Изучение морфологии, структуры и пространственной организации хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala

Ананьина, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение морфологии, структуры и пространственной организации хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение морфологии, структуры и пространственной организации хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala"

На правах рукописи

Ананьина Татьяна Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ, СТРУКТУРЫ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ CALLIPHORA ERYTHROCEPHALA (DIPTERA: CALLIPHORIDAE)

03.00.15-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2004

Работа выполнена в НИИ Биологии и Биофизики при Томском государственном университете

Научный руководитель:

докгор биологических наук, профессор Стегний Владимир Николаевич Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Назаренко Сергей Андреевич доктор биологических наук, профессор Высоцкая Людмила Васильевна

Ведущая организация: Институт цитоло! ии РАН (Санкт-Петербург)

диссертационного совета Д 212.267.10 при Томском государственном университете (634050, г. Томск, пр. Ленина, 36).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Томскою государственного университета.

Защита

года в

часов на заседании

Автореферат разослан

2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Развитие исследований в области структурно-функциональной организации хромосом стимулировало интерес к интерфазному ядру как системе, отражающей репликативную и транскрипционную организацию генетического аппарата. Поиск новых подходов, применение современных молекулярно-цитогенетических методов и их адаптация к конкретным объектам необходимы для решения одной из ключевых задач клеточной биологии - изучения структурно-функциональной организации интерфазного ядра.

Трофоциты яичников насекомых - прекрасная модель для изучения важнейших клеточных процессов, происходящих в интерфазном ядре -эндоредупликации, транскрипции, а также пространственной реорганизации интерфазного хроматина, являющейся ключевым событием в процессе видообразования (Стегний, 1993). Трофоциты не только обеспечивают ооцит всеми необходимыми для формирования яйца продуктами, но и участвуют в создании видоспецифичной конформации цито- и нуклеоплазмы ооцита (Айзенштадт, 1984).

Молекулярно-цитологическое изучение хроматина трофоцитов яичников Calliphora etythrocephala (Díptera: Calliphoridae) открывает уникальные возможности для выяснения принципов организации генома высших эукариот. Формирование политенных хромосом с переходом хроматина от сильно ком-пактизованного (блоки первичных политенных хромосом) к декомпактизо-ванному состоянию (ядра с ретикулярной структурой), позволяет оценить значение уровня компактизации хроматина и общей архитектуры интерфазного ядра в процессе оогенеза

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы является изучение пространственной организации и морфологии хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala. Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:

1. Изучить развитие фолликулов яичников и изменение морфологии хроматина трофоцитов; 2. идентифицировать первичные политенные хромосомы трофоцитов и оценить их пространственное взаиморасположение; 3. микро-дилетированием районов и хромосом получить ДНК-библиотеки для изучения пространственной организации хроматина ядер трофоцитов; 4. проанализировать локализацию ДНК-библиотек в ядрах трофоцитов с различной морфологией хроматина; 5. оценить упорядоченность хроматина в ретикулярных ядрах трофоцитов.

Научная новизна.

Впервые показано, что на определенной стадии развития яичника С erythrocephala фолликул визуально (по морфологии хроматина трофоцитов) можно разделить на три зоны: в зависимости от близости к ооциту, в ядрах трофоцитов хроматин представлен различными морфологическими формами и имеет различную степень конденсации. Проведена идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов методом сопоставления с цитологической картой вторичных политенных хромосом и оценена их пространст-

3 РОС.. НАЦИОНАЛ ЬНАч) J БИБЛИОТЕКА Í I С.ПетербурГi* J Í

' 09 ТОSjuJQf- Г

венная организация в ядре. Впервые для изучения архитектуры ядер трофо-цитов яичников С. erythrocephala применен метод микродиссекции участков политенных хромосом. Получена информация об особенностях гибридизации ДНК-проб с хроматином, находящимся на различных стадиях эндомитотиче-ского цикла. Впервые показано, что у С. erythrocephala в ядрах трофоцитов яичников, имеющих ретикулярную структуру хроматина, материал отдельных хромосом локализуется в определенных хромосомных территориях.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссек-ция, DOP-ПЦР и FISH проводились на базе лаб. морфологии и функции клеточных структур (ИЦиГ СО РАН) совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой.

Практическая ценность работы.

Практический интерес имеет применение методики микродиссекции по-литенных хромосом для изучения пространственной организации интерфазных ядер. Работа имеет теоретическое значение в области цитогенетики.

Апробация результатов.

Результаты исследований были представлены на Научных чтениях "Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и интродукции", посвященных 100-летию профессора В.П. Чехова, Томск (1997); Конференции «Сибирская школа молодого ученого», Томск (1998); II Съезде ВОГиС, С-Петербург (2000); XIV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра», С-Петербург (2002); 1 Съезде Общества клеточной биологии и Международном симпозиуме по проблемам мейоза, С-Петербург (2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 203 ссылки. Работа изложена на 106 страницах, содержит 12 рисунков и 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования: Объектом исследования являлась сине-зеленая мясная муха Calliphora erythrocephala Mg., взятая из природной популяции г.Алматы. Лабораторное культивирование проводили по обычной методике (Тамарина, 1958; Виноградова, 1984). Для изучения влияния температуры на динамику изменения структуры хроматина трофоцитов из общей культуры были получены 2 линии, которые содержались при температуре 13°С и 25° С. Яичники самок разного возраста (с 1 по 9 день после выхода имаго из пупария) выделяли в изотоническом растворе (0,7%NaCl) и фиксировали в метанол-уксусной смеси (3:1).

Приготовление лактоаието-орсеиновых препаратов. Фиксированные яичники разделяли на фолликулы, красили лактоацето-орсеиновым красителем 15-20 мин, отмывали в 45% уксусной кислоте, накрывали покровным стеклом и раздавливали.

Приготовпение воздушно-высушенных препаратов Фиксированные яичники разделяли на фолликулы, помещали в 45% уксусную кислоту, накрывали покровным стеклом и раздавливали. После замораживания препарата жидким азотом удаляли покровное стекло и проводили обезвоживание в спиртах (50%, 75%, 100%, этанол-уксусный фиксатор (3:1)) по 10 мин, затем высушивали на воздухе при комнатной температуре. Для микродис-секции препараты делали на покровных стеклах (24x60 мм)

G-окраска (ASG) Воздушно-высушенные препараты инкубировали в 2Х SSC при 60°С в течение 1 ч, затем промывали в дистиллированной воде и красили в 2%-ном растворе красителя Гимза в течение 1,5 ч.

Микродиссекиия и получение хромосомо-спеиифичных ДНК-проб Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором 1R (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером, мик-родиссекционными иглами. ДНК-библиотеки хромосом 2, 3 и 6 были получены микроманипуляционным сбором восьми копий соответствующих хромосом 3 и 6 и теломерного района хромосомы 2 и последующей амплификацией ДНК в полимеразной цепной реакции с частично вырожденным праймером (DOP-PCR) (Rubtsov et al, 2000; Карамышева, 2001).

Супрессионная in situ гибридизация Супрессионную in situ гибридизацию проводили, как описано у Пинкеля (Pinkel, 1986).

FISH Флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) и детекцию меченой ДНК проводили согласно стандартным протоколам (Lichter, 1988). ДНК-библиотеки метили дигоксигенин-11-дУТФ (зеленый сигнал) и родамином (красный сигнал) Для окрашивания хромосом после in situ гибридизации использовали DAPI. В случае одновременной гибридизации двух ДНК-библиотек, меченных разными гаптенами, условия in situ гибридизации не отличались от условий для FISH с одним зондом.

Для одновременной детекции двух сигналов, являющихся результатом гибридизации различно меченых проб, готовили два раствора соответствующих коньюгатов в блок буфере: авидин-FITC (1:250) и СуЗ (1:125). Перед нанесением на препарат данные растворы коньюгатов смешивали в соотношении 1:1. Под покровное стекло в качестве первого антитела наносили 30 мкл общего раствора двух коньюгатов. В качестве второго антитела - биотинилированный антиавидин, затем — авидин-FITC.

Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AXIOSCOP 2, для регистрации сигнала использовали CCD-камеру и программное обеспечение «ISIS» фирмы METASYSTEMS GmbH (Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Развитие фолликулов и политеиных хромосом трофоцитов яичников С. erythrocephala.

Яичники С. erythrocephala являются мероистическими политрофными, т. е. фолликулы яичника состоят из ооцита, 15 питающих клеток (трофоци-тов) и окружающих их клеток фолликулярного эпителия.

Был проведен анализ развития яичников С erythrocephala При содержании имаго при t=20 °C в течение первых двух дней с момента выхода имаго из пупария фолликулы имеют грушевидную форму, хроматин в ядрах трофоцитов практически не окрашивается, политенные хромосомы не визуализируются (Рис. I. а) На 3-4 день фолликул приобретает овальную или округлую форму, хроматин трофоцитов окрашивается хорошо (Рис.1. а) На этой стадии развития фолликула в трофоцитах визуализируются по-литенные хромосомы различной морфологии

Наблюдали фолликулы, в которых имелись все переходные стадии от хорошо оформленных палочковидных хромосом до ядер с ретикулярной структурой (Рис 1. а, б) При анализе целых фолликулов самок 3-4-х дневного возраста, оказалось, что по морфологии хроматина трофоцитов фолликул можно разделить на 3 зоны Первая зона - дистальная (от ооцита) часть

Рис 1 Развитие фолликулов яичников и М0рф0Л01ИЯ хромосом трофоцитов С erythrocephala

а - фолликулы яичника му\ (4 дня после выхода из пупария), б

- три зоны (1, 2, 3) в фолликуле, отличающиеся морфологией хроматина трофоцитов, в - схема пространственных взаимоотношений между ооцитом и трофоцитами (Bier et al, 1969), г

- фолчикулы яичника мух (6 дней после выхода из пупария) о - оошгт, NC- трофоииты

фолликула - содержит ядра трофоцитов с длинными, тонкими хромосомами. Вторую зону - среднюю часть фолликула - образуют ядра с первичными полигенными и компактными хромосомами. В третьей зоне - проксимальной части фолликула - находятся ядра с эндометафазными хромосомами и ядра, в которых эндометафазные хромосомы начинают декомпакти-зоваться (С1адия эндоанафазы), образуя ретикулярную структуру (Рис I. б) Эти результаты хорошо согласуются со схемой пространственных взаимоотношений между ооцитом и трофоцитами, предложенной Биром (Bier et al, 1969), где также имеет место зональность в расположении трофоцитов в фолликуле (Рис 1.в)

На 5-6 день после выхода мух из пупария в фолликулах преобладали трофоциты с ретикулярными ядрами Отмечалось варьирование в размерах ретикулярных ядер ядра 4 трофоцитов, непосредственно контактирующих с ооцитом были значительно больше других ядер (Рис 1 г) Дальнейший рост фолликула сопровождается увеличением размеров ядер и деконденса-цией хроматина, после чего ядра трофоцитов постепенно деградируют.

