Цитогенетический и молекулярно-генетический анализ критических районов хромосом, повреждаемых при менделирующих синдромах МВПР

Залетаев, Дмитрий Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Цитогенетический и молекулярно-генетический анализ критических районов хромосом, повреждаемых при менделирующих синдромах МВПР
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический и молекулярно-генетический анализ критических районов хромосом, повреждаемых при менделирующих синдромах МВПР"

г/, ......

* Т НУ.! •

Российская Академия Медицинских Наук МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 575.113.2+575.224.22:616-056.7

ЗАЛЕТАЕВ Дмитрий Владимирович

"ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРИТИЧЕСКИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ, ПОВРЕЖДАЕМЫХ ПРИ МЕНДЕПИРУЮЩИХ СИНДРОМАХ МВПР"

03.00.15 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена в лаборатории клинической цитогенетики Института клинической генетики и наследственной патологии Медико-генетического научного центра РАМН.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Н.П.Кулешов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.С.Баранов доктор биологических наук, профессор Н.К.Янковский доктор биологических наук О.В.Евграфов

Ведущая организация: НИИ педиатрии и детской хирургии Министерства Здрагрохранения и Медицинской промышленности РФ

Защита диссертации состоится "Ч" __1996 г.

в 4А час, на заседании Диссертационного Совета Д 001.16.01 по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

Актуальность.

Одной из причин наследственных и врожденных заболеваний у человека, приводящих к синдромам множественных врожденных пороков развития (МВПР), бесплодию, аномалиям полового развития и различным формам новообразований, является хромосомная патология. В

клинической цитогенетике разработан обширный арсенал методов и методических подходов для выявления хромосомной патологии, разработаны критерии ее описания, рекомендации для медико-генетического консультирования, пренатальной диагностики, формируются регистры и группы риска. Многое сделано в плане изучения структуры и функции хромосом человека в норме и патологии. Показано, что практически все хромосомы имеют по несколько "критических" сегментов, делеции и дупликации которых вызывают устойчивые симтомокомплексы пороков развития, что позволяет выделять их в отдельные клинико-цитогенетические синдромы. В то же время существует большое количество синдромальных форм и неклассифицированных комплексов МВПР, при которых хромосомная патология не выявляется обычными цитогенетическими методами. Вследствие этого, в начале 80-х годов большое распространение получил метод прометафазных хромосом, благодаря которому удалось повысить разрешающую способность цитогенетического анализа и подтвердить предположение о существовании микрохромосомных мутаций. Использование высокоразрешающего хромосомного анализа позволило не только выявить небольшие транслокации равными по величине участками, парацентрические инверсии, но и выделить особую группу заболеваний, возникающих в результате микрохромосомных аномалий-микроделеций и микродупликаций. К таким заболеваниям относятся синдромы, считавшиеся моногенными: Прадера-Вилли и Ангельмана, \WAGR (аниридия, сопровождающаяся опухолью Вилмса), Видемана-Беквита, трихо-рино-фаланговые I и II типов, Миллера-Диккера, ДиДжорджа, ретинобластома и др. Однако ряд синдромов МВПР, при которых хромосомная патология предполагалась, но не была выявлена часть выше указанных синдромов и нозологические формы, входящие составной частью в эти синдромы, не показали хромосомной патологии даже при использовании тонких методов цитогенетики, что «спжет свидетельствовать и о генетической гетерогенности заболевания и о пределе разрешения метода прометафазных хромосом. Это заставило обратиться к методам молекулярной биологии, имеющим разрешение на несколько порядков большее.

Использование молекулярно-биологических технологий в клинико-цитогенетических исследованиях имеет две основных задачи:

1) обнаружить субмикроскопическую структурную патологию на уровне ДНК, описать ее в терминах молекулярной биологии и охарактеризовать наименьший критический район, подвергающийся перестройкам;

2) выявить в критическом сегменте ген/ы, повреждения которого формируют патологический фенотип, выяснить его структуру,закономерности функционирования в норме и патологии, выявить спектр мутаций и, благодаря этому, понять этиопатогенетический механизм возникновения конкретного заболевания.

Структурная хромосомная патология позволяет ускорить процесс картирования и клонирования генов наследственных заболеваний, что является одной из важнейших задач современного этапа развития медицинской генетики. Значительное количество публикаций на эту тему свидетельствует о научно-практической актуальности проблемы и требует систематизации полученных результатов.

В настоящей работе предложен алгоритм анализа и представлены результаты исследования по комплексной цитогенетической и молекулярно-биологической характеристике критических районов хромосом, микроструктурные, субмикроскопические и функциональные изменения которых вызывают определенные синдромы МВПР. Проведено исследование критических районов хромосомы 15(ч11.2-я13) при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана, хромосомы 11р13 при полных и неполных формах синдрома УУАОЯ, хромосомы 8я24.1 при трихо-рино-фаланговых синдромах I и II типов.

Цель и задачи исследования.

Основной целью работы является разработка направления исследований в клинической цитогенетике, связанного с поиском и комплексной характеристикой критических районов хромосом, анализом их микроструктурной, субмикроскопической и функциональней патологии, картированием и клонированием генов, расположенных в этих районах, поиском и характеристикой мутаций, приводящих к определенным синдромальным формам МВПР. Основными задачами работы являются:

1. Изучить возможности использования комплекса высокоразрешающих методов хромосомного анализа и молекулярно-биологических методов для характеристики микроструктурной и с>5микроскопической хромосомной патологии в терминах молекулярной биологии в контингенте детей с синдромами МВПР и злокачественными новообразованиями; выработать алгоритм комплексного анализа критических районов хромосом;

2. Провести делеционное, физическое и генетическое картирование критического района хромосомы 8q24.1 при ТРФС-t и II шпон, картирование и клонирование гена-кандидата МЭХД (EXT I), осуществить поиск его мутаций. Доказать генетическую гетерогенность МЭХД. S. Провести анализ и делеционное картирование критического района хромосомы 11р13 при полных и неполных формах синдрома WAGR, комплексную характеристику микроструктурной и субмикроскопической патологии в терминах молекулярной биологии, поиск и характеристику мутаций, приводящих к заболеваниям;

4.0ценить частоту и охарактеризовать микроструктурную, субмикроскопическую и функциональную патологию критического • района хромосомы 15q12, вызывающую синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана на основе использования комплекса высокоразрешающих методов хромосомного анализа и методов молекулярной биологии. Научная новизна.

Определен подход в клинической цитогенетике, позволяющий проводить комплексный анализ и характеристику критических районов хромосом, микроструктурная и субмикроскопическая патология которых приводит к возникновению синдромов МВПР и педиатрическим новообразованиям. Впервые проведено объемное цитогенетическоо исследование с использованием высокоразрешающих методов хромосомного анализа такой группы заболеваний. Впервые осуществлен комплексный методический подход в диагностике микроструктурной и субмикроскопической хромосомной патологии, основанный на использовании прометафазного хромосомного анализа и методов молекулярной биологии и показавший возможность диагностики и характеристики как цитогенетической патологии, так и точковь.х мутаций при синдромах сегментных анеусомий. Разработан алгоритм такого анализа.

Определен наименьший район перекрывания всех делеций при синдромах Лангера-Гидиона и ТРФС-1. Впервые проведено физическое картирование сегмента хромосомы 8q24.1, получены и охгц.~* ;еризованы новые, диагностически ценные ДНК-маркеры, новые STS и EST. В общей сложности секвенировано около 10 т.п.н. Делеционное и генетическое картирование позволило установить наиболее вероятные районы локализации ТРФС-1 - локус D8S98, и предполагаемого гена МЭХД (ЕХТ 1) -локус D8S67. Проведено частичное клонирование гена ЕХТ 1. Впервые проведен поиск возможных перестроек и мутаций, приводящих к заболеванию и злокачественной трансформации экзостоза в хондросарксму. Показана генетическая гетерогенность МЭХД и проведено генетическое

картирование второго гена (ЕХТ 2) в участке хромосомы 11р12 -локус D11S903.

Проведен анализ и делеционное картирование критического района хромосомы 11р13, повреждаемого структурными хромосомными аберрациями при синдромах WAGR, аниридии с аномалиями развития и изолированной нефробластоме, позволившие разграничить гены аниридии (PAX 6) и нефробластомы (WT 1) в одном хромосомном субсегменте. Разработан вариант множественной дифференциальной ПЦР для анализа делеций при синдроме WAGR. Разработаны подходы к ДНК-диагностике и впервые описано несколько новых мутаций в гене PAX 6.

Проведен комплексный анализ критического района хромосомы 15q11.2, повреждаемого при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана. Впервые охарактеризован ряд необычных структурных и функциональных нарушений этого района у больных. Оценен вклад структурной и функциональной патологии в генезе этих синдромов. Предложен новый термин - "комплекс импринтинга", объясняющий структурно-функциональную организацию района хромосомы 15(q11.2-q13).

