Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ, СТРУКТУРЫ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ CALLIPHORA ERYTHROCEPHALA (DIPTERA: CALLIPHORIDAE)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ, СТРУКТУРЫ И ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ CALLIPHORA ERYTHROCEPHALA (DIPTERA: CALLIPHORIDAE)"

Л-ЗЗЧ96

На правах рукопм

зпиуи

Ананьина Татьяна Викторовна

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ, СТРУКТУРЫ и ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМАТИНА ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ CALLIPHORA ERYTHROCEPHALA (DIPTERA; CALL1PHORIDAE)

03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2004

Работа выполнена в НИИ Биологин к Биофизики при Томском государственном унмверсите

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Стегаий Владимир Николаевич Официальные омноненты:

доктор биологических »пук, профессор Назаренко Сері ей Андреевич доктор биологических наук, профессор Высоцкая Людмила Васильевна

Ведущая организация: Институт цитолоітш РАН (Санкт-ІІеіербург)

Защита состоится 2004 года в часов на тсданин

диссертационного совета Д 212.267.10 ири Томском государственном университете (634050, г. Томск, нр. Ленина, 36).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной бнЯмы гике Гомскши 1ч>сударствснного университета.

Автореферат разослан чЗ 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Гшківпцкая И.Ф.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность -темы.

Развитие исследований в области струетурно-фуншиональной организации хромосом стимулировало интерес к интерфазному ядру как системе, отражающей решшкштшную и транскрипционную организацию генетического аппарата. Поиск новых подходов, применение современных .чолекулярно-цнтогенетических методов и их адаптация к конкретным объектам необходимы для решения одной из ключевых задач клеточной биологии • изучения структурно-функциональной организации интерфазного ядра.

Трофоциты яичников насекомых - прекрасная модель для изучения важнейших клеточных процессов, происходящих в •интерфазном ядре -•)ндоредушикации, транскрипции, а также пространственной реорганизации шперфазного хроматина, являющейся ключевым событием в процессе ыидообратования (Стегний, 1993). Трофоциты не только обеспечивают ооцит всеми необходимыми для формирования яйца продуктами, но и участвуют в создании иидосцецифич ной конформации иито- и ну кл со плазмы ооцита (Лйзенштштг, 1984).

Молекулярно-иитологическое изучение хроматина трофоцитов яичников Сч111р1:ога егуШгосеркЫа (Оф1ега: СаШрЬопёае) открывает уникальные возможности для выяснения принципов организации генома высших эукаршгг. Формирование нолитенных хромосом с переходом хроматина от сильно компакт ню ванного (блоки первичных нолитенных хромосом) к деком паютао-ванному состоянию (ядра с ретикулярной структурой), позволяет оценить значение уровня компактизаиии хроматина и обшей архитектуры шперфазного ядра в процессе оогенеза

Пел» и задачи исследования.

Целью данной работы является изучение пространственной организации и морфологии хроматина трофоцитов яичников С. егу/кгосерШа. Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:

1, Изучить развитие фолликулов яичников и изменение морфологии хроматина трофоцитов; 2. идентифицировать первичные полигенные хромосомы трофоцитов и оценить их пространственное взаиморасположение; 3. микро-дплетированием районов и хромосом получить ДНК-библиотеки для изучения пространственной организации хроматина ядер трофоцитов; 4, проанализировать локализацию ДНК-библиотек в ядрах трофошггов с различной .морфологией хроматина; 5. оценить упорядоченность хроматина в ретикулярных ядрах трофоцитов.

Научная ноамзна.

Впервые показано, что на определенной стадии развития яичника С. ег)1^1госерЬа1а ||юлликул визуально (по морфологии хроматина трофоцитов) можно разделить на три зоны: в зависимости от близости к ооциту, в ядрах трофошгтоа хроматин представлен различными морфологическими формами и имеет различную степень конденсации. Проведена идентификация первичных нолитенных хромосом трофоцитов методом сопоставления с шггологн-ческой картой вторичных на их про стран ст-

венная организация в ялре. Впервые лля изучения архитектуры мер ipciw-цитов яичников С. erythroeephala применен метол микродиссекции участков нолигенных хромосом. Полічена информация об особенностях іибрилишши ДНК-проб с хроматином, находящимся на различных стадиях эндомитотиче-ского цикла. Впервые показано, что у С. erythroeephala в ядрах трофонитов яичников, имеющих ретикулярную структуру хроматина, материал отдельных хромосом локализуется и определенных хромосомных территориях.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Микроднссск-ция. DO Р-Н ЦР и FISH проводились на базе лаб. морфологии и функции меточных структур (ИЦиГ СО РАН) совместно с д.б.н. Н. Б. Рубцовым и к.б.н. Т. В. Карами шс вой.

Практическая ценность работы.

Практический интерес имеет применение методики микродиссекции нолигенных хромосом лля шученпя пространственной организации интерфазных ядер. РаСкиа имеет теоретическое значение » области цитогенетики.

ЛпроОацня результатна.

Результаты исследования были представлены на Научных чтениях "Проблемы эволюционной цитогенетики, селекции и иитродукции", посвященных 100-летию профессора В.П. Чехова, Томск (1997); Конференции «Сибирская школа молодого ученого», Томск (1998); 11 Съезде ВОГнС. С-Петербург (2000); XIV Всероссийском совещании еСірукіура и функции клеточкою ядра», С-Летербург (2002); 1 Съезде Общества клеточной биологии и Международном симпозиуме но проблемам мейоза, С-Петербург (2003).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Стцуктуца н обьем диссертации.

Диссертация состоит щ введения, обюра лигераяуры, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, в который входит 203 ссылки. Работа изложена на 106 страницах, содержит 12 рисунков и 1 таблицу.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования' Объектом исследования являлась сине-зеленая мясная муха Calliphora eryllirocephala Mg., взятая из природной популяции г. Ал маты. Лабораторное культивирование проводили по обычной методике (Тамар и на, 1958; Виноградова. 1984), Для изучения влияния температуры на динамику изменения структуры хроматина трофонитов из общей культуры были получены 2 линии, которые содержались при температуре 13°С и 25^. Яичники самок разного возраста (с 1 по 9 день после выхода имаго из ну пария) выделяли в изотоническом растворе (0,744 NaCI) и фиксировали и метанол-уксусной смеси (3:1),

Приготол_пение лактопието-орсеинояых препаратов" Фиксированные яичники разделяли на фолликулы, красили лактоансто-орсеиновым красителем 15-20 мин, отмывали а 454» уксусной кислоте, накрывали покровным стеклом и раздавливали.