На стадии ретикулярных ядер размер 4 трофоцитов, непосредственно контактирующих с ооцитом, больше по сравнению с остальными трофоци-тами (также как и у дрозофилы: 4 трофоцита имеют ядерные объемы в среднем в 2,67 раза больше, чем объемы остальных клеток (Brown, King, 1964)). Известно, что увеличение объема ядра может свидетельствовать о резко возросшей транскрипционной активности хроматина (Анисимов 1976; Eils. Dietzel, 1996; Swedlow, Lamond, 2001). Таким образом, причиной вариации морфологии хроматина в одном фолликуле могут являться различия в уровне плоидности и транскрипционной активности, возникшие вследствие специфики геометрии синцития.

Для изучения динамики морфогенеза хроматина трофоцитов необходим детальный анализ морфологии хроматина трофоцитов на всех стадиях развития фолликула.

Морфология хроматина трофоцитов яичников С erythrocephala.

Формирование первичных политенных хромосом.

На ранних стадиях развития имаго (1-2 день после выхода из пупария) в фолликулах наблюдали мелкие ядра с ретикулярной структурой или ядра с тонкими, переплетенными фибриллами. Хроматин трофоцитов окрашен слабо, отдельные хромосомы не выявляются (Рис. 2.1. а, б). Коньюгация хроматиновых фибрилл приводит к появлению рыхлых жгутов с редкими гетерохроматиновыми блоками. Отдельные хромосомы еще не визуализируются (Рис. 2.1. в).

Следующая стадия - ядра с тонкими длинными политенными хромосомами, плохо структурированными и переплетенными между собой (Рис. 2.1. г). Постепенная компактизация хроматина (возможно и дальнейшая политенизация) приводит к образованию первичных политенных хромосом — укороченных, рыхлых и не имеющих дисковой исчерченности (Bier, 1958). В результате соматической конъюгации гомологов мы наблюдаем гаплоидный набор хромосом - 5 крупных и I маленькая, гетерохроматиновая (имеющая С-положительное окрашивание (Вассерлауф и др., 2003)) хромосома (Рис. 2.1. д). Именно на этой стадии количество ярко окрашенных блоков хроматина максимально, что и позволяет идентифицировать хромосомы.

Дальнейшая компактизация ведет к значительному укорочению первичных политенных хромосом. Блоки, которые выявлялись на предыдущей стадии, сливаются, формируя протяженные участки ярко окрашенного хроматина. Структура хромосом становиться более рыхлой в результате неплотной коньюгации составляющих их хроматид. Однако, на этой стадии еще видна характерная морфология каждой хромосомы (Рис. 2.1. е).

Конъюгация гомологов первичных политенных хромосом может быть нарушена. В норме может наблюдаться как частичный асинапсис - характерен для одной хромосомы (Рис. 2.1. ж), так и редко встречаемый полный

l* у

's» >

vt и: «^i*'

} v

, >V*—i Д1-Ч* *

5-i4

4»v

•¿sj »

№

¿t* »St«

3' /

.3&

Рис 2 I Стадии формирования первичных политенных хромосом трофоцитов яичников Г егу1кгосерЬа\а

а. б. в - первичные ретикулярные ядра, г, д, е - стадии постепенной компактизации хроматина первичных полигенных хромосом, ж, з - первичные политенные хромосомы с нарушенной соматической конъюгацией гомологов Окраска лакчоацего-орсенном Шкала-10 мкм х 100

- блоки, проявляющиеся на первичных политенных хромосомах, ► - хромосома 6, ^ - районы аитапсисов гомологов первичных тепленных хромосом

асинапсис гомологов некоторых хромосом. Полный асинапсис гомологов был выявлен у потомства, полученного при скрещивании мух из разных популяций (популяции г. Алматы и г. Томска) и имеет большее проявление в укороченных хромосомах с рыхлой структурой (Рис. 2.1. з).

Асинапсис участка одной хромосомы, встречаемый практически во всех ядрах (Рис. 2.1. ж) - специфика этого района, а не результат раздавливания ядер в ходе приготовления препаратов. По литературным данным, варьирование методов приготовления препаратов не влияет на наличие и протяженность асинапсиса (Куличков, Беляева, 1975). Причиной асинапсиса гомологов у потомства, полученного от скрещивания особей из разных популяций, может быть разнокачественность структуры гомологов, обусловленная как наличием хромосомных перестроек (Beermann, 1962). так и накоплением мобильных элементов генома в удаленных популяциях (Riede, Ren/, 1983)

Формирование вторичных ретикулярных ядер.

Конденсация хроматина и ослабление связи между хроматидами приводит к тому, что хромосомы приобретают овальную форму с хорошо видимой перетяжкой в центромерном районе (Рис. 2.2. а) Обнаружено, что

а: * ■— б .•«—< в г —

'-ЖГ' " • * -

Д _ е» -^ж Л -

I* f*». « 4? *

.. .»к--*. г ^^ л * х»*"*'»» »

Ci/w/'^r

'--îf^

3Ï . —• И ' VJ'' ' К

Рис 2 2 Стадии формирования вторичных ретикулярных ядер трофоцигов яичников С erylhrocephala

а, б - компакшые хромосомы и начало эндомигошческого распада (энлапро-фаи). в. г -ииомепфнные хромосомы, сохраняющие свою территориальность в ядре, д - эвдомегафлныс хромосомы, рассеянные но пару; е. ж. з - стадии дгспирализании энаомегафазныч хромо-сом ( жлоанафана). и. к - вюричнме ретикулярные ялра СХраска лакгоаиеиюрсеином Шкала - 10 мкм х100

-районы перетяжек в [донромерных областях. ^-начатюэнаомшогическогораавдаодной m хромосом, ^ -ршюн хромосомы 6

распад политенных хромосом на эндометафазные происходит асинхронно: одна из хромосом начинает распадаться первой, в то время как другие 4 большие хромосомы еще сохраняют свою форму (Рис. 2.2. а, б, в). Некото-рос время эндометафазные хромосомы еще сохраняют свою территориальность в ядре и располагаются отдельными группами (Рис. 2.2. г). Но затем они рассеиваются, равномерно заполняя все пространство ядра (Рис. 2.2. д). Следующая стадия — зндоанафаза - постепенная декомпактизация эндоме-гафазных хромосом (Рис. 2.2. е, ж, з). Для ядер, находящихся на этой стадии xapaктерна дифференциальная декомпактизация хроматина. Тонкие хрома-гиновые нити соседствуют с участками еще не декомпактизованного хро-магина.

Стадия эндоанафазы заканчивается полной декомпактизацией хроматина и образованием ретикулярного ядра. В течение эндоанафазы материал маленькой гетерохроматиновой хромосомы 6 выявить практически невозможно. Он теряется в обшей массе хроматина и вторично (после стадии

первичных политенных хромосом) начинает проявляться в виде ярко окрашиваемого района только в ядрах с ретикулярной структурой (Рис.2.2. и).

Структура хромагина ретикулярных ядер может варьировать: встречаются ядра с равномерно распределенными по кариоплазме хроматиновыми нитями, образующими однородную массу в которой выделяется один более темный участок (предположительно район маленькой хромосомы 6) (Рис. 2.2. и) и ядра, в которых в однородной массе декомпактизованного хроматина встречаются участки компактного хроматина (Рис. 2.2. к).

Результаты работ по изучению неклассических форм политении у млекопитающих (Зыбына, 1986) и растений (Brady, 1973a) прямо указывают на то, что расщепление участков политенных хромосом на отдельные хромо-немы и их деконденсация связаны с периодом репликации ДНК. Ретикулярные ядра трофоцитов С. erythrocephala, имеющие гомогенно распределенный по ядру хроматин и ядра с компактными участками хроматина, вероятно, также находяться на разных стадиях эндоцикла.

Обнаружение на препарате трофоцитов с той или иной морфологией хроматина зависело от возраста мух и температуры, при которой содержалась культура. В связи с этим интересна роль температуры как экзогенного фактора в скорости развития фолликулов яичников и динамике процессов компактизации-декомпактизации хроматина трофоцитов яичников.

Влияние температуры на динамику изменения морфологии хроматина трофоцитов С. erhythrocephola.

В опыте по влиянию температуры на развитие яичников, личинок и имаго содержали при температуре 13°С и 25°С. Опыт проводили в летние месяцы (июнь, июль). Реакцией на понижение температуры было общее замедление развития, которое выражалось в запаздывании откладки яиц по сравнению с мухами, содержащимися при t=25°C и в более длительном периоде продукции яиц.

Анализировали развитие фолликулов яичников и структуру хромосом трофоцитов у самок разного возраста, содержащихся при температуре 13°С и 25° С (Табл.1).

На ранних стадиях развития (1 день) отличия в развитии фолликулов не наблюдалось. В фолликулах встречались мелкие ядра с ретикулярной структурой или ядра с тонкими, переплетенными фибриллами. При t=25° С наибольшее количество морфологических типов ядер трофоцитов наблюдалось на 2-3 день, а при t=13 С - на 4-5 день после выхода имаго из пупария. Эндометафазные и крупные ретикулярные ядра обнаруживались на 4 день (при t=25° С) и на 8-9 день (при t=13°C) (Табл. 1).

Анализ динамики морфогенеза ядер трофоцитов яичников показал, что при сохранении всех морфологических типов ядер и очерёдности прохождения всех стадий преобразования хроматина, при снижении температуры имеет место задержка развития трофоцитов, что вероятно и определяет замедление формирования яиц и наступление репродуктивной стадии.

laó.mna I. Динамика изменения морфолоши хроматина трофоцигов яичников С. erhvthrocephala при содержании имаго на 13°С (+) и 25°С (*).

Дни (после выхода имаго ю пупария)

тины 1 2 3 4 5 6 7 8 9

ядер

1 + * +

II * + + +

III * + + +

IV * + + +

V * * +

VI * * + + +

VII * * + + + +

VIII * * + +

Примечание 1 - мелкие ретикулярные ядра, II - ядра с тонкими олигопенными фибриъими. Ill - ядра с длинными первичными политенными хромосомами, IV -ядра с утолщенными первичными нолшенными хромосомами. V - ядра с комиакщымн первичными нолшенными хромосомами. VI - начало 1НД0МИ101 ического распада первичных политенных хромосом, VII - ядра с шдомегафашыми хромосомами, VIII - крупные ретик)лярные ядра

Идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов

яичников С. erythrocephala.

Для анализа пространственного) взаиморасположения первичных полигенных хромосом необходимо их идентифицировать. Идентификация первичных полигенных хромосом трофоцитов была проведена путем сопоставления с картой вторичных полигенных хромосом (хромосомы, имеющие четкий дисковый рисунок) грофоцитов С. erythrocephala. Нами была использована номенклатура хромосом, предложенная Риббергом (Ribbert, 1979).

Вследствие особенностей структуры первичных политенных хромосом - неплотной конъюгации хроматид и отсутствия дискового рисунка. анализировали только хорошо определяемые районы - это прителомерные. при-центромерные районы и отдельные районы плеч.

Хромосома 1. Маркерным является прицентромерный район в виде перетяжки. рядом с которой локализован гетерохроматиновый блок (кинето-хор по Ribbert, 1979). Характерной особенностью прителомерных районов плеч является окутствие определенных очертаний («размытость») (Рис. 3. а).