Практическая значимость.

Настоящее исследование имеет очевидную практическую компоненту, т.к. направлено на развитие новых диагностических подходов в клинической цитогенетике, позволяющих выявлять микроструктурные и субмикроскопические хромосомные аномалии, вплоть до точковых мутаций. В процессе работы обследовано, с использованием высоко разрешающих цитогенетических методов, более 450 больных с синдромами МВПР и педиатрическими новообразованиями и. члены их семей. В общей сложности, хромосомная патология выявлена почти в • 25% случаев. Разработаны методические рекомендации по использованию высокоразрешающих методов хромосомного анализа. Более 100 больных исследованы с использованием комплекса молекулярно-биологических методов. Оценен вклад хромосомной, субмикроскопической и функциональной патологии при синдромах Лангера-Гидиона, трихо-рино-фаланговом синдроме I типа, МЭХД, полных и неполных формах синдрома WAGR, Видеманна-Беквита, синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана. У обследованных больных выявлены определенные мутации, подтвержден или исключен диагноз, даны рекомендации по пренатальной диагностике и прогноз в отношении развития специфических новообразований. Разработан вариант количественной ПЦР для диагностики делеций при синдроме WAGR. Разработана ДНК-диагностика мутаций в гене аниридии и описаны новые мутации. Выявлен определенный район в локусе D8S67, повреждаемый при МЭХД. Все эти разработки могут быть использованы в

практической работе диагностических лабораторий Института педиатрии и-------------

детской хирургии МЗМП РФ, ЦИТО им. Приорова МЗРИП РФ, ВОНЦ РАМН. ЭНЦ РАМН и федеральных медико-генетических центрах.

В процессе картирования участка хромосомы 8q24.1 были получены новые диагностически ценные ДНК-маркеры, новые STS и EST, в общей сложности секвенировзно около 10 т.п.н. Полученные результаты могут быть использованы для дальнейшего картирования этого района и являются укладом в ГНТП России "Геном человека".

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на ежегодных конференциях ГНТП России "Геном человека" в 1991, 1992, 1993, 1994 и 1996 гг., на I Российском съезде общества медицинских генетикоп в 1994 г., на ежегодных европейских конференциях по генетике человека: в 1993 г. (Барселона, Испания), в 1994 г. (Париж, Франция), в 1995 г. (Берлин, Германия), в 1996 г. (Лондон, Великобритания), на втором рабочем совещании по картированию хромосомы 8 в 1994 г. (Оксфорд, Великобритания), на научных семинарах МГНЦ РАМН Координационным Межведомственным Советом по приоритетному направлению "Науки о жизни и биотехнология" фрагменты работы признаны лучшим исследованием за 1995 г. по ГНТП России "Геном человека"

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Хромосомы человека имеют критические сегменты, повреждение которых на микроскопическом и субмикроскопическом уровнях вызывают определенные синдромы МВПР. Предложен алгоритм анализа таких районов.

2. Синдром Лангера-Гидиона является синдромом генных последовательностей и возникает в результате делеции критического сегмента хромосомы 8q24.1. Вероятными локусами локализации ТРФС-1 типа является D8S98, а МЭХД - D8S67. Клонирован и охарактеризован фрагмент предполагаемого гена-кандидата МЭХД (ЕХТ1).

3. МЭХД является гетерогенным заболеванием. Второй ген МЭХД (ЕХТ 2) картирован в участке хромосомы 11р12, в локусе D11S903.

4. Синдром WAGR является синдромом генных последовательностей и возникает в результате делеции критического сегмента хромосомы 11р13. Изолированные аниридия и нефробластома являются результатом субмикроскопических перестроек критического района и мутаций в соответствующих генах. Описаны новые точковые мутации в гене аниридии (РАХ6).

5. Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана вызываются структурными и функциональными нарушениями критического района хромосомы 15(я11.2-я13), в локусах 015Э13 и Б^РМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ВЫСОКОРАЗРЕШАЮЩИЕ МЕТОДЫ ХРОМОСОМНОГО АНАЛИЗА В КЛИНИЧЕСКОЙ ЦИТОГЕНЕТИКЕ.

Метод прометафазных хромосом, разработанный Yunis (1978) практически революционизировал клиническую цитогенетику, увеличив разрешение обычного анализа на порядок.

В решении задач практического использования хромосом на ранних стадиях митоза наибольшее значение имеет обнаруженная нами вариабельность гомологичных хромосом. Это делает проблематичным использование хромосом на ранних стадиях митоза (более 850 сегментов) при рутинных клинико-цитогенетических исследованиях. Использование анализа прометафазных хромосом целесообразно для уточнения локализации точек разрыва в случаях структурной хромосомной патологии, для более детального анализа морфологии хромосомы, в случае подозрения на хромосомную патологию и при заболеваниях, где с высокой вероятностью ожидается микроструктурная патология. Оптимальным критерием его проведения соответствуют раннеметафаэные хромосомы, имеющие 500-600 сегментов на гаплоидный набор (Залетаев и др., 1986). Повышение точности цитогенетических . исследований стало основной компонентой в изучении хромосомных болезней и неклассифицированных комплексов МВПР. Тонкие структурные перестройки, представленные микроделециями, микродупликациями, парацентрическими инверсиями, небольшими транслокациями равных по величине участков и необнаруженные на метафазных хромосомах, были выявлены высокоразрешающими методами.

Нами накоплен большой фактический материал по использованию прометафазных хромосом в клинико-цитогенетических исследованиях и, особенно, в диагностике целого ряда так называемых менделирующих синдромов и неклассифицированных комплексов МВПР, сопровождающихся микроструктурными изменениями хромосом. На сегодняшний день выявлена этиология более 20 менделирующих нозологических форм, при которых выявлены специфические микроструктурные перестройки.

Эти синдромы МВПР и злокачественные новообразования, сопровождающиеся хромосомной патологией создают неоценимую базу для

картирования и клонирования генов и генных последовательностей, — повреждение" в которых, приводит к тому или "иному патологическому фенотипу (ЭсЫпге!, 1988; Залетаев и др. 1989; Мпка\л/а, 1990).

Нами, с использованием высокоразрешающих методов хромосомного анализа, обследован ряд больных с синдромальными формами ВПР. Нозологические формы, число обследованных и выявленные аномалии кариотипа представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1.

Менделируюшие синдромы МВПР н злокачественные новообразования, обследованные иысоко разрешающими методами

цитогенетики. _ __

Нозологические формы Обследовано Аномалии карь отипа

с-м К. де Ланге 12 1

с-м Видеманна-Беквита 21 1

с-м "Кошачий глаз" 3 1

с-м Прадера-Вилли 98 66

с-м Ангельмана 14 2

с-м Лангера-Гидиона 10 10

с-м Трихо-рино-фаланговый I типа 4 2

МЭХД 63 -

с-м \VAGR 15 15

Аниридия с аномалиями развития 67 4

Нефробластома с аномалиями развития 41 2

Ретинобластома 66 6

с-м МЭН-2В 4 I

Феохромаци тома 20 1

с-м Рубинштенна-Тейби 9 1

с-м Сильвера-Рассела 3 1

с-м Крузона 4 -

с-м Смита-Магениса 2 2

Таблица 2.

Единичные хромосомные аномалии, выявленные в ряде мсидели-руклцих синдромов МВПР и новообразований.

Нозологическая форма Формула кариотипа

К. де Ланге 46,ХХ,с1ег(21),НЗ;21)(я27.1:рП.!)

Видеманна-Беквита 46,X У4ег( 18), 1(11; 18)(р 15.3;Ч21,3)ра1

Рубишнтейна-Тсйби 46,ХУАф(1б)(р13)

Силпера-Расеела 46,ХУ,г(15)

Смита-Магениса 46,Х(Х)У,(1е1(17)(р11.2)

"Кошачьего глаза" 47,ХХ,+<1ег(22),с1е1(22)(ч22-ч1ег)

Ретинобластома 46,ХУ,ае1(13)(ч14-ч22) .

46,Х(Х)У^е1(13)(я14.1)

МЭН-2В 46,ХУ,ае1(10)(Ч11.2-Ч12)

Феохромоцитома 46,ХХ,<1с1(20)(р12.2)

Больные, с уже установленным диагнозом, поступали из Научно-поликлинического отделения МГНЦ РАМН, ВОНЦ РАМН, Института педиатрии и детской хирургии МЗМП РФ, ЦИТО им. Приорова МЗМП РФ, Института психиатрии МЗМП РФ, ЭНЦ РАМН, Республиканской детской клинической больницы и федеральных медико-генетических центров.

