Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика структурной организации хромосом трофоцитов яичников двукрылых насекомых надсемейства Oestoidea

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Динамика структурной организации хромосом трофоцитов яичников двукрылых насекомых надсемейства Oestoidea"

На правах рукописи

Ведерников Андрей Евгеньевич

ДИНАМИКА СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМОСОМ ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ ДВУКРЫЛЫХ НАСЕКОМЫХ НАДСЕМЕЙСТВА ОЕЗТЯОГОЕА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

- ?

- ЛЕН 2010

Томск-2010

004615699

Работа выполнена в Обособленном структурном подразделении «Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета»

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Стегний Владимир Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Ильинских Николай Николаевич

доктор биологических наук Лебедев Игорь Николаевич

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии наук Институт цитологии РАН, адрес: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

Защита состоится « Т£» декабря 2010 года в £ ** ч на заседании диссертационного совета Д 208.096.03 при ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава по адресу: 634050, г.Томск, ул. Московский тракт, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Автореферат разослан « » ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Современные исследования в области клеточной биологии всё чаще ориентируются на изучение структуры и пространственной организации интерфазного ядра, как основы функционального состояния клетки (Singer Н„ Green M., 1997; Dernburg A., Sedat J., 1998; Thomas С. et al., 2002). Благодаря развитию новейших и высокоэффективных методов клеточной и молекулярной биологии, а также приёмов 3D, 4D микроскопирования появилась реальная возможность выяснить более тонкие закономерности структурной упорядоченности интерфазного ядра (Стегний В.Н., 1979; Lowenstein M., Goddard T., and Sedat J., 2004; Ferrai С., Pombo A., 2009). Первым шагом на этом пути должно стать изучение архитектуры ядра при функционально различных его состояниях и выяснение принципов реорганизации хроматина при переходе ядра из одного функционального состояния в другое. Последние исследования показывают, что именно изменения в пространственной укладке хроматина определяют клеточную дифференцировку (Yoshioka H. et al, 2009).

В ряде работ на цитологическом уровне был описан процесс политенизации в ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala Mg (Bier К., 1958; Ribbert D., 1979; Стегний B.H. и др., 1999). Интерес к данному объекту обусловлен тем, что в процессе развития в ядрах трофоцитов яичников происходят преобразования хроматина, связанные с эндомитозом. При этом выявляются политенные хромосомы, а также ряд промежуточных стадий политенизации. На конечном этапе развития трофоцитов по прошествии нескольких эндоциклов в их ядрах формируется ретикулярная структура хроматина. Таким образом, данная клеточная система предоставляет уникальную возможность для изучения морфофункциональных особенностей укладки хромосом и использования её в качестве модели преобразования структуры интерфазного ядра.

Цель исследования: Изучить структурную реорганизацию хромосом в ядрах трофоцитов яичников в процессе политенизации трофоцитов у ряда представителей надсемейства Oestroidea (отряд Díptera): Calliphora erythrocephala (Mg.), Protophormia terranovae (R.-D.), Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilia sp.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ изменения структуры хромосом в процессе политенизации у представителей надсемейства Oestroidea (Díptera): Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilia sp.;

2. Выявить отличительные особенности структуры хромосом трофоцитов у линий Calliphora erythrocephala, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний;

3. Проанализировать, с использованием ДНК-проб, динамику хромосомных территорий в связи со сменой стадий политенизации;

4. Выявить наличие общих ДНК последовательностей в районах хромосом, характеризующихся более плотной упаковкой хроматина у представителей семейства Calliphoridae: Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae и Lucilia sp.

Положения, выносимые на защиту:

1.В трофоцитах яичников представителей надсемейства ОезНоМае в процессе политенизации происходят последовательные изменения структуры хромосом: на промежуточных стадиях формируются политенные хромосомы, затем они разобщаются на эндохромосомы, декомпактизуются и, на конечном этапе, формируется полиплоидное ядро с ретикулярной структурой хроматина.

2. Структура хромосом в трофоцитах яичников особей СаШрИога егуЛгосерШа, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний, отличается от структуры хромосом исходных линий.

3. В трофоцитах СаШрИога егуЛгосерШа в процессе политенизации происходит направленная динамика морфологии хромосомных территорий: в первичных ретикулярных ядрах хромосомы занимают отдельные протяжённые области ядра; на стадии политенных хромосом - компактизуются; во вторичных ретикулярных ядрах - занимают не перекрывающиеся обширные области ядра.

4. Районы хромосом СаШрИога егуЛгосерШа, Рго1орИогт1а 1еггапогае и ЬисШа ¿р., отличающиеся от остальной части генома более плотной упаковкой хроматина, содержат гомологичные последовательности ДНК.

Научная новизна. Впервые выявлены общие для пяти видов надсемейства Ое$1го'к1еа (СаШрИога егуЛгосер1ш1а, РгоМрИогтга ?еггапоуае, Sarcophaga ¡р., Parasarcophaga яр. и ЬисШа яр.) стадии политенизации трофоцитов, протекающие при начальных этапах оогенеза в течение первых суток жизни имаго. Смена стадий политенизации происходит в следующем порядке: первичные ретикулярные ядра, политенные хромосомы, помпоновидные хромосомы, эндохромосомы, вторичные ретикулярные ядра. Таким образом, в результате проведенных исследований установлены основные морфотипы ядер трофоцитов яичников. Впервые показаны индивидуальные видовые отличия в характере реорганизации ядерной архитектуры. Сюда относятся отличия в скорости политенизации; отличия в структуре хромосом. У С. егуЛгосерШа показана структура хромосомных территорий трофоцитов и выяснен характер её изменения в процессе политенизации и в том числе на стадии ретикулярных ядер. Новыми являются данные о наличии общих последовательностей ДНК в составе половой хромосомы С. егуЛгосерШа, половой хромосомы Р. /еггапоте и плотного блока хроматина в ядрах ЬисШа лр.; эти районы характеризуются аналогичной структурой хроматина.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные данные об особенностях структуры и реорганизации ядерного аппарата клетки на примере генеративной системы двукрылых насекомых вносят вклад в развитие представлений о функционировании интерфазного ядра. Основные положения диссертации используются при проведении занятий со студентами и магистрантами в рамках курсов «Цитогенетика» и «Практикум по молекулярной генетике» на кафедре цитологии и генетики Биологического института Томского государственного университета.

Апробация работы. Основные результаты диссертации обсуждены на всероссийских и международных конференциях: I Съезд Общества клеточной

биологии (Санкт-Петербург, 2003), III Съезд ВОГиС (Москва, 2004), XV Всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005), IV Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных (Санкт-Петербург, 2006), Международная молодёжная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007), Международная конференция «Хромосома 2009» (Новосибирск. 2009).

Исследования поддержаны грантами РФФИ - «Механизмы реорганизации хромосомного аппарата в ядрах генеративной ткани при экстремальных температурных воздействиях и инбридинге» (№ 04-04-48175.); «Механизмы структурных модификаций хромосом и гетерохроматина в онто- и филогенезе эукариот» (№ 07-04-01484.); грантами Президента РФ для ведущих научных школ - «Молекулярно-цитогенетическое исследование реорганизации архитектуры хромосом в онто- и филогенезе. Генодиагностика видов и эколого-генетический мониторинг популяций эпидемически опасных групп двукрылых насекомых» (НШ-4283.2006.4); «Молекулярно-цитогенетическое исследование реорганизации архитектуры хромосом в онто- и филогенезе. Генодиагностика видов и эколого-генетический мониторинг популяций растений и эпидемически опасных групп двукрылых насекомых» (№НШ-2027.2008.4).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в центральных рецензируемых журналах из перечня ВАК Министерства образования и науки РФ.

Личное участие автора. Основные результаты исследований, вошедшие в диссертацию, получены лично автором. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах научно-исследовательской работы, в обработке полученных результатов, иллюстративного материала и последующей подготовки результатов для печати. Микродиссекция и FISH районов хромосом 2, 3 и 6 Calliphora erythrocephala проводились совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН).

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 135 ссылок на литературные источники. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 рисунками и содержит 3 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования Объектом исследований являлись следующие представители надсемейства Oestroidae (отряд Díptera): Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilla sp. взятых из природных популяций г.Томска. Была сделана выборка С. erythrocephala из популяции г.Алма-Ата.

Данные представители отряда Díptera относятся к двум семействам: Calliphoridae (С. erythrocephala, Р. terranovae, и Lucilia sp.) и Sarcophagidae СSarcophaga sp., Parasarcophaga sp.)

Лабораторное культивирование проводили при стандартных условиях: при температуре 20-22°С с 14 часовым суточным периодом освещения (Виноградова Е.Б., 1984). Яичники самок разного возраста (с 1 по 6 день после выхода имаго из пупария) выделяли в изотоническом растворе (0,7% ИаС1) и фиксировали в метанол-уксусной смеси (3:1).

Количество проанализированных особей различных видов представлено в таблице 1. Поскольку в работе был осуществлён только качественный, а не количественный анализ статистическая обработка не применялась.

Таблица 1

Количество проанализированных препаратов для различных видов _надсемейства ОейгоШае_

Вид Возраст имаго (дней)

1 2 3 4 5 6

С. erythrocephala 120 190 250 240 280 110

P. terranovae 130 140 250 260 220 120

Sarcophaga sp. 230 70 60 40 32 24

Parasarcophaga sp. 80 70 80 27 34 25

Lucilia sp. 130 HO 290 280 140 160

Микродиссекция

Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером по специальной методике (Rubtsov N. et al„ 2000).

Диссектированный материал переносили в коллекционную каплю (20-40 нл): ЮмМ Трис HCl (pH 7,5), 10мМ NaCl, 0,1% SDS, 30% глицерин, 500 мкг/мл протеиназы К. Затем инкубировали 2 часа на водяной бане (60°С).

Амплификацию собранного материала проводили в два этапа. Вначале осуществляли 8 низкотемпературных циклов с Sequenase Version 2.0 Т7 ДНК полимеразой (United States Biochemical) в ПЦР-смеси следующего состава: 0,6 кратный Секвеназный буфер (24мМ Трис HCl, pH 7,5; 12мМ MgC12; ЗОмМ NaCl), 5мкМ DOP-праймера (6-MW) (5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3') (СибЭнзим), 200мкМ каждого из дНТФ. 0,5ед. фермента добавляли перед каждым циклом (при 25°С). Перед добавлением фермент Sequenase Version 2.0 (исходная концентрация 13 ед/мкл) разводили в буфере, содержащем ЮмМ Трис HCl, pH 7,5; 5шМ DTT; 0,5 мг/мл БСА в соотношении 1:8. ПЦР проводили по следующей схеме: 25°С - 2 мин., 36°С - 2 мин., 94°С -1 мин. 0,5ед.

Затем осуществляли 33 высокотемпературных цикла. При этом к ПЦР-продукту добавляли 50 мкл реакционной смеси, содержащей lxStoffel буфер, 200 мкМ дНТФ, 1мкМ DOP-праймера, 2,5мМ MgC12 и 5 ед. AmpliTaq, Stoffel Fragment ДНК полимеразы (Applied Biosystems). ПЦР проводили по следующей схеме: 94°С - 1 мин.; 56°С - 1,5 мин.; 72°С - 2 мин.

Получение хромосом-специфичных ДНК-зондов ДНК-библиотеки хромосом 2, 3 и 6 были получены путём микроманипуляционного сбора восьми копий соответствующих хромосом 3, 6 и прителомерного района хромосомы 2 с последующей амплификацией ДНК в

ПЦР с DOP-праймером (Rubtsov N. et al, 2000; Карамышева T.B., 2001). ДНК метили в 24 циклах ПЦР. 1 мкл DOP-библиотеки использовали для приготовления 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей - ЮшМ Трис HCl, 50шМ KCl, pH 8,3, 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и 100 мкМ дТТФ и ЮОмкМ родамин-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ, 2 мкМ DOP-праймера, 2,5мМ MgC12 и 1,5 ед. Ampli Taq ДНК полимеразы (Fermentas). ПЦР проводили по следующей схеме: 94°С - 1 мин.; 56°С - 1,5 мин.; 72°С - 2 мин.; с завершающей элонгацией цепей при 72°С - 8 мин.

Флуоресцентная in situ гибридизация

Флуоресцентную in situ гибридизацию (Fluorescence In Situ Hybridization; FISH) и детекцию меченой ДНК проводили согласно протоколам (Lichter P. et al, 1990; Rubtsov et al., 2000). Для этого препараты первоначально отмывали в трёх сменах 2xSSC при 37°С по 5 минут. Затем проводили дегидратацию в серии спиртов. После этого под покровное стекло наносили раствор зонда в гибридизационной смеси: 50% формамид, 10% сульфат декстрана, 1% Твин-20, 2xSSC, рН7,0. Денатурацию проводили при 75°С в течение 5 мин.; гибридизацию - при 37°С в течение 18 часов.

По окончании гибридизации покровные стекла смывали в 2xSSC, а препараты последовательно отмывали в трех растворах 50% формамида (ФА) в 2xSSC; один раз в 2xSSC при 42°С и три раза в O.lxSSC при 60°С в течение 5 минут. Переносили в 4xSSC, 0,1% Твин-20 и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем препараты помещали в блокирующий буфер (3% обезжиренное молоко, 4xSSC; 0,1% Твин-20) на 30 минут при 42°С. Затем на препараты раскапывали по 30 мкл раствора конъюгата. В случае детекции биотинилированных зондов использовали авидин-DCS, меченый флуоресцеинизотиоционатом (авидин-FITC; 5 мкг/мл) (производства фирмы ИМТЕК), который предварительно был растворён в блокирующем буфере в соотношении 1:500. Выявление дигоксигенин меченых зондов проводили с помощью антидигоксигинина конъюгированного с родамином (конечная концентрация: 200 мкг/мл) (Roche). После нанесения соответствующего антитела препарат накрывали покровным стеклом, помещали во влажную камеру и инкубировали 30 минут при 42°С. Не связавшийся флуорохром отмывали в 4xSSC; 0,1% Твин-20 (Зх5минут, 42°С).

Общее окрашивание хромосом проводили при помощи 4,6-diamidino-2-phenyl-indole (DAPI) с конечной концентрацией 200 нг/мл.

Суирессионная in situ гибридизация

Супрессионную in situ гибридизацию проводили, как описано у Пинкеля (Pinkel, 1986). Для этого 0,4 мкг меченой ДНК пробы смешивали с 20 мкг соответствующей Cot-2 ДНК и осаждали тремя объёмами охлаждённого 96 % спирта при 13000 об/мин в течение 20 минут. Супернатант сливали, а осадок подсушивали и ресуспендировали в 20 мкл гибридизационной смеси (50 % формамид, 10 % сульфат декстрана, 1 % Твин-20, 2xSSC, pH 7,0). Денатурацию зонда и Cot-2 ДНК проводили при 96°С три минуты, а отжиг повторяющихся последовательностей в течение 1 часа при 42°С. После этого проводили FISH по описанной методике, за исключением того, что денатурацию ДНК на препарате в

данном случае осуществляли перед нанесением ДНК-зонда при помощи обработки в 70% формамиде в 2xSSC в течение 2 минут при 70°С.

Получение Cot-2 ДНК из личинок Cattiphora erythrocephala Личинок замораживали в жидком азоте и гомогенизировали. Фильтрат обрабатывали протеиназой К (0,2 мг/мл) и РНКазой А (0,1 мг/мл). ДНК фрагментировапи ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Преобразования структуры хромосом в трофоцитах яичников представителей надсемейства Oesroidea В результате проведённых исследований было установлено, что у всех рассматриваемых представителей надсемейства Oestroidea (Diptera): С. erythrocephala, Р. terranovae, Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilia sp. в процессе развития трофоцитов яичников происходят аналогичные эндомитотические преобразования хроматина (рис. 1). Сходства были обнаружены в характере изменения пространственной организации ядер на различных стадиях политенизации и очерёдности этих стадий. Необходимо указать на большую эволюционную консервативность данных процессов.

Рис. 1 - Ядра трофоцитов С. егу11ггосерИа1а на различных стадиях политенизации Примечание - а - первичное ретикулярное ядро; б - стадия сборки политенных хромосом; в - полигенные хромосомы; г - стадия помпоновидных хромосом; д -эндометафазные хромосомы; е - вторичное ретикулярное ядро. Тёмной стрелкой обозначен район асинапсиса гомологов; светлой стрелкой обозначен пуф.

Для всех изученных видов характерно наличие пяти мета- и субметацентрических аутосом и одной точковой половой хромосомы. Одна из хромосом следующих изученных видов: С. егуЛгосерЬа1а, Р. ¡еггапоуае, Parasarcophaga зр, и ЬисШа 5р., характеризуется наличием асинапсиса

гомологов в прицентромерной области (рис. 2). По классификации принятой для С. егунИюсеркаЬ это хромосома 3. Другая хромосома этих видов содержит обширный пуф. По классификации принятой для С. егуМгосерШа это хромосома 4. Наличие пуфа, как известно, указывает на высокую экспрессионную активность этого района.

• < р»

а ' до мкм б ¡§ 10 мкм:

в

шш г

/

Аг

10мкм

Рис. 2 - Политенные хромосомы трофоцитов представителей надсемейства Ое.чПоШеа

Примечание - а -Р. геггапоуае; б - Sarcophaga ¡р.; в - Рагазагсор!га§а 5р.; г -ЬисШа эр. Тёмной стрелкой обозначен район асинапсиса гомологов; светлой стрелкой обозначен пуф.

Половая хромосома сохраняет свою целостную структуру на всём протяжении функциональной активности трофоцита. Остальные хромосомы подвергаются процессу эндометатического разобщения - в конце 6 эндоцикла каждая удлинённая хромосома разобщается на 64 пары эндометафазных хромосом (рис. 1д). Эти данные были получены в результате их подсчёта. Соответственно плоидность ядра на этой стадии политенизации составляет 128С количества ДНК. Согласно исследованиям, проведённым на Ою$орЫ1а, хроматиды в парах являются сестринскими по происхождению и удерживаются вместе за счёт наличия недореплицированных участков ДНК (Dej К., 8ргас]Пгщ А., 1999). При этом было доказано, что недорепликация затрагивает лишь эндоцикл, предшествующий разобщению (у ОгояорИИа - пятый). На более ранних стадиях хромосомы реплицируются полностью. В противном случае объединение хроматид происходило бы не в пары, а в большие по численности группы. На основе полученных результатов и литературных данных следует заключить, что первые пять эндоциклов трофоцитов С. егуЛгосерИа1а обеспечивают полную репликацию хроматина. Последующий, шестой эндоцикл характеризуется укороченной синтетической фазой. В результате оказываются недопредставленными позднореплицируемые домены хромосом. Это и приводит к парному спариванию хроматид. Последующая эндоредупликация и декомпактизация эндохромосом приводит к формированию 64-плоидного политенного ядра с ретикулярной структурой хроматина (скрытая политения). Примечательно, что сходные эндомитотические преобразования ядер трофоцитов ОгозорИИа приводят к формированию 32-плоидного политенного ядра. Следовательно, в данной

клеточной системе двукрылых насекомых крайне важное значение имеет этап расхождения синтезированных в процессе эндоциклов сестринских хроматид с дальнейшей их политенизацией. При этом число эндоциклов, предшествующих расхождению может отличаться у разных видов: у ОгсдарМа - 5, у С. егуЛгосерШа - строго 6. В более зрелых трофоцитах хроматин в ядрах приобретает ретикулярную структуру. В ходе всех описанных преобразований происходит многократное увеличение размеров ядра: от 10-20 мкм до 80-120 мкм в диаметре.

Нами были выявлены значительные отличия в скорости протекания отдельно взятых стадий и в целом формирования вторичного ретикулярного ядра. Полученные данные сравнительного анализа динамики политенизации представлены на рисунке 3.

Таким образом, у изученных представителей надсемейства Оех^сМеа смена фаз клеточного цикла, а также в целом развитие трофоцитов сопровождается сложными, но строго упорядоченными во времени процессами реорганизации ядерного аппарата. В ходе этого в диплоидных клетках происходит многократное умножение генома, приводящее к значительному увеличению размеров ядра и характеризующееся уникальной сменой стадий: изначально эндорепликация приводит к политении, а затем к формированию 64-плоидного политенного ядра.

Рис. 3 - Динамика развития трофоцитов яичников представителей надсемейства Оехтш1еа

Примечание - А - Sarcophaga и РагачагсорИсца\ Б-Р. !еггапо\>ае и ЬисШа; В - С. егугНюсер/гакл. Стадии развития: а - ядро с первичной ретикулярной структурой; б - политенные хромосомы; в - помпоновидные хромосомы; г - ядро с вторичной ретикулярной структурой.

Особенности структуры политенных хромосом линий С. егуОггосерксйа, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний

Выявлены отличия в организации политенных хромосом в трофоцитах С. егуЛгосерИа/а у особей в первом поколении, полученных в результате скрещивания особей алма-атинской и томской природных популяций. .

Часть ядер содержит хромосомы с асинапсисами гомологов (рис. 4). Встречались ядра с полностью асинаптированными хромосомами. Особенности асинапсиса в ядрах была различна и отличалась у хромосом в пределах одного ядра. На стадии помпоновидных хромосом преобладали полностью асинаптированные хромосомы. Вероятно, причинами асинапсиса гомологов хромосом являются инверсионный полиморфизм и/или отличия в составе мобильных элементов у двух изученных популяций С. егуЖгосерИа/а. Эти данные укладываются в теорию сальтоционного видообразования (Стегний В.Н, 1993), а также указывают на существование помимо видовой ещё и популяционной специфики организации ядерного аппарата.

\

'Л

/

мкм , , 10

а ................................................

Рис. 4 - Политенные хромосомы трофоцитов С. егуМгосерИаЬ линий, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний представителей томской и алма-атинской природных популяций

Примечание - стрелками обозначены асинаптированные участки хромосом.

Анализ структуры хромосомных территорий в ядрах трофоцитов яичников СаШрНога егу/ИгосерИаЬ на различных стадиях политенюации

Ранее на недавленых лактоацето-орсеиновых препаратах яичников С. егу^госерка1а был выявлен ряд закономерностей в организации политенных хромосом (Стегний В.Н. и др., 1999). Вопрос об упорядоченности хроматина на стадии эндометафазных хромосом и в ядрах с ретикулярной структурой оставался открытым. С целью обнаружения или опровержения существования такой упорядоченности были получены хромосом-специфичные ДНК-библиотеки хромосом 3, 6 и ДНК-библиотека теломерного района хромосомы

11

2, отличающегося наличием плотнокомпактизованного гетерохроматического блока, который хорошо выявляется на неокрашенных препаратах.

При проведении FISH-анализа хромосом-специфичной ДНК-библиотеки хромосомы 6 был получен чёткий сигнал в ядрах с первичной ретикулярной структурой (рис. 5а). Мечение происходило в DAPI-позитивный домен, интенсивно окрашивающийся и на лактоацето-орсеиновых препаратах (рис. 1а). Мечение хромосомы происходило почти целиком, за исключением некоторых районов интенсивно окрашенных DAPI. Структура хромосомы 6 характеризуется разрыхленными участками интеркалярных районов и плотной прицентромерной областью.

Отмечена специфическая инвариабельность структуры хромосомной территории хромосомы 6 на последующих стадиях политенизации, вплоть до формирования вторичной ретикулярной структуры ядра (рис. 5в).

При использовании метода супрессионной in situ гибридизации и ДНК-библиотеки хромосомы 2 в качестве зонда были получены следующие результаты.

В ядрах с первичной ретикулярной структурой было обнаружено несколько сайтов гибридизации ДНК-зонда, рассредоточенных в пространстве ядра. Характер мечения характеризовался диффузным распределением сигнала, что объясняется декомпактизованным состоянием хроматина (рис. 5г).

На стадии политенных хромосом были установлены следующие особенности распределения сигнала. Хромосомы содержали по одному сайту гибридизации на одной из теломер (рис. 5д). Кроме того, метка была обнаружена в облати центромеры на каждой из этих хромосом. Гибридизация зонда на хромосоме 3 происходила в теломерные районы; в интеркалярных районах сигнала не обнаружено. Это свидетельствует о наличии общих последовательностей ДНК в теломерных и прицентромерных районах. Центромеры хромосом ярко окрашиваются DAPI и характеризуются содержанием плотно структурированного хроматина.

На последующих стадиях компактизации политенных хромосом характер мечения сохраняется вплоть до начала разобщения на эндометафазные хромосомы. После этого наблюдается декомпактизация хроматина, при этом происходит перемещение меченых фрагментов к периферии ядра (рис. 5е).

Таким образом, следует сделать вывод о гомологии теломерных и прицентромерных районов хромосом, а также об их периферийном расположении в объёме интерфазного ядра.

Анализ проведенной супрессионной in situ гибридизации с использованием в качестве зонда ДНК-библиотеки хромосомы 3 позволил выявить ряд закономерностей в реорганизации структуры хромосомы 3 в процессе политенизации. В первичных ретикулярных ядрах был обнаружен один сайт интенсивной гибридизации и слабый сигнал на диффузном хроматине в той же области ядра (рис. 5а, г). На более поздних стадиях компактизации хроматина детекция зонда прослеживается по всей длине хромосомы (рис. 56).

N N <W

I

1 rit> MK\j

Рис. 5 - FISH на ядра трофоцитов С. erythrocephala на различных стадиях политенизации

Примечание - красным, зелёным и желтым цветами отмечены места гибридизации ДНК-библиотек хромосом 3, 6 и 2 соответственно. Стрелками отмечены места наиболее интенсивной гибридизации. Синим цветом отмечена тотальная окраска хромосом. Красной и желтой линиями обозначены области ядра, содержащие ДНК-зонд хромосом 3 и 2 соответственно.

Для ядер с эндометафазными хромосомами характерна дальнейшая компактизация хроматина до формирования хроматид. Метка на этой стадии не выявлена. Возможно, это обусловлено тканеспецифичной компактизацией хроматина.

На стадии начала декомпактизации хромосомного материала были обнаружены эндометафазные хромосомы, расположенные в отдельной области ядра, содержащие яркие сайты гибридизации (рис. 5е). Гибридизация ДНК-зонда хромосомы 3 происходила преимущественно в центральной части эндометафазных хромосом, на их концах была отмечена детекция зонда хромосомы 2, остальная часть хроматина окрашивалась DAPI (рис. 6). Характер мечения эндометафазных хромосом соответствует особенностям распределения метки на политенной хромосоме 3, у которой так же в прицентромерной области располагается интенсивный сайт гибридизации ДНК-зонда хромосомы 3, а теломерные участки гибридизуются с район-специфичным ДНК-зондом хромосомы 2. Это указывает на гомологию хромосомы 3 с данными

эндометафазными хромосомами и является дополнительным подтверждением того, что эндометафазные хромосомы являются результатом разобщения политенных хромосом на составляющие их гомологи, которые были синтезированы в процессе репликации эндомитотических циклов. Таким образом, было установлено, что каждая эндометафазная хромосома является одной из многочисленных копий данной хромосомы.

Более поздняя стадия декомпактизации эндометафазных хромосом характеризуется появлением области интенсивного мечения, в которой, предположительно, сосредоточена хромосома 3. В ходе дальнейшей декомпактизации эндометафазных хромосом формируется вторичная ретикулярная структура ядра. Распределение метки в таком ядре носит локальный характер, т.е. отдельная область ядра отмечена присутствием в ней ДНК-зонда хромосомы 3.

Таким образом, в процессе политенизации ядер трофоцитов хромосомная территория хромосомы 3 претерпевает запрограммированные во времени преобразования. В целом ядро представляет собой высокоупорядоченное образование, архитектура которого находится под строгим контролем стадии клеточного цикла и связана с выполняемой клеткой функцией.

т

2 мкм 2 мкм

Рис. 6 - FISH на эндохромосомы трофоцитов Calliphora erythrocephala Примечание - красным и зелёным цветами отмечены места гибридизации ДНК-библиотек хромосом 3 и 2 соответственно. Синим цветом отмечена тотальная окраска хромосом.

Межвидовая in situ гибридизация у представителей семейства Calliphoridae

Хромосомы трофоцитов изученных видов отряда Díptera характеризуются морфофункционльными преобразованиями в процессе политенизации. Исключение составляет половая хромосома. Она сохраняет свою целостную структуру на протяжении всего процесса политенизации, а также после формирования ретикулярной структуры ядра. Очевидно, это обусловлено уникальной структурой хроматина и в первую очередь содержанием особых нуклеотидных последовательностей ДНК. Подтверждением этого

предположения было бы обнаружение общих, гомологичных последовательностей ДНК в составе половых хромосом у разных видов. С этой целью была проведена межвидовая in situ гибридизация ДНК-библиотеки хромосомы 6 С. erythrocephala на хромосомы трофоцитов P. terranovae.

В результате проведения in situ гибридизации и последующего анализа препаратов обнаружен сигнал ДНК-зонда хромосомы 6 С. erythrocephala на половой хромосоме P. terranovae (рис. 7в). При этом у обоих видов были отмечены сходства в структуре хроматина, содержащего метку: для центральной части хромосомы характерно сужение и более плотная упаковка хроматина; на периферии хроматин веерообразно расплетён и имеет более рыхлую структуру. В остальных хромосомах сигнал отсутствовал.

Полученные данные свидетельствуют о наличии общих ДНК последовательностей в составе половой хромосомы С. erythrocephala и половой хромосомы P. terranovae. Вероятно, наличие гомологичных участков ДНК в половых хромосомах этих видов является одним из ключевых моментов структурных особенностей этих хромосом на протяжении развития трофоцитов. Кроме того, это указывают на эволюционную консервативность этих участков генома.

Рис. 7 - FISH ДНК-библиотеки хромосомы 6 С. erythrocephala на хромосомы трофоцитов Р. terranovae и Lucilla sp.

Примечание - а - хромосомы трофоцита С. erythrocephala; б - ядро трофоцита Lucilia sp.; в - хромосомы трофоцита Р. terranovae. Стрелочками отмечены места гибридизации хромосом-специфичной ДНК-библиотеки половой хромосомы С. erythrocephala.

С целью выявления гомологичных последовательностей у близкородственных видов была проведена in situ гибридизация ДНК-библиотеки хромосомы 6 С. erythrocephala на хромосомы трофоцитов Lucilia sp. В результате анализа полученных препаратов с использованием тотальной окраски хромосом в первичных ретикулярных ядрах был выявлен яркий блок хроматина, содержащий чёткий сигнал ДНК-зонда (рис. 76). В остальной области ядра метка отсутствовала. Это указывает на наличие общих ДНК-последовательностей у половой хромосомы С. erythrocephala и

плотного блока хроматина в ядрах Lucilla sp. Следует отметить, что у обоих видов гибридизация происходит с той частью хроматина, который имеет более плотную упаковку.

Как было показано, наряду с общей декомпактизованностью хроматина половая хромосома в ретикулярных ядрах выявляется в виде плотного ярко окрашиваемого DAPI сгустка хроматина. Исходя из этого, можно сделать предположение, что единственный плотный блок хроматина, обнаруженный в ретикулярных ядрах трофоцитов Lucilla sp, содержащий ДНК-метку библиотеки половой хромосомы С. erythrocephala, является половой хромосомой анализируемого вида.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённых исследований получены данные об изменении структуры интерфазных ядер трофоцитов яичников у 5 видов надсемейства Oestroidae: Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp. Parasarcophaga sp. и Lucilia sp. в процессе политенизации. Полученные данные расширяют общие представления о формировании интерфазных хромосом. Сравнение стадий структурных преобразований хроматина между близкими видами отряда Díptera позволило выявить ряд общих, эволюционно консервативных особенностей этого процесса: 1) отсутствие общего хромоцентра и разобщённость политенных хромосом в пространстве ядра, 2) их ориентированность друг относительно друга, 3) сохранение структуры половой хромосомы на всём протяжении политенизации у изученных видов. Также выявлена короткая S-фаза шестого эндоцикла политенизации, приводящая к появлению недореплицированных районов сестринских хроматид и их парному связыванию на стадии эндомитоза. В тоже время репликация в ходе предыдущих пяти эндоциклов является полной. Известно, что у Drosophila лишь 4 первых эндоцикла обеспечивают полную репликацию хромосом, тогда как S-фаза пятого эндоцикла укорочена (Dej К., Spradling А., 1999). В целом процесс политенизации протекает аналогично у всех изученных нами представителей надсемейства Oestroidae. На первых этапах в первичных ретикулярных ядрах формируются хромосомы, затем они компактизуются, а в дальнейшем разобщаются на эндохромосомы. Последние постепенно декомпактизуются, что в итоге приводит к формированию ретикулярной структуры ядра.

Хромосомные территории в ходе описываемых процессов политенизации претерпевают значительные структурные изменения, однако их структура вполне закономерна и предопределена. Таким образом, хромосомные территории данной клеточной системы можно классифицировать как строго определённым образом ориентированные друг относительно друга, не перекрывающиеся функциональные области ядра, содержащие индивидуальные хромосомы. При этом некодирующие участки ДНК располагаются по периферии ядра, а кодирующие преимущественно ближе к центру.

Выявлены уникальные, видоспецифичные особенности политенизации в трофоцитах изучаемых видов. Прежде всего, сюда относится скорость данного процесса. Наиболее быстрые изменения в реорганизации хроматина происходят в трофоцитах Sarcophaga и Parasarcophaga. При этом с повышением скорости эндоциклов у видов усиливается вариабельность морфотипов ядер трофоцитов в пределах одного фолликула.

Межвидовая in situ гибридизация позволила выявить наличие гомологичных ДНК-последовательностей в районах половых хромосом Calliphora и Protophormia, а так же в плотноструктурированном блоке хроматина в ретикулярных ядрах трофоцитов Lucilia, что указывает на эволюционную консервативность и, возможно, высокую значимость этих участков генома. У различных видов районы хромосом, содержащие гомологичные последовательности ДНК, имеют общий характер упаковки хроматина, так же отличающий эти районы от остальных участков генома.

ВЫВОДЫ

1. Структура хромосом трофоцитов видов надсемейства Oestroidae -Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilia sp. имеет общую организацию: соматическая конъюгация гомологов, отсутствие локального хромоцентра, рассредоточенность хромосом в пространстве ядра. Одна из хромосом видов: С. erythrocephala, P. terranovae, Parasarcophaga sp. и Lucilia sp., характеризуется наличием асинапсиса гомологов в прицентромерной области. Другая хромосома этих видов содержит обширный пуф. Структура политенных хромосом трофоцитов особей Calliphora erythrocephala, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний, характеризуется нарушением конъюгации гомологов.

2. Политенизация в ядрах трофоцитов у всех изученных видов происходит аналогичным образом и характеризуется сменой стадий в следующем порядке: образование первичных ретикулярных ядер, политенные хромосомы, помпоновидные хромосомы, разобщение на эндометафазные хромосомы, стадия вторичных ретикулярных ядер. Скорость протекания процесса политенизации различна у представителей надсемейства Oestroidae: у Sarcophaga sp. и Parasarcophaga sp.- за 0,5 суток; у Protophormia terranovae и Lucilia sp.- за 4 суток; у Calliphora erythrocephala- за 6 суток. Половая хромосома сохраняет свою целостную структуру на всём протяжении дифференцировки трофоцита; остальные хромосомы подвергаются процессу эндометатического разобщения. У Sarcophaga sp. и Lucilia sp., также как у Calliphora erythrocephala, разобщение политенных хромосом на хроматиды происходит асинхронно.

3. Политенизация в трофоцитах Calliphora erythrocephala сопровождается направленной динамикой структуры хромосомных территорий. Первые пять эндоциклов обеспечивают полную репликацию хроматина и формирование классических политенных хромосом. Последующий, шестой эндоцикл характеризуется укороченной синтетической

фазой, в конце которого каждая удлинённая хромосома разобщается на 64 пары эндометафазных хромосом. Дальнейшие процессы дифференцировки трофоцитов приводят к формированию 64-плоидного политенного ядра с упорядоченной структурой и наличием хромосомных территорий.

4. Распределение сигналов ДНК-зондов хромосом 2 и 3 на эндохромосомах Calliphora erythrocephala соответствует распределению на политенных хромосомах, что подтверждает происхождение эндохромосом из политенных хромосом путем расхождения хроматид и дальнейшей их компактизации.

5. В составе половой хромосомы С. erythrocephala, половой хромосомы Р. terranovae и плотного блока хроматина в ядрах Lucilla sp. содержатся общие, отсутствующие в других участках генома, последовательности ДНК; хроматин этих районов имеет аналогичную структуру: для центральной части характерно сужение и более плотная упаковка хроматина; на периферии хроматин веерообразно расплетён и имеет более рыхлую структуру.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Изучение пространственной организации хроматина в ядрах трофоцитов в ходе эндомитотического цикла у мух Calliphora erythrocephala / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // Цитология. - 2003. - Т.45, №9. -С.848.

2. Хромосомные территории в высокополиплоидных ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Díptera: Calliphoridae) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // III Съезд ВОГиС «Генетика в XXI веке : современное состояние и перспективы развития». Москва, 6-12 июня 2004г. -М., 2004. - Т.2. - С.277.

3. Эндоредупликация хроматина в ядрах питающих клеток яичников у представителей сем. Calliphoridae (Díptera) - Calliphora, Protophormia, Lucilla и Sarcophagidae (Díptera) / А. E. Ведерников [и др.] // Вестн. Том. гос. ун-та. Бюллетень оперативной научной информации. - 2004. - №30. - С.50-57.

4. Визуализация хромосомных территорий в интерфазных ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala Mg. (Díptera: Callihoridae) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // Генетика. - 2005. - Т.41, №10. -С.1350-1357.

5. Особенности гибридизации ДНК-зондов с ДНК политенных хромосом трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Callihoridae: Díptera) (CISS-гибридизация) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // Цитология. - 2005. - Т.47, №9. - С.790-791.

6. Ведерников А. Е. Сравнительный анализ морфологии политенных хромосом трофоцитов яичников видов Calliphora erythrocephala (Mg) (С. vicina (R. - D.)), Protophormia terranovae (R. - D.), Lucilla sp. и Parasarcophaga sp. (Díptera) / А. E. Ведерников, Т. В. Ананьина, В. Н. Стегний // IV Междунар. конф. по кариосистематике беспозвоночных животных. Санкт - Петербург, 2830 августа 2006г. - СПб., 2006. - С.12.

7. Сравнительный анализ локализации хромосомы 6 в ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala и Protophormia terranovae (Díptera:

Calliphoridac) / А. А. Коханенко, Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // Междунар. молодёжная науч. - метод, конф. «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 9-12 мая 2007г. - Томск, 2007. - С.102-103.

8. Развитие фолликулов яичников Protophormia terranovae (Diptera: Calliphoridae) / Ходжанов А.Э., Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // Междунар. молодёжная науч. - метод, конф. «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск, 9-12 мая 2007г. - Томск, 2007. - С. 180.

9. Коханенко А. А. Процесс репликации хроматина на различных стадиях клеточного цикла в полиплоидных ядрах на примере трофоцитов Calliphora erythrocephala / А. А. Коханенко, А. Е. Ведерников, Т. В. Ананьина // Материалы XLV1I междунар. науч. студ. конф. «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск, 11-15 апреля 2009г. - Новосибирск, 2009. - С. 170.

10. Коханенко А. А. Сопоставление морфологических преобразований хроматина с активностью синтеза ДНК на разных стадиях оогенеза в трофоцитах Calliphora erythrocephala / А. А. Коханенко, Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников // Материалы LVIII научной студенческой конференции Биол. ин-та. Томск, 27-30 апреля 2009г. - Томск, 2009. - С.46-47.

11. Анализ гомологии половых хромосом представителей семейства Calliphoridae / А- Е. Ведерников [и др.] // Материалы междунар. конф. «Хромосома 2009». Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009г. - Новосибирск, 2009. - С.124-125.

12. Развитие овариол и структур цитоскелета трофоцитов Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников [и др.] // Цитология. - 2010. - Т.52, №2. - С. 110-116.

Тираж 110. Заказ № 1033. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ведерников, Андрей Евгеньевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Модели интерфазного ядра.

1.2 Современные представления о структуре интерфазного ядра.

1.2.1 Роль ядерной оболочки в морфофункциональной организации хромосом.

1.2.2 Кинетика хромосом.

1.2.3 Внутриядерная компартментализация.

1.3 Организация интерфазных ядер в клетках генеративной и соматической систем Díptera.

1.3.1 Особенности оогенеза Díptera.

1.3.1.1 Эндоредупликация в трофоцитах яичников у Díptera.

1.3.2 Пространственная организация политенных хромосом малярийных комаров рода Anopheles в ядрах соматических тканей и генеративной системы клеток.

1.3.3 Структура и взаиморасположение политенных хромосом у представителей рода Drosophila.

1.3.4 Идентификация, структура и взаиморасположение политенных хромосом Calliphora erythrocephala.

1.4 Системная реорганизация генома при видообразовании.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГлаваЗ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Сравнительный анализ структурной реорганизации хромосом в трофоцитах яичников у представителей надсемейства Oestroidae.

3.1.1 Политенизация в ядрах трофоцитов Calliphora erythrocephala.

3.1.2 Политенизация в ядрах трофоцитов Protophormia terranovae.

3.1.3 Политенизация в ядрах трофоцитов Sarcophaga sp.

3.1.4 Политенизация в ядрах трофоцитов Parasarcophaga sp.

3.1.5 Политенизация в ядрах трофоцитов Lucilia sp.

3.2 Структура политенных хромосом трофоцитов Calliphora erythrocephala при межпопуляционных скрещиваниях.

3.3 Структура хромосомных территорий в ядрах трофоцитов Calliphora erythrocephala на различных стадиях политенизации.

3.3.1 Анализ структуры хромосомной территории хромосомы 6.

3.3.2 Анализ структуры хромосомной территории хромосомы 3.

3.3.3 FISH ДНК-библиотеки теломерного участка хромосомы 2.

3.4 Межвидовая in situ гибридизация у представителей семейства Calliphoridae.

3.4.1 FISH ДНК-библиотеки половой хромосомы Calliphora erythrocephala с хромосомами трофоцитов Protophormia terranovae.

3.4.2 FISH ДНК-библиотеки половой хромосомы Calliphora erythrocephala с хромосомами трофоцитов Lucilia sp.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика структурной организации хромосом трофоцитов яичников двукрылых насекомых надсемейства Oestoidea"

Актуальность темы

Современные исследования в области клеточной биологии всё чаще ориентируются на изучение структуры и пространственной организации интерфазного ядра, как основы функционального состояния клетки (Singer and Green, 1997; Dernburg and Sedat, 1998; Thomas et al., 2002). Благодаря развитию новейших и высокоэффективных методов клеточной и молекулярной биологии, а также приёмов 3D, 4D микроскопирования появилась реальная возможность выяснить более тонкие закономерности структурной упорядоченности интерфазного ядра (Стегний, 1979; Lowenstein, Goddard and Sedat, 2004; Ferrai and Pombo, 2009). Первым шагом на этом пути должно стать изучение архитектуры ядра при функционально различных его состояниях и выяснение принципов реорганизации хроматина при переходе ядра из одного функционального состояния в другое. Последние исследования показывают, что именно изменения в пространственной укладке хроматина определяют клеточную дифференцировку (Yoshioka, 2009).

В ряде работ на цитологическом уровне было описано протекание политенизации в ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Mg) (Bier, 1958; Ribbert, 1979; Стегний и др., 1999). Интерес к данному объекту обусловлен тем, что в процессе развития в ядрах трофоцитов яичников происходят преобразования хроматина, связанные с эндомитозом. При этом выявляются политенные хромосомы, а также ряд промежуточных стадий политенизации. На конечном этапе развития трофоцитов по прошествии нескольких эндоциклов в их ядрах формируется ретикулярная структура хроматина. Таким образом, данная клеточная система предоставляет уникальную возможность для изучения морфофункциональных особенностей укладки хромосом и использования её в качестве модели преобразования структуры интерфазного ядра.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучить структурную реорганизацию хромосом в ядрах трофоцитов яичников в процессе политенизации трофоцитов у ряда представителей надсемейства Oestroidea (отряд Díptera): Calliphora erythrocephala (Mg.), Protophormia terranovae (R.-D.), Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilia sp. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ изменения структуры хромосом в процессе политенизации у представителей надсемейства Oestroidea {Díptera): Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilia sp.]

2. Выявить отличительные особенности структуры хромосом трофоцитов у линий Calliphora erythrocephala, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний;

3. Проанализировать, с использованием ДНК-проб, динамику хромосомных территорий в связи со сменой стадий политенизации;

4. Выявить наличие общих ДНК последовательностей в районах хромосом, характеризующихся более плотной упаковкой хроматина у представителей

Положения, выносимые на защиту

1. В трофоцитах яичников представителей надсемейства Oestroidae в процессе политенизации происходят последовательные изменения структуры хромосом.

2. Структура хромосом в трофоцитах яичников особей Calliphora erythrocephala, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний, отличается от структуры хромосом исходных линий.

3. В трофоцитах СаШркога егу^госерка1а в процессе политенизации происходит направленная динамика морфологии хромосомных территорий.

4. Районы хромосом СаШркога егу№госерка1а, Рго^ркогт1а 1еггапоуае и ЬисШа яр., отличающиеся от остальной части генома более плотной упаковкой хроматина, содержат гомологичные последовательности ДНК.

Научная новизна

Впервые выявлены общие для пяти видов надсемейства Ое^гш'б/ея {СаШркога егу1кгосерка1а, Рго1оркогтга 1еггапоуае, Sarcopkaga яр., Parasarcopkaga яр. и ЬисШа Бр.) стадии политенизации трофоцитов, протекающие при начальных этапах оогенеза в течение первых суток жизни имаго. Смена стадий политенизации происходит в следующем порядке: первичные ретикулярные ядра, политенные хромосомы, помпоновидные хромосомы, эндохромосомы, вторичные ретикулярные ядра. Таким образом, в результате проведенных исследований установлены основные морфотипы ядер трофоцитов яичников. Впервые показаны индивидуальные видовые отличия в характере реорганизации ядерной архитектуры. Сюда относятся отличия в скорости политенизации; отличия в структуре хромосом. У С. егу1кгосерка1а показана структура хромосомных территорий трофоцитов и выяснен характер её изменения в процессе политенизации и в том числе на стадии ретикулярных ядер. Новыми являются данные о наличии общих последовательностей ДНК в составе половой хромосомы С. егу1кгосерка1а, половой хромосомы Р. terranovae и плотного блока хроматина в ядрах ЬисШа зр.; эти районы характеризуются аналогичной структурой хроматина.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные об особенностях структуры и реорганизации ядерного аппарата клетки на примере генеративной системы двукрылых насекомых вносят вклад в развитие представлений о функционировании интерфазного ядра. Основные положения диссертации используются при проведении занятий со студентами и магистрантами в рамках курсов «Цитогенетика» и «Практикум по молекулярной генетике» на кафедре цитологии и генетики Биологического института Томского государственного университета.

Апробация работы

Основные результаты диссертации обсуждены на всероссийских и международных конференциях:

- I Съезд Общества клеточной биологии и Международный симпозиум по проблемам мейоза, С-Петербург, 14-17 октября 2003;

- III Съезд ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 6-12 июня 2004;

- XV Всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург, 18-20 октября 2005;

- IV Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных, Санкт-Петербург, 28-30 августа 2006;

- Международная молодёжная научно-методическая конференция «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, 9-12 мая 2007.

- Международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009.

Исследования поддержаны грантами РФФИ - «Механизмы реорганизации хромосомного аппарата в ядрах генеративной ткани при экстремальных температурных воздействиях и инбридинге» (№ 04-0448175.); «Механизмы структурных модификаций хромосом и гетерохроматина в онто- и филогенезе эукариот» (№ 07-04-01484.); грантами

Президента РФ для ведущих научных школ — «Молекулярно-цитогенетическое исследование реорганизации архитектуры хромосом в онто- и филогенезе. Генодиагностика видов и эколого-генетический мониторинг популяций эпидемически опасных групп двукрылых насекомых» (НШ-4283.2006.4); «Молекулярно-цитогенетическое исследование реорганизации архитектуры хромосом в онто- и филогенезе. Генодиагностика видов и эколого-генетический мониторинг популяций растений и эпидемически опасных групп двукрылых насекомых» (№НШ-2027.2008.4).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в центральных рецензируемых журналах из перечня ВАК Министерства образования и науки РФ.

Вклад автора

Основные результаты исследований, вошедшие в диссертацию, получены лично автором. Автор принимал непосредственное участие на всех этапах научно-исследовательской работы, в обработке полученных результатов, иллюстративного материала и последующей подготовки результатов для печати. Микродиссекция и FISH районов хромосом 2, 3 и 6 Calliphora erythrocephala проводились совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карамышевой (ЩиГ СО РАН).

Структура и объём диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, полученных результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 135 ссылки на литературные источники. Диссертация изложена на 103 страницах

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Ведерников, Андрей Евгеньевич

выводы

1. Структура хромосом трофоцитов видов надсемейства Oestroidae — Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp., Parasarcophaga sp. и Lucilla sp. имеет общую организацию: соматическая конъюгация гомологов, отсутствие локального хромоцентра, рассредоточенность хромосом в пространстве ядра. Одна из хромосом видов: С. erythrocephala, P. terranovae, Parasarcophaga sp. и Lucilla sp., характеризуется наличием асинапсиса гомологов в прицентромерной области. Другая хромосома этих видов содержит обширный пуф. Структура политенных хромосом трофоцитов особей Calliphora erythrocephala, полученных в результате межпопуляционных скрещиваний, характеризуется нарушением конъюгации гомологов.

2. Политенизация в ядрах трофоцитов у всех изученных видов происходит аналогичным образом и характеризуется сменой стадий в следующем порядке: образование первичных ретикулярных ядер, политенные хромосомы, помпоновидные хромосомы, разобщение на эндометафазные хромосомы, стадия вторичных ретикулярных ядер. Скорость протекания процесса политенизации различна у представителей надсемейства Oestroidae: у Sarcophaga sp. и Parasarcophaga sp.- за 0,5 суток; у Protophormia terranovae и Lucilla sp.- за 4 суток; у Calliphora erythrocephala- за 6 суток. Половая хромосома сохраняет свою целостную структуру на всём протяжении дифференцировки трофоцита; остальные хромосомы подвергаются процессу эндометатического разобщения. У Sarcophaga sp. и Lucilla sp., также как у Calliphora erythrocephala, разобщение политенных хромосом на хроматиды происходит асинхронно.

3. Политенизация в трофоцитах Calliphora erythrocephala сопровождается направленной динамикой структуры хромосомных территорий. Первые пять эндоциклов обеспечивают полную репликацию хроматина и формирование классических политенных хромосом. Последующий, шестой эндоцикл характеризуется укороченной синтетической фазой, в конце которого каждая удлинённая хромосома разобщается на 64 пары эндометафазных хромосом. Дальнейшие процессы дифференцировки трофоцитов приводят к формированию 64-плоидного политенного ядра с упорядоченной структурой и наличием хромосомных территорий.

4. Распределение сигналов ДНК-зондов хромосом 2 и 3 на эндохромосомах СаШркога егу^госерка1а соответствует распределению на политенных хромосомах, что подтверждает происхождение эндохромосом из политенных хромосом путем расхождения хроматид и дальнейшей их компактизации.

5. В составе половой хромосомы С. егуЖгосерка1а, половой хромосомы Р. 1еггапоше и плотного блока хроматина в ядрах ЬисШа $р. содержатся общие, отсутствующие в других участках генома, последовательности ДНК; хроматин этих районов имеет аналогичную структуру: для центральной части характерно сужение и более плотная упаковка хроматина; на периферии хроматин веерообразно расплетён и имеет более рыхлую структуру.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённых исследований получены данные об изменении структуры интерфазных ядер трофоцитов яичников у 5 видов надсемейства Oestroidae'. Calliphora erythrocephala, Protophormia terranovae, Sarcophaga sp. Parasarcophaga sp. и Lucilia sp. в процессе политенизации. Полученные данные расширяют общие представления о формировании интерфазных хромосом. Сравнение стадий структурных преобразований хроматина между близкими видами отряда Díptera позволило выявить ряд общих, эволюционно консервативных особенностей этого процесса: 1) отсутствие общего хромоцентра и разобщённость политенных хромосом в пространстве ядра, 2) их ориентированность друг относительно друга, 3) сохранение структуры половой хромосомы на всём протяжении политенизации у изученных видов. Также выявлена короткая S-фаза шестого эндоцикла политенизации, приводящая к появлению недореплицированных районов сестринских хроматид и их парному связыванию на стадии эндомитоза. В тоже время репликация в ходе предыдущих пяти эндоциклов является полной. Известно, что у Drosophila лишь 4 первых эндоцикла обеспечивают полную репликацию хромосом, тогда как S-фаза пятого эндоцикла укорочена (Dej, Spradling, 1999). В целом процесс политенизации протекает аналогично у всех изученных нами представителей надсемейства Oestroidae. На первых этапах в первичных ретикулярных ядрах формируются хромосомы, затем они компактизуются, а в дальнейшем разобщаются на эндохромосомы. Последние постепенно декомпактизуются, что в итоге приводит к формированию ретикулярной структуры ядра.

Хромосомные территории в ходе описываемых процессов политенизации претерпевают значительные структурные изменения, однако их структура вполне закономерна и предопределена. Таким образом, хромосомные территории данной клеточной системы можно классифицировать как строго определённым образом ориентированные друг относительно друга, не перекрывающиеся функциональные области ядра, содержащие индивидуальные хромосомы. При этом некодирующие участки ДНК располагаются по периферии ядра, а кодирующие преимущественно ближе к центру.

Выявлены уникальные, видоспецифичные особенности политенизации в трофоцитах изучаемых видов. Прежде всего, сюда относится скорость данного процесса. Наиболее быстрые изменения в реорганизации хроматина происходят в трофоцитах Sarcophaga и Parasarcophaga. При этом с повышением скорости эндоциклов у видов усиливается вариабельность морфотипов ядер- трофоцитов в пределах одного фолликула.

Межвидовая in situ гибридизация позволила выявить наличие гомологичных ДНК-последовательностей в районах половых хромосом Calliphora и Protophormia, а так же в плотноструктурированном блоке хроматина в ретикулярных ядрах трофоцитов Lucilia, что указывает на эволюционную консервативность и, возможно, высокую значимость этих участков генома. У различных видов районы хромосом, содержащие гомологичные последовательности ДНК, имеют общий характер упаковки хроматина, так же отличающий эти районы от остальных участков генома.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ведерников, Андрей Евгеньевич, Томск

1. Айзенштадт Т.Б. Цитология оогенеза. М., 1984. — 247 с.

2. Ананьев Е.В., Барский В.Е. Электронно-микроскопическая карта политенных хромосом слюнных желез дрозофилы (D. melanogaster). -М., 1985.-86 с.

3. Беннетт М. Д. Нуклеотипическая основа пространственной упорядоченности хромосом эукориот и ее значение для эволюции генома и фенотипической изменчивости // Эволюция генома. М.5 1986. — С. 234-255.

4. Бродский В .Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. М., 1981. - 259с.

5. Вассерлауф И.Э. Динамика ориентации хромосом в ядрах трофоцитов яичников у близкородственных видов подгруппы D. melanogaster и группы D. virilis II Вестник ТГУ. 2008. - № 313. - С.205-214.

6. Вассерлауф И.Э. Организация и дифференциальная окраска хромосом эндомитотических ядер трофоцитов Calliphora erythrocephala (Díptera: Calliphoridae) / Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В., Унгер М.Ф. и др. // Генетика. 2003. -Т.39, №9. - С. 1004-1012.

7. Вассерлауф И.Э., Стегний В.Н. Видоспецифичные особенности архитектоники первично политенных хромосом трофоцитов у Drosophila orena, D.erecta, D. teissieri, D. yakuba // Генетика. 1992. — T.26, №3. - С. 198-201.

8. Вассерлауф И.Э. Влияние инбридинга и низкой температуры на характер синапсиса хромосом в ядрах трофоцитов яичников в линиях Drosophila melanogaster/ Вассерлауф И.Э., Шелковникова Т.А., Митренина Е.Ю. и др. // Генетика. 2008. Т.44, № 8. С. 1066-1074.

9. Виноградова Е.Б. Мясная муха (Calliphora vicina) модельный объект экологических и физиологических исследований. — Л., 1984. - 272с.

10. Гвоздев В.А. Пространственное расположение хромосом в клеточномядре определяет активность генов // Соросовский образовательный журнал. 2001. — Т.2, №2. — С. 4-10.

11. Генералова М.В. Структура интерфазного ядра и образование хромосомных перестроек у Crepis capillaris // Генетика. 1975. - Т. 11, №7. - С. 40-54.

12. Жимулёв И.Ф. Молекулярная и генетическая организация гетерохроматина в хромосомах дрозофилы // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т.6, №2. - С.76-82.

13. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика : учеб. пособие. — 2-е изд., испр. и доп. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2003. - 479с.

14. Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура. -Новосибирск., 1992.-479с.

15. Зыбина Е.В. Цитология трофобласта. JL, 1986. — 192с.

16. Карамышева Т.В. Клинический и молекулярно-цитогенетический анализ редкого случая мозаицизма по частичной моносомии Зр и частичной трисомии 10q у человека / Карамышева Т.В., Матвеева В.Г., Шорина А.Р. и др. // Генетика. 2001. - Т.37, №3. - С.811-816.

17. Керкис Ю.Я. Причины неполной конъюгации хромосом у гибридов Drosophila melanogaster и Drosophila simulans // Изв. АН СССР. Сер. биол., 1937. №2. - с.459.

18. Монахова М.А. Цитогенетические аспекты пространственной организации интерфазного ядра // Успехи современной биологии. 1990. -Т. 110, вып.2(5). - С.163-179.

19. Наумова Н.М. Инактивация репортерных генов клонированнымигетерохроматированными повторами Drosophila melanogaster сопровождается компактизацией хроматина / Наумова Н.М., Оленкина О.М., Гвоздев В.А. // Генетика. 2003. Т.39, №5. С.682-686.

20. Прокофьева-Бельговская A.A. Гетерохроматические районы хромосом. -М., 1986.-430с.

21. Рубцов Н.Б. Микроклонирование и характеристика ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster / Рубцов Н.Б., Алексеенко A.A., Беляева Е.С. и др. // Генетика. 1999. - Т.35, №1. - С.55-61.

22. Стегний В.Н. Архитектоника генома, системные мутации и эволюция. Н.: Изд-во Н-ого ун-та, 1993. - 110с.

23. Стегний В.Н. Проблема системных мутаций // Генетика. 1996. - Т.32, №1. - С.10-18.

24. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе малярийных комаров // Докл. АН СССР. 1979. - Т.249, №5.-С. 1231.

25. Стегний В.Н. Системная реорганизация архитектоники политенных хромосом в онто- и филогенезе малярийных комаров. 1 .Различия структуры ядер соматических и генеративных тканей // Генетика. -1987а.-Т23, №5. — С.821.

26. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и проблемы филогенетических отношений в подгруппе melanogaster рода Drosophila {Sophophorà) II Генетика. — 1994. Т.ЗО, №4. - С.478-483.

27. Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э. Межвидовые отличия коориентации первично политенных хромосом трофоцитов у Drosophila melanogaster, D.simulans и D.mauritiana II Генетика. 1991. - T.27, №7. - С.1196-1173.

28. Стегний В.H. Взаиморасположение первичных политенных хромосом яичников у 12 видов группы "virilis" рода Drosophila (.Sophophorà) / Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В. // Генетика. — 1996. — Т.32, №6. С.750-754.

29. Стегний В.Н. Идентификация, взаиморасположение и развитие первично политенных хромосом в ядрах трофоцитов у Calliphora erythrocephala / Стегний В.Н., Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.В. // Генетика. 1999. - Т.35, №7. - С.912-918.

30. Стегний В.Н., Шарахова М.В. Системная реорганизация архитектоники политенных хромосом в онто- и филогенезе малярийных комаров. Структурные особенности зон прикрепления хромосом к ядерной мембране // Генетика. 1991. - Т.27, №5. - С. 828.

31. Фролова СЛ. Структура ядер в слюнных железах некоторых видов Drosophila. Сравнительная кариология Drosophila II Биологический журнал 1936.-Т.5, №2.-С.271.

32. Хвостова В.В. Эндомитоз в питающих клетках насекомых в связи с ролью материнского генотипа в организации яйца // Проблемы генетики в исследованиях В. В. Хвостовой. Новосибирск, - 1980. - С. 23-36.

33. Чадов Б.Ф., Банникова C.B. Определение взаимного расположения хромосом в профазе мейоза 1 дрозофилы по ориентации негомологов // Генетика. 1993. - Т.29, №1. - С.42-53.

34. Щапова А.И. О структуре кариотипа и порядке расположения хромосом в интерфазном ядре // Цитология. 1971. - Т.13, №9. — С.1157-1163.

35. Amano Т. Chromosomal dynamics at the shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription / Amano Т., Sagai Т., Tanabe H. at. al. // Developmental Cell. 2008. - vol.16. - P.47-57.

36. Angus D., Raisbeck J. A transmissible factor involved in hybrid sterility in Drosophila melanogaster 11 Genetiea. 1979. - vol.50. - P.81-87.

37. Bates G. Microdissection of and microcloning from the short arm of human chromosomes 2 / Bates G., Wainwright В., Williamson at. al. // Mol. Cell. Biol. 1986. - vol.6. - P.3826-3830.

38. Bennett M. Genotypic control of centromere position of parental genomes in Hordeum Secale hybrid metaphases // J. Cell Sei. 1987. - vol.8. - P.291-304.

39. Bier K. Beziehungen zwishen Wachstumsgeschwindigkeit, endometophasischer Kontraktion und der Bildung von Riesenchromosomen in den Nährzellen von Calliphora erythroeephala II Z. Naturforsch. 1958. Bd. 13b.-P. 80-93.

40. Bier K. Der Karyotyp von Calliphora erythroeephala Meigen unter besonderer berücksichtungung der Nährzellenkernchromosomen im debündelten und gepaarten zustand II Chromosoma. — 1960. vol.ll. -P.335—364.

41. Boveri Th. Die Blastomerenkerne von Ascaris megaloeephala und die Theorie der Chromosomenindividualität II Archiv fur Zellforschung. 1909. - vol.3. -P.181-268.

42. Boyes J. Somatic chromosomes of higher Diptera. V. Interspecific and intraspecific variation in the Calliphoridae II Can. J. Zool. 1961. - vol.39. -P.549-570. .

43. Boyes J., Shewell G. Cytotaxonomy of Calliphoridae {Diptera) II Genetiea.- 1975. vol.45. -P.435-488.

44. Broers J. Dynamics of the nuclear lamina as monitored by GFP-tagged Atype lamins / Broers J., Machiels B., van Eys G. at. al. // J. Cell. Sci. -1999. -№112. P.3463-3475.

45. Brown K. Nuclear structure, gene expression and development // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1999. - vol.9. - P.203-212.

46. Brutlag D. Molecular arrangement of evolution of heterochromatic DNA // Ann. Rev. Genet. 1980. - vol.14. - P. 121-144.

47. Callow R. Comments on Bennett's model of somatic chromosome disposition // Heredity. 1985. - vol.54. - P.171-177.

48. Carvalho C. Chromosomal G-dark bands determine the spatial organization of centromeric geterochromatin in the nucleus / Carvalho C., Pereira H., Ferreira J. at. al. // Mol. Biol. Cell. 2001. - vol.12. - P.3563 -3572.

49. Chiarelli B., Brogger A. Superchromosomal organization and its cytogenetic consequences in the eukariota // Genetica. (Ned.). 1978. - vol.49, №2-3. P.109-126.

50. Coates D.s Smith D. The spatial distribution of chromosomes in metaphase neuroblast cells from subspecific F1 hybrids of the grasshopper Caledia captiva II Chromosoma. 1984. - vol.90. - P.338-348.

51. Comings D. The rational for an ordered arrangament of chromatin in the interphase nucleus // The Amer. J. of Hum. Genet. 1968. - vol.20, №5. -P.440-460.

52. Cremer M. Chromosome territories of small and large chromosomes are differently distributed in human lymphocyte nuclei / Cremer M., Heintzmann R., Brero A. // Medgen. 2000. - №12. - P.95.

53. Cremer T., Cremer C. Chromosome territories, nuclear architecture andgene regulation in mammalian cells // Genetics. 2001. - vol.2. - P.292-301

54. CsinkA., HenikoffS. Large-scale chromosomal movements during interphase progression in Drosophila II J. Cell Biol. 1998. - vol.143, №1. -P.13-22.

55. Dej K., Spradling A. The endocycle controls nurse cell polytene chromosome structure during Drosophila oogenesis // Development. 1999. -vol.126. -P.293-303.

56. Dernburg A., Sedat J. Mapping three-dimensional chromosome architecture in situ II Methods Cell Biol. 1998. - №53. - P. 187 -233

57. Dernburg A. Perturbation of nuclear architecture by long -distance chromosome interactions / Dernburg A., Broman K., Fung J. at. al. // Cell. 1996. - vol.85, №5. - P.745 -759.

58. Ferrai C., Pombo A. 3D chromatin regulation of sonic hedgehog in the limb buds // Developmental Cell. 2009. - vol.16. - P.9-11.

59. Finch R. Hordeum and Secale mitotic genomes lie apart in a hybrid / Finch R., Smith J., Bennett M.// J. Cell Sci. 1981.-vol.52.-P. 391-403.

60. Foisner R., Gerace L. Integral membrane proteins of the nuclear envelope interact with lamins and chromosomes, and binding is modulated by mitotic phosphorylation// Cell. 1993. -№73. - P. 1267-1279.

61. Fong L. Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice / Fong L., Ng J., Meta M. at. al. // PNAS. 2004.-№52.-P.18111-18116.

62. Fussell C., Catharine P. The position of interphase chromosomes and late replicating DNA in centromere and telomere region of Allium cepa L. // Chromosoma. 1975. - vol.50. -P.201-210.

63. Gerace L., Burke B. Functional organization of the nuclear envelope // Annu. Rev. Cell. Biol. 1988. - №4. - P.335-374.

64. Goode B. Functional cooperation between the microtubule and actin cytoskeletons / Goode B., Drubin D., Barnes G. // Curr. Opin. Cell Biol. — 2000. №12. — P.63 -71.

65. Gruenbaum Y. The nuclear lamina comes of age / Gruenbaum Y., Margalit A., Goldman R. at. al. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - №6. - P.21 -31.

66. Henning W. Heterochromatin // Chromosoma. 1999. - vol.108. - P.1-9.

67. Heslop-Harrison J.S., Bennett M.D. Chromosome order possible implication for development // J. Embryol. Exp. Morph. - 1984. - vol.83. -P.51-73.

68. Hochstrasser M., Sedat J. Three-dimensional organization of Drosophila melanogaster interphase nuclei. II. Chromosome spatial organization and gene regulation // J. Cell Biol. 1987. - vol.104. - P.470-483.

69. Holaska J. The nuclear envelope, lamins and nuclear assembly / Holaska J., Wilson K., Mansharamani M. // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. - №14. -P.357-364.

70. Holmer L., Worman H. Inner nuclear membrane proteins: functions and targeting // Cell. Mol. Life Sci. 2001. - №58. - P. 1741 -1747.

71. Hsu T. Arrangement of mouse cells / Hsu T., Cooper J., Mace M. at. al. // Chromosoma. 1971. - vol.34. -P.73-87.

72. Jacque J., Stevenson M. The inner-nuclear-envelope protein emerin regulates HIV-1 infectivity // Nature. 2006. - vol.441. - P.581-582.

73. King R. Ovarian development in Drosophila melanogaster. — N. Y.: Acad. Press, 1970.-270p.

74. Koch E., King R. The origin and early differentiation of thr egg chamber of Drosophila melanogaster II J. Morphol. 1966. - vol.119, №3. - P.283-303.

75. Lammerding J., Hsiao J., Schulze P. Abnormal nuclear shape and impaired mechanotransduction in emerin-deficient cells / Lammerding J., Hsiao J., Schulze P. at. al. // J. Cell Biol. 2005. - №170. - P.781-791.

76. Liu J. Essential roles for Caenorhabditis elegans lamin gene in nuclear organization, cell cycle progression and spatial organization of nuclear pore complexes / Liu J., Ben-Shahar T., Riemer D. at. al. // Mol. Biol. Cell. -2000. -№11.- P.3937-3947.

77. Machiels B. An alternative splicing product of the lamin A/C gene lacks exon 10 / Machiels B., Zorenc A., Endert J. at. al. // J. Biol. Chem. 1996. - №271. - P.9249-9253.

78. Malone C. UNC-84 localizes to the nuclear envelope and is required for nuclear migration and anchoring during C. elegans development / Malone C., Fixsen W., Horvitz H. at. al. // Development. 1999. - №126.1. P.3171-3181.

79. Malone C. The C. elegans hook protein, ZYG-12: mediates the essential attachment between the centrosome and nucleus / Malone C., Misner L., le Bot N. at. al. // Cell 2003. -№115.- P.825-836.

80. Maniotis A. Demonstration of mechanical connections between integrins, cytoskeletal filaments and nucleoplasm that stabilize nuclear structure / Maniotis A., Chen C., Ingber D. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. -№94. — P.849-854.

81. Mannuelidis L. Indications of centromere movement during interphase and differentiation // Ann NY Acad. Sci. 1985. - vol.450. - P.205-221.

82. Manuelidis L., Borden J. Reproducible compartmentalization of individual chromosome domains in human CNS cells revealed by in situ hybridization and three-dimensional reconstruction // Chromosoma. 1988. -№.96. -P.397-410.

83. Marshall W. Order and disorder in the nucleus // Curr. Biol. 2002. - №12. -P.185-192.

84. Marshall W. Specific interactions of chromatin with the nuclear envelope, positional determination within the nucleus in Drosophila melanogaster / Marshall W., Dernburg A., Harmon B. at. al. // Mol. Biol. Cell. 1996. -№.7. — P.825-842.

85. Marshall W. Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells / Marshall W., Straight A., Marko J. at. al. // Curr. Biol. 1997. - vol.7. - P.930-939.

86. Matarazzo M. Chromosome territory reorganization in a human disease with altered DNA methylation / Matarazzo M., Boyle S., D'Esposito M. at. al. // PNAS. -2007. vol.104, №42. - P. 16546-16551.

87. Mateos-Langerak J. • Spatially confined folding of chromatin in the interphase nucleus / Mateos-Langerak J., Bohn M., de Leeuw W. at. al. // PNAS. 2009. - vol.106, №10. - P.3812-3817.

88. Mazurkiewicz M, Kubrakiewicz J. Intercellular cytoplasm transport duringoogenesis of the moth midge, Tinearia alternata Say (Diptera: Psychodidae) // Folia Biol (Krakow). 2001. - vol.49. - P.205-213.

89. Meabura K., Misteli T. Cell biology: Chromosome territories // Nature. — 2007. vol.445. - P.379-381.

90. Mislow J. Myne-1, a spectrin repeat transmembrane protein of the myocyte inner nuclear membrane, interacts with lamin Al C / Mislow J., Kim M., Davis D. at. al.//J. Cell. Sei.-2002.-№115.-P.61-70.

91. Murray A., Davies H. Three-dimensional reconstruction of the chromatin bodies in the nuclei of mature erythrocytes from the newt Triturus cristatus: the number of nuclear envelope-attachment sites // J. Cell. Sei. 1979. -№35. -P.59 -66.

92. Padmakumar V. Karakesisoglou I. Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton / Padmakumar V., Abraham S., Braune S. at. al. // Exp. Cell Res. 2004. -№295. -P.330 -339.

93. Painter T., Reindorp E. Endomitosis in the nurce cells of the ovary of Drosophila melanogaster II Chromosoma. 1939. - vol.1. - P.276-283.

94. Pardue M., Gall J. Chromosomal localization of mouse sattelite DNA // Science. 1970. - vol.170. -P.1356-1358.

95. Park P., De Boni U. Dynamics of structure-function relationships in interphase nuclei //Life Sciences. 1999. - vol. 64, №19. -P1703-1718.

96. Pinkel D. Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization / Pinkel D., Straume T., Gray J. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA.- 1986. vol.83. - P.2934-2938.

97. Ponelies N. Telomeric sequences derived from laser-microdissected polytene chromosomes / Ponelies N., Bautz E.K., Monajembashi S. at. al. // Chromosoma. 1989.-vol.98.-P.351-357.

98. Rabl C. Über Zellteilung // Morphologisches Jahrbuch. 1885. - №10. -P.214-330.

99. Razin S. Chromatin domains and territories: flexibly rigid / Razin S., Petrov

100. A., Hair A. at. al. // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 2004. - №14. -P.79-88.

101. Razin S. Chromatin domains and territories: flexibly rigid / Razin S., Petrov A., Hair A. at. al. // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 2004. - №14. -P.79-88.

102. Ribbert D. Chromosomes and puffing in experimentally induced polytene chromosomes of Calliphora erythrocephala II Chromosoma (Berl.). 1979. - vol.74.-P.269-298.

103. Robertson F. Studies in quantitative inheritance X. Genetic variation of ovary size in Drosophila I I J. Genetics. 1957. - №55. - P.410-427.

104. Rohme D. Molecular clones of the mouse t complex derived from microdissected metaphase chromosomes / Rohme D., Fox H., Hermann B. at. al. // Cell. 1984. - vol.36. - P.783-788.

105. Rubtsov N. Chromosomal origin and distribution of DNA from the homogeneously staining regions in COLO 320-HSP cells / Rubtsov N., Junker K., von Eggelin F. at. al. // Medgen. 1995. - vol.7. - P.55.

106. Rubtsov N. Chromosome microdissection is a universal tool for studies of mammalian chromosome rearrangements / Rubtsov N., Sablina O., Ivanova I. at. al. //Medgen. 1998. - vol.10. -P.149.

107. Saitoh Y., Ikeda J. Technical viewpoint. Chromosome microdissektion and microcloning // Chromosome Res. 1997. - vol.5. - P.77-80.

108. Scalenghe F. Microdissection and cloning of DNA from a specific region of

109. Drosophila melanogaster politene chromosomes / Scalenghe F., Turco E., Edstrom J-E. // Chromosoma. 1981. - vol.82. - P.205-216.

110. Shelby R. Dynamic elastic behaviour of a-sattelite DNA domains visualized in situ in living human cells / Shelby R., Hahn K., Sullivan K. // J Cell Biol 1996. - vol.135. -P.545-557.

111. Singer H., Green M.R. Compartmentalization of eukaryotic gene expression: causes and effects // Cell. — 1997. vol.91. — P.291-294.

112. Sokolova M. A redescription of the morphology of mosquito (Diptera: Culicidae) ovarioles during vitellogenesis // Bull. Soc. Vector Ecol. 1994. -№19. -P.53-68.

113. Spradling A. Developmental genetics of oogenesis. In The Development of Drosophila melanogaster / Под ред. Bate M, Martinez-Arias A. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993. - 70p.

114. Starr D., Han M. ANChors away: an actin based mechanism of nuclear positioning // J. Cell. Sci. 2003. - №116. - P.211-216.

115. Starr D., Han M. Role of ANC-1 in tethering nuclei to the actin cytoskeleton // Science. 2002. - №298. - P.406-409.

116. Starr D. unc-83 encodes a novel component of the nuclear envelope and is essential for proper nuclear migration / Starr D., Hermann G., Malone C. at. al. // Development. 2001. - № 128. - P.5039-5050.

117. Swedlow J., Lamond A. Nuclear dynamics: where genes are how they got there // Genome biology. -2001. vol.2, №3. -P.0002.1-0002.7.

118. Szklarzewicz Т., Bilinski S. Structure of ovaries in ensign scale insects, the most primitive representatives of Coccomorpha {Insecta, Hemiptera) // Journal of Morphology. 1995. - vol.224. - P.23-29.

119. Thomas C. Engineering gene expression and protein synthesis by modulation of nuclear shape / Thomas C., Collier J., Sfeir C. at. al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -№99. - P. 1972-1977.

120. Wagenaar E. B. End-to-end chromosome attachments in mitotic interphase and their possible significance to meiotic chromosome pairing //

121. Chromosoma. 1969. - №26. - P.410-426.

122. Ye Q., Worman H. Interaction between an integral protein of the nuclear envelope inner membrane and human chromodomain proteins homologous to Drosophila HP1 // J. Biol. Chem. 1996. -№271. - P. 14653-14656.

123. Yoshioka H. Dynamic nuclear organization of constitutive heterochromatin during fetal male germ cell development in mice / Yoshioka H., McCarrey J., Yamazaki Y. // Biology of Reproduction. 2009. - №4. - P.804-812.

124. Zhang Q, Nesprins: a novel family of spectrin- repeat-containing proteins that localize to the nuclear membrane in multiple tissues / Zhang Q., Skepper J., Yang F. at. al. // J. Cell. Sci. 2001. - №114. - P.4485-4498.

125. Zhen Y. NUANCE, a giant protein connecting the nucleus and actin cytoskeleton / Zhen Y., Libotte T., Munck M. at. al. // J. Cell. Sci. 2002. - №115. - P.3207-3222.

126. Zink D., Cremer T. Chromosome dynamics in nuclei of living cells // Current Biology. 1998. - vol.8, №9. - P.321-324.

127. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

128. Изучение пространственной организации хроматина в ядрах трофоцитов в ходе эндомитотического цикла у мух Calliphora erythrocephala / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников и др. // Цитология. 2003. - Т.45, №9. -С.848.

129. Визуализация хромосомных территорий в интерфазных ядрах трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala Mg. (Díptera: Callihoridae) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников и др. // Генетика. 2005. - Т.41, №10. -С.1350-1357.

130. Особенности гибридизации ДНК-зондов с ДНК политенных хромосом трофоцитов яичников Calliphora erythrocephala (Callihoridae: Díptera) (CISS-гибридизация) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников и др. // Цитология. 2005. - Т.47, №9. - С.790-791.

131. Анализ гомологии половых хромосом представителей семейства Calliphoridae / А. Е. Ведерников и др. // Материалы междунар. конф. «Хромосома 2009». Новосибирск, 31 августа-6 сентября 2009г. -Новосибирск, 2009. С.124-125.

132. Развитие овариол и структур цитоскелета трофоцитов Calliphora erythrocephala Mg. (Díptera: Calliphoridae) / Т. В. Ананьина, А. Е. Ведерников и др. // Цитология. 2010. - Т.52, №2. - С. 110-116.