Хромосома 2 Является наиболее легко идентифицируемой хромосомой, I.K. имеет крупный терохромагиновый блок в теломерном районе длинною плеча. Гсломерный район короткою плеча слабо окрашивается. Прицен-тромерный район короткого плеча содержит крупный гетерохроматиновый блок (Рис. 3. б).

хромосома 1

хромосома2~

хромосома 3

б - - ■

хромосому 4

хромосома 5

Рис. 3. Идентификация первичных политенных хромосом трофощпов путем сопоставления с картой вторичных политенных хромосом трофоштгов С. егу(ЬгосерЬа1а ДОЬЬеЛ, 1979).

Окраска лактоацето-орсеином. Скобками обозначены соответствующие районы; г - кинетохор.

Хромосома 3. Отличается характерной морфологией: у первичных политенных хромосом (так же как и у вторичных) в прицентромерном районе имеется большой пуф, вблизи которого зачастую наблюдается асинапсис гомологов. Короткое плечо (3Ц) тоньше длинного плеча (3R) (Рис. 3. в).

Хромосома 4. Отличительной особенностью хромосомы 4 является морфология прицентромерного района: хромосома «разорвана», т.е. с обеих сторон центромерной области, на месте большого пуфа у вторичных поли-тенных хромосом, расположены слабо окрашиваемые деконденсированные районы. В центре - блок хроматина с яркоорашенным блоком. (Рис.3, г).

Хромосома 5. Маркером для идентификации хромосомы 5 является асинаптированный прителомерный район длинного плеча (Рис. 3. д).

По мере сокращения длины первичных политенных хромосом происходит слияние ярко окрашенных районов в более крупные блоки, имеющие нечеткие границы (Рис. 4. а, б). Однако положение таких блоков является специфичным для хромосом, а его изменение можно проследить в ходе компактизации хроматина. Индивидуальной для каждой хромосомы является и локализация светлых зон декомпактизованного материала. Наличие этих признаков, положение центромерного района (в виде ярко окрашенного блока), соотношение плеч — т.е. общая морфология хромосом - делают возможной идентификацию первичных политенных хромосом трофоцитов яичников у С егуШгосерка!а.

Взаиморасположение первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников С. enthrocephala.

Архитектура ядра с политенными хромосомами достаточно хорошо изучена у многих представителей Díptera как в соматических, так и в генеративной тканях (Hochstrasser et aL 1987; Прокофьева-Бельговская, 1967; Стегний, 1987, 19916). Однако у С. erythrocephala этот вопрос изучен не был.

Анализ взаиморасположения первичных политенных хромосом трофоцитов яичников С. erythrocephala не выявил объединения хромосом и их плеч в общий центромерный район - локальный хромоцентр. Хромосомы рассредоточены в пространстве ядра и, по видимому, располагаются в определенном порядке по отношению друг к другу. Тяготение отдельных хромосом к ядерной оболочке может свидетельствовать о прикреплениях. Об этом же говорит и наличие тонких тяжей хроматина, отходящих от некоторых хромосом к оболочке ядра. Однако хорошо выраженные прикрепления (веерообразное расплетение хромосомы в районе прикрепления) обнаружены не были (Рис. 4 а, б).

Таким образом, отсутствие локального хромоцентра и рассредоточен-ность хромосом трофоцитов в пространстве ядра, характерное для видов Anopheles (Стегний, 1979) и Drosophila (Стегний, Вассерлауф, 1991 а, б; Стегний и др., 1996) выявлено и у С erythrocephala.

Рис. 4. Идентификация и пространственное взаиморасположение первичных политенных хромосом трофоцитов С. erythrocephala. Окраска лактоацето-орсеи-ном. Шкала - 10 мкм х 100. 1-6 - нумерация хромосом; |~~| маркерные районы.

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) ДНК-библиотек, полученных методом микродиссекции, на первичные политенные хромосомы трофоцитов.

Перед нами стояла задача - оценить упорядоченность хроматина в ходе сложного эндомитотического цикла и в ретикулярных ядрах высокой пло-идности. Сложность заключалась в отсутствии маркеров на определенные хромосомы С erythrocephala. Эта проблема была решена путем получения хромосомо- и районо-специфичных ДНК библиотек методом микродиссек-ции хорошо определяемого теломерного участка первичной политенной хромосомы 2 и хромосом 3 и 6 (Рис. 5). Для проверки специфичности полученных ДНК-библиотек была проведена флуоресцентная in situ гибридизация ДНК-проб на первичные политенные хромосомы.

Хpoмосомо-спеuифичная ДНК-библиотека хромосомы 6 При анализе результатов FISH хромосомо-специфичнои ДНК-библиотеки хромосомы 6 на первичные полигенные хромосомы оказалось, чю ДНК-библиотека окрашивала только хромосому 6. саигы гибридизации пробы на других хромосомах не выявлены (Рис 6 а) Анализ локализации ДНК-библиотеки на материал политенной хромосомы 6 выявил особенности структуры хроматина этой хромосомы наличиедвух плотнокомпакгизованньк блоков в

Рис 6 FISH ДИК-биб шотек на первичные политенные хромосомы трофоцигов С trylhrotephala

а - HSH хромосомо-специфичнои ДНК-библиотеки хромосомы 6 ( t> красный tin-нал) б - HSII хромосомо-специфнчной ДНК-биб1иотеки хромосомы 3 ( ^ красный сигнал) и раионо-сисцифичной ДНК-библиотеки хромосомы 2 (->. зе пений синил) Хрочашн окрашен 1МР1 Шкала-Юмкч х 100

центромерном районе, которые не метятся зондом, и яркое окрашивание эухромати-новыхплеч. Отсутствие сигнала может быть объяснено плотной упаковкой ДНК при-центромерных районов, и как следствие - недоступностью гомологичной ДНК для меченых фрагментов. Эти районы ярко окрашиваются DAPI

Хромосомо-спеиифичная ДНК-библиотека хромосомы 3 Вследствие сложности идентификации какою либо определенною района, хромосома 3 была микродитегирована полностью. Чтобы исключить фоновый сигнал была проведена HSH с супрессией высокоповторен-ных последовательностей. В результате был получен сигнал только в рай-

оне наибольшей гомологии - в прицентромерном районе хромосомы 3, вероятно, наиболее декомпактизованном (Рис. 6. б).

Районо-спеиифичная ДНК-библиотека хромосомы 2

Районо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 2 была получена мик-романипуляционным сбором материала теломерного района хромосомы 2.

При проведении FISH районо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 2, на первичных политенных хромосомах трофоцитов выявилось множество сайтов гибридизации ДНК-библиотеки. Предпочтительные места гибридизации - теломерные и прицентромерные районы хромосом. В некоторых хромосомах ДНК-библиотека гибридизовалась и по плечам хромосомы (Рис. 6. в). Интенсивность сигнала в ядрах даже в пределах одного препарата отличалась вариабельностью, что может быть объяснено различной компактизацией и доступностью хроматина для меченых фрагментов ДНК.

При анализе распределения сигнала на политенных хромосомах выявились некоторые закономерности в локализации ДНК-зонда: только у хромосомы 3 метятся оба теломерных района. У остальных хромосом яркие сигналы были на одном из теломерных районов, в прицентромерном и ин-теркалярном хроматине.

Такая специфика в распределении сигнала говорит об определенной гомологии последовательностей гетерохроматина теломерных и прицен-тромерных районов.

FISH ДНК-библиотек с ядрами трофоцитов различной морфологии

Визуализаиияхромосомы бвядрахсразличнойморфологиейхроматина.

В результате FISH хромосомо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 6 на первичные ретикулярные ядра трофоцитов был выявлен один сайт гибридизации ДНК-библиотеки (Рис. 7. а, б; зеленый сигнал). Область, занимаемая хромосомой 6, значительно больше и хорошо визуализируется. Наблюдаются отдельные участки мечения, находящиеся на некотором расстоянии от общей зоны гибридизации (Рис. 7. д; зеленый сигнал). Характер мечения не изменяется при образовании первичных политенных хормосом, их компактизации и начале эндомитотического распада (Рис. 7. д, е; зеленый сигнал). Отсутствие мечения наблюдается только на стадии эндомета-фазы (Рис. 7 ж). С началом декомпактизации эндометафазных хромосом сигнал опять начинает проявляться (Рис. 7. з).

Визуализаиияхромосомы 3 вядрахсразличнойморфологиейхроматина.

В результате FISH с супрессией высокоповторенных последовательностей ДНК-библиотеки хромосомы 3 на первичные ретикулярные ядра была выявлена одна область гибридизации, размер которой варьировал (Рис. 7. а. б, в; красный сигнал). ДНК-библиотека гибридизуется либо в обширную область, вероятно окрашивая практически всю хромосому 3 (Рис. 7. а), либо виден только один ярко окрашенный район (Рис. 7. б). Хроматин первичных ретикулярных ядер, постепенно компактизуется, формируя фибриллы, образующие затем первичные политенные хромосомы. По мере компакти-зации и формирования хроматиновых тяжей, область гибридизации ДНК-

зонда сокращается. Часто визуализируется только небольшой яркий диск (Рис. 7. в: красный сигнал). В первичных полигенных хромосомах, где коньюгация хромагид максимальная, виден один ярко окрашенный блок и менее яркое окрашивание плеч хромосомы 3 (Рис. 7. г; красный сигнал). Затем происходит сокращение первичных политенных хромосом с одновременным «разрыхлением» их структуры в результате нарушения конью-гации и увеличения расстояния между хроматидами. Процесс компактиза-ции первичных политенных хромосом показан на примере хромосомы 3 (Рис. 7. г).

Ярко окрашиваемый блок в центромерном районе (ДНК-библиотека хромосомы 3). окрашивание теломерных районов (ДНК-библиотека хромосомы 2). а также яркий блок прицентромерного гетерохроматина, интенсивно окрашиваемого DAPI. служат прекрасными маркерами для идентификации хромосомы 3 равной степени компактности.

На стадии компактных хромосом ДНК-библиотека гибридизуется практически по всей хромосоме 3, за исключением одною блока (ярко окрашенною DAPI) (Рис. 7. д; красный сигнал). Дальнейшее эндомитотиче-ское сжатие хроматид приводит к тому, что зона гибридизации ДНК-зонда опять сокращается до неширокой полосы (Рис. 7. е; красный сигнал). В ждометафазных ядрах, где имеет место максимальная конденсация хрома-тид (уже отдельных эндохромосом) ДНК-зонд не гибридизуется вообще (Рис. 7. ж). И. наконец, при деспирализации эндометафазных хромосом вновь появляется сигнал в виде области еще слабоокрашенною хроматина (Рис. 7. и).

Визуализация материала из теломерного района хромосомы 2

В первичных ретикулярных ядрах наблюдается несколько сайтов гибридизации ДНК-библиотеки хромосомы 2 (Рис. 7. в; зеленый сигнал). Для первичных политенных хромосом характерно сокращение области мечения при уменьшении длины хромосом. Это показано на примере теломерных районов хромосомы 3 (Рис. 7. г; зеленый сигнал). На стадии компактных хромосом мечения ДНК-зондом не наблюдается вообще. Вновь сигнал появляется на стадии эндоанафазы, когда начинается деспирализация эндоме-тафазных хромосом - ДНК зонд из прителомерного района хромосомы 2 гибридизуется во многих местах по периферии ядра (Рис. 7. и; зеленый сигнал)

Поскольку флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) проводили на воздушно-высушенных давленых препаратах, то при анализе локализации метки необходимо учитывать расположение хроматина в одной плоскости. Вариации в окрашивании ДНК-зондом хромосомы 3 первичных ретикулярных ядер можно объяснить таким «расплющиванием» ядра, когда хромосома 3 либо располагается сверху, либо на нее налагается хроматии других хромосом и тогда заметен только наиболее ярко окрашенный блок. Различной степенью распластанности материала хромосом объясняются и вариации в размере области мечения ДНК-зондом хромосомы 6, которые можно

(V аГ ътпятз > ^ О ' Ф. '¡и : - о О £ г| о \ ? /"-> * чч

, Г

е|

* ф л % ВГ -

ж) ъ я) .....—V-- - -«-к ; ' - " Ш

Рис 7 Локалишция ДНК-бибпиотек в ядрах трофоцитов яичников С егу)Ьго-сер!ш1а

а. б, в - первичные ретикулярные ядра, г - стадии компактизации первичной ноли-тенной хромосомы 3. д. е - стадии эндопрофазы, ж - стадия эндометафазы, з, и -стадии ждоанафазы

С> - хрочосомо-сиецифичная ДНК-библиотеки хромосомы 6, ^ . хромосомо-спсцмфичная ДНК-библиотека хромосомы 3, районо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 2. ** - блок чрицентромерного гетерохроматина хромосомы 3, белая линия - область декомпактизации материала хромосомы 3 Хроматин окрашен ЦАР1 Шкала- 10 мкм х 100

наблюдать на всех стадиях морфогенеза ядер, а также наличие отдельных участков мечения «разлетевшегося» при давлении материала хромосомы 6.

Неодинаковая доступность участков ДНК для меченых зондов кажется наиболее вероятной причиной вариабельности интенсивности гибридизации ДНК-библиотек не только с первичными политенными хромосомами, но и с ядрами, имеющими различную структуру хроматина. Очевидно, в данном случае решающее значение имеет степень компактности различных

районов хромосом. В декомпактизованные структуры ДНК-зонд гибриди-зуется интенсивнее. Так при гибридизации соответствующего ДНК-зонда с хромосомой 6 мы наблюдаем обширную зону гибридизации. Очевидно, метятся эухроматиновые плечи этой хромосомы, хроматин которых настолько декомпактизован, что не выявляется при окрашивании лактоацето-орсеином. В плотноупакованные структуры, такие как центромерные районы хромосомы 6 и прицентромерный блок в хромосоме 3, ДНК-зонды не гибридизуются вообще. Изменением компактизации хроматина можно объяснить постепенное «затухание» в теломерных районах сигнала ДНК-зонда из хромосомы 2 по мере компактизации хромосомы 3, сокращение зоны гибридизации ДНК-зонда из хромосомы 3 в начале компактизации хрома-тид. А так же полное отсутствие сигналов всех ДНК-зондов в ядрах с эндо-метафазными хромосомами, хроматин которых достигает такого уровня компактности, что становиться недоступным для меченых фрагментов гомологичной ДНК при проведении FISH.

Упорядоченность хроматина в высокополиплоидном ретикулярном ядре: хромосомные территории.

Хроматин вторичных ретикулярных ядер, окрашенных лактоацето-орсеином, имеет однородную диффузную структуру с редкими, более ярко окрашенными гетерохроматиновыми участками. Это крупные ядра, степень плоидности которых, по данным Вира (Bier 1958), может достигать 4096С. Лактоацето-орсеиновое окрашивание таких ретикулярных ядер не позволяет вычленить материал отдельных хромосом из общей массы хроматина. Наличие маркеров на отдельные хромосомы значительно облегчило бы изучение упорядоченность хроматина в высокополиплоидном ретикулярном ядре и ответило бы на вопрос о сохранении хромосомных территорий при полиплоидизации и процессе конденсации / деконденсации хроматина, происходящем в эндомитотическом цикле.

Поскольку при гибридизации ДНК-библиотек из хромосом 3 и 6 на первичные политенные хромосомы было получено по одному сайту гибридизации, можно сделать вывод о хромосомо-специфичности этих зондов и о возможности использовать эти ДНК-зонды в качестве маркеров соответствующих хромосом в ядрах с ретикулярной структурой. Однако, есть вероятность, что при переходе хроматина из политенного в декомпактизованное ретикулярное состояние появятся дополнительные сайты гибридизации этих ДНК-библиотек на других хромосомах.

При проведении двухцветной FISH хромосомо-специфичных ДНК-библиотек хромосомы 3 и 6 оказалось, что не смотря на то, что FISH проводили на давленых, а не на объемных препаратах, области интенсивной гибридизации этих ДНК-зондов имели определенную локализацию в пространстве ядра (Рис. 8. а, б). Очевидно, что территории, занимаемые этими хромосомами в ядре, сохраняются при многократном возрастании уровня пло-идности и преобразовании хроматина в ретикулярную структуру.

ДНК-библиотека хромосомы 2 гибридизовалась небольшими глыбками по периферии ядра (Рис. 8, б). Для анализа состава ДНК прителомерного

Рис. 8. Территории хромосом 3 и 6 в высокополиплоидных ретикулярных ядрах тро(]юцитов яичников С. erythrocephala.

а - результат двухцветной FISH хромосомо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 6 (С>. зеленый сигнал) и хромосомо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 3 красный сигнал); б - результат двухцветной FISH хромосомо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 3 красный сигнал) и районо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 2 (зеленый сигнал). Хроматин окрашен DAPI. Шкала - 10 мкм. х 100.

района хромосомы 2, из которого была получена ДНК-библиотека, первичные полигенные хромосомы были окрашены методом дифференциального G-окрашивания. Были выявлены G-положительные блоки, приемуществен-но прицентромерной локализации. Интересующий нас прителомерный блок хромосомы 2 также имел G-гюложительное окрашивание. По литературным данным, периферийная локализация и G-положительное окрашивание характерно для факультативного гетерохроматина, состоящего из позднореп-лицирующихся, обедненных генами хроматиновых доменов (Cook, 1995; Carvalho et a!., 2001: Cremer et al., 2001).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

кулярной структуре ядра (через стадии эндомитоза) не позволяет проследить дальнейшую судьбу материала отдельных хромосом. Это становиться возможным при использовании хромосомо-специфичных ДНК-библиотек. По результатам дифференциального G-окрашивания и FISH районо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 2 с вторичными ретикулярными ядрами следует, что теломерный район хромосомы 2 представлен факультативным гетерохроматином. FISH ДНК-библиотек хромосом 3 и 6 с ядрами трофоцитов, имеющих различную морфологию хроматина, позволила визуализировать материал этих хромосом на стадиях, когда идентифицировать хромосомы невозможно. Анализ локализации ДНК-зондов хромосом 3 и 6 позволил сделать вывод о сохранении хромосомных территорий в высокополиплоидных ядрах при переходе хроматина в ретикулярное состояние.

ВЫВОДЫ

1.В результате анализа фолликулов яичников Calhphora erythrocephala обнаружено, что на определенной стадии развития яичников в фолликуле трофоциты имеют различную морфологию хроматина - от первичных ретикулярных ядер до вторичных ретикулярных ядер. При понижении температуры происходит замедление морфогенеза ядер трофоцитов.

2. Показана возможность идентифицировать первичные политенные хромосомы методом сравнения с картой вторичных политенных хромосом. Установлено, что хромосомы трофоцитов не имеют общего хромоцентра и рассредоточены в пространстве ядра.

3. Анализ распределения ДНК-библиотеки хромосом 3 и 6 при проведении FISH на первичные политенные хромосомы показал, что эти ДНК-библиотеки являются хромосомо-специфичными, т.е. обнаружено по одному сайту гибридизации этих ДНК-библиотек на соответствующие хромосомы. При гибридизации ДНК-библиотеки из теломерного района хромосомы 2 обнаружено множество сайтов гибридизации на всех хромосомах (кроме 6-ой).

4. Анализ локализации ДНК-библиотек в ядрах трофоцитов с различной морфологией хроматина выявил связь между размерами области гибридизации ДНК-библиотек и степенью компактности хроматина - с повышением компактизации хроматина происходит уменьшение зон гибридизации ДНК-библиотек. В ядрах с эндометафазными хромосомами отсутствуют сигналы всех трех ДНК-библиотек.

5. В результате гибридизации ДНК-библиотек хромосом 3 и 6 с вторичными ретикулярными ядрами обнаружено, что при переходе хроматина в ретикулярную структуру имеет место сохранение территорий этих хромосом в ядре. ДНК-библиотека теломерного района хромосомы 2 гибри-дизуется по переферии ядра, что характерно для гетерохроматиновых доменов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н Политенные хромосомы трофоцитов яичников у Calliphora erythrocephala (Díptera: Calliphoridae) // Материалы конференции, посвященной памяти В.П.Чехова. Томск. ТГУ, 1997.

2. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.Э. Политенизация хромосом трофоцитов у Calliphora erythrocephala (Díptera: Calliphoridae) // Тез. докл. на конф. «Сибирская школа молодого ученого». Томск. ТПУ. 1998.

3. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В. Идентификация, взаиморасположение и развитие первичных полигенных хромосом в ядрах трофоцитов у Calliphora erythrocephala (Díptera: Calliphoridae) // Генетика. 1999. Т. 35. №7. С. 912-918.

4. Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В., Стегний В.Н. Политенизация хромосом и их взаиморасположение в ядрах трофоцитов Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoraidae) // 2000. ВОГИС (1-5 февраля). С-Петербург.

5. Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В., Стегний В.Н. Исследование интерфазного ядра трофоцитов Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Цитология. 2002. № 9. XIV Всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ядра».

6. Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В., Унгер М.Ф., Карамышева Т. В., Мельникова Н. Н., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Организация и дифференциальная окраска хромосом эндомитотических ядер трофоцитов Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Генетика. 2003. № 9.

7. Ананьина Т.В., Ведерников А.Е., Вассерлауф И.Э., Карамышева Т. В., Рубцов Н.Б., Стегний В.Н. Изучение упорядоченности хроматина в ядрах трофоцитов в ходе эндомитотического цикла у Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) // Цитология. 2003. № 9.1 Съезд Общества клеточной биологии и Международный симпозиум по проблемам мейоза. 14-17 октября 2003. С-Петербург.

Отпечатано на участке оперативной полиграфии Редакционно-издательского отдела ТГУ Лицензия ПД № 00208 от 20 декабря 1999 г.

Заказ № /¿Г « 29 » 0<_2004 г. Тираж ЮО экз,

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ананьина, Татьяна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Трофоциты яичников насекомых: происхождение, развитие и функция.

1.1.2. Политенизация хроматина трофоцитов яичников: формирование первичных политенных хромосом.

1.1.3. Пространственная организация политенных хромосом трофоцитов.

1.1.4. Эндомитотические преобразования и формирование ретикулярной структуры хроматина в ядрах трофоцитов.

1.2. Интерфазное ядро: основные принципы ядерной архитектуры.

1.2.1. История вопроса.

1.2.2. Современные представления о структуре интерфазного ядра: компартментализация ядра, хромосомные территории, территории активных и неактивных генов, хромосомная динамика, регуляторные взаимодействия между хромосомами.

1.3. Использование метода микродиссекции для изучения структуры и локализации хромосомных районов.

1.4. С. erythrocephala (Mg) как объект цитогеиетических исследований.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3. 1. Развитие фолликулов и политенных хромосом трофоцитов яичников С. erythrocephala.

3.1.1. Развитие фолликулов яичников.

3.1.2. Морфология хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala. Формирование первичных политенных хромосом.

3.1.2. Формирование вторичных ретикулярных ядер.

3.1.3. Влияние температуры на динамику изменения морфологии хроматина трофоцитов С. erhythrocephala.

3.2. Идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов яичников

С. erythrocephala.

3.3. Взаиморасположение первичных политенных хромосом в ядрах трофоцитов яичников С. erythrocephala.

3.4. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) ДНК-библиотек, полученных методом микродиссекции, на первичные политенные хромосомы трофоцитов С. erythrocephala.

3.4.1. Хромосомо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 6.

3.4.2. Хромосомо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 3.

3.4.3. Районо-специфичная ДНК-библиотека хромосомы 2.

3.5. FISH ДНК-библиотек на ядра трофоцитов с различной морфологией хроматина.

3.6. Упорядоченность хроматина в высокополиплоидном ретикулярном ядре: хромосомные территории.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение морфологии, структуры и пространственной организации хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala"

Актуальность темы.

Развитие исследований в области структурно-функциональной организации хромосом стимулировало интерес к интерфазному ядру как системе, отражающей репликативную и транскрипционную организацию генетического аппарата. Поиск новых подходов, применение современных молекулярно-цитогенетических методов и их адаптация к конкретным объектам необходимы для решения одной из ключевых задач клеточной биологии -изучения структурно-функциональной организации интерфазного ядра.

Трофоциты яичников насекомых - прекрасная модель для изучения важнейших клеточных процессов, происходящих в интерфазном ядре -эндоредупликации, транскрипции, пространственной реорганизации интерфазного хроматина, являющейся ключевым событием в процессе видообразования (Стегний, 1993). Несомненна их огромная роль не только в обеспечении ооцита всеми необходимыми для формирования яйца продуктами, но и в создании видоспецифичной копформации цито- и нуклеоплазмы ооцита, т.е. в вопросах ооплазматической сегрегации (Айзенштадт, 1984).

Молекулярно-цитологическое изучение хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Diptera: Calliphoridae) открываег уникальные возможности для выяснения принципов организации генома высших эукариог. Формирование политенных хромосом с последующим переходом их материала от сильно компактизованного (диски первичных политенных хромосом) к декомпактизованному состоянию хроматина (ядра с ретикулярной структурой) позволяет оценить значение уровня компактизации хроматина и общей архитектоники интерфазного ядра в процессе оогенеза. Данный объект является уникальным для проведения детального анализа воздействия внутренних и внешних факторов на динамику изменений структурно-функциональной организации ядра.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы является изучение пространственной организации и структуры хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala, изменяющейся в процессе эндоредупликационных преобразований, многократного увеличения степени плоидности и возрастания уровня экспрессии генома. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить развитие фолликулов яичников и изменение морфологии хроматина трофоцитов.

2. Идентифицировать первичные политенные хромосомы трофоцитов и проанализировать их пространственное взаиморасположение.

3. Получить ДНК-библиотеки путем микродилетирования районов и хромосом для изучения пространственной организации хроматина ядер трофоцитов.

4. Проанализировать локализацию ДНК-библиотек в ядрах трофоцитов с различной морфологией хроматина.

5. С помощью ДНК-зондов оценить упорядоченность хроматина в ядрах трофоцитов с ретикулярной структурой хроматина.

Научная новизна.

Впервые показано, что по морфологии хроматина трофоцитов яичников С. erythrocephala фолликул визуально можно разделить на три зоны: в зависимости от близости к ооциту, в ядрах трофоцитов хроматин представлен различными морфологическими формами и имеет различную степень конденсации. Проведена идентификация первичных политенных хромосом трофоцитов методом сопоставления с цитологической картой вторичных политенных хромосом и оценена их пространственная организация в ядре. Впервые для изучения архитектуры ядер трофоцитов яичников С. erythrocephala примспсн метод микродиссекции участков политенных хромосом и подобрапы условия проведения флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) полученных ДНК-проб с хроматином трофоцитов. Получена информация об особенностях гибридизации ДНК-проб с хроматином, находящимся на различных стадиях эндомитотического цикла. Впервые показано, что у С. erythrocephala в ядрах трофоцитов яичников, имеющих ретикулярную структуру хроматина, материал отдельных хромосом локализуется в определенных хромосомных территориях.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Микродиссекция, DOP-ПЦР и FISH проводились на базе лаб. морфологии и функции клеточных структур (ИЦиГ СО РАН) совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т.В. Карамышевой.

Практическая ценность работы.

Практический интерес имеет применение методики микродиссекции политенных хромосом для изучения пространственной организации интерфазных ядер, модификация методики флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) для работы с хромосомами трофоцитов яичников насекомых. Работа имеет теоретическое значение в области цитогенетики.

Апробация результатов.

Результаты исследований были представлены на Научных чтениях "Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и интродукции", посвященных 100-летию профессора В.П. Чехова, Томск (1997); Конференции «Сибирская школа молодого ученого», Томск (1998); II Съезде ВОГиС, С-Петербург (2000); XIV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра», С-Петербург (2002); I Съезде Общества клеточной биологии и Международном симпозиуме по проблемам мейоза, С-Петсрбург (2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Благодарности.

Выражаю глубокую признательность и благодарность В.Н.Стегнию за руководство и помощь в проведении исследований и написании диссертации. Особая благодарность Н.Б.Рубцову и Т.В.Карамышевой за руководство, огромную помощь, максимальное содействие и обсуждение молекулярно-цитологической части раборты. Хочу искренне поблагодарить Т.Г.Зыбипу,

Б.Н.Кудрявцева, Н.А.Попову и Л.П.Кузнецову за ценные комментарии и проявленный интерес к работе, И.Э.Вассерлауф за постоянную поддержку и ценные советы при написании диссертации, А.К.Сибатаева за методическую и организационную помощь, А.Е.Ведерникова за помощь в культивировании и участие в работе по микродиссекции и флуоресцентной in situ гибридизации. Большое спасибо моим коллегам из лаборатории эволюционной цитогенстики НИИ Биологии и Биофизики за участие, моральную поддержку и постоянный интерес к проводимым исследованиям.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Ананьина, Татьяна Викторовна

ВЫВОДЫ

1. В результате анализа фолликулов яичников Calliphora erythrocephala обнаружено, что на определенной стадии развития яичников в фолликуле трофоциты имеют различную морфологию хроматина - от первичных ретикулярных ядер до вторичных ретикулярных ядер. При понижении температуры происходит замедление морфогенеза ядер трофоцитов.

4. Анализ локализации ДНК-библиотек в ядрах трофоцитов с различной морфологией хроматина выявил связь между размерами области гибридизации ДНК-библиотек и степенью компактности хроматина - с повышением компакгизации хроматина происходит уменьшение зон гибридизации ДНК-библиотек. В ядрах с эндометафазными хромосомами отсутствуют сигналы всех трех ДНК-библиотек.

5. В результате гибридизации ДНК-библиотек хромосом 3 и 6 с вторичными ретикулярными ядрами обнаружено, что при переходе хроматина в ретикулярную структуру имеет место сохранение территорий этих хромосом в ядре. ДНК-библиотека теломерного района хромосомы 2 гибридизуется по переферии ядра, что характерно для гетерохроматиновых доменов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные результаты, можно заключить, что у Calliphora erythrocephala система ооцит-трофоциты является уникальной моделью для изучения проблемы становления организации зрелого яйца. Возможность наблюдать все переходные типы хроматина трофоцитов от первичных ретикулярных ядер к первичным политенным хромсомам, все стадии эндомитоза и образование вторичных ретикулярных ядер позволяет проследить изменение морфологии хроматина, а значит и его функционального состояния. Наличие стадии первичных политенных хромосом, имеющих характерную морфологию и индивидуальный рисунок ярко окрашиваемых блоков хроматина, позволяет идентифицировать хромосомы, находящиеся на этой стадии и оценить их пространственное взаиморасположение в ядре. Переход хроматина от первичных политенных хромосом к ретикулярной структуре ядра (через стадии эндомитоза) не позволяет проследить дальнейшую судьбу материала отдельных хромосом. Это становиться возможным при использовании хромосомо-специфичных ДНК-библиотек. Хромосомо-специфичные ДНК-библиотеки хромосом 3 и 6 и районо-специфичная ДНК-библиотека теломерного района хромосомы 2 были полученны методом микродиссекции и последующей DOP-PCR микродилетированного материала. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) этих ДНК-библиотек с ядрами трофоцитов, имеющих различную морфологию хроматина, позволила визуализировать материал хромосом 3 и 6 на стадиях, когда идентифицировать хромосомы невозможно. По результатам дифференциального G-окрашивания и FISH районо-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 2 с вторичными ретикулярными ядрами следует, что теломерный район хромосомы 2 представлен факультативным гетерохроматином. Анализ локализации ДНК-зондов хромосом 3 и 6 позволил сделать вывод о сохранении хромосомных территорий в высокополиплоидных ядрах при переходе хроматина в ретикулярное состояние.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ананьина, Татьяна Викторовна, Томск

1. Айзенштадт Т.Б. Цитология оогенеза. М.: Наука, 1984.247с.

2. Ананьев Е.В., Барский В.Е. Электронно-микроскопическая карта политенных хромосом слюнных желез дрозофилы (D. melanogaster). М.: Наука. 1985. 86с.

3. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. VIII. Псевдоэндомитоз терминально дифференцированных клеток // Цитология. 1997. Т.39. №2/3. С.244-252.

4. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. I. Хромоцентрическая морфология полиплоидных ядер // Цитология. 1994. Т.36. №1. С.75-82.

5. Анисимов А.П. Полиплоидизация и рост гигантских ядер пищеводных желез в постнатальном онтогенезе аскариды // Цитология. 1976. Т. 18. №4. С.445-450.

6. Белар К. Цитологические основы наследственности. М.-Л. «Биомедгиз.». 1934.434с.

7. Беннетг М. Д. Нуклеотипическая основа пространственной упорядоченности хромосом эукориот и ее значение для эволюции генома и фенотипической изменчивости. В кн.: Эволюция генома. М.:Мир. 1986. С.234-255.

8. Богданов Е.А. Значение опытов с обыкновенной синей мясной мухой для разрешения вопроса об унаследовании приобретенных признаков. М., 1928. 68 с.

9. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М.: Наука. 1981.259с.

10. Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Видоспецифичные особенности архитектоники первично политенных хромосом трофоцитов у Drosophila orena, D.erecta, D. teissieri, D. yakuba И Генетика. 1992. T.26. N3. С. 198-201.

11. Виноградова Е.Б. Диапауза мух и ее регуляция. 1991. М.: Наука, с.255

12. Виноградова Е.Б. Мясная муха {Calliphora vicina) модельный объект экологических и физиологических исследований. JI.: Наука. 1984. 272с.

13. Гвоздев В.А. Пространственное расположение хромосом в клеточном ядре определяет активность генов // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 2. №2. С. 4-10.

14. Генералова М.В. Структура интерфазного ядра и образование хромосомных перестроек у Crepis capillaris II Генетика. 1975. Т. 11. № 7. С. 40-54.

15. Грузова М.Н. Ядро в оогенезе (структурно-функциональный аспект). В кн.: Современные проблемы оогенеза. М.: Наука, 1977. С.51-98.

16. Губенко И.С. Цитологические и генетические карты хромосом Drosophila virilis II Генетика. 1983. Т.29. №12. С.2028-2036.

17. Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. Новосибирск.: Наука. 1992. с.479.

18. Жимулев И.Ф. Хромомерная организация политенных хромосом. Новосибирск: Наука. 1994. с. 565.

19. Жимулев И.Ф., Лычев В.А. Функционирование хромосом слюнных желез личинок Harmandia laevi (Diptera: Cecidomyiidae). 1. Изменение морфологии хромосом гигантских клеток в онтогенезе // Онтогенез. 1972. Т.З. №2. С. 194-201.

20. Зыбина Е.В. Особенности полиплоидизации клеток трофобласта // Цитология. 1970. Т. 12. №9. С. 1081-1094.

21. Зыбина Е.В. Цитология трофобласта. Л.: Наука. 1986. 192с.

22. Зыбина Е.В., Зыбина Т.Г. Политения и эндомитоз в сверхгигантских клетках трофобласта серой полевки Microtus subarvalis II Цитология. 1985. Т.27. №4. С.402-409.

23. Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Шорина А.Р., Рубцов Н.Б. Клинический и молекулярно-цитогенетический анализ редкого случая мозаицизма по частичной моносомии Зр и частичной трисомии 10q у человека // Генетика. 2001. Т. 37. № З.С.1-6.

24. Кикнадзе И.И. Функциональная организация хромосом. JI.: Наука. 1972. с.210.

25. Куличков В.А., Беляева Е.С. Распределение участков асинапсиса гомологов в хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster II Докл. АН СССР. 1975. Т.221. №2. С.463-467.

26. Лейбович Б.А. Дифференциальная репликация ДНК у дрозофилы. М.: ВИНИТИ (Итоги науки и техники; сер. Молекуляр. Биология. Т.20). 1984. С. 186223.

27. Лейбович Б.А., Куренова Е.В. Данилевская О.Н. Вариабельность теломерных и ряда внутренних районов хромосом дрозофилы по интенсивности гибридизации in situ с мечеными зондами // Цитол. и Генет. 1990. Т.24. №1. С.23-28

28. Малиновский Ю.Ю., Безлепкин В.Г., Газиев А.И. ДНК-полимеразная активность и синтез ДНК в составе ядерного матрикса гепатоцитов // Молекулярная биология. 1985. Т 19. № 6. С.1626-1632.

29. Монахова М.А. Цитогенетические аспекты пространственной орга-пизации интерфазного ядра // Успехи современной биологии. 1990. Т.110. Вып.2(5). С.163-179.

30. Наумова Н.М., Оленкина О.М., Гвоздев В.А. Инактивация репортерных генов клонированными гетерохроматированными повторами Drosophila melanogaster сопровождается компактизацией хроматина // Генетика. 2003. Т.39. №5. С.682-686.

31. Онищенко Г.Е. О соответствии числа центриолей плоидности гепатоцитов в печени мыши // Цитология. 1978. Т.20. №4. С.395-399.

32. Онищенко Г.Е. Центриолярный и центросомный циклы при дифференцировке и патологии. М.: Наука. 1993. с.256.

33. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука. 1986. с. 430.

34. Прокофьева-Бельговская А.А. Строение интерфазного ядра // Структура и функции клеточного ядра. М.: Наука. 1967. С.8-16.

35. Разин С.В., Кекелидзе М.Г., Луканидин Е.М. Пространственная организация репликонов в эукариотическом ядре: прикрепление участков начала репликации к ядерному скелету // Молекулярная биология. 1986. Т. 20. Вып. 2. С. 387-394.

36. Свидченко А.И. Соматические ассоциации хромосом // Цитология и генетика. 1975. Т.9. № 5. С.464-470.

37. Семешин В.Ф. Демаков С.А., Перес Алонсо М., Жимулев И.Ф. Формирование междисков из материала ДНК Р-элемента в политенных хромосомах дрозофилы // Генетика. 1990. Т.26. №3. С.448-456.

38. Семешин В.Ф., Шлома В.В., Андреева Е.Н., Саумвебер X., Жимулев И.Ф. Иммуноэлектронно-микроскопическая локализация белков па политенныххромосомах дрозофилы с помощью имунной техники мечения золотом // Цитология. 2003. Т.45. №3. С.235-242.

39. Серов O.J1. Генный и хромосомный уровни контроля развития // Вестник ВОГиС. 2003. №24-25ю С.2-8.

40. Сиирина М.Т., Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Карагодин Д. А., Кикнадзе И.И. Молекулярно-цитогенетическая характеристика В-хромосом хирономид (Diptera, Chironomidae) // Цитология. 2003. Т.45. №6.1. C.582-589.

41. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в опто- и филогенезе малярийных комаров //Докл. АН СССР. 1979. Т. 249. № 5. С. 1231.

42. Стегний В.Н. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров. Томск: Изд-во Томского ун-та. 1991. с. 135.

43. Стегний В.Н., Вассерлауф Н.Э. Особенности взаимного расположения политенных хромосом в генеративной ткани у Drosophila melanogaster II Генетика. 1991а. Т.27. N7. С.1163-1168.

44. Стегний В.Н., Вассерлауф Н.Э. Межвидовые отличия коориентации первично политенных хромосом трофоцитов у Drosophila melanogaster,

45. D.simulans и D.mauritiana II Генетика. 19916. Т.27. N7. С.1196-1173.

46. Стегний В.Н., Шарахова М.В. Системная реорганизация архитектоники политенных хромосом в онто- и филогенезе малярийных комаров. Структурные особенности зон прикрепления хромосом к ядерной мембране // Генетика. 1991. Т. 27. №5. С. 828.

47. Стегний В.Н. Архитектоника генома, системные мутации и эволюция. II.: Изд-во Н-ого ун-та. 1993. с.110.

48. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и проблемы филогенетических отношений в подгруппе melanogaster рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. 1994. Т.ЗО. N4. С.478-483.

49. Стегний В.Н. Проблема системных мутаций // Генетика. 1996. Т.32. №1. С.10-18.

50. Стегний В.Н., Вассерлауф Н.Э., Ананьина Т.В. Взаиморасположение первичных политенных хромосом яичников у 12 видов группы "virilis" рода Drosophila (Sophophora) // Генетика. 1996. Т.32. N6. С.750-754.

51. Тамарина Н.А. Методика разведения синей мясной мухи Calliphora erhytrocephala И Зоол. Журн. 1958. Т.37. №6. С.946-948.

52. Хвостова В.В. Развитие хромосом в питающих клетках яичника мухи тахины Emestia consorbina//Докл. АН СССР. 1947 Т.57. №6. С.621.

53. Хвостова В.В. Эндомитоз в питающих клетках насекомых в связи с ролью материнского генотипа в организации яйца. В кн.: "Проблемы генетики в исследования В.В. Хвостовой". Н.: Наука. 1980. С.23-36.

54. Чадов Б.Ф. Околоцентромерный гетерохроматип и коориентация хромосом в делящихся клетках дрозофилы // Генетика. 1987. Т.23. №6. С. 1082-1087.

55. Чадов Б.Ф., Банникова С.В. Определение взаимного расположения хромосом в профазе мейоза 1 дрозофилы по ориентации негомологов // Генетика. 1993. Т.29. № 1. С 42-53.

56. Чубыкин B.J1. Структура хромоцентра в мейотических клетках дрозофилы. Спаривание негомологов // Цитология. 1993. Т.35. № 5. С.24-35.

57. Щапова А.И. Кариотип и расположение хромосом в интерфазном ядре // Цитология. 1969. Т.23. С.1157-1164.

58. Щапова А.И. О структуре кариотипа и порядке расположения хромосом в интерфазном ядре // Цитология. 1971. Т.13. № 9. С.1157-1163.

59. Яровая О.В., Горелова Т.В., Шуппе Н.Г., Разин С.В. Характер прикрепления к ядерному матриксу генов белков теплового шока не зависит от их функционального состояния // Генетика. 1985. Т.21. № 6. С.896-901.

60. Andrulis E.D., Neiman A.M., Zappula D.C., Sternglanz R. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silensing // Nature. 1998. V.394. P.592-595.

61. Avivi L., Feldman M. Arrangement of chromosomes in interphase // Hum. Genet. 1980. V.55. P.259-281.

62. Barboro P., D'Arrigo C., Mormino M., Coradeghini R., Parodi S., Patrone E., Balbi C. An intranuclear frame for chromatin compartmentalization and higher-order folding // J. Cell Biochem. 2003. V.88 (1). P.l 13-20.

63. Bates G.P., Wainwright B.J, Williamson R, Brown S.D.M. Microdissectionof and microcloning from the short arm of human chromosomes 2 // Mol Cell Biol. 1986. V.6. P.3826-3830.

64. Becker H. J. Puffs der Speicheldriisenchromosomen von Drosophila melartogaster. II. Die Auslosung der Puffbildung, ihre Spezifitat und ihre Beziehung zurFunktion der ringdriise // Chromosoma. 1962. Bd.13. S.341-384.

65. Bedo D.G. Cytological characterisation of heterohromatin in mitotic and meiotic chromosomes of the Old World screw-worm fly, Chrysomya bezziana (Diptera: Calliphoridae)//Genome. 1991. V.34. P.631-637.

66. Bedo D.G. Polytene chromosomes of the Old World screw-worm fly, Chrysomya bezziana, and its evolutionary relationships with Lucilia cuprina and Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) // Genome. 1992. V.35. P.294-303.

67. Beermann W. Riesenchromosomen. Protoplasmatologia 6/D. Wicn: Springer. 1962.

68. Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Cytogenetic analysis of the X-chromosome region 2B3-4 2B11 of Drosophila melanogaster. IV. Mutation at the SWI (singed wings) locus interfering with the late 20-OH ecdysone puff system // Chromosoma. 1982. V.86. P.251-263.

69. Bennett M.D. Towards a general model for spatial law and order in nuclcar and karyotipic architecture // Chromosomes Today. 1984. P. 190-202.

70. Bennett M.D. Genotypic control of centromere position of parental genomes in Hordeum Secale hybrid metaphases //J. Cell Sci. 1987. V8. P.291-304.