UHWaiwe.V"? f"rdvtitHo-<ibicvutennhix nrv>w[>amw Фіі ксиро ванные яичники раїлеляли на фолликулы, помешали в -15% уксусную кислоту, накрывали і to кроимым стеклом и раздавливали. После замораживания препарата ж ил ким аютом удаляли покровное стекло и проводили обезвоживание r спиртах (50ii, 754®. lOOfö, этанол-уксусный фиксатор (3:1)) по 10 мин. затем высушивали на воілухе при комнатной температуре. Для микролиссекши« препараты делали па покровных стеклах (24x60 мм)

G-PKfacl-g MSG): Воздушно-высушенные препараты инкубировали в 2Х SSC при 60l'C в течение 1 ч, затем промывали в дистиллированной воле и красили в 2їі-ноч растворе красителя Гнмза в течение 1,5 ч.

\1икр<*)исс$киия и поттенис * поносе чо-спепиф»чнчх ННК-проб: Микродиссекнию проводили на микроскопе AXIOVHRT 10, оснащенном мнкроманнпулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером, мик-ролнссскиионнымн иглами, ДНК-Г>ибл потеки хромосом 2, 3 и 6 были получены микроманипуляцнонным сбором восьми копий соответствующих хромосом 3 и 6 и теломерного района хромосомы 2 и последующей амплификацией ДИК в полимера] но it ценной реакции с частично вырожденным праймером (DOP-PCR) (Rublsov et al, 2000; Карам ишева. 2001).

CvpcccuQHHOH jn sifц гибридизация- Супрессиоинуто ІП situ гибридніа-ііню проводили, как описано у Иинкеля (Pinkel, 1986).

FfSff • Флуоресі теї m ото in situ нібрндптаїшю (PISH) и дстскиню меченой ДНК* проводили согласно стандартным протоколам (Lichten 1988). ДНК-библиотеки мстили литиксш«нии-11-дУТФ (зеленый сигнал) и родамином (красный сигнал) Для окрашиышю хромосом после in situ гибрид юани и ис-по/н.юводи IMP). В случае одновременной гибридизации „mj-x ДНК-библиотек, меченных разными гашензми, условия in situ гибридизации не отличались от условий для FISH с одним зоилом.

Для одновременной детекции двух сигналов, янлвнлиихся результатом (ибридтаиии различно меченых проб, готовил» два раствора соответствующих коньки акт в блок буфере: аиилин-НТС (1:250) и СуЗ (1:125), Перед пзнесснием на препарат данные растворы коньюгато» смешивали н соотношении 1:1, Под покровное стекло в качестве первого антитела наноси ли 30 мкл общего раствора двух конвютатов. В качестве второго антитела - бноткнилированньтії антнавидин, затем - авндип-ПТС.

Препараты анализировали с почошькч флуоресцеїн но то микроскопа AXIOSCOP 2, для регистрации сигнала использовали CCD-камеру и программное обеспечение «ISIS» фирмы MHTASYSTI-MS GmbH (Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОПСУЖДЕНИЕ Развитие фолликулов п нплитеннмх хромосом тпофоцитоп мнчникои С. cryth roceph a fa.

Яичники С. eryilirocephala являются мсроистн чсски ч и политрофными, т. е. фолликулы яичника состоят и j ооиита, 15 питающих клеток (трофони-тон) и окружающих их клеток фолликулярного з ни гелия.

liu.і проведен ano.un рашиїия яичников С. vr} ilírncfplia/ч. І lpt1 содержании нмаго при t-20 °С в течение первых лв>х лис ¡і с мам ем га вы чола iimüio tu нунарин фолликулы имеют ір\шсвилії)к> форму, хроматин и ядрах ірофоншо» практически не окрашивается, нолитсиные хромосомы не нн)уплиінр>юіся (1кие. 1. а). На 3-4 день фолликул приобретает окольную или »кр%гл>ю форму, хроматин і роскоши о в окрашивается хорошо (І'нс.І. ai. IIa н»К сі алии раїнишя фолликула и трофошпах виїуаліпируются нолитсиные \ ром «комы рааіі'шоіі морфолог ни.

Наблюдали фолликулы, в которых имелись псе переходные сталий от

хорошо оформ.тс......ix палочковидных хромосом до ядер с ретикулярної!

структуро» (['не. К а, б). Мри аналіпе целых фолликул о о самок 3-4-х дневного iHHpjcia, окаїалось, >но но морфологии хроматина трофоннюи фолликул можно раїлелить на 3 юны. Первая -зона—дистальная (от (хшита) часть

І'ис, І. Гаї в и те -

ЛОВ ЯИЧНИКОВ И MOp}t>.!OMlH

хромосом ipo Ji)iiim>B С. t-nth-

rocephjlj.

а - <¡*jT.i»kj.iu я к чинка м>\ (4 дні тчле вичолл и» н>нари*); С»

• Ipil ЮМЫ (1, 2. 3) В <¡«.1, LlllKJ.lt,

оїдич.гмшиссч мор {<1 ют ней хркчапша ірофоішов: в - схема нросіралсі пенных виичо-онюшений между ООШІІОЧ н трофонитачи (Bier сі al, ІУ6У), і - фоллику.іи яичшіка м>х (f> лнсП ік^тс выхода in її) нарий) О -ООШІТ, NC- ipChJoilUTtJ.

фолликула — содержит" ядра трофонімов с длинными, тонкими хромосомами. Шорую sohj — среднюю часть фолликула — обраіуют ялра с первичными нолшенными и компакшыми хромосомами. В третьей зоне - проксимальной части фолликула - находятся ялра с тіідомет афа шы м и хромосомами и ялра. н которых •жлочегафаліис хромосомы начинают лекомнакти-зоваться (еі&іня '»їлоанафаш). оораіуя ретикулярную структуру (Рис. I. б). г)іи pcij.ii.iaiu хорошо согласуются со схемоІ1 пространственных вгаимо-отношсннП между ооцитом и трофопніами, предложенной Киром (Bier el al., l%9), где также имеет место зональность в расположении трофонитов в фолликуле (Рис. 1. н).

Мл 5-6 лень после выхода мух їй пупария в фолликулах преобладали ірофошш.і с ретикулярными ядрами. Отмечаюсь варьирование в размерах решку лярных ядер: ядра 4 трофонитов. непосредственно контактирующих е ооцитом Г»ыли значительно Оолынс других ядер (І'ис, I. г). Дальнейший роет фолликула сопровождается увеличением ратмерцв ядер и дсконленса-ни eií хроматина, после чею ялра т рознит о в постепенно деіралир>юг.

На стадии ретикулярных ядер размер 4 трофоиитов, непосредственно контактирующих с ооцитом, больше но сравнению с остальными ірофоци-тами (также как и у дрозофилы: 4 трофоцига имеют ядерные объемы в среднем и 2,67 раза больше, чем обьемы остальных клеток (Brown, King, 1964)). Известно, что увеличение обьема ядра может свидетельствовать о резко поіроснісй транскрипционной активности хроматина (Лннсимов 1976; Iii Is, Dietzel, 1996; S wed low, Lamond,2001). Таким образом, причиной нар пашні морфологии хроматина в (ином фолликуле могут являться различия и >ровне плоидпости н транскрипционной активности, возникшие «сделствие специфики геометрии синиигия.

Для изучения динамики морфогенеза хроматина трофоиитов необходим детальный анализ морфологии хроматина трофонитов на всех стадиях развития фолликула.

Морфология хроматина трофоиитов чнчинюов С. ervthroctohaia.

Формирование первичных пояитеины« хромосом.

На ранних стадиях развития имаг о (1-2 день после выхода из нупария) it фолликулах наблюдали мелкие ядра с ретикулярной структурой или ядра с тонкими, переплетенными фибриллами. Хроматин трофоиитов окрашен слабо, отдельные хромосомы не выявляются (Рис. 2.1. а, б). Коньюгаїшя хромат иновых фибрилл приводит к появлению рыхлых жгутов с редкими гетерохроматиновыми блоками. Отдельные хромосомы еше не визуализи-Ріюіся(Рнс.2.1.в).

Следующая стадия - ядра с тонкими длинными политенными хромосомами, плохо структурированными и переплетенными между собой (Рис. 2.L г). Постепенная ком пакт иіа пня хроматина (возможно и дальнейшая нолнгенніация) приводит к образованию первичных пол »генных хромосом - укороченных, рыхлых и не имеющих дисковой исчсрчснности (Bier, 1958). В результате соматической конъюгации гомологов мы наблюдаем гаплоидный набор хромосом - 5 крупных и I маленькая, гетерохроматиновая (имеющая С-положительное окрашивание (Вассерлауф и лр., 2003)) хромосома (Рис. 2.1. д). Именно на этой стадии количество ярко окрашенных блоков хроматина максимально, что и позволяет идентиф и пировать хромосомы.

Дальнейшая компакт изаиня ведет к значительному укорочению первичных политенных хромосом. Блоки, которые выявлялись на предыдущей стадии, сливаются, формируя протяженные участки ярко окрашенною хроматина. Структура хромосом становиться более рыхлой и результат неплотной коньюгании состовляющих их хромат пл. Однако, на этой «алии chic вилна характерная морфология каждой хромосомы (Рис. 2.1. е).

Коньюгания юмолотов первичных политенных хромосом может быть нарїшепа. її норме может наблюдаться как частичный асинапсис - характерен для одной хромосомы (Рис. 2.1. ж), так и редко встречаемый полный

Гне. 2,1. Сіадни г}и>рчпромини нервичмич по.шкнныч \рочс>сі»ч і ротнії і ов 9іічш1коя (\ г>Г) throceph<ih-

а. f», в - первичные рсіикупрнис ялра; г, д. е - еіалии nocictrciiiiutl коч покій мини хроматина первичных молміснних хроиоеоч; ж. j - нсрвичнис ікі.ііікііиио хромосомы q нарушенной сочаїмчесьоЙ коні-кнаниіП іочлюїов. Окраска лзмоаіміо-орсеиімч. III яз. и - 10 мкч. х 104.

іч »4 эли ui«« чі иич і и (w і к-рич« «j\ um ггеїітл >|Ч»лча>ч

асш ганене юмо.н» im некоторых хромосом. Полный асинапспс ні чоло in в Омл выявлен у тїоюмспіа, но.іуіенноіо при скреши пашні mjx ні ралімх по пул ший (пону.іяшш г, Ллчаш it г, Томска) м имеет большее нроттсішс ввороченных хромосомах с рмх.юіі стр>кі>рой (Рис. 2.1. і).

Ас і імлі с не уасіка o.inotl хромосомы, леї решаемый практически m> всех ялрах (Рис. 2.1. ж) - сненнфика -мою района. а не роультат раианлітаїнн» ялер в .холе нріноіоилення нренарашн, По ліігерапрнич

........їм, пар і.и ропа мис методов пріноіоіілення препарати не нлняеї на

налігше к протяженность аеинанеиса (Куличков, Селяева, 1975 t. Прнчнной асинапеиоа іомолоіон у потомства, полуїенпоіо оі скрешинанпя oeofiefl иї раяімч попх.іяннМ. може» (ішь рашокачсс пісні юсі ь сір)к-і>рі.і іомолоюн. оЛуслоіілсішаи как наличием .хромосомных перестроек (Оеетіалп, ІУ62). іак и накоплением мобильных '»лечентчи іепоча п удаленных нонх.іяііннх (Riede, Ken/, 1УКЗ).

фщіммгшиянир итощічнмч рмнкулнпнмч ц-tfp.

Конленслішя хромаїима и ослабление спяін между хромапіламн приполи г к юму, чи» хромосомы приобретают ока.ші}Ю форму с хорошо пилимой перетяжкоН и нені ромерном районе (Рис. 2,2, а). Обнаружено, чю

А

5;

■■«•Ж

I*

Э'

1'чс. 2.2, Сгааии формирования вторичных ретикулярных ядер трофоиитоа яич-иимж {' сіуіІігікерЬаІіі.

а, Л - млныкпца; хрнкммы н іа'сно »ікімігптіігчсскш> распада (»(ляіро-фіо). и, г — ■нтмеїафіиіми хромі иимьи еохрннякчщи; сы«о ісррмніриа'іьносіь в л - тцломеїафгг« іме хримниіиьі. р:ьххзниые ік> яру; їх ис, і - стадии „ксниратдоііхн ¡июмичафзапдх чрткмхм (»ціщюі|віаі, її. к — іччріі'шьк; репікулярньїе Окраска лакпиетн^хдаокиї 11І»ліа - 1(1 чкм х І(М

і(Ц)с-іяжі;КВіеі(ірі»*^іііьсх(Лт."іих; -нлчагк) ясіимипліі'кх>їіи> ^ -риіюнчримисоми6

расиал нолінснпмх хромосом на »нлометафалные ироисхолит асинхронно: олій її) хромосом начинает расмалаїьея первой, її то время как л рупіє 4 большие хромосомы еше сохраняют спою форму (Рис. 2.2. а. Г», н). ІІ екот сирое прем я иідомстафаіньїс хромосомы ешс сохраняют скою тер ритор иаль-носи. н ядре и располагаются отлельными іруїшами (Рис. 2.2, і ). По іатем они расееииаютеи. равномерно заполняя все пространетьо ядра (Рис. 2.2. л). След\ кипам стадия - 'мілоапафаіа - постепенная леком п актимшія "»нлоче-гафашых хромосом (Рис, 2.2. е. ж, і). Д.ія ялер, находящихся на кой стадии \ирактсрн:і лнффере ні шальная лекочпакіиіаїшя хромати из. Тонкие хрома-іипокьіе нити соеслсткуюі с участками еше не лекомиактиюнашіог о хроматина.

Сталим шлоаиафалы іакаїїчинастсн полной лекочпаьгпоацнеЯ хроматина н оор;иоііаннем рстикулирното ядра, и іечение »нлоанафаім материал малеїн,коИ іетерохроматиновой хромосомы 6 выявить практически невоі-можно, Он теряется н «(їшеіі массе хроматина и иторично (после стадии

первичных поди ген шлх хромосом) начинает проявляться в виде ярко окрашиваемого района только в я л pax с ретикулярной структурой (Рис.2.2. и).

Структура л ромашка ретикулярных ядер может варьировать: встречаются ядра с равномерно распределенными но карної їлаїме хромати но вы ми шикмн. образующими однородную массу в которой выделяется один более темный участок (предположительно район маленькой хромосомы 6) (Рис. 2.2. и) и ядра, и которые в однородной массс лекомiiatatijoaaiiною хроматина встречаются участки компактного хроматина (Рис. 2.2. к).

Результаті J работ по ніученню неклассичсскнх форм полктении у млекопитающих (Зыбьша, I9S6) и растений (Brady, 1973а) прямо укатывают на то, что растеплен не участков поли те иных хромосом на отдельные хромо-немы к их деконденсаиия связаны с периодом репликации ДНК. Ретикулярные ядра трофоциюв С. erythrocephala, имеющие гомогенно распределенный по ядру хроматин и ядра с компактными участками хроматина, вероятно, также находяться in разных стадиях ттоцнкла.

Обнаружение на препарате трофоиитов с той или иной морфологией хромаї и на зависело от еоіраста мух и температуры, при которой содержалась культура. О спяіи с ним интересна ролыемпературы как экзогенного фактора в скорости рашнгия фолликулов яичников и динамике процессов компактизацин-лскомпактшации хроматина трофоаи то в яичников.

Влияние температуры на динамику измененця мпріЬ«лпгии хроматина трофоннтоп С erttythroa'phafa*

I) опыте по влиянию температуры на развитие яичников, личинок и имаго содержали при температуре 13°С и 25°С, Опыт проводили в летние месяцы (июнь, июль). Реакцией на понижение температуры было общее замедление развития, ко трое выражалось в запаздывании откладки яиц по сравнению с мухами, содержащимися при t*25°C и в более длительном периоде Прод) кцни яиц.

Анализировали развитие фолликулов яичников и структуру хромосом трофоциюв у самок разного iwjpacia, содержащихся при температуре 13ПС и 25° С (Tafli. I).

На ранних стадиях раї вити я (! день) отличия в развитии фолликулов не наблюдал ось. В фолликулах встречались мелкие ядра с ретикулярной структурой или ядра с гонкими, переплетенными фибриллами. При tJ25° С наибольшее количество морі ¡»логических типов ядер лрофошл ов наблюдалось на 2-3 день, а при t= 13 'С - на 4-5 день после выхода имаго из пу пария. Эндомстафашыс и крупные ретикулярные ядра обнаруживались на 4 лень (при t=25° С) и на 8-9 лень (при t=130C) (Табл. 1).

Анализ динамики морфогенеза ядер трофоинтов яичников покатал, что при сохранении всех морфологических типов ядер и очередности прохождения всех стадий преобразования хроматина, при снижении температу ры имеет место задержка развніия трофоциюв, что вероятно и определяет замедление формирования яиц н наступление репродуктивной стздии.

Тиб.шна 1. Дшіахіика (вменения морфолшин хроматина ірофотиои яичникон С, ег/мІігосі'/>!шІа мри содержании нчаїо на ІЗ°С (-<■) и 25°С Г>.

МІІН'І я л ер Дни (после выхода нмаю и) иунэрня)

1 2 э 1 5 6 7 8 9

1 л »

II • -t \ 4

III 4 \ t 4

IV * н ■4

V * • 4

VI * * 4 +

VII -І ■і 4 4

VIII * 4 4 +

І Іримочлте: І • че.ікііо реіи>,>л»рііі.іе ялра. |[ - ялра с іоньичн шмнж-ішмчи фіи'рн і мчи; III - я.ірл с длинными пер в m ними ткін існні.іми чромосочлши IV -ядр.і с >ні ішенними первичными ito.ui і ємними хромосомами: V - я.фл с МІЧІїаКІІІМЧІІ ІІСрШІЧННМИ NO.) НІСШІ 1.1 ЧІІ хромосомами, VI - начало нмочниннчеенно распада иервичнич ію.інгсішич. чроч(>сом; VII - ялра с хромооочачн; Vlll - крупице решк>д»рные ядра

ПкттЬок'ащт neрничних п<і.ііитиі.и <ртіі>гмі тлблцщпл

яичинцчт Г. erxthriict'pltnln.

Дім ai la. і и и просірансі ценною нїаііморасподожепия первичных подшейных хромосом необходимо их идет ифтш pona їй Идентификация мсршічнмч подиіенпі.іч хромосом іро<}>ошпоп 6t,Lu иропедеиа путем сопоставления с кар-mil И!«рИЧНІД\ HO.HtteUHUX ЛрОМОСОМ (xpOMíVCOMU, ИМСКЧШіе ЧСЇкНЙ ДНСКОНЫИ рисуїкж) ірофоншок С cnihrixrcpluiUi. Нами была исиолі.к)напа номенклатура чромосом, провоженная І'иб&ршч (lîibhoft, 1979).

Ііслслетініе особенносі ей структуры нершічнич но.пиенных хромосом - неп до moi і коїо.юіашш х романи и otejiei ішя лис копою рисунка, аиади-1 пропал и только хорошо определяемые районы - но нрш ело черные, ири-неш рочерные районы и отдельные районы плеч.

AjKiMiii'mw 1. Маркерным япаяется принешрочериый район it и иле пореї нж кн. рилом с которой л о кал и іо пан і сі еро хром а m ионий блок (кнпею-\ор по liibheri. 1979). Характерной особенностью нртсломерпыч район о її плеч яіияеіси оісутстшіс определенных очертаний («раїмиїосп.») (Рис. ,1. а).

,\/>r*uni'<tir<f 2. Яішеїея наиболее леї ко идентифицируемой хромосомой, і.к, и чее і кру iniuií і еісрохром.пиііоні.ій блок а і ел ом ер ном районе длинною плеча. Гелочерішіі район коро і кою плеча слабо окрашивается. 1Іринен-ірочерш-Ж район корої кою плеча содержит крупный і ет ерох ро ма і и і юн м іі блок (Гне. .Я, (і).

хромосома 1

xpowobowa2

хромосома З

а

_ в _ хромосома 5

Хромосому 4

і

г

'Д

Рис. 3. Идентификация первичны к полчтенных хромосом трофошггов путем сопоставления с партой вторичных полктенных хромосом трофоцптоа С eryihrocephala

(Ribbetl, 1979).

Окраска лзктоаието-орсеином. Скобками обозначены соответствующие районы;

Храчосома 3. Отличается характерной морфологией: у первичных политенных хромосом (так же как и у вторичных) в прицентромерном районе имеется большой пуф, вблизи которого зачастую наблюдается асннапсис гомологов. Короткое плечо (3L) тоньше длинного плеча (3R) (Рис. 3. в).

Храчосаии 4. Отличительной особенностью хромосомы 4 является морфология при центром ерного района: хромосома «разорвана», т.е. с обеих сторон центромерной области, на месте большою пуфа у вторичных полигенных хромосом, расположены слабо окрашиваемые дсконденсированные районы. В центре-блок хроматина с яркоорашенным блоком. (Рис. 3. г).

Храчосома 5. Маркером для идентификации хромосомы 5 является асинантированный прителомерный район длинного плеча (Рис. 3. д).

По мере сокращения длины первичных политенных хромосом происходит слияние ярко окрашенных районов в более крупные блоки, имеющие нечеткие границы (Рис. 4. а, б). Однако положение таких блоков является специфичным для хромосом, а ею изменение можно проследить в хеше компактизаиии хроматина. Индивидуальной для каждой хромосомы является н докали <ация светлых зон декомпакгизованного материала. Наличие зтих признаков, положение центромерного района (в виде ярко окрашенного блока), соотношение плеч — т.е. общая морфология хромосом - делают возможной идентификацию первичных политенных хромосом трофоиитов яичников у С. eryihrocephala.

- кпметохор.

Взаиморасположение первичных „полнтенных. хромосом в ядрах

тиоіЬоиитов янчииков С. erfthrocephala.

Архитектура ядра с политеннымн хромосомами достаточно хорошо изучена у многих представителей Diptera как и соматических, так и в генеративно« тканях (Hochrtrasser cl al.. 1987; Прокофьева-Есльговская, 1967; Стегний, 1987, 19916). Однако у С, erythrocephala этот вопрос изучен не был.

Анализ взаиморасположения первичных иолитенных хромосом трофо-цитов яичников С. erythrocephala не выявил объединения хромосом и их плеч в обший центромерный район - локальный хромоцеитр. Хромосомы рассредоточены в пространстве ядра н. по видимому, располагаются в определенном порядке по отношению др>г к лругу. Тяготение отдельных хромосом к ядерной оболочке может свидетельствовать о прикреплениях. Об этом же говорит и наличие тонких тяжей хроматина, отходящих от некоторых хромосом к оболочке ядра. Однако хороню выраженные прикрепления (веерообразное расплстеине хромосомы в районе прикрепления) обнаружены не были (Рис. 4 а. б).

Таким образом, отсутствие локальною хромопеитра и рассредоточен* ность хромосом трофоцитов в пространстве ядра, характерное для видов Anopheles (Стсгний, 1979) и Drosophila (Стегний, Вассерла>ф, 1991 а, б; Стегний н лр„ 1996) выявлено и у С', erythrocephala

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) ДНК-Яиблнотек. подученных методом микроднссекпии. на первичные пол н генные хромосомы трофо ЦHTQB.

Перед нами стояла задача - оценить упорядоченность хроматина н ходе сложного '>ндом итогического цикла н н ретикулярных ядрах высокой нло-илности. Сложность заключалась в отсутствии маркеров на определенные хромосомы С. erythrocephala. Эта проблема была решена путем получения хромосомо- и районо-спеиифичных ДНК библиотек метолом чикродиссекай и .хорошо определяемого тел опер ното участка первичной полит ей ной хромосомы 2 и хромосом 3 и 6 (Рис, 5). Для проверки специфичности полученных ДНК-библиотек была про воле на флуоресцентная in situ гибридизация ДНК-проб на первичные подшейные хромосомы.

Рис. 4. Илгнтфикшшя н пространственное выичо-расио.поасеине первичны*, полигеннык хромосом трофоцитов С. eryihrocíphnU. Окраска лзккмнего-ореен-ном. Шкала- 10 мкм х 100. 1-6 - нучераиіщ хрочосоч;

Рис. 5. Iio!,i)iui«vBucjuiciiiiuH копра-

UJCHIllJil npCIIJfW нфенчных j]0.1HtaillU\ \po-МОСОЧ ipi1-J>t>UHlk>!l С. ertlhroct'plulíl ClptniiJMH оОошачСИЫ хромосоми З II 6 И рзйон \pOMO-

сомы 2. выбранные ли чиироліееемши. <l>ato-виГі коїнрдсг. л -ID.

.\'{мміи'<ічи-ет'иифпчііач JfHK-i'itit'niiotrtf^t tfnntficomj ri При аналіие реіультатов PISIl хромосом о-специфичном ДНК-библиоіски хромосомы 6 на первичные подшейные хромосомы окашось. ню ДІІК-ГшГі.ншіека окрашивала только хромосому (к саіііьі і ибрнди îanmi нроби па друпіх хромосомах не выявлены (Рис. 6. а). А пал и j л ока ш tai и ш ДІІК-бнй.іпотеки їй материале поли ієні toil хромосомы 6 ¡тяти осойеіи и>сти <лр\ к-ijpu хромлин.глои хромооомы: тшичие днух п.тіно«омпзктиюіипньіх (і www і і

і'ііс. 6. КІМ І ДМК-биГыиогек на первичные наш і синие хрочоеочы іроіімштв

(*. СГ)ІІ1Г<ЧІ'/>І!,ІІ<І.

a - IISH чрочосичо-сненнфичноИ ДИК-СиГиисіїски хромосомы (і ( О, і pa; чий сіннії), Гі - 11ST) хроиостмьсікиїї-Ї-мчіїоіі ДІЖч>»іб.іноч:кн хромосоми 3 ( t* красный сиінал> и р.ніішіi-tntніj.имmit! ДІІк'-ОиОлноіеки хромосомы 2 l*^. іє.іілшґі tniiixi) Хроманін окрлпіен ПЛІЧ Шкала • 10 мкм. х 100.

ікшромфіїом іхіін'ію. мнорые IM мети і ем юилом, И кркое Окришшшнм >у\рі>чаін-ікни-іх іііеч. Otcyici line сипаи может биті-оОїлснсіюіііонкШ\нлміцкчйі ДІІК нрн-цсшріїм^риич (хйіонон, и как елздлние - нслосшиюстмо іомоміичноіі ДІІК діч мо lom.K ijpni Ma і wit, *}> и paikmu ярко окрашшинпся ПАРІ.

Вследствие сложности илешификаїїнн какою либо определенною patíoiia, хромосома 3 была чнкродилетнронана полностью. Чии'и исключим» «¡юионпіі сш нал была про кеде на DSM с С) прессиеіі высоко нов торенных поедедонит ель посте it. И реіультаїе бил получен сигнал только в ран-

оне наибольшей іомолоіни - в і іриненгро черном районе хромосомы З, вероятно, наиболее леком пакт июнанком (Рис. б. б).

Paùonn-спсиифичнт ЛИК-биГчнотека хромосомы 2

Районо-снешіфич пая ДНК-библиотека хромосомы 2 была порчена мик* ромашшуляционным сбором матери&іателомерного района хромосомы 2.

При пропел с ннн FISH районо-спениф ич но й ДНК-библиотеки хромосомы 2, на первичных политенных хромосомах трофоцитов выявилось множество сайтов гибридизации ДП К-биб л йот екн. Предпочтительные места гибридизации - телом ерные н при неї про черные районы хромосом. H некоторых хромосомах ДНК-библиотека гибридиювалась м по плечам хромосомы (Рис. 6. в). Инге ней ни ость сигнала в ядрах лаже а пределах одною препарата отличалась вариабельностью, что может быть объяснено различной ком пакт нзанией и доступностью хроматина для меченых фрагментов ДНК.

При анализе распределения сиг пата на политенных хромосомах выявились некоторые закономерное і и в локализации ДНК-зонда: только у хромосомы 3 метятся оба теломернык района. V остальных хромосом яркие анналы были на одном из теломерных районов, в приueiпромерном и ин-теркалярпоч хроматине.

Такая специфика в распределении сигнала говорит об определенной гомологии последовательностей і етеро хромат и на теломерных и при центромера ы\ районов.

1-1SH ЛНК-библиотек с ядрами трофопитои нагл ич ной морфологии

Ііітшнхіиия храиосаиы бяя^гык с /хгниччои Mo^powueù xp<ivamu"a.

[І результате FISH хромосомо-сі ієни фнч ной ДНК-библиотски хромосомы 6 на первичные ретикулярные ядра трофоцитов был выя bien один сайт тибрил и jaunn ДНК-библиотеки (Рис. 7. а. б: зеленый еншал). Области, занимаемая хромосомой 6, значительно больше и хорошо визуализируется. Наблюдаются отдельные участки мечения, находящиеся на некотором расстоянии от обшей зоны і ибридтанин (Рис. 7. д; зеленый сигнал). Характер мечения не изменяется при образовании первичных полигеннык хормоеом, нх компактизаини и начате тточ и тогическ от о распада (Рис. 7. д. е; зеленый сні паї). Отсутствие мечения наблюдается только на стадии энломета-фаіьі (Рис. 7 ж). С началом деком 11 акти зании зндометафаіньїч хромосом сигнал опять начинает проявляться (Рис. 7. з).

BtmmitnniitH rfHutoctiubi 3 n e<kwc с txun^oit и/учрд^Mlfù xfwtçnfуча.

LI результате FISH с супрессией высокоповторепных последовательностей ДНК-библиоіекн хромосомы 3 на первичные ретикулярные ядра была выявлена одна область гибридизации, размер которой варьировал (Рис. 7. а. б, в; красный сигнал). ДНК-библпотека гибридизуется либо в обширную область, вероятно о крайні пая практически всю хромосому 3 (Рис. 7. а), либо виден только один ярко окрашенный район (Рис. 7. б). Хроматин первичных решкулярных ядер, постепенно компактнзуется, формируя фибриллы, обратукшnie затем первичные нолитенные хромосомы. По мере компактн-заиии и формирования хромат и новых тяжей, область гибридизации ДИК-

it una сокращается. Часто в и зу ализи руется только небольшой яркий диск (Рис, 7. в: красный сигнал). В первичных политенных хромосомах, їло конмог.щня хроматид максимальная, виден один ярко окрашенный блок и менее яркое окрашивание плеч хромосомы 3 (Рис. 7. п красный сигнал). Затем происходит сокращение первичных политенных хромосом с одновременным «разрыхлением» их структуры в результате пару и ¡ей и я конмо-ганин и увеличения расстояния между хроматиламн, Процесс компактиза-нии первичных полите иных хромосом показан на примере хромосомы 3 {Рис. 7. г).

Ярко окрашиваемы й блок в цеитромерном районе (ДНК-библиотека хромосомы 3). окрашивание лед о мерных районов (Д Н К-би бл но ге ка хромосомы 2). а также яркий блок при центром ер ною гетерох ром аги i ta. интенсивно окрашиваемою DAP1, служат прекрасными маркерами для идентификации хромосомы 3 разной степени компактное) и.

На стадии компактных хромосом ДНК-библиотека тибридизусгся практически по всей хромосоме 3, за исключением одною блока (ярко окрашенного DAPI) (Рис. 7. л: красный сигнал). Дальнейшее ¡ндочниннче-ское сжатие хроматид приводит к тому, что юна гибридизации ДНК-їонда опять сокращается до неширокой полосы (Рис. 7. с; красный сигнал). В »НЛОМС1 афазных ядрах, где имеет место максимальная конденсация хромагил (уже отдельных іило хромосом) ДНК-зонд не тибрилизуеіся вообше (Рис. 7. ж). И. наконец, ігри деспирализацнн эндометафазпых хромосом вновь появляется сигнал в виде облает еще с дабоо країнемною хроматина (Рис. 7. и).

/¡¡тчпн >q>iux мимепіщіа ;{t п^еломе/'кого района хромосомы 2.

11 первичных ретикулярных ядрах наблюдается несколько сайтов гибридизации ДН КС-библиотеки .хромосомы 2 (Рис. 7. в; зеленый сигнал). Для первичных политенных хромосом характерно сокращение области мечения при уменьшении ;|дины хромосом. Ото показано на примере ісдомерньтх райони» хромосомы 3 (Рнс. 7. п /зеленый сигнал). На стадии компактных хромосом мечения ДНК-іоіиюм не наблюдается вообще. Вновь сигнал появляется па стадии эндоанафазы, когда начинается деснирализация зндомс-гафазных хромосом - ДНК зонд из нрнт слом ер ного района хромосомы 2 гибрнлизуется во MnoiTtx местах по периферии ядра (Рис. 7. и; зеленый сигнал).

Поскольку флуоресцентную in situ шбрилнзаіино (RSH) провили ли на воиутнно-виеушенпых давленых препаратах, то при анализе локализации метки необходимо учитывать расположение хроматина а одной плоскости. Вариации к окрашивании ДНК-зондом хромосомы 3 первичных реї и кул яр-пых ядер можно объяснить таким «расплющиванием» ядра, когда хромосома 3 либо располагается сверху, либо на нее налагается хроматин других .хромосом и югла заметен только наиболее ярко окрашенный блок. Различной степенью распластанносги материала .хромосом оСьясняюіся и вариации в размере области мечения ДНК-зондом хромосомы 6, которые можно

ешшвш, 9 п .=» ШрШ

вГ &

Ш - ',

|'||С. 7. ЛоКИН МЦИЯ ДНК-Л|1ЙЛ1М1£К Й Я.1рД\ 1р0'{«>|Ш10в ЯИЧНИКОВ С. СфЬг(Ь <.ер1м1а

О, В - первичны« рстнк\л»рпие ялрл, Г - С13.1НН ЬОЧПаМИМШШ первичной <111.111-К11но(( хромосомы 3; д. е - сюлнп »микрофаги; ж - стали» миочгта^аш, 1, и -СТАЛИН »иоли^чиы

0 - ч(>1>м1Ком1ьс1кш(')ич11ач Д11К-ЛнГиичгем1 чрочосочи 6; ^ . чрочосочо-сиеии^ичмаи ЛНК-бнанннсьэ чрочосочы 3; раПотьспеин^нчиач ДИК-бн&пьнека хрочисочы 2; *-> -блок нрниентрочсрною^ерочрочатииачрочосочы 3:бела« .1111)нч - область декочнамимиин ма [срыли чричосочы 3. Хроматин опрошен ПАИ М11А1Д- Шмьч ч 1ои

наблюл ль на ьеех стадиях моряки сие и млер. а также наличие отделы нач. участков мечеиия «раметевшегоея» при давлении материала хромосомы

Неодинаковая доступ тип ь \частков ДНК для меченых зонлон кажется наиболее вероятной причиной вариабельности интенсивности г нОр ил танин ДНК-библтнек не юлько с первичными полшенными хромосомами, но и с ядрами, имеющими ра(личную етрук|)ру хромашна. Очевидно. п данном случае ре тли инее значение имеет степень компактности ратлнчных

раііонов хромосом. Li декомпакт питанные структуры ДНК-зонд тнбриди-зуется интенсивнее. Так при гибридизации соответствующего ДНК-зонда с хромосомой 6 мы наблюдаем обширную зону гибридизации. Очевидно, метятся эухроматішовыс плечи этой хромосомы, хроматин которых настолько леком її акт изогон, что не выявляется при окрашивании лактоацето-орсенном. В плот ноу накованные структуры, такие как ценгромерные районы .хромосоми 6 н при неї про мерный блок в хромосоме 3, ДИК-зоиды не тибрилизуются вообще. Изменением компакт из ации хроматина можно объяснить постепенное «затухание» в тсломерных районах сигнала ДНК-зонда из хромосомы 2 по мере компактизапии хромосомы 3, сокращение зоны гибридизации ДНК-зонда из хромосомы 3 в начале ком пакти зони и \ро матій. Л так же полное отсутствие сигнаюв всех ДНК-зондов в ядрах с эндо-метафазнымн хромосомами, хроматин которых достигает такою уровня компактности, что становиться недоступным для меченых фрагментов гомологичной ДНК при проведении FISH,

Упорядоченность хроматина в высокоиплипллияиом пегикулнр-

ном mut: хппмосомные территории.

Хроматин вторичных ретикулярных, ядер, окрашенных лактоацето-орсснном, имеет однородною диффузную структуру с редкими, более ярко окрашенными теїсрохроматиновыми участками. Это крупные ядра, степень п.юидности которых, по данным Бира {Шег 1958), может достигать 4096С. Лактоането-орсснновое окрашивание таких ретикулярных ядер не позволяет вычленить материи отдельных хромосом из обшей массы хроматина. Наличие маркеров на отдельные'хромосомы значительно облепило бы изучение упорядоченность хроматина в высоко полиплоидном ретикулярном ядре и ответило бы на вопрос о сохранении хромосомных территорий при нолиплоилитаиин и процессе конденсации / деконленсании хроматина, происходящем в ")і ідом и т о г нческочші кл е.

Поскольку при гибридизации ДНК-библиотек in хромосом 3 и 6 на первичные нол и теннис хромосомы было получено по одному сайгу гибридизации, можно сделать вывод о хромосомо-спенифичпости этих зондов и о возможности использовать эти ДНК-зонды в качестве маркеров соответствующих хромосом в ядрах с ретикулярной структурой. Однако, есть вероятность, »по при переходе хроматина кз политекного в деком пакт питанное ретикулярное состояние появятся дополнительные сайты гибридизации этих ДНК*библиотек на других хромосомах.

При проведении двухцветной FISH хромосомо-епеиифичных ДНК-библиотек хромосомы 3 и 6 оказалось, что несмотря на то, что FISH проводили на давленых, а не на объемных препаратах, области интенсивной гибридизации "них ДНК-зондов имели определенную локализацию в пространстве ядра (Рис. 8. а, б). Очевидно, что территории, занимаемые этими хромосомами в ялре, сохраняются при многократном возрастании уровня пло-идности и преобразовании хроматина в ретикулярную структуру.

ДНК-библиотека хромосомы 2 тмбршнсзовалась небольшими глыбками по периферии ядра (Рис, 8, б). Для анализа состава ДНК нритсломерного

І'мС 8. VcpplllOpItlI ХрОЧЧСОЧ 3 >1 6 В Є МСО KOI KM НІ 1.ЮИД111J Ч, р<1»к>лярни\«jpjy ІрофіНІМНШ »ІІЧІІИкОЙ С", erythntceplwlj

а - резеды ai дв>х несший 1ІМН хрочисочо-енсшЦмчиой ДНІС-(>іі(ї,іиі>іємі ^рочіюо-чи 6 (t>, íc.k'iiijíI сіп нал) (і хричолічі к і геці і } ичж>(1 ДІІК-бнґиноіеки хрочі>сочьі З (S* красиш! сіп над), 0 -pítj.ibtat .iB)\iiseinofi ІISH хрочочоми-акнн^ичноп ДНК-библиотеки \рччосччі4 J її* красний CIHIIJ.1) н раПон»-сиешіфичіієні УПІК-Сні і\ іпотеки чрі>чосочі,і 2 (имений сш ції) Хром а і іш о*р£Ш<и ІїлИ, Шкаїа - 10 мкч \ 100.

района хромосоми 2, ні которою была поду чека ДНК-библиотека, первичные полиіснние хромосоми были окрашены метолом дифференциальною (І-ОКраШИВЛІІИЯ. КьіЛІІ ВЫЯВЛСНЫ G-ноложительныс блоки, приему шест ВС lino нрннешромерной локализации. Интерес) юший нас нрителомерный блок хромосомы 2 также пчел G-положшедыюе окрашивание. По литературным данным, периферийная локали »ни я и О-полож и тельное окрашивание характерно для факультативною іетерохроматпна. состоящею из позднореп-лннирунпннхея. обелпсиних ієнами хроматиновыч доменов (Соок, 1495: CarvaMio et al., 2001: Cremer et at.. 2(101).

злкліочілли:

Суммируя пол>ченные результаты, можно эаклк>чить, что у Catliphora i-ryiltroccphnla система оопнт-трофоннты является уникальной модель«) для изуїення проблемы становлення оріанизашіи зрелою яйца. Возможность паб.тнідаїь нес переходные тины хроматина ipo<ÍK)нитов ог первичных ретикулярных ядер к первичным нолнтеиным хром сомам, все Сталин энд омито la и образование вюрнчныч ретикулярных я л ер поіволяет проследить изменение морфолошн хроматина, а значит и ею функциональною состояния. Наличие стадии первичных нолитеиных хромосом, нмеюших характерную морфолоіию и индивидуальный рисунок ярко окрашиваемых блоков хромат и на, позволяет идентифицировать хромосомы, находящиеся на 'ной стадии и онеиить их пространственное взаиморасположение в ядре. Переход хрочапша из состояния первичных нолитеиных хромосом к рети-

кулярной структуре ядра (через стадии аидомитоза) не позволяет проследить дальнейuiyю судьбу материала отдельных хромосом. Это становиться возможным при использовании хромосомо-сненифичных ДНК-библиотек. По результатам дифференциального G-окрашиваиия и FISH район о-специфичноП ДНК-библиотеки хромосомы 2 с вторичными ретикулярными ядрами следует, что тело мерный район хромосомы 2 представлен факультативным гетсрохроматином. FISH ДНК-библиотек хромосом 3 и 6 с ядрами трофоиитов, имеющих различную морфологию хроматина, позволила визуализировать материал этих хромосом на стадиях, когда идентифицировать хромосомы невозможно. Анализ локализации ДНК-зондов хромосом 3 и 6 позволил сделать вывод о сохранении хромосомных территорий в высокополиплоидных ядрах при переходе хроматина в ретикулярное состояние.

выводы

1.В результате анализа фолликулов яичников Caliiphora erythroeephala обнаружено, что на определенной стадии развития яичников в фолликуле трофопиты имеют различную морфологию хроматина - от первичных ретикулярных ядер до вторичных ретикулярных ядер. При понижении температуры происходит замедление морфогенеза ядер трофоиитов.

2. Показана возможность идентифицировать первичные иолнтенные хромосомы методом сравнения с картой вторичных полшенныч хромосом. Установлено, что хромосомы трофоиитов не имеют общего хромонстра и рассредоточены в пространстве ядра.

3. Анализ распределения ДНК-библиотеки хромосом 3 и б при проведении FISH на первичные полнтенные хромосомы показал, что эти ДНК-библиотеки являются хромосомо-специфичными, т.е. обнаружено по одному сайту гибридизации этих ДНК-библиотек на соответствующие хромосомы. При гибридизации ДНК-библиотеки из теломерного района хромосомы 2 обнаружено множество сайтов гибридизации на всех хромосомах (кроме 6-оН).

4. Анализ локализации ДНК-библиотек в ядрах трофоиитов с различной морфолоіией хроматина выявил связь между размерами области гибридизации ДНК-библиотек и степенью компактности хроматина - с повышением компактизашш хроматина происходит уменьшение зон гибридизации ДНК-библиотек. В ядрах с экдометафазными хромосомами отсутствуют сигналы всех трех ДНК-библиотек.

5. В результате гибридизации ДНК-библиотек хромосом 3 и б с вторичными ретикулярными ядрами обнаружено, что при переходе хроматина в ретикулярную структуру имеет место сохранение территорий этих хромосом в ядре. ДНК-библиотека теломерного района хромосомы 2 гибри-днзустся по персферии ядра, что характерно для гетерохроматиновых доменов.

Список pafior, опубликованных по теме диссертации.

1. Ананьина Т.В., Васссрла>ф Н.Э., Стеши ti В.Н Иолитенпые хромосомы трофоиитов яичников у Caliiphora erythroeephala (Díptera: Calliphoridae) // Материалы конференции, посвященной памяти В Л.Чехова. Томск. TIT. 1997.

2. Ананьина Т.В., Вассерлауф И.О. Политснизация хромосом трофоиитов у Caliiphora erythroeephala (Díptera: Calliphoridae) II Тез. докл. na копф. «Сибирская школа молодого ученого«, Томск. Т11У. 1998.

3. СтегниИ В.Н„ Вассерлауф Н.Э., Ананьина Т.В. Идентификация, взаиморасположение и развитие первичных нолитенныч хромосом в ядрах tpo-фошпои у Caliiphora erythroeephala (Díptera: Calliphoridae) И I снетка. 1999. Т. 35. №7. С 912-918.

4. Васссрлауф Н.Э., Ананьина Т.В., СтегниП В.Н. Полите и та ни я хромосом и их взаиморасположение в ядрах трофоиитов Caliiphora erythroeephala (Díptera: Calliphoraidac) // 2000. BOfTiC (1-5 февраля). C-Пстербург,

5. Вассерлауф И.Э., Ананьина Т.Н., Сгсгний В.Н. Исследование интерфазного ядра трофоиитов Caliiphora erythroeephala (Díptera: Calliphoridac) // Цитология. 2002. № 9. XIV Всероссийское совещание «Структура и функции клеточного ялра».

6. Вассерлауф Н.Э., Ананьина Т.It., Ушср М.Ф., Кзрамишсва Т. В., Мельникова П. П., Рубцов Н.В., Сте[ннй В.Н. Организация и дифференциальная окраска хромосом зндомнтотическнх ядер трофоиитов Caliiphora erythroeephala (Díptera: Calliphoridac) // Генетика. 2003. .Vt 9.

7. Ананьина Т.В., Ведерников A.B., Васссрлауф Н.Э., Карамышспа Г. В., Рубцов D.S., СтетниЙ В.Н. Изучение упорядоченности хроматина в ядрах трофоиитов в ходе 7ИДОМИЮ1ИЧССКОЮ цикла у Caliiphora ery thracephala (Díptera: Calliphoridac)// Цитология. 2003. И* 9.1 Съезд Общества клеточной биологии и Международны!) симпозиум по проблемам Mcíioia. 14-17 октября 2003, С-Петербург.

Отпечатано на участке оперативной полиграфии Редакиионно-издательского отдела ТГУ Лицензия ПД№ 00208 от 20 декабря 1999г.

Заказ № 1& О*_2004 г. Тираж ЮО экз.

»-2659