Высокоразрешающий хромосомный анализ позволил выявить хромосомную патологию в 100% случаев синдрома Лангера-Гидиона, \ZVAGR и Смита-Магениса. В частности, микроделеция короткого плеча хромосомы 17р11.2 и фенотипические проявления были описаны нами задолго до того, как этот кпинико-цитогенетический синдром стал именным (Залетаев, Маринчева, 1984). Хромосомные аномалии выявлены в 66% у больных с синдромом Прадера-Вилли, в 50% - у больных с трихо-рино-фаланговым синдромом I типа, в 21% - при синдроме Ангельмана, в 10% - при ре-тинобластоме, в 6% - при нефробластоме и в 5% - при аниридии. При других синдромах выявлены единичные хромосомные аномалии. В общей сложности, выявленная частота хромосомной патологии в настоящем исследовании составила около 25%.

Ряд синдромов МВПР, при которых хромосомная патология предполагалась с высокой вероятностью, некоторые нозологические формы, входящие составной частью в эти синдромы, не показали хромосомной патологии даже при использовании тонких методов цитогенетики, что может свидетельствовать и о генетической гетерогенности заболевания и о недостаточном разрешения данного метода. Это заставило использовать методы молекулярной биологии, имеющие разрешение на несколько порядков большее. В тоже время, высокоразрешающий уровень конденсации хромосом является прмежуточным звеном между цитогенетическим и молекулярно-биологическим уровнем анализа генома.

Использование молекулярных методов в клинико-цитогенетических исследованиях имеет двуединую цель. Первая - чисто практическая -обнаружить субмикроскопическую структурную патологию на уровне ДНК, описать ее в терминах молекулярной биологии и охарактеризовать наименьший критический сегмент, вторая - более теоретическая - выявить в критическом сегменте ген/ы, повреждения которого формируют патологический фенотип, выяснить его структуру, закономерности функционирования в норме и патологии, выявить спектр мутаций и, благодаря этому, понять этиопатогенетический механизм возникновения конкретного заболевания.

Практически любая, выявленная микрохромосомная аномалия, сопровождающаяся характерным патологическим фенотипом, вносит свой

вклад в картирование генов наследственных болезней, облегчая задачу по их хромосомной локализации и является необходимым инструментом в стратегиях "позиционного" клонирования и "позиционного гена-кандидата". Клонирование точек разрыва и определение наименьшего участка перекрывания делеций позволяет значительно ускорить процесс от постановки цитогенетического диагноза до клонирования искомого гена.

Возможности молекулярно-биологических методов в анализе критических районов, в диагностике и характеристике микроструктурной и субмикроскопической хромосомной патологии продемонстрированы в настоящей работе на примере изучения синдромов Прадера-Вилли, Ангельмана, WAGR, ТРФС-1 и II типов и МЭХ^.

2. АНАЛИЗ КРИТИЧЕСКОГО РАЙОНА ХРОМОСОМЫ 8q24.1 ПРИ ТРФ СИНДРОМАХ I и II ТИПОВ И МЭХД.

Синдром Лангера-Гидиона (СЛГ) или трихо-рино-фаланговый синдром II типа (ТРФС-II) - редкое генетическое заболевание, описанное впервые в 1969 г. (Langer, 1969). Популяционная частота синдрома не определена, в литературе описано около 80 случаев. Тип наследования не установлен, предполагается аутосомно-доминантная передача заболевания, т.к. известно только три семейных случая (Murachi'et al.,1981, Shabtai et al., 1985, Brenholz et al., 1989). Практически у всех больных выявляется микроделеция хромосомы 8q24.1.

Фенотип СЛГ складывается из 4 основных диагностических признаков: тонкие редкие волосы на голове, бульбообразный нос, конические эпифизы фаланг и множественные экзостозы (МЭ). Кроме этих признаков больные имеют целый комплекс микроаномалий: высокая пиния роста волос на лбу, широкие редкие брови, глубоко посаженные глаза, широкая и уплощенная переносица, фильтр длинный и уплощенный, верхняя губа тонкая, макростомия, высокое небо, нарушение роста зубов и их прорезывания, микроретрогнатия, череп микроцефальной формы, ушные раковины большие, оттопыренные, низко расположенные, различные степени умственной отсталости. Характерна патология скелета: низкий рост, искривление позвоночника, незаращение дужек позвонков, гипоплазия ребер, крыловидные лопатки, гиперподвижность суставов. МЭ развиваются до 4-х лет,обладают высокой скоростью роста и располагаются везде, где есть растущий хрящ ( Buhler et al., 1984; Залетаев, 1987). Случаев озлокачествления экзостозов при СЛГ не описано. ТРФС-1 типа, описанный в 1966 г. (Giedion, 1966), так же довольно редок, описано около 400 случаев этого заболевания. Частота в популяции неизвестна. Предполагается

аутосомно-доминантный тип наследования, имеется описание более 30 семейных случаев (Beals, 1973, Sugiura et al.,1976, Naritomi et al., 1989). В ряде случаев выявляется микроструктурная патология хромосомы 8q24.1.

Фенотип ТРФС-1 типа практически идентичен таковому при СЛГ, за исключением отсутствия МЭ (Buhler et al., 1984). Больные, как правило, интеллектуально сохранны.

Множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) распространенное наследственное заболевание, с частотой в разных популяциях от 1:50000 до 1:90000 или 1 на 7000 ортопедических больных, на его долю приходится 27,4% всех доброкачественных опухолей, опухолеподобных и дислластических поражений скелета. Заболевание имеет аутосомно-доминантный тип наследования, очень велика доля семейных случаев - до 80%. Пенетрантность составляет 100%. Описано шесть случаев хромосомной патологии в районе хромосомы 8q24.1.

МЭХД проявляется к 4 годам и представавлена генерализованными формами поражения скелета с многочисленными прогрессирующими деформациями костей и суставов, укорочением и вторичными изменениями костей, вторичными изменениями в мышечной системе. К 18-20 годам рост МЭ прекращается. Серьезным осложнением является трансформация отдельных экзостозов во вторичную хондрому и/или хондросаркому (25% и 5%, соответственно) (Берглезов, Раззоков, 1985; Matsuno et al.,1988). Умственной отсталости при МЭХД, не наблюдается.

В 1995 г. описаны больные с МЭ, комплексом аномалий развития, умственной отсталостью, сопровождающиеся хромосомной патологией в коротком плече хромомосомы 11 (van Hui et al., 1995). Этот симптомокомплекс получил название DEFECT 11 синдром (Bartsch et al., 1996).

Основная масса МЭ при МЭХД по структуре и расположению Идентичны таковым при СЛГ и DEFECT 11.

СЛГ практически объединил в себе фенотипические проявления ТРФС-1 типа и МЭХД. Видимо, ТРФС-1 и МЭХД - самостоятельные генные локусы, расположенные в непосредственной близости в сегменте хромосомы 8q24.1, каждый из которых, имеет независимое аутосомно-доминантное наследование, а СЛГ представляет собой делецию обоих генов.

2.1. Цитогенетическая характеристика критического сегмента хромосомы 8q24.1.

Нами был проведен высоко разрешающий хромосомный анализ у 10 больных с СЛГ и у четырех больных с ТРФС-1, результаты которого

представлены в таблице 3.

- Все больные" с~С ЛГ имели цитогенетически определяемые делеции участка хромосомы 8q24.1, но слегка различающиеся по длине. Минимальная делеция повреждала только сегмент 8q24.12, а максимальная - Ь(ц23-ц2Л.2). Наименьшим районом перекрывания делеций является область на границе двух сегментов - ц24.12 и д24.13. В двух случаях ТРФС-1 из 4 также обнаружена микроделеция критического района.

Тонкий кариотипический анализ показал, что, несмотря на то, что делеции

Таблица 3.

Результаты хромосомного анализа пациентов с ТРФС-1 и II._

Пациенты Синдром Формула кариотпа

1. СЛГ 46,ХУ,с1е1(8)№4.11 ^24.13)

2. СЛГ 46,ХУ,сЬе1(8)(я24.11 ^24.2)

3. СЛГ 46,ХУ,с1е1(8)№4.11 ^24.12)

4. СЛГ 46,ХХ,с1е1(8)№3^24.12)

5. СЛГ 46,ХХ,с!е1{8)(я24.11-ц24.2)

6. СЛГ 46,ХУ,с)е1(8)^24.11^24.13)

7. СЛГ 46,ХУ,с!еК8)№3-ч24.13)

8. СЛГ 46,ХУ,с)е1(8)(я24.12)

9. СЛГ 46,ХХ^е1(8)(я23-р24.2)

10. СЛГ 46,ХУ,с1е1(8Кя24.1),т5(1;8)(р36;р22)

11. ТРФС-1 46,XX

• 12. ТРФС-1 46,ХУ

13. ТРФС-1 46,ХХ,с(е1(8)^24.11-я24.12)

14. ТРФС-1 46,ХУ,ае1(8)(я23^24.12)

по величине и локализации практически не отличаются от таковых при СЛГ, все-таки, они располагаются немного проксимальней и "критический" сегмент 8ц24.13 не затрагивается.

Проведено цитогенетическое иследование с использованием высокоразрешающих методов 52 больных с МЭХД, но хромосомных аномалий не выявлено.

В связи с тем, что в ряде случаев СЛГ и ТРФС-1. структурной хромосомной патологии диагностировать не удается, СЛГ является прекрасной моделью для картирования генов, а критический район 8q24.1 недостаточно изучен, возникла необходимость его картирования.

2.2. Картирование критического участка хромосомы 8я24.1.

Полиморфные ДНК'Маркеры.

Была проведена работа по поиску полиморфных ДНК-маркеров в области хромосомы 8q24.1. Выявлены два космидных субклона, показавшие наличие

полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Субклон 49С2Н14 имеет два диаллельных полиморфизма. Один из них выявляется ферментом Seal. Молекулярная масса аллелей:

А1=5,0 т.п.н., А2=5,2 т.п.н. Гетерозиготность составила 43,3%, частота аллелей: А1= 61,7% А2=38,3%, PIC = 0,36. Исследование проведено на 60 нормальных неродственных хромосомах. Второй полиморфизм определяется по ферменту Taq I. Молекулярная масса аллелей: В1=1,5 т.п.н., В2=1,3 т.п.н. Гетерозиготность составила 34,4%, частота аллелей: В 1=76%, 82=33%, PIC = 0,37.

Исследование проведено на 64 нормальных неродственных хромосомах.

Другой субклон - 10G8R27, показал наличие диаллельного полиморфизма по ферменту Dra I. Молекулярная масса аллелей: А1=4,9 т.п.н., А2=4,7 т.п.н. Гетерозиготность составила 27%, частота аллелей: А 1=64%, А2=36%, PIC = 0,355. Исследование проведено на 22 нормальных неродственных хромосомах.

Выявлено несколько уникальных субклонов, которые достаточно равномерно распределены в наименьшем участке перекрывания всех делеций (SRO) и могут быть использованы в эксперементах по дозовому анализу и характеристике делеций по длине в случае микроделеций при СЛГ и ТРФС-1.

В процессе изучения ДНК-маркера 49С2Н14, был выявлен несовершенный комплексный тетрануклеотидный повтор, имеющий структуру:

ТТСТТТТТТСТТТТСтТТ(СТТТ)49СТТТТТ(СТТТ)43СТТТТТ(СТТТ)45СТ (ССТТ)42СГСТТТ)42СТТСТТТС(СТТТ)49СТ(ССТТ)42С(СТТТ)44(ССТТ)46СС ААТ(ССТТ)45С(СТТТ)45(СТ)42(СТТТ)42СТТСТТТСТТТТТТААА

Анализ 120 хромосом контрольных индивидов показал высокую гетерозиготность маркера - 90%. Выявлено 17 аллелей, размах вариабельности которых составляет 58 п.н. Маркер имеет менделевское наследование и может быть использован для нализа сцепления. Экстремальные аллели и ряд промежуточных были клонированы и секвенированы. Наибольшему изменению подвержены первые 3/4 повторяющейся последовательности, как по количеству повторяющихся единиц и их композиции, так и по нуклеотидному составу. Поэтому, достаточно сложно говорить об определенных аллелях и их частоте. Полиморфизм обусловлен либо неравными обменами участков в процессе рекомбинации или происходит обмен подобных фрагментов из анапогичных повторов. Возможная причина второго явления - воздействие рет-ротранспозонов, сайт интеграции которых выявлен возле элемента ССААТ. Обнаруженный повтор является наиболее протяженным и информативным из описанных ранее в районе хромосоы 8q24.1.

Полученные нами полиморфные и неполиморфные ДНК-маркеры являются совершенно новыми, достаточно хорошо~ охарактеризованы, удобны в работе и могут быть использованы как для картирования конкретного участка хромосомы 8, так и для проведения процедур ДНК-диагностики.

Основной стратегией физического картирования генома остается получение и характеристика секвенированных маркерных участко (STS) (Ward, Davies, 1993). Нами получено 12 новых STS в различных локусах критического района хромосомы 8q24.1. Анализ базы данных (Genbank, ИМБ РАН) показал, что чти последовательности не имеют гомологии с прокариотами и вирусами, и могут служить STS.

Наличие ДНК-маркеров и рабора STS позволило перейти к следующему этапу исследования - характеристике длины делеций и поиску наименьшего участка перекрывания всех делеций (SRO) у больных с СЛГ и ТРФС-t.

% I

2.3. Делеционное картирование критического района хромосомы 8q24.1.

Первоначально был проведен молекулярный анализ у двух больных с СЛГ, имеющих делецию, и 5 больных с МЭХД без таковой (Залетаев и др., 1989). ДНК-маркером служил фрагмент клеточного онкогена с-тус, соответствующий 3-ему экзону, картированный в участке 8q24.13. Анализ геномных блотов больных с МЭХД не выявил изменений. Только в одном случае СЛГ обнаружены перестройки онкогена с-тус при использовании различных рестриюаз, что свидетельствует о повреждении этого участка де-лецией.

Для более подробной характеристики делеций у пациентов с СЛГ и ТРФС-1 по длине и выявления SRO были проведены эксперименты по анализу дозы гена с использованием уникальных ДНК-маркеров:

10G8R27 (D8S98), L48 (D8S51), и 144Н12.3 (D8S67), В качестве референсного маркера был использован ДНК-зонд pML34 (D15S9), картированный на хромосоме 15. Радиоавтографы оценивали визуально и с помощью денситометра.

Анализ показал, что все больные с СЛГ имеют только одну дозу гена по всем тестируемым маркерам. Трое больных с ТРФС-1 имели делецию локуса D8S98 и двое из трех имели делецию локуса D8S51, в то время как локус D8S67 был неповрежден. Это подтверждает наше предположение, что гены, отвечающие за формирование фенотипа ТРФС-1, располагаются проксимальнее, а ген МЭХД - дистальнее, в участке перекрывания делеций при СЛГ. Таким образом, делеционное картирование позволило сузить

область поиска гена МЭХД и начать его с области локуса D8S67. Результаты делеционного картирования и физическая карта критического района представлены на рисунке 1.

Исследование ПДРФ в семьях с СЛГ, ТРФС-1 и МЭХД было проведено с целью выяснения происхождения делеций, возможной характеристики величины делеций и для поиска сцепления полиморфных маркеров с МЭХД. В исследование был взят ДНК-маркер, полученный нами -49С2Н14 (ПДРФ по Seal и Taql) и соответствующий локусу D8S67, а также полиморфные маркеры L1 (D8S42), L47 (D8S50), L48 (D8S51), любезно предоставленные Д-ром Horsthemke. Анализ ПДРФ в семьях с СЛГ и ТРФС-1 подтвердило результаты делеционного картирования,, показав, что у больных с ТРФС-1, в отличие от больных с СЛГ, локус D8S67 не поврежден делециями.

Исследование полиморфных маркеров в семьях с МЭХД дало неожиданный результат. В четырех семьях у больных маркер 49С2Н14 при гидролизе ДНК ферментом Taql показал наличие дополнительного гибридизационного сигнала в области 6,8 т.п.н. Анализ еще 27 больных с МЭХД, с использованием. ДНК-зонда 49С2Н14 не выявил подобных изменений. Однако, в одной семье с тремя больными показано изменение в гибридизационном рисунке как на лимфоцитах, так и в секционном материале экзостоза. Анализ позволяет заключить, что произошла делеция, захватившая около 2 т.п.н. в области ДНК-маркера 49С2Н14 и составившая около 8 т.п.н.

По-гидимому, перестройки повреждают один или несколько сайтов узнавания для фермента Taql. Использование ДНК-зонда 49С2Н14 в целях ДНК-диагностики может оказаться весьма продуктивным. В тоже время, ни у одного из больных с ТРФС I и II не выявлено каких-либо изменений, что может являться косвенным подтверждением тому, что предполагаемый ген МЭХД локализован именно в этом локусе. Семьи с МЭХД были изучены с использованием высоко полиморфного тетрануклеотидного повтора. Анализ аллелей у больных показал такой же высокий уровень вариабельности - 13 аллелей, а показатель гетерозиготности - 93%. В 16 семьях наблюдалось наследование без рекомбинационных событий. Во всех 22 обследованных случаях МЭХД и в секционном материале экзостоза и хондросарком повтор не подвергается каким-либо специфическим изменениям и, по-видимому, не несет явной функциональной нагрузки. В двух семьях у больных с СЛГ выявлена потеря гетерозиготности. Т.о. ДНК-маркер является диагностически ценным для косвенной пренатальной или пресим-птоматической ДНК-диагностики МЭХД и в случаях дифференциальной диагностики СЛГ и ТРФС-1.

к.

ДНК ЯРЬР/ " хромосом- расстояние__лелсиии космидш.к- полученные

-маркеры КТК ным локус м.п.н. СЛГ ТРФС \ОХД клоны поклоны

У/ 1,2

!. I Ь47

1(Ю8Я27

(СА)п 6 аллелей

Ншс1 Ш М^ 1

08Э98

М8

Бас!

088121

088592 088352 088100'

М5 (СТТТ)п/(СС1Т)п Г)8867 17аллелей 088101 088527

Ь24

08848

08847

08в199

08Э269

085568

(СА)п 5 аллелей

ОАРЛ1

с36Й1 40кЬ

С49С2 /40кЬ

с1Ш'9 40кЬ

с25В8 40кЬ

с650 5 40кЬ

с81Е11 ■1ПкЬ

кЪ

С165П5 40кЬ

С9008 . 40кЬ

М07

мз

М1.7

ехоп! ! БТЯ ехоп2 ехопЗ

(е! |

Рис.1. Физическая карта района 8q23-24.11 (25 м.п.н.) и делеции при СЛГ, ТРФС-1, МЭХД.

2.4. Клонирование предполагаемого гена МЭХД (ЕХТ 1). Поиск мутаций.

Исходя из предположения, что ДНК-маркер 49С2Н14 является внутригенным или расположен в непосредственной близости от предполагаемого гена ЕХТ 1, был проведено его секвенирование. Анализ его первичной последовательности, размером в 5555 п.н. с использованием различных компьютерных программ (Autogene, PC-GENE, Genebank) позволил выявить несколько функционально значимых элементов (Рис.2).

NF-A3

OctR Oct3,4,5

АР2 АР2 Oct3,4,5 CTF AP2

I ill Ii II '' V ■ 1111 ■'■'■•■: i

кДНК 02456

800 1600 2400 3200 4000 4800 5600

[ I - последовательность /IHK-маркера I I - промоторный район El - последовательность 5'-UTR

- последовательности вероятных экзонов * - сайты фермента рестрикции Taq 1 Рис. 2. Расположение функциональных элементов в последовательности ДНК-маркера М5 и кодирующей последовательности кДНК 02456.

Выявлено три сайта связывания АР2, белка, выполняющего функцию регулятора фоновой транскрипции. Мутации таких сайтов снижают уровень транскрипции до 20% от нормального уровня (Lewin, 1994). Выявлены сайты связывания известных белков-регуляторов транскрипции: NF1, NF-АЗ, NTF1, CTF1, и бепков Oct3, Oct4, Oct5 и OctR, которые так же являются регуляторами транскрипции и имеют функцию переключения генов при дифференцировке тканей. Наличие этих маркерных районов указывает на возможную экспрессию тканеспецифических генов при дифференцировке тканей во время эмбриогенеза (Lewin, 1994). Ранее было показано, что по биохимическому составу экзостозы практически идентичны эмбрионапьному хрящу (Фещенко, 1986).

Анализ последовательности с использованием программ Autogene и GRAIL, показал последовательности трех вероятных экзонов. Они кодируют вероятную белковую последовательность в 124 аминокислоты (Рис.3).

Анализ этого белкового фрагмента по базам данных BLAST, BLITZ, FASTArTIGR показал наличие гомологии с гликопротеинами (GH3, GPa2 ). Эти белки расположены на клеточной поверхности и участвуют в образовании матрикса наружной клеточной поверхности. Гликопротеин-3 имеет сходство с рецепторами стероидных гормонов и онкогенами, Известно, что при дифференцировке хрящевой ткани происходит изменение структуры гликопротеин-гликозаминогликанового матрикса на поверхности хондроцитов. Нарушение соотношения гликопротеинов, гликоза-миногликанов и хондроитинсульфатов показано в ткани растущих экзостозов, по сравнению с нормальным хрящем (Фещенко, 1986).

181 TAAGCTCAAGGACCAAGCTGTGTTGACTTTTAGACAGATTCATTT 226 AACCTTTCTACACCTCGATTTCCCCATTTGTTAGAAAAAATATTG 271 AACATCCAACTTCTGGGAGTTCAAGGAACACTTGGGGATTGGTAA 316 GTGTCAGTGCAGGCACACAGTAGGGGTCAGTAAATCTTAATTCAA 361 TCAATTAGGAACACTGTTTTGGGGGCGGGGGGGTAGGCATTGGAG 406 GCAAAGTTCCAGGGACAAAGGAAGGGAGGTTCAGCTGGCGGGAAA 451 AAAAAGGGAGGGAAAGAGAGAGAGCGATAAAATTACGTTGTATGA 4 96 GAATGTTGTGGTTGTTTTCATGCCTGTGTCTCTAAGAC 534 AAATCAGCAACATGGAACATTTGCAAACAC.TTGATCCACACCAAG 1 KSATWNI CKHLIHTK ЭКЗОН 1

580 ACGTCTGGAGAAGGCCCCAAGGGAGAGCTGCTCCGTTCTGCCCTC 16 -TSGEGPKGELLRSAL 625 CCTTCAGGCCAGCTGGGGGTGCCTCACTTGTTTCCAATCCTAAAT 31 PSGQLGV PHLFPILN 670 CATTTGTTGTCAAAGAATTCCATGGACAGAAGCAGCGACTGCAGC 46 HLLSKNSMDRSSDCS 715 TCAGCGCTCAAGCAC 61 S A L К Н

729 GTGCACACCTTCCTGCGTTTCCTTGAGACAACATCACACTTCAGC

774 ACACAGCAGGAGTGCTTTATGTATACTTCCCATTTCCCAATATTT. . .

3554 TATAGGTCACTGTCTGGTTGCAGCCACATGAGAGCCCTGAGCAAG

66 YRSLSGC SHMRALSK ЭКЗОН 2

3599 ACCATCCAGCTAAGCCCAGTTATCCCTCAGAACCATGAG AG

81 TIQLSPVIP QNHE

364 0 GTAATAACAAAGTGATGATGTTGTTGTAGGCTACTACATTTTTAG

3685 CATGCTCGCTTACAGTCAGÄGATCACAGTGCGTATACATGGGTGGG. . .

4 304 CGACATGGATGGAACTGAAGGTCATTATCTTAAGGGAAACCACXCA

94 SDMDGTEGHYLKGNHS ЭКЗОН 3

4350 GACACAGAAGAACAACTACTGCATGTGCTCACTTACAAA

110 DTEEQLLHVLTYK

4 389 TGAGAGCTAAATAATATGTCTACATGGACATAGACTGTGGAATGG 4 4 34 ACAACAGAGATTCAGAAAGGTGAGAGGATGTGAGGGCGATGAATG... 4 614 GAAAGCCTAGATTTGAACCCACTTATTAGTXGCTTGACTTTGAGA. . .

Рис.3. Расположение вероятных экэонов t последовательности ДНК-маркера М5 и первичная последовательность фрагмента предсказанного пептида. Жирным шрифтом выделены ориентированные "наружу" праймеры.

ДНК-маркер 49С2Н14 был использован в скрининге кДНК-библиотек, полученных из фетального мозга (любезно предоставлена Д-ром Lehroch, ICRF) и из тканей печени, легкого, почек (любезно предоставлена Д-ром Willems, Университет г. Антверпен). Скрининг тканеспецифической библиотеки не позволил выявить кДНК-клонов, а в результате скрининга кДНК-библиотеки ICRF было получено 14 клонов. Перекрестная гибридизация, секвенирование и компьютерный анализ позволил дискриминировать 11 клонов, оставшиеся ß клона были локализованы на частично перекрывающихся космидных клонах 49С2 и 166F9, в жестких условиях гибридизации. Один из них содержал протяженный (СТТТ)п повтор, но последовательность не имела гомологии с ДНК-маркером 49С2Н14. Два клона оказались идентичными при секвенировании, имели гомологию с геномным клоном на протяжении 90 п.о. и соответствовали третьему предсказанному экзону (Рис.2)..

Компьютерный анализ по базам данных BLAST и TIGR так же показал гомологию с гликопротеинами.

Экзон-интронная структура клонированного фрагмента позволила осуществить поиск возможных мутаций, приводящих к МЭХД. Ко всем трем экзонам были сконструированы праймеры и подобран режим амплификации. Анализ SSCP показал отсутствие каких-либо изменений в 1 и 3 экзонах. Во втором экзоне у 7 больных выявлено изменение в подвижности одной из цепей. В семейных случаях такое же изменение было выявлено и у пораженных родителей. В 24 контрольных образцах ДНК изменений не отмечено. Интересно, что аномалии выявлены в трех семьях, показавших ранее дополнительный гибридизационный сигнал при блот-гибридизации. В общей сложности нами выявлены изменения изучаемого района в 9 семьях из 22 (Рис. 4), что составляет около 40%. Таким образом, можно с осторожностью предположить, что нами клонирован фрагмент гена белка клеточного матрикса, мутации в котором могут вызывать МЭХД.

По данным литературы известно, что предполагаемый ген МЭХД клонирован в непосредственной близости от изучаемого нами локуса (Ahn et al, 1995). Предполагаемая аминокислотная последовательность не показала гомологии ни с одним из известных белков, также, как и

го

М О (1 | М О п

1 2 з

Ьт 'Л4 1 7 кЬ

тЩ

1.0 к Ь

12 3

-I

. ,л

■I :\1

. У т

456789ННН

г ¡пг^г]! 11П; - ¡И: ^ и И:'.

* ч- I * '- '1 • 1 IЛ !

11 1

Рис. 4. Нарушение в локусе 08567, выявленные у больных с МЭХД

A) дополнительный гибридизационный сигнал : М-мать, О- отец, П- пробанд

Б) Изменение гибридизационного рисунка: 1) контрольная ДНК;

2) ДНК экзостоза; 3) ДНК лимфоцитов больного МЭХД

ДНК гидролизована ферментом Тац-1, ДНК- маркер 49С2Н14

B) Анализ вероятного экзона 2 методом ЭЭСР 1-9 ДНК больных, Н- ДНК нормальных индивидов, стрелкой обозначены мутации

нуклеотидная последовательность не обнаружила сходства с известными генами (Ahn et al., 1995, Luedecke et al., 1996). Поиск мутаций в гене у 25 больных с МЭХД позволил выявить только две идентичных мутации -однонуклеотидные делеции, приводящее к возникновению стоп-кодона.

Мы использовали олигонуклеотидные праймеры и условия амплификации, указанные в статье (Ahn et а!., 1995), для тестирования наших 20 больных и 3 образцов ДНК из секционного материала экзостоза и хондросаркомы в целях выявления подобной мутации. Выявить каких-либо изменений этого района у наших больных не удалось. Не выявлено мутаций и в 12 бельгийских семьях с МЭХД, сцепленных с участком хромосомы Cq24.1.

Был проведен другой вариант поиска мутаций в этой последовательности, заключавшийся в блот-гибридизации полноразмерной кДНК-последовательности предполагаемого гена ЕХТ1 (любезно предоставлена Д-ром Horsthemke) с геномной ДНК, гидролизованной ферментом Taql, у 20 пациентов с МЭХД. Изменений гибридизационного рисунка, по сравнению с контрольными образцами, не произошло. Результаты поиска мутащй в уже клонированном гене заставляют усомниться в его причастности к МЭХД.

В целях поиска возможных мутаций, приводящих к озлокачествлению МЭ, нами проанализированы образцы ДНК, полученные из лимфоцитов, из секционного материала экзостоза одного больного, лимфоцитов и хондросаркомы, развившейся из экзостоза, второго больного, лимфоцитов и спорадической хондросаркомы у третьего, с использованием нашего полиморфного ДНК-маркера 49С2Н14 .по ферментам Seal и Taql. Результаты блот-гибридизации показывают значительные изменения в гибридизационном паттерне как экзостоза, так и хондросаркомы, по сравнению с ДНК из лимфоцитов, при этом, в случае экзостоза можно предполагать гомозиготное состояние по делетированному району в 8 т.п.н., а при хондросаркоме - ПГ и значительную перестройку этого участка. ДНК из секционного материала и из лимфоцитов, была изучена на предмет изменений в повторяющейся последовательности. Явных аномалий не выявлено. В случае хондросаркомы, развившейся из экзостоза, результат неоднозначный, т.к. и в лимфоцитах и в секционном материале показано гомозиготной состояние повторяющейся последовательности, что может являться гемизиготностью. В случае спорадической хондросаркомы изменений в повторе не выявлено, что позволяет предположить иное происхождение мутации.

2.5. Генетическая гетерогенность МЭХД и картирование второго______

_____________________________гена ЕХТ 2.

В нескольких работах по сцеплению МЭХД с районом хромосомы 8q24.1 было показано, что не во всех семьях заболевание связано с хромосомой 8 (Cook et al.r 1993; Le Merrer et al., 1994; Wu et al., 1994; Blanton et al., 1996). Это послужило основанием для предположения о генетической гетерогенности МЭХД. Обнаружение микроделеции хромосомы 11р12 у больных с синдромом DEFECT 11 явилось дополнительным подтверждением этого (Bartsch et al., 1996).

Обнаружение нопых микросателлитных ДНК-маркеров в районе 11р12 позволило продолжить работу по более точной локализации второго гена МЭХД -ЕХТ 2 (Wuyts et al. 1995). В этой совместной работе с университетом г. Антверпен (Бельгия) были использованы ДНК-маркеры, соответствующие локусам D11S905, D11S1355, D11S903, D11S1361 и D11S554. Двухлокусные лод-баллы были подсчитаны между ЕХТ 2 и ДНК-маркерами с использованием программ сцепления MÜNK и ILINK. Частота аллелей была установлена как 1/п для всех маркеров, пенетрантность заболевания была оценена а 95% и частота мутаций соответствовала 0,00002. Исследовано 22 семьи. Семьи, в которых лод-балл хотя бы по одному маркеру не превышал +2, далее не анализировались. В результате анализ проводился только в 7 семьях. Комбинированный лод-балл выше трех был получен для всех ДНК-маркеров. Наиболее вероятным местом расположения гена является локус D11S903, который показал максимальный лод-балл при полном отсутствии рекомбинационных событий - 17,883.

Это было подтверждено в работах Blanton et at. (1996) и Bartsch et al., (1996), обнаруживших делецию локуса D11S903. Таким образом, второй ген-кандидат для МЭХД располагается в участке, равном 3 м.п.о. между локусами D11S1355 и D11S554, а полученные результаты подтверждают генетическую гетерогенность МЭХД.

3. ХАРАКТЕРИСТИКА КРИТИЧЕСКОГО РАЙОНА ХРОМОСОМЫ 11р13, ПОВРЕЖДАЕМОГО ПРИ ПОЛНЫХ И НЕПОЛНЫХ ФОРМАХ СИНДРОМА

WAGR.

Впервые сочетание опухоли Вилмса и аниридии было отмечено Miller и др. (1964), описавших несколько больных, у которых диагностированы: умственная отсталость, микроцефалия, двусторонняя аниридия, с сопутствующей патологией глаз, опухоль Вилмса, нефробластома и аномалии мочеполового тракта, различные степени умственного и

физического недоразвития. Среди пациентов с нефробластомой, больные, имеющие аниридию, встречаются в соотношении 1:50-70 (Pendergrass et al., 1976, Shannon et al., 1982). В то же время у 1 из 3 больных со спорадической аниридией развивается опухоль Вилмса. Синдром WAGR до 1978 года считался моногенным синдромом с неясной этиологией, возникает, как правило, спорадически и представляет собой сочетание по крайней мере двух самостоятельных заболеваний - аниридии и нефробластомы (Schmickel et al., 1986). Основная масса больных имеет микроделецию короткого плеча хромосомы 11р13.

Аниридия - порок развития глаз, связанный с аплазией или гипоплазией эктодермального пигментного слоя радужной оболочки и ее мезодермальной стромы. Наследуется аутосомно-доминантно с неполной пенетрантностью. Частота среди новорожденных составляет 1:30000. Частота спорадических форм порока состасляет 25-50% (Hittner et al., 1980; Francois et al., 1982). В ряде случаев описана такая же хромосомная патология.

Изолированная нефробластома наследуется так же аутосомно-доминантно с варьирующей пенетрантностью и экспрессивностью (Matsunaga, 1981). Двусторонняя опухоль выявляется в 20% семейных случаев и в 3% спорадических. Частота в популяции составляет 1:800010000 (Breslow et al.,1982, Francois et al., 1982). Время выявления опухоли колеблется от внутриутробного периода до 10-12 летнего возраста. Нефробластома сопровождается пороками развития мочеполовой системы у 5% мальчиков (Сотникова, 1987). Достаточно часто выявляется гонадобластома (Turleau et al., 1981). В отдельных случаях у больных с нефробластомой выявлена делеция хромосомы 11р13.

Синдром Видеманна-Беквита мы рассматриваем в контексте исследования синдрома WAGR в связи с тем, что опухоль Вилмса является самым частым новообразованием, возникающим у пациентов, а в исследовании были использованы те же подходы и ДНК-маркеры, что и для характеристики делеций при синдроме WAGR. В ряде случаев у больных выявляется дупликация хромосомы 11р15.5.

3.1. Хромосомный анализ критического района 11р13 у больных с полными и неполными формами синдрома WAGR.

Высокоразрешающими методами хромосомного анализа, обследовано 14 больных с полной формой синдрома WAGR, хромосомная патология была выявлена во всех случаях. Среди 67 больных с аниридией, сопровол',давшейся аномалиями развития, но без нефробластомы, хромосомная патология выявлена в 4 случаях. Среди 41 случая

изолированной нефробластомы и нефробластомы в сочетании с другими аномалиями развития, но без патологии глаз, цитогенетические аномалии выявлены в 2 случаях. Результаты хромосомного анализа представлены в таблице 5. Выявленные микроделеции повреждают район короткого плеча хромосомы 11 р 13, и варьируют по величине от микроструктурного изменения непосредственно в критическом районе, до, легко выявляемой, потери средней трети короткого плеча хромосомы 11. Нами впервые описаны случаи мозаичной формы делеции. У одного больного с полной формой синдрома и двусторонней нефробластомой удалось выявить уникальную несбалансированную транслок^цию хромосом 7 и 11, сопровождавшуюся делецией критического участка. Выявленная нами хромосомная патология соответствует, данным литературы как по частоте выявляемости, так и по характеру аномалий.

Таблица 4.

Хромосомные аномалии, выявленные у больных с полными и неполными формами синдрома \Л/АСК.

Формула кариотипа Число случаев

Полная форма синдрома

46,Х(Х)У,ае1(11)(р13-р15.1) 1

46,Х(Х)У,с1е1(11 )(р12-р13) 3

46,ХУ,ае1(11)(р13-р14) 2

46,Х(Х)У,ае1(11)(р13) 4

46,Х(Х)У,с1е1( 11)(р12-р14) 2

46,ХУ,<1е1(11)(р11.2-р13) 1

46,ХУ,ае1(11)(р13-р14.05),и7;11)(р15.2;р13) 1

Неполная форма синдрома (без нефробластомы)

46,ХУ,с1е1(11)(р13-р14.08) 1

46,ХУ,с1е1(11)(р12-р13) 1

46,Х(Х)У,ае1(11)(р13) 2

Неполная форма синдрома (без аниридии)

46,ХХ,с1е1(11)(р11.2-р13) 1

46,ХУМ6,ХУ,<1е1(11)(р13) 1

Исследован 21 больной с синдромом Видеманна-Беквита, в двух случаях отмечалась нефробластома. Высоко разрешающий хромосомный анализ позволил заподозрить хромосомную аномапию, выражающуюся в незначитепьном изменении сегментации длинного плеча хромосомы 18 у одного больного. Исследование кариотипа родителей позволило выявить у

отца сбалансированную транслокацию хромосом 11 и 18. Т.о. пациент имел частичную трисомию по терминальному участку короткого плеча хромосомы 11 и частичную моносомию по длинному плечу хромосомы 18: 46.XY, der(18), t{11;18)(p15.3;q23) pat.

Для подтверждения наличия хромосомной патологии, для диагностики субмикроскопической патологии и для характеристики критического района хромосомы 11р13, десять больных с полными и неполными формами синдрома WAGR, изолированной аниридией и нефробластомой и трое больных с синдромом Видеманна-Беквита были исследованы с использованием комплекса молекулярно-биологических методов. Все ДНК-зонды были любезно предоставлены д-ром Veronica van Heyningen (Институт генетики человека, г.Эдинбург, Великобритания). Расположение ДНК-зондов и результаты делеционного картирования показаны на рисунке 5.

3.2. Флуоресцентная гибридизация in situ.

Флуоресцентная гибридизация in situ была проведена на хромосомах, полученных • из лимфобластоидных клеточных линий, трансформированных вирусом Элштейна-Барра. В гибридизации in situ были использованы ДНК-зонды, картированные в участке хромосомы 11р13: DHB 2.1, JM44 (РАХ6), р60; и в участке хромосомы 11р15.5: фрагмент клеточного онкогена HarveyRasI (HaRasI), фрагмент гена инсулина (Ins). Мечение маркеров проводили биотином (bio-16-dUTP). Биотинилированный зонд выявляли FITS авидином DCS (Vector). Для амплификации сигнала использовали двух-трех кратную реакцию с биотинилированным ан-тиавидином-авидином FITS.

Все больные с синдромом WAGR, имевшие цитогенетические делеции, имели гибридизацию ДНК-зондов только с одной хромосомой (Табл.5). Трое пациентов с аниридией показали интактность локуса гена РАХ6. В случае аниридии, сопровождающейся аномалиями развития была показана депеция локуса гена аниридии (РАХ6), в то время как область гена нефробластомы (WT1) оказалась неповрежденной. В случае изолированной нефробластомы показана делеция области гена WT1 и сохранность области гена РАХ6. Пациент с синдромом Видеманна-Беквита и частичной трисомией короткого плеча хромосомы 11 показал наличие трех гибридизационных сигналов (один в длинном плече хромосомы 18) по маркерам, картированным в этой области, что подтверждает нашу интерпретацию перестройки. Двое других больных не показали аномалий тестируемого района.

15.5

15.4 15.3

15.2 15.1

________________________Делений

ГеньГ ДИК - сайты расстояние ————————

_маркеры Not 1 kb_WT An_УУАСЦ

1 2

HaRasi INS HBB

Cale

14.3 14.2

14.1

11.2 11.1

Jm44

Й;

PAX6 p5/p60 VVT1

СМ

WT33 _ WT20 В ..

NBC12 DHB2.1

3500 kb

1400 kb

325kb

375 kb

500 kb

150 kb

300 kb

Ссп11р

Рис. 5 Физическая карта короткого плеча хромосомы 11, и делеции района 11р13-15

4,5

i Ш

1 ¡

tJV Щ

'•fe- Ö

sí

-1 Щ

l; h ?

V- I'} Ii

1 bud g

i i i

3.3. Анализ ДНК-маркеров посредством дозовой блот-гиб-ридизации.

В целях молекулярной диагностики субмикроскопических аномалий и характеристики по длине цитогенетически выявленных делеций был проведен дозовый блот-гибридизационный анализ с использованием уникальных ДНК-зондов, картированных в критическом районе: р5, NBC 12, JM44. В качестве референсного ДНК-зонда использован фрагмент гена кальцитонина (Cale). Анализ радиоавтографов проводили с использованием

денситометра.

Таблица 5.

Результаты гибридизации in situ у исследуемых пациентов.

Пациенты \ ДНК-зонды DHB2.1 Р60 JM44 Ins HaRasI

1. Ан. del11(p13)? НТ ++ ++ нт нт

2. Ан. del11(p13) нт . ++ + ++ нт

3. Ан. 46,XX нт нт ++ нт нт

4. WAGR dell 1 (р 13-р 15.1) + + + ++ ++

5. WAGR del11(p13) ++ + + нт нт

6. WT dell 1(р11.2-р13) + + ++ нт нт

7. Ан. 46,XX нт нт ++ нт нт

8. Ан. 46,XX нт нт ++ нт нт

9. WAGR del11(p12-p14) + + + нт нт

10. WAGR del11(p12-p14.2) + + + нт нт

11. ВВС der(18),t(11;18) нт ++ нт +++ +++

12. ВВС 46,XY нт нт нт ++ ++

13. БВС46.ХХ нт нт нт ++ ++

+ - наличие одного гибридизационного сигнала, ++ - двух, +++ - трех, нт - локус не тестировался

Таблица 6.

Результаты дозового анализа у исследуемых пациентов.

Пациенты \ ДНК-зонды PS NBC12 JM44 Cale

1. Ан. del 11 (р 13)V ++ нт ++ ++

2. Ан. del11(p13) ++ нт + ++

3. Ан. 46,XX нт нт ++ ++

4. WAGR dell 1(р13-р15.1) + + + +

5. WAGR dell 1(р13) + + + ++

6. WTdel11(p11.2-p13) + + ++ ++

7. Ан. 46,XX нт нт ++ ++

8. Ан. 46,XX нт нт ++ ++

9. WAGR dell 1(р12-р14) + + + ++

10. WAGRdel11(p12-p14.2) + + + ++

11. 5BCder(18),t(11;18) нт ++ нт ++

++ - наличие двойной дозы маркера, + - наличие одной дозы маркера, нт - локус не тестировался.

В целом, проведенный анализ подтвердил" результаты цито-генетического анализа (Таол.6). Все больные с полным синдромом WAGR и цитогенетически определяемой делецией показали аличие одной копии тестируемых локусов, причем у пациента 4 выявлена делеция участка гена кальцитонина, расположенного в участке хромосомы 11р14.3. У трех больных с аниридйей патологии обнаружить не удалось, хотя у пациента 2 была

выявлена делеция небольшого участка в рэйоне локализации гена аниридии. У пациента 6 выявлена делеция участка локализации гена опухоли Вилмса, и отсутствие повреждения области гена аниридии. У пациента с СВБ и частичной трисомией 11р15.5 аномалий в тестируемых локусах не обнаружено.

Использование ДНК-зонда WT33, предположительно являющимся частью гена опухоли Вильмса, не позволило выявить патологии. Однако был обнаружен не описанный ранее ПДРФ при рестрикции ДНК ферментом EcoRI в области 10,4 т.п.н.

3.4. Анализ исследуемого района с использованием ПЦР.

Нами была разработана количественная ПЦР для характеристики делеций при синдроме WAGR. Олигонуклеотидные праймеры были подобраны из имеющихся в базе данных последовательностей, которые соответствовали: 1) фрагменту субъединицы гена гемоглобина В (НВВ), размером 355 п.н., картированного в участке хромосомы 11р15, незатрагиваемом де-лецией, и служившим референсной последовательностью - НВВ1 5' ATGGTGCACCTGACTCCTGAGG; НВВ2 5' GCCATCACTAAAGGGACCGAGC: 2) фрагменту уникальной последовательности S1, размером 120 п.н., - S1A 5' CCCTGGAAACACTTTCTGCC; S1B 5' GGCTGGGTTGGAGGCAAGG; и 3) фрагменту уникальной последовательности, соответствовавшей области 7 экзона гена нефробластомы, содержащего мотив второго цинкового пальца, размером 250 п.н. - WT1A 5' AGGTTTTTTCGTTCAGACCAGATC; WT1B 5' GGGGAAATGTGGGGTGTTTCC. Продукты реакции анализировали с использованием денситометра после электрофореза в 4% агарозном геле (NuSieve). Было показано, что продукты амплификации в контрольных образцах соотносятся, как 1:0,5:1, причем наиболее подходящим вариантом оказалось использование 27 циклов, т.к. реакция еще не выходит на плато У больных, имеющих делецию тестируемого локуса соотношения составляют 1:0,25:0,5 (Табл.7).

Все больные с нефробластомой и хромосомной патологией показапи депецию обпасти гена WT1. При аниридии патологии не выявлено. Т.о., показана принципиальная возможность создания и использования количественной ПЦР в целях диагностики микроделеций.

Таблица 7.

Результаты количественного ПЦР- анализа

Пациенты \ Олигопраймеры . НВВ

2. Ан. del11(p13)

4. WAGR del11(p13-p15.1)

5. WAGR del11p13

6. WTdel11(p11.2-p13) 9. WAGR dell 1(p12-p14)

Контроль_

++ (2,79) ++ (2,71) ++(4,21) ++ (6,78) ++ (3,54) ++ (4,39)

++(1,4) ++(1,02)

(0.66) + (1.05) + (2,01) + (0,72) ++(2,41)

+ (0,73) + (2,19) + (4,16) + (1,64) ++(4,15)

++ - наличкэ двойной дозы амплифицированного фрагмента, + - наличие единичной дозы, +++ - наличие тройной дозы, в скобках даны абсолютные значения плотности сигнала.

Проведенное исследование показывает возможности комплексной молекулярно-цитогенетической диагностики делеций при синдроме WAGR. Но такую диагностику имеет смысл проводить при неполных формах синдрома (отсутствие опухоли Вильмса), когда необходима уверенность в том, что у ребенка микроделецией не затронут ген, отвечающий за развитие опухоли. В то же время, комплекс молекулярно-биологических методов позволяет локализовать ген, повреждение которого вызывает патологию, и охарактеризовать спектр его мутаций.

3.5. Поиск и характеристика мутаций в гене аниридии (PAX 6).

Благодаря использованию стратегии позиционного клонирования ген аниридии (РАХ6) был клонирован в критическом районе, в 700 т.п.н. дистальнее гена опухоли Вилмса (Ton et al., 1991). Анализ кДНК показал, что ген РАХ6 состоит из 14 экзонов, а предполагаемый белковый продукт имеет в своей структуре "связывающий" бокс (Paired box), гомеобокс и домен, обогащенный пролином, серином и треонином, которые участвуют в активации и регуляции транскрибции (Walther et al., 1991; Glaser et al., 1992; Epstein et al., 1994) (Рис.6).

Нами была предпринята попытка поиска мутаций в гене аниридии у четырех пациентов с аниридией и сопутствующей патологией глаз, не показавших микроструктурных и субмикроскопических аномалий критического района хромосомы 11р13.

Анализ проводился на ДНК и кДНК, полученной в результате обратной транскрибции мРНК. Использовали ПЦР с вложенными праймерами. Мутации выявляли анализом гетеродуплексов, образующихся в результате ренатурации продуктов амплификации кДНК пациентов и контрольных образцов, обрабатывая их гидроксиламином и тетрахлоридом осмия с последующим секвенированием. Были использованы следущие пары праймеров:

jNotl

EcoRl

iEcoRI

IJH

IEcoRI Notl V i EcoRI FxoRÍ

tel

•1 2 3 4 АТС 5 5a 6 7 Paired box

8 9 10 11

12 13 TAA

; Horneo i: PST-rich box

box

// Белок PAX6 Páired box

Horneo box

PST-rich box

iH-

Повреждения белка PAX6

шшшш

*tw

¡g";

■JÜsUi

i fe»..1»»«

Рис.6 Структура гена PAX6 и повреждения белка, вызванные

мутациями в гене.

С139 (экзон 3) 5'- AGAGTGGACAGACATCCGAGA {внешние)

С130 (экзон 8) 5'- CTTTCTCCAGGGCCTCAAT

С127 (экзон 4) 5'- GCCAGAGCCAGCATGCAGAAC (вложенные)

С860 (экзон 8) 5'- AGCCTCATCTGAATCTTCTCC

В251 (экзон 7) 5'- TCAATAAACAGAGTTCTTCGC (внешние)

С402 (экзон 13) 5'- AATCTTGGCCAGTATTGAGAC

В509 (экзон 8) 5'- TGCCAGCAACAGGAAGGAGG (вложенные)

С401 (экзон 13)5'- ATCAGGTTCACTTCCGGGAAC

С141 (экзон 5а) 5'- CCATGCAG^TGCAAAAGTCC

У одного из пациентов был выявлен гетеродуплекс между нормальной и мутантной цепями, которые были полумены в результате амплификации ДНК экзонов с последующим электрофорезом в ПААГ. Было предположено, что произошла небольшая делеция или дупликация в 9-ом экзоне. Секвенирование продукта ПЦР выявило инсерцию двух нуклеотидов AG в одну из нитей ДНК. В результате этого сплайсинг РНК не нарушается, но сдвиг рамки считывания приводит к возникновению стоп-кодона ТАА в следующем экзоне, в 34 кодоне ниже инсерции, что приводит к обрыву белка в процессе трансляции и практически полному отсутствию С-концевой части белка. Инсерция приводит к возникновению нового рестрикционного сайта для фермента Hinfl, а следовательно, к появлению дополнительного фрагмента при обработке ферментом как ДНК, так и РНК продуктов ПЦР.

Во втором случае была проведена ПЦР с вложенными праймерами на обратно транскрибированной РНК. Удалось выявить два продукта, причем один, приблизительно, на 80 нуклеотидов короче. ПЦР на ДНК не выявила изменений, что свидетельствует о том, что делеция не представлена на уровне ДНК. Продукт РНК-ПЦР был подвергнут рестрикции ферментом Bglll, сайт которого присутствует в норме в 8-ом экзоне, длина которого составляет 83 п.н. Меньший продукт амплификации не обнаружил указанного сайта рестрикции. Прямое се»венирование этого участка показало полную потерю 8-го экзона и воссоединение экзонов 7 и 9, в резупьтате чего происходит сдвиг рамки считывания и возникновение терминирующего кодона UAA в 9-ом экзоне. Синтез белкового продукта обрывается в районе первой трети гомеобокса. Секвенирование амплификата ДНК и анализ химически выявляемого неспаривания в интронах, окружающих экзон 7 позволило выявить замену нуклеотида А на Т в акцепторном сайте сплайсинга в 5' районе экзона 8.

Такой же анализ проведен у третьего пациента и позволил выявить две полосы, соответствующие нормальному продукту, получающемуся в результате альтернативного сплайсинга этого района, и две полосы, приблизительно, на 100 нуклеотидов короче нормального фрагмента.

Прямое секвенирование более короткого продукта позволