащий свежие дрожжи корм на 5-12 дней (в зависимости от генотипа мух и эксперимента). Затем из анестезированных самок извлекали яичники в капле раствора Эфрусси-Бидла и помещали в ацетоорсеин на 30-40 минут. После окраски каждый яичник переносили на предметное стекло в каплю 55% молочной кислоты, где с помощью тонких вольфрамовых игл овариолы освобождали от перитонеальной и трахеальной оболочек и зрелых яиц. Стадии развития оставшихся яйцевых камер определяли согласно классификации Кинга (King, 1970). Затем приготавливали давленые препараты.

Для приготовления препаратов были взяты по 10 невиргинных самок каждого генотипа на 11ый день после вылупления. Общее число изученных ядер составило для мух генотипов otu7/otu7 - 511, otu'Votu11 -550 и для otuVotu11 - 537. Для разбиения хромосом на классы и группы сперва были определены примерные размеры хромосом, входящих в каждую категорию, и сделаны их фотографин, выполненные в одном масштабе. Такие фотографии и легли в основу классификации. Сравнительный анализ экспериментальных данных с помощью критерия X показал, что все три выборки достоверно различаются с вероятностью р«Ю"10. Для частот классов были вычислены 95% доверительные интервалы с помощью преобразования Фишера (Fisher, 1990).

питающих клеток ооцитов. Построение цитологических карт хромосом нитаюших клеток. Для анализа были выбраны мухи генотипа otu11. Сравнительный анализ проводился для четырех выборок хромосом клеток слюнных желез и питающих клеток ооцитов из личинок и взрослых мух генотипов XX и XXY. Было проанализировано по 50 хромосом каждого типа.

Анализ пуфинга политенных хромосом питающих клеток после тепловой обработки. Опыты проводили- на личинках третьего возраста и взрослых мухах генотипа otu!/у w sn3 otu". Личинок инкубировали 30 минут в растворе Эфрусси-Бидла при температуре 37°С. Аналогично проводили инкубацию яичников, после чего приготовляли окрашенные ацетоорсеином, давленые в молочной кислоте препараты.

Результаты и обсуждение

В яичниках мероистического типа яйцевая камера представляет собой синцитий из 16 клеток, связанных между собой системой каналов, в котором синтез РНК и белков для растущего ооцита осуществляется 15 питающими клетками, сестринскими клетками яйцеклетки. На основе морфологических критериев развитие яйцевой камеры с момента образования синцития и до зрелого яйца делится на 14 стадий. В норме эндополиплоидные ядра питающих клеток имеют ретикулярную структуру и, следовательно, непригодны для цитологического анализа (King, 1970). Среди целого класса мутаций, вызывающих стерильность самок, мутации гена otu (ovarian tumor) приводят к сильным нарушениям оогенеза (King, Riley, 1982). Яичники самок, гомозиготных по otu, могут не иметь яйцевых камер, либо содержать опухолевые камеры, заполненные множеством митотпчески делящихся клеток. Редко в них могут встречаться нормальные яйцевые камеры и камеры, не имеющие ооцита, но содержащие большие эндополиплоидные ядра, напоминающие ядра питающих клеток в норме. Такие мутантные клетки были названы псевдопитающими, поскольку они не выполняют свою функцию - "питание" ооцита. Известно 17 аллелей otu и для некоторых из них, а также их межаллельных комбинаций, характерно (с разной частотой) образование в ядрах питающих и псевдопитающих клеток политенных хромосом (Storto, King, 1987; 1988). Анализ результатов, полученных другими исследователями (King, 1981; Sinha et al, 1987; Storto, King, 1987; 1988; Heino, 1989), касающихся морфологии политенных хромосом питающих клеток ооцитов мутантов, несущих разные аллели otu, позволил нам изначально выбрать 7 и 11 аллели, вызывающие в питающих клетках ооцитов имаго образование, с максимальной частотой, политенных хромосом с наиболее четкой дисковой структурой.

Наиболее сильным фактором, влияющим на структуру политенных хромосом, является температура среды, при которой происходит развитие организма. Причины этого до сих пор не выяснены, хотя есть предположения относительно, например, изменения количества молекул белков, приводящего к усилению синапсиса или конъюгапионных связей между хромосомными нитями (обзоры: Жимулев, 1992; 2Ыти1еу, 1996).

Вторым значительным фактором, влияющим на структуру хромосом, является состав корма. Яркой иллюстрацией такого влияния является муха АрШосИае1а хапМпа Бр., в ядрах слюнных желез которой полн-

тенные хромосомы образуются только тогда, когда пища этого насекомого богата жирами и аминокислотами. При обедненном питании ядра клеток заполнены филаментозным материалом (Barigozzi, Бетеага, 1952). Для улучшения структуры и качества политенных хромосом ОгоБорЫ1а в корм обычно добавляют дрожжи и сахар (обзор: Жимулев, 1992). В результате наших экспериментов оказалось, что низкая температура развития (16°С) и богатая дрожжами пища приводят к усилению конъюгации хроматид, тем самым улучшая четкость дискового рисунка политенных хромосом питающих клеток ооцитов у мутантов ош.

Политенные хромосомы питающих и псевдопитающих клеток мутантов otu сильно варьируют по длине, ширине и дисковому рисунку. По длине их можно разделить.на четыре основных класса:

1. "Помпоны" (Р) - наиболее короткие хромосомы. Они названы так, поскольку напоминают политенные хромосомы, впервые описанные в ядрах клеток Rhynchosciara angelae, инфицированных микроспоридиями (Pavan, Basile, 1966). Дисковый рисунок у этих хромосом так сильно изменен, что их практически невозможно идентифицировать.

2. "Полупомпопы" (HP) - примерно в два раза длиннее, чем "помпоны" и, как правило, также имеют значительно измененный дисковый рисунок.

3. "Сжатые хромосомы" (С) - этот класс включает в себя хромосомы с длиной промежуточной между полупомпонами и хромосомами последнего класса. Хромосомы данного класса легко опознаются, однако тонкий анализ отдельных районов часто затруднен.

4. Последний класс, "нормальные" хромосомы (N) - включает хромосомы, близкие по длине к хромосомам слюнных желез.

Поскольку хромосомы сильно варьируют также и по толщине, внутри каждого класса было выделено несколько ipynn. Три из них, тонкие (S), средние (М) и толстые (L), характерны для всех классов, причем каждая последующая группа включает хромосомы с шириной, в 1,5-2 раза превышающей ширину хромосом из предыдущей группы. Кроме того, была выделена специальная группа "гигантских" помпонов (РХ). Эти огромные, "помпоно"-подобные хромосомы встречаются в яичниках мух, гомозиготных по otu7. В классе, содержащем нормальные хромосомы и представляющем для нас наибольший интерес, оказалось возможным выделить шесть групп. Прежде всего это тонкие (NS), средние (NM) и толстые (NL) хромосомы, ще средние хромосомы по своим размерам близки к политенным хромосомам слюнных желез личинок третьего возраста, а тонкие и толстые, соответственно в 1.5 - 2

раза тоньше или толще. Помимо этих групп была выделена группа очень тонких хромосом, напоминающих бусы (N13). Эти хромосомы, по-видимому, соответствуют политенным хромосомам с маленькой степенью политении, которые классифицированы Беерманом как спиральные или меандрические (Вееппапп, 1962, рис. 31). Группа "хрупких" хромосом (М5) включает, в основном, хромосомы из КМ и N1, групп с дисковым рисунком, нарушенным в результате диссоциации хромосом на фибриллы. Наконец, у гибридов оШ7/оШи встречались гигантские политенные хромосомы (НХ) с четким дисковым рисунком.

30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

к

оиГ/оШ7

В.

30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

30% 25% 20% 15% 10% 5% 0%

у V* ЯП* оШ" / у V/ Я13 0{и"

-[Уу*1 ,1*1.1*1, йй

гЬ

л

й

П5_1Х«2-1«5_|тм5-1И-Х

<Лит / у VI 31® оШ"

гЗп.гЗН,-

г^та. т

гЬ|

гЬ

(0 2-1 а. £ Ои

= х *

со г 10 и

о § " 2 2

Рпс.1. Частота образован™ хромосом различной морфологии в ядрах питающих клеток ооцитов мух гомозиготных по от (о), от" (б) и оЫ 1оШ генотипа (в). Абцисса - классы хромосом (объяснения в тексте). Ордината - частота образования (в %). На рисунке указан 95% доверительный интервал.

Такая классификация, хотя и довольно упрощенная, тем не менее позволила нам провести сравнение морфологии хромосом псевдопита-ющих и питающих клеток у мух исследуемых генотипов. В результате

оказалось, что псевдопитакнцие и питающие клетки мух, гомозиготных по оШ7, в основном имеют ядра с хромосомами первых двух классов, т.е. "помпонами" и "полупомпонами" (Р и НР, Рис. 1а). У мух генотипа ошп/о1ии встречаются хромосомы практически всех классов и групп, кроме гигантских "помпонов" (РХ) и гигантских нормальных хромосом (ЙХ) (Рис. 16). Самыми распространенными были очень тонкие (N6, 15,4%) и тонкие (N8, 20,7%) хромосомы.

У гибридов 0Ш7/0Ши происходит сдвиг распределения в сторону хромосом нормального класса (Рис. 1в). Хромосомы же первых двух классов почти не встречаются, поэтому возрастает процент сжатых и нормальных хромосом и появляется группа гигантских нормальных хромосом. Кроме того, более чем в два раза увеличивается количество "хрупких" хромосом, по сравнению с таковым у мух генотипа оШ ¡ош11. Как показал дальнейший анализ, эти хромосомы относятся к ядрам питающих клеток из яйцевых камер, находящихся на 12 стадии развития, когда цитоплазма питающих клеток уже перешла в ооцит, и над ним формируруется "шапочка" из ядер питающих клеток с дегенерирующими хромосомами. Такая разница в количестве "хрупких" хромосом между самками генотипа оШ7/ошп и оШи1о1и11, по-видимому, объясняется большим количеством камер, находящихся на 12 стадии развития, у самок оШ7/оШп. Таким образом, в результате проведенного анализа оказалось, что частота образования политенных хромосом с четким дисковым рисунком максимальна в питающих клетках фертильного гибрида от7/оШп, где процесс оогенеза происходит полностью. В целом, большинство хромосом псевдопитающих и питающих клеток мух генотипа оШ71оЫц имеют морфологию более близкую к хромосомам слюнных желез, по сравнению с гомозиготами оШ7 (Рис. 1а и в) и более высокую степень политении по сравнению с хромосомами псевдопитающих и питающих клеток мух генотипа о1и111оШ11 (Рис. 16 и в). Исследование препаратов индивидуальных яйцевых камер, содержащих ооцит, мух генотипа оШ71оШп подтвердило предположение о том, что, в отличие от псевдопитающих, питающие клетки содержат, как правило, хромосомы нормального и, реже, сжатого классов. Отличное цитологическое качество политенных хромосом гибрида ош7/оши позволяет проследить развитие хромосом всех питающих клеток яйцевой камеры на 7-11 стадиях развития (стадиях накопления в ооците желтка).

Построение цитологических карт политенных хромосом питающих клеток. Анализ пуфинга политенных хромосом питающих клеток.

Фотографические карта всех политенных хромосом питающих клеток были составлены для хромосом мух генотипа у уу яп3 оШи/у м ж3 оШи. Их сравнение с картами политенных хромосом клеток слюн-

ных желез выявило значительное сходство дискового рисунка между этими хромосомами, за исключением нескольких эухроматиновых районов, а также дистальных прицентромерных районов, таких как 20C-F, 41-42, и 80 района, который в разных ядрах питающих клеток меняет свою структуру от полностью диффузной до дисковой. Во многих случаях соответствующие одиночные диски в хромосомах слюнных желез (21С1-2, 22С, 23D1-2, 23Е1-2, 30АВ, 48F, 51АВ, 55С, 57Е, 61С, 65D, 66Е, 71А, и 93F) были представлены двумя или тремя дисками в хромосомах питающих клеток.

Данные по сравнительному анализу дискового рисунка политенных хромосом из разных тканей одного организма противоречивы (обзор Жимулев, 1992). Результаты, представленные в нашем исследовании, подтверждают сходство дискового рисунка политенных хромосом слюнных желез и питающих клеток ооцитов для крупных и средних дисков, хорошо видимых в световом микроскопе, в большинстве хромосомных районов. Исключением являются 5 районов, где сходство обнаружить не удалось. Что касается картирования участков хромосом, содержащих тонкие диски, то для этого необходимо дровести анализ па электронно-микроскопическом уровне.

В целом, получепные нами данные хорошо согласуются с ранее высказанной точкой зрения (Веегтап, 1952, 1972; Жимулев, Беляева, 1977; Zhimulev et al., 1983) относительно постоянства дискового рисунка в нормально функционирующих клетках разных тканей, согласно которой наблюдаемые различия могут быть обусловлены изменением размеров междисков или расщеплением дисков (два или три диска в одной ткани вместо одного - в другой).

При исследовании хромосом питающих клеток было найдено малое количество крупных пуфов, что было неожиданным, принимая во внимание функцию питающих клеток и тот факт, что во врет оогенеза, по подсчетам (Garcia-Bellido, Robbins, 1983), экспрессируется до 70% всех генов дрозофилы. Крупные пуфы развиваются лишь в районах 3CD, 7Е, 8С, ИВ, 22F, 42АВ, 47А и 79D. Однако, наши наблюдения показывают, что множество мелких пуфов возникает на протяжении жизненного цикла питающих клеток. На одном из этапов своего развития структура самого крупного пуфа 2R хромосомы, 47А, напоминает маленькое Кольцо Бальбиани - пуф очень редкий для видов Drosophila. До сих пор Кольца Бальбиани были обнаружены только в политенных хромосомах клеток слюнных желез Drosophila auraria и нескольких близких видов (Kastritsis, Grossfield, 1971), и у видов группы Drosophila virilis (W. Beerman цит. по Scouras and Kastritsis, 1984). Иногда также виден крупный пуф, развивающийся из нескольких дисков на теломерном конце 3L хромосомы (61АВ).

Анализ пуфинга политенных хромосом питающих клеток после воздействия тепловым шоком

Картина индукции пуфов теплового шока на политенных хромосомах клеток слюнных желез полностью соответствовала описанной в литературе (Ashburner, Bonner, 1979). В политенных хромосомах питающих клеток ооцитов индукция пуфов теплового шока оказалась крайне слабой. Лишь небольшое пуфирование наблюдалось в районах 63В, 64F, 67В, 87А, 93D и 95D. В то же время такой крупный в политенных хромосомах клеток слюнных желез пуф теплового шока как 87С вообще не развивался, как и пуфы 33В и 70А. Таким образом, индукция пуфов теплового шока в политенных хромосомах питающих клеток в условиях стресса оказалась крайне слабой по сравнению с хромосомами клеток слюнных желез.

Сравнительный анализ основных характеристик политенных хромосом питающих клеток оопитов и клеток слюнных желез.

Для исследования основных характеристик политенных хромосом питающих клеток и проведения сравнительного анализа с хромосомами клеток слюнных желез нами были выбраны личинки и мухи генотипов у w sn3 otu11/у w sn3 otu11 и у w sn3 otu11/у w sn3 otuу* У^У5. Для анализа выбирали лишь хромосомы питающих клеток, близкие по морфологии к хромосомам слюнных желез. Доля таких хромосом составляла 5-10% от всех хромосом на препарате. Вопреки мнению о том, что отсутствие хромоцентра в ядрах питающих клеток с политенными хромосомами обусловлено сильной недорепликацией гетерохроматина (Dabbs, King, 1980; Heino, 1989, 1994), в прицентро-мерных районах хромосом сжатого и нормального классов нами были обнаружены дополнительные блоки гетерохроматина, часто связанные между собой тонкими гетерохроматиновыми тяжами. По своей структуре данные блоки напоминают ß-гетерохроматин хромосом клеток слюнных желез, однако в большинстве исследованных ядер питающих клеток они приобретают дисковый рисунок и даже признаки пуфиро-вания (например, 80 район 3L хромосомы). По-видимому, дополнительные блоки гетерохроматина в хромосомах питающих клеток возникают в результате уменьшения степени недорепликации при-центромерного гетерохроматина.

Фрид и Шульц (Freed and Schultz, 1956) с помощью цитофотометрии показали, что добавление Y хромосомы в геном самки Drosophila melanogaster приводит к значительному увеличению содержания ДНК в ядрах питающих клеток. Введение Y хромосомы в геном самок, гомозиготных по otu", не привело к увеличению степени политешш хромосом питающих клеток, однако обнаруженное нами влияние Y хромосомы на структуру политенных хромосом удивительно. В наших

экспериментах с самками генотипа XXY было показано значительное улучшение структурированности как эу-, так и гетерохроматиновых участков хромосом. Однако, сама Y-хромосома также недореплициро-вана в ядрах питающих клеток, как и в ядрах клеток слюнных желез.

Асинапсис является одной из основных характеристик политенных хромосом. Для хромосом слюнных желез было показано, что частота возникновения асинапсиса меняется в зависимости от хромосомы и хромосомного района. Так, максимальная частота наблюдается в проксимальных районах X хромосомы и центральных эухроматиновых районах, расположенных в плечах хромосом 2 и 3 (Belyaeva, 1973). В политенных хромосомах питающих клеток асинапсис встречается в 10 раз чаще, чем в хромосомах клеток слюнных желез. При этом максимальная частота асинапсиса характерна для 19-20 районов X хромосомы н районов 39D - 42ВС второй хромосомы. Частота асинапсиса для хромосомы 4 в питающих клетках^также высока и составляет 32% - для самок XX и 16% - для самок XXY генотипов. Особенностью политенных хромосом питающих клеток является частая неполная конъюгация хроматид, вследствие которой хромосомы разделяются не только на гомолога, но и на 4 и более пучка хроматид. Сходные типы асинапсиса, с разделением гомологов на 4 элемента, наблюдали у Anopheles atroparvus (Стегаин, 1979). Расщепление политенных хромосом на 2,3,4,5 и даже 6 пучков было обнаружено у Cerodontha dorsalis (.Agromyzidac) (Stalker, 1954)

Способность хромосом к эктопической конъюгации и разломам в определенных "слабых точках", вызванных локальной недорепликацией ДНК (районы интеркалярного гетерохроматина) является характерным свойством политенных хромосом клеток слюнных желез (Zhimulev et al„ 1982). Исследуя политенные хромосомы питающих клеток ооцитов Рибберт (Ribbert, 1979) у Calliphora erythrocephala и Хейно (Heino, 1989, 1994) у мутанта otu Drosophila melarwgaster не обнаружили разломов или эктопической конъюгации в этих хромосомах. Они объяснили это особенностью организации хромосом клеток зародышевого пути. Однако данные, полученные в наших экспериментах, свидетельствуют о том, что оба эти свойства все же характерны для хромосом питающих клеток, хотя и в гораздо мепьшей степени, чем для политенных хромосом. слюнных желез. В нашей работе были обнаружены разломы в 45 сайтах хромосом питающих клеток. В Таблице 1 суммированы данные по частотам образования разломов в слабых точках с наибольшими для политенных хромосом слюнных желез частотами для самок генотипа XX и X^Y. Из данных, приведенных в Таблице 1, следует, что частоты образования разломов, а значит недорепликация ДНК, в политенных хромосомах питающих клеток значительно ниже, чем в клетках слюнных желез и сравнимы по

порядку величины лишь в районах 19Е, 36Б и 39Е. Эффект воздействия У-хромосомы на частоту образования разломов незначителен.

Таблица 1. Частота образования разломов в районах слабых точек в хромосомах клетж слюнных желез (СЖ) личинок и питающих клеток (ПК) мух генотипов XX иХХУ.

Район XX, СЖ . ХХУ, СЖ XX, ПК ХХУ, ПК

ЗС 36.0016.79% 32.0016.60% 6.0013.36% о.оо±о.оо%

НА 64.0016.79% 50.0017.07% 6.0013.36% 4.0012.77%

12Е 40.0016.93% 36.0016.79% 0.0010.00% 2.0011.98%

19Е 68.0016.60% 68.0016.60% 22.0015.86% 20.0015.66%

35Э 50.0017.07% 54.0017.05% 4.0012.77% 4.0012.77%

360 52.0017.07% 52.0017.07% 8.0013.84% 8.0013.84%

зт 22.0015.86% 10.0014.24% 4.0012.77% 0.0010.00%

39ЭЕ 62.0016.86% 54.0017.05% 44.0017.02% 22.0015.86%

67БЕ 44.0017.02% 34.0016.70% 2.0011.98% 4.0012.77%

70С 32.0016.60% 32.0016.60% 6.0013.36% 6.0013.36%

75С 68.0016.60% 74.0016.20% О.ООЮ.ОО% 2.0011.98%

89Е 66.0016.70% 54.0017.05% 2.0011.98% 2.0011.98%

Это можно объяснить тем, что низкая температура, при которой происходит развитие особи, нейтрализует воздействие У-хромосомы. Частота образования эктопических контактов также значительно снижена в питающих клетках ооцита (Таблица 2).

Таблица 2. Образование эктопических контактов в политенных хромосомах клеток слюнных желез (СЖ) личинок п питающих клеток (ПК) мух генотипов XX и ХХУ. (Данные для 50 хромосом каждого типа).

Хромосома XX, СЖ ХХУ, СЖ XX, ПК ХХУ, ПК

X 20 9 4 0

21. 28 23 1 0

2Я 10 1 2 1

зь 13 12 0 4

зя 7 9 1 0

Эффект положения мозаичного типа (ЭПМ) в политенных хромосомах питающих клеток.

Для изучения ЭПМ в политенных хромосомах питающих клеток самок, гомозиготных по оШи, были выбраны две перестройки Ор(1;1)рп2Ь и Бр(1;/)1337, прекрасно изученные цитологически и характеризующиеся протяженным ЭПМ как на генетическом, так и

цитологическом уровнях при пониженной температуре (Ве1уаеуа, 2Ыши1еу, 1991).

Дупликация Ор(1;1)рп2Ь содержит эухроматиновый район 1А-2Е1-2, прикрепленный к прицентромерному гетерохроматину X хромосомы. В ядрах клеток слюнных желез она чаще всего располагается вблизи хромоцентра. Нами было проанализировано 108 ядер, содержащих хорошо различимую дупликацию, из клеток слюнных желез пяти личинок, находящихся на РБЗ-б личиночного развития (пуф 2ВЗ-5 хорошо развит на этой стадии и его отсутствие в дупликации может быть обусловлено лишь компактизацией). Обычно дупликация располагалась в области хромоцентра. Оказалось, что компактизация в дупликации наблюдается в 92,6% ядер, распространяясь в дистальном направлении от 2Е1-2 до 1С района (рис. 2). В ядрах питающих клеток дупликация Бр(1;1)рп2В часто конъюшровала с гомологичным районом Х-хромосомы. Всего было проанализировано 114 ядер с дупликацией, в среднем по 2-4 ядра из одной мухи. Образование блоков компактного материала (рис. 2) наблюдалось лишь в 13,3% случаев, что примерно в 6 раз реже, чем в слюнных железах. В целом, хотя частота компактизации дупликации мала, картина ее распространения напоминает таковую в хромосомах слюнных желез; в большинстве случаев компактизовались диски 2С-2Е1-2 района (рис. 2).

100%

гЪ гЬ гЪ • гЬ ■Е- гЬ гЬ

а Яш п

-.-»-.-.-.-»KJMtO WWW

> OJ о о гп -п > CD GO -» Ш О о

Z £ и V

го

Рис.2. Частоты компактизация районов дупликации Dp(l;l)pn2b в ядрах клеток слюнных желез (белые столбики) и в ядрах питающих клеток оощгтов (заштрихованные столбики). Абцисса -районы Х-хромосомы по карте Бриджеса. Ордината - частота комлактазащга (в '.%). На рисунке обозначен 95% доверительный интервал.

Свободная дупликация Dp(l;f)1337 значительно короче, чем Dp(l;l)pn2B. Ее эухроматиновая часть содержит район 1А-2В7-8, прикрепленный к гетерохроматину из 19 и 20 районов X хромосомы. Всего нами было проанализировано 111 ядер из 5 личинок на стадии PS3-6. Оказалось, что при 16°С частота образования блоков в ядрах клеток слюнных желез для этой перестройки составляет 56,8%. Компактизация чаще всего захватывает район 2В и может распространяться, сильно меняя морфологию дупликации, до 1С района. Частота компактизации максимальна для района 2В1-7

дупликации. Из проанализированных 113 ядер питающих клеток компактизация наблюдалась в 9,7% случаев и только в районе 2В. Таким образом, суммируя данные, полученные для двух перестроек, можно сделать вывод, что, как и друше свойства гетерохроматина, проявление ЭПМ также сильно ослаблено в полнтенных хромосомах питающих клеток. В целом, ЭПМ в питающих клетках ооцитов выражен в 6 раз слабее, чем в ядрах клеток слюнных желез.

ЭПМ проявляется как результат распространения гетерохроматиза-цип из гетерохроматиновых доменов на эухроматиновые районы перестройки. В настоящее время можно считать доказанным, что компактизация эухроматина в перестроенной хромосоме отражает инактивацию расположенных там генов (гЫти1еу е1 а1., 1988 ). Наши данные о значительном снижении проявления ЭПМ в питающих клетках по сравнению с клетками слюнных желез хорошо согласуются с биохимическими. Так, при биохимическом исследовании активности гена фермента 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (ФГД), вовлеченного в хромосомную перестройку, приводящую к ЭПМ, в различных тканях личинок и взрослых мух было показано, что активность фермента сильно меняется в зависимости от исследуемой ткани. В клетках слюнных желез, ще степень проявления ЭПМ высока, активность ФГД составляла 16% от нормы. Наименьшее изменение активности (93% активности) наблюдалось в яичниках имаго, что позволило предположить резкое ослабление или отсутствие ЭПМ в клетках зародышевого пути (Слободянюк, 1989). Наряду с резким снижением компактизации материала перестроек при ЭПМ в политенных хромосомах в ядрах питающих клеток, по сравнению с полптенными хромосомами ядер клеток слюнных желез, наблюдается уменьшение недорепликации ДНК в районах прицентромерного и интеркалярного гетерохроматина. Это приводит к образованию в прицентромерных районах дополнительных блоков политенизирующешся материала и значительному ослаблению проявления таких свойств интеркалярного гетерохроматина как частоты возникновения разломов и образования эктопических контактов как между районами интеркалярного гетерохроматина, так и с прицентромерным гетерохроматином. Таким образом, в политенных хромосомах питающих клеток ооцита наблюдается общее ослабление проявления всех гетерохроматиновых свойств. Это свидетельствует об отличиях системы гетерохроматизации клеток зародышевого пути от таковой в клетках соматической ткани.

Тот факт, что некоторые из аллелей ош комплементируют, в смысле восстановления фертильности, не вызывая при этом дисперсии эндореплицированных хромосом питающих клеток, подтверждает предположение о том, что политенное состоянием хромосом питающих клеток не влияет- на процесс оогенеза. Изучение оогенеза у других

насекомых также подтверждает этот вывод (Bier, 1959; Ribbert, 1979). Таким образом, питающие клетки ооцитов, содержащие политенные хромосомы, могут нормально функционировать с точки зрения синтеза РНК и переноса необходимых веществ в ооцит. Поэтому политенные хромосомы питающих клеток фертильных гибридов аллелей otu Drosophila melanogaster представляют собой уникальную систему, позволяющую изучать на хромосомном уровне активацию и экспрессию генов, принимающих участие в оогенезе, в этом, пожалуй, наиболее сложном и загадочном биологическом процессе, в наше время все сильнее привлекающем внимание специалистов в области биологии развития.

Выводы

1. Разработана новая цитогепетическая модель для изучения функциональной организации интерфазной хромосомы - политенные хромосомы питающих клеток ооцитов мутанта otu Drosophila melanogaster.

а) Определены генетические и средовые факторы, влияющие на морфологию политенных хромосом питающих клеток. Максимальная частота образования хромосом, близких по структуре и размерам к хромосомам слюнных желез личинки, наблюдается у фертильных мух генотипа otu''/otu11, выращенных на обогащенной белками среде при 16°С.

б) Составлены цитологические карты политенных хромосом питающих клеток, которые являются основой для идентификации хромосомных районов и нх сравнения с гомологичными участками в хромосомах слюнных желез.

2. Для эухроматиновых районов была выявлена практически полная идентичность дискового рисунка хромосом питающих клеток имаго и клеток слюнных желез личинки. Наиболее существенные различия связаны с изменением спектра пуфов. Индукция пуфов теплового шока в политенных хромосомах питающих клеток выражена слабее, чем в хромосомах клеток слюнных желез

3. Выявлены особенности организации гетерохроматиновых районов в хромосомах питающих клеток:

а) В 45 районах интеркалярного гетерохроматина из-за ослабления недорепликации происходит значительное снижение частоты образования разломов и эктопических контактов по сравнению с таковым в хромосомах слюнных желез личинок.

б) Уменьшение степени недорепликации ДНК в районах прицен-тромерного гетерохроматина приводит к образованию дополни-

тельных блоков политенизирующегося материала в хромосомах питающих клеток, в) В питающих клетках значительно ослаблена способность прицентромерного гетерохроматина вызывать генетическую инактивацию при эффекте положения мозаичного типа: частота компактизации эухроматиновых районов, перенесенных к гетерохроматину в результате хромосомных перестроек, в ядрах питающих клеток снижена в 6 раз по сравнению с частотой компактизации в ядрах клеток слюнных желез.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Mal'ceva N.I., Zhimulev I.F. Extent of polyteny in the pericentric heterochromatin of polytene chromosomes of pseudonurse cells of otu (ovarian tumor) mutants of Drosophila melanogaster. II Mol. Gen. Genet. 1993. V. 240. P. 273-276.

2. Mal'ceva N.I., Gyurkovics H., Zhimulev I.F. General characteristics of the polytene chromosomes from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otu11 and fs(2)B mutants. // Chrom. Research. 1995. V. 3. P. 191-200.

3.Жимулев И.Ф., Беляева E.C., Семешин В.Ф., Похолкова Г.В., Кокоза Е.Б., Козлова Т.Ю., Демаков С.А., Мальцева Н.И., Демакова О.В., Баласов МЛ., Коряков Д.Е., Макунин И.В., Белоусова Н.В. Молекулярно-генетическая организация политенных хромосом. II Изв. Акад. наук (хим. серия). 1995. N. 9. С. 1623-1638.

4. Мальцева Н.И., Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы питающих клеток ооцитов - новая модель цитогенетики. // Цитология. 1997. Т. 37. N. 1. С. 34.

5. Mal'ceva N.I., Belyaeva E.S., King R.C., Zhimulev I.F. Nurse cell polytene chromosomes of Drosophila melanogaster otu mutants: morphological changes accompaning interallelic complementation and position effect variegation. // Dev. Genet, in press.