71. Bier K. Endomitose und polytanie in den Nahrzellenkerncn von Calliphora erythrocephala. II Chromosoma. 1957. V.8. P.493-522.

72. Bier К. Beziehungen zwishen Wachstumsgeschwindigkeit, endometophasischer Kontraktion und der Bildung von Riesenchromosomen in den Nahrzellen von Calliphora erythrocephala //Z. Naturforseh. 1958. Bd.l3b. S.80-93.

73. Bier K. Quantitative untersuchungen Uber die variability der Nahrzellenstructur und ihre Beinflussung dureh die Temperatur// Chromosome. 1959. V.10. S.619-653.

74. Bier K. Der Karyotyp von Calliphora erythrocephala Meigen unter besonderer beriicksichtungung der Nahrzellenkernchromosomen im debttndelten und gepaarten zustand // Chromosoma. 1960. V.l 1. P.335-364.

75. Bier K. Autoradiographische Untersuchungen uber die Leistungen des Follikelepithels und der Nahrzellen bei der Dotterbildung und Eiweissynthese im Fliegenovar// Wilhelm Roux's Arch. Entwickl. Mech. 1963. Bd.154. №6. S.552-575.

76. Bier K. Gerichteter Ribonukleinsauretransport durch das Cytoplasma // Naturwissenschaften. 1964. V.51.№17. S.418-438.

77. Bier K. Oogenese, das wachstum von ricsenzellen // Naturwissenschaften. 1967. V.54. №8. S.189-195.

78. Block W., Erzinclioglu Y.Z., Worland M.R. Cold resistance in all life stages of two blowfly species (Diptera, Calliphoridae) // Med. Vet. Entomol. 1990. V.4 (2). P.213-219.

79. Bourgeois C.A., Hubert J. Spatial relationship between the nucleolus and the nuclear envelope: structural aspects and functional significance // Inter. Rev. of Cytology. 1988. V.3. P.l-52.

80. Boveri Jh. Die Blastomerenkerne von Ascaris megalocephala und die Iheorie der Chromosomenindividualitat // Arch. Zellforsch. 1909. V.3. P.181-268.

81. Boyes J.W., Shewell G.E. Cytotaxonomy of Calliphoridae (Diptera) // Genetica. 1975. V.45.P. 435-488.

82. Boyes J.W. Somatic chromosomes of higher Diptera. V. Interspecific and intraspecific variation in the Calliphoridae // Can. J. Zool. 1961. V.39. P. 549-570.

83. Brady T. Feulgen cytophotometric determination of the DNA content of the embryo proper and suspensor cells of Phaseolus coccineus II Cell. Differ. 1973. V.2. P.65-75.

84. Brown E.H., King R.C. Studies on the events resulting in the formation of an egg chamber in Drosophila melanogaster // Growth. 1964. V.28. P.41-81.

85. Brown K.E., Guest S.S., Smale S.T. et al. Association of transcriptionally silent genes with ikaros complexes at centromeric heterochromatin // Cell. 1997. V.91. P.845-854.

86. Brown K. Nuclear structure, gene expression and development // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1999. V.9(3-4). P.203-212.

87. Brutlag D. Molecular arrangement of evolution of heterochromatic DNA // Ann. Rev. Genet. 1980. V.14. P.121-144.

88. Callow R.S. Comments on Bennett's model of somatic chromosome disposition // Heredity. 1985. V.54. P. 171-177.

89. Carvalho C., Pereira H.M.- Ferreira J., Pina C., Mendonfa D., Rosa A.C., Carmo-Fonseca M. Chromosomal G-dark Bands Determine the Spatial Organization of Centromeric geterochromatin in the Nucleus // Mol Biol Cell. 2001. V.12 (11). P.3563-3572.

90. Chiarelli В., Brogger A. Superchromosomal organization and its cytogenetic consequences in the eukariota // Genetica. (Ned.). 1978. V.49. №2-3. P. 109-126.

91. Coates D.J., Smith D. The spatial distribution of chromosomes in metaphase neuroblast cells from subspecific F1 hybrids of the grasshopper Caledia captiva II Chromosoma. 1984. V.90. P.338-348.

92. Coluzzi M., Kitzmiller J.B. Anopheles mosquitos // Handbook of Genetics / Ed. R.C. King. N.Y.; L.: Plenum Press. 1975. V.3. P.285-309.

93. Comings D.E. The rational for an ordered arrangament of chromatin in the interphase nucleus // The Amer. J. of Hum. Genet. 1968. V.20. № 5. P.440-460.

94. Cook P.R. A chromomeric model for nuclear and chromosome structure // J. of Cell Science. 1995. V.108. P.2927-2935.

95. Cremer M., Heintzmann R., Brero A., et al. Chromosome territories of small and large chromosomes are differently distributed in human lymphocyte nuclei. // Medgen. 2000. N. 12. P.95.

96. Cremer Т., Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells // Genetics. 2001. V.2. P.292-301.

97. Croft J.A., Bridger J.M., Boyle Sh., Perry P., Teague P., Bickmore W.A. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus //J. Cell Biol. 1999. V.145. №6. P. 1119-1131.

98. Csink A.K., Henikoff S. Large-scale chromosomal movements during interphase progression in Drosophila//J. Cell Biol. 1998. V.143. №1. P.13-22.

99. Davies L., Ratcliffe G.G. Development rates of some pre-adult stages in blowflies with reference to low temperatures // Med. Vet. Entomol. 1994. V.8(3). P.245-254.

100. Davring L., Sanner M. Female meiosis and embryonic mitosis in Drosophila melanogaster. I. Meiosis and fertilization // Hereditas. 1973. V.73. P.51-64.

101. De Boni U. The interphase nucleus as a dynamic structure // Int. Rev. Cytol. 1994. V.150. P.149-171.de Cuevas M., Lilly M.A., Spradling A.C. Germline cyst formation in Drosophila // Annu. Rev. Genet. 1997. V.31. P.405-428.

102. Dej K.J., Spradling A.C. The endocycle controls nurse cell polytene chromosome structure during Drosophila oogenesis // Development. 1999. V.126(2). P.293-303.

103. Evans H.J., Bigger T.R.L. Chromatid aberrations induced by gamma irradiation. II. Non random in the chromosome length in Vicia faba root-tip cells // Genetics. 1961. V.46. P.277-289.

104. Evgen'ev M.B., Polianskaya G.G. The pattern of polytene chromosome synapsis in Drosophila species and interspecific hybrids // Chromosoma. 1976. V.57. P.285-295.

105. Feldman M., Mello-Sampayo Т., Sear E.R. Somatic association in Triticum aestivum // Proc. Nat. Acad. Sci. 1966. V.56. №4. P. 1192-1199.

106. Finch R.A., Smith J.B., Bennett M.D. Hordeum and secale mitotic genomes lie apart in a hybrid // J. Cell Sci. 1981.

107. Fussell C.P., Catharine P. The position of interphase chromosomes and late replicating DNA in centromere and telomere region of Allium сера L. // Chromosoma. 1975. V.50. P.201-210.

108. Gall J.G., Cohen E.H., Polan M.L., Repetitive DNA sequences in Drosophila // Chromosoma. 1971. V.33. P.319-344.

109. Gatti M., Rizzoni M., Palitti F., Olivieri G. Studies on induced aberrations in diplochromosomes of Chinese hamster cells // Mutat Res. 1973. V.20(l). P.87-99.

110. Geitler L. Neueste Forshungen Uber den Chromosomenbau // Der ZUchter. 1935. Bd.7. S.294-304.

111. Grunstein M. Yeast heterochromatin: regulation of its assembly and inheritance by histones // Cell. 1998. V.93. P.325-328.

112. Hammond M.P., Laird C.D. Chromosome structure and DNA replication in nurse and follicle cells of Drosophila melanogaster II Chromosoma. 1985. V.91. P.267-278.

113. Heitz E. Das Heterochromatin der Moose // Jb. Wiss.Bot. 1928. V.69. P.762-818.

114. Hendzel M.J., Kruhlak M.J., MacLean N.A.B. Boisvert F.M., Lever M.A., Bazett-Jones D.P. Compartmentalization of regulatory proteins in the cell nucleus // J. Steroid Biochem. 2001. V.76. P.9-21.

115. Heslop-Harrison J.S., Bennett M.D. Prediction and anaalysis of spatial order in haploid chromosome complements // Proc. Roy Soc. Lond. (Biol.). 1983. V.218. P.211-223.

116. Heslop-Harrison J.S., Bennett M.D. Chromosome order possible implication for development//J. Embryol. Exp. Morph. 1984. V.83. P.51-73.

117. Hochstrasser M.D., Sedat J.W. Three-dimensional organization of Drosophila melanogaster interphase nuclei. II. Chromosome spatial organization and gene regulation //J. Cell Biol. 1987. V.104. P.470-483.

118. Hsu W.S., Hansen R.W. The chromosomes in the nurse-cells of Drosophila melanogaster II Cytologia. 1953. V.18. P.330-342.

119. Hsu T.S., Cooper J.E.K., Mace M.L., Brinkley B.R. Arrangement of mouse cells // Chromosoma. 1971. V.34. P.73-87.

120. Hughes-Schrader S. A new type of spermatogenesis in Isering coccids with a linear aligment of chromosomes in the sperm // J. Morphol. 1946. V.78. P.48-87.

121. Jacob J., Sirlin J.L. Cell function in the ovaiy of Drosophila. I. DNA classes in nurse cell nuclei as determined by autoradiography // Chromosoma. 1959. V.10. P.210-228.

122. Jelinek W.R., Schmid C.W., Repetitive sequences in eukaryotic DNA and thei expression. //Annu. Rev. Biochem. 1982. V.51. P.813-844.

123. Jha S., Sen S. Induction of mitosis in polytene nuclei and hormonal effect on nuclear changes during callus initiation in diploid Urgenia indica Kunth (Liliaceae) // Genetica. 1990. V.80. P.9-15.

124. Keyl H.-G., Pelling C. Differentielle DNS-Replikation in der Speicheldriisen-Chromosomen von Chironomus thummi II Chromosoma. 1963. V.14. P.347-359.

125. King R.C., Koch E.A., Cassens G.A. The effect of temperature upon the ovarian tumors of the FES mutant of Drosophila melanogaster // Growth. 1961. V.25. P.45-65.

126. King R.C. Ovarian development in Drosophila melanogaster. New York, San Francisco: Acad. Press. 1970.

127. King R.C., Riley S.F., Cassidy J.D., White P.E., Paik Y.K. Giant polytene chromosomes from the ovaries of a Drosophila melanogaster II Science. 1981. V.56. P. 577-588.

128. King R.C., Mohler D., Riley S.F., Storto P.D., Nicolazzo P.S. Complementation between alleles at the ovarian tumor locus of Drosophila melanogaster II Developm. Genet. 1986. V.7.P.1-20.

129. Kitani Y. Orientation, arrangement and association of somatic chromosomes // Japan. J. Genet. 1963. V.38. №34. P.244-256.

130. Klug W.S., Bodenstein D., King R.C. Oogenesis in suppressor2 of Hairy-wing mutant of Drosophila melanogaster. I. Phenotypic characterization and transplantation experimants//J. Exp. Zool. 1968. V.167. P.151-156.

131. Koch E.A., King R.C. Studies on the fes mutant of Drosophila melanogaster // Growth. 1964. V.28. P.325-369.

132. Koch E.A., King R.C. The origin and early differentiation of thr egg chamber of Drosophila melanogaster II J. Morphol. 1966. V.l 19. №3. P.283-303.

133. Koch E.A., Smiht P.A., King R.S. The division and differentiation of Drosophila cystocytes//J. Morphol. 1967. V.121. P.55-70.

134. Mahowald A.P., Strassheim J.M. Intercellular migration of centrioles in the germarium of Drosophila melanogaster II J. Cell Biol. 1970. V.45. №2. P.306-320.

135. Mahowald A.P., Caulton J.H., Edwards M.K. Loss of centrioles and polyploidization in follicle cells of Drosophila melanogaster II Exp. Cell Res. 1979. V.l 18. P.404-410.

136. Mal'ceva N.I., Zhimulev I.F. Extent of polyteny in the pericentric heterochromatin of polytene chromosomes of pseudonurse cells of otu (ovarian tumor) mutants of Drosophila melanogaster И Mol. Gen. Genet. 1993. Vol.19. P.237-276.

137. Mal'ceva N.I., Gyurkovics H., Zhimulev I.F. General characteristics of the polytene chromosome from ovarian pseudonurse cells of the Drosophila melanogaster otul 1 and fs(2)B mutants // Chromosome Res. 1995. V.3(3). P. 191-200.

138. Mannuelidis L. Indications of centromere movement during interphase and differentiation //Ann NY Acad. Sci. 1985. V.450. P.205-221.

139. Marshall W.F., Straight A., Marko J.F., Swedlow J., Dernburg A., Belmont A., Murray A.W., Agard D.A., Sedat J.W. Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells // Curr. Biol. 1997. V.7. P.930-939.

140. Mets C.W. Chromosome studies in the Diptera. II. The paired association of chromosomes in Diptera and its significance // J. exp. Zool. 1916. V.21. P.213-280.

141. Mulligan P.K., Rasch E.M. DNA content of nurse and follicle cell nuclei from female sterile mutants of Drosophila melanogaster II J. Histochem. Cytochem. 1981. V.29. P.886.

142. Nazimiec M., Beckingham К. 3B55: a repetitious sequence family which is transcribed and proportionately replicated in germ-line polyploidnuclei of Calliphora erythrocephala II Dev. Biol. 1986. V.l 15(2). P.398-406.

143. Nokkala S., Puro J. Cytological evidence for a chromocenter Drosophila melanogaster oocytes // Hereditas. 1976. V.83. P.265-268.

144. Painter T.S., Reindorp E.S. Endomitosis in the nurce cells of the ovary of Drosophila melanogaster II Chromosoma. 1939. V.l. P.276-283.

145. Pardue M.L., Gall J.G. Chromosomal localization of mouse sattelite DNA // Science. 1970.V.170. P.1356-1358.

146. Parise-Maltempi P.P., Avancini R.M. C-banding and FISH in chromosomes of the blow flies Chrysomya megacephala and Chrysomya putoria (Diptera, Calliphoridae) // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2001 V.96(3). P.371-377.

147. Park P. C., De Boni U. Dynamics of structure-function relationships in interphase nuclei. // Life Sciences. 1999. V64. Issue 19. P1703-1718.

148. Pinkel D., Straume Т., Gray J.W. Cytogenetic analysis using quantitative, highsensitivity, fluorescence hybridization // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. V.83(9).P.2934-2938.

149. Ponelies N., Bautz E.K., Monajembashi S., Wolfrum J., Greulich K.O. Telomeric sequences derived from laser-microdissected polytene chromosomes // Chromosoma. 1989. V.98(5). P.351-357.

150. Pushalla S.Polytene chromosomes of monogenic and amphogenic Chrysomya species (Calliphoridae, Diptera): analysis of banding patterns and in situ hybridization with Drosophila sex determining gene sequences // Chromosoma. 1994. V. 103(1) P.16-30.

151. Rabl C. Uber Zelllheilung // Morphologisches Jahrbuch. 1885. P.214-330. Ribbert D. Chromosomes and puffing in experimentally induced polytene chromosomes of Calliphora erythrocephala II Chromosoma (Berl.). 1979. V.74. P.269-298.

152. Ribbert D., Bier K. Multiple nucleoli and enhanced nucleolar activiti in the nurse cells of the insect ovary // Chromosoma. 1969. V.27. P. 178-197.

153. Riede L., Renz M. Study on the somatic pairing of polytene chromosomes // Chromosoma. 1983. V.88. P.l 16-123.

154. Rohme D., Fox H., Hermann В., Frischauf A.M., Edstrom J.E., Mains P., Silver L.M., Lehrach H., Molecular clones of the mouse t complex derived from microdissected metaphase chromosomes // Cell. 1984. V.36. P.783-788.

155. Rubtsov N., Junker K., von Eggelin F., Mishel S., Claussen U. Chromosomal origin and distribution of DNA from the homogeneously staining regions in COLO 320-HSP cells // Medgen. 1995. V.7. P.55.

156. Rubtsov N., Sablina O., Ivanova I., Zhdanova N., Graphodatsky A. Chromosome microdissection is a universal tool for studies of mammalian chromosome rearrangements// Medgen. 1998. V.10. P.149.

157. Rubtsov N., Karamysheva Т., Babochkina T. et al. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24-multi-color FISH, Multi-color banding (MCB), ZOO-FISH and in clinical diagnostics // Medgen. 2000. V.12.P.65.

158. Rudkin G.T. Nonreplicating DNA in giant chromosomes // Genetics. 1965a. V.52. N2(pt2). P.470.

159. Rudkin G.T.The structure and function of heterochromatin // Genetics today: Proc. Of XI Intern Congr. Of Genetics, The Hague. 1963. L.:Pergamon Press. 1965b. V.2. P.359-374.

160. Saitoh Y., Ikeda J.-E. Technical viewpoint. Chromosome microdissektion and microcloning//Chromosome Res. 1997. V.5. P.77-80.

161. Saumweber H. Arrangement of chromosomes in interfase cell nuclei / " Struct, and Funct. Eukariotic chromosomes " Berlin, a. 1987. P.223-234.

162. Scalenghe F., Turco E., Edstrom J-E., ct al., Microdissection and cloning of DNA V ' from a specific region of Drosophila melanogaster politene chromosomes //

163. Chromosoma. 1981. V.82. P.205-216.

164. Scheller K., Mascheck P. The genome of Calliphora analysis by DNA reassociation kinetics // Hoppe Seyler's Z. physiol. Chem. 1978. Bd.359. S.1423-1427.

165. Selleri L. Hermanson GG, Eubanks JH, Evans GA. Chromosomal in situ hybridization using yeast artifishial chromosomes. // Genet. Analyt. Technol. Appl. 1991. V.8. P.59-66.

166. Shelby R.D., Hahn K.M., Sullivan K.F. Dynamic elastic behaviour of a-sattelite DNA domains visualized in situ in living human cells // J Cell Biol 1996. V.135. P.545-557

167. Sherman M.L., McLaren A., Walker P.M.B. Mechanism of accumulation of DNA in giantcells of mouse trophoblast // Nature New Biol. 1972. V.238. P. 175-176.

168. Singer H., Green M.R. Compartmentalization of eukaryotic gene expression: causes and effects // Cell. 1997. V.91. P.291-294.

169. Spear B.B., Gall J.G. Independent control of ribosomal gene replication in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. V.70. P.1359-1363.

170. Steffensen D.M. Chromosome architecture and the interphase nucleus: Data and theory on the mechanisms of differentiation and determination // Chromosomes Today. 1977. Amsterdam: Elsever. V.6. P.247.

171. Swedlow J.R., Lamond A. Nuclear dynamics: where genes are how they got there // Genome biology. 2001. V.2. №3. P.0002.1-0002.7.

172. Tajbakhsh J., Luz H., Bornfleth H., Lampel S., Cremer C., Lichter P. Spatial distribution of GC- and AT-rich DNA sequences within human chromosome territories v // Exp. Cell Res. 2000. V.255(2) P.229-37.

173. Tanabe H., Muller S., Neusser M., von Hase J., Calcagno E., Cremer M., Solovei I., Cremer C., Cremer T. Evolutionary conservation of chromosome territory arrangements in cell nuclei from higher primates // PNAS. 2002. V.99. №7. P.4424-4429.

174. Teplis R.L., Gustafson P.E., Pellet O.L. Chromosomal distribution in interspecific in vitro diploid cells // Exp. Cell Res. 1968. V.52. P.379-391.

175. Therman E., Murashida T. Polytene chromosomes in cultured pea roots (Pisum, Fabaceae) // Plant Syst. Evol. 1984. V.148. P.25-33.

176. Throckmorton L.H. The virilis species group // The Genetic and biology of Drosophila. N.Y.: Acad. Press. 1982. P.227-296.

177. Tsukomoto Т., Hashiguchi N., Janicki S.M., Tumbar Т., Belmont A.S., Spector D.L. Visualization of gene activity in living cells // Nat. Cell Biol. 2000. V.2. P.871-878.

178. Van Driel R., Wansink d.G., van Steensel В., Grande M.A., Schul W., Jong L. Nuclear domains and the nuclear matrix // Int Rev Cytol. 1995. V.l62a. P. 151-189.

179. Visser A.E., Eils R., Jauch A., Little G., Bakker P.J.M., Cremer Т., Aten J.A. Spatial Distributions of early and late replicating chromatin in interphase chromosome territories // Exp'. Cell Research. 1998. V.243. №2. P.398-407.

180. Woodruff R.I., Telfer W.H. Polarized interzellular bridges in ovarian follicles of the cecropia moth.//J. Cell Biol. 1973. V.58. №1. P.172-188.

181. Zelesco P., Grawes J.A.M., Chromosomes segregation from cell hybrids N. Movement and position of segregant set chromosomes in early-phase interspecific cell hybrids//J. Cell Sci. 1988. V.89. P.48-56.

182. Zink D., Cremer T. Chromosome dynamics in nuclei of living cells // Current Biology. 1998. V.8. № 9. P.321-324.

183. Zink D., Cremer Т., Saffrich R., Fisher R., Trendelenburg M.F., Ansorge W., Stelzer E.H.K. Structure and dynamics of human interphase chromosome territories in vivo //Hum. Genet. 1998. V.102. P.241-251.

184. Zink D., Bornfleth H., Visser A., Cremer C., Cremer T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories // Experimental Cell Research. 1999. V.247.№ l.P.176-188.

185. Zirbel R.M., Mathieu U.R., Kutz A., Cremer Т., Lichter P. Evidence for a nuclear compartment of transcription and splicing located at chromosome domain boundaries // Chromosome. Res. 1993. V.l. P.93-106.

Информация о работе

Ананьина, Татьяна Викторовна
кандидата биологических наук
Томск, 2004
ВАК 03.00.15

Диссертация

Изучение морфологии, структуры и пространственной организации хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Изучение морфологии, структуры и пространственной организации хроматина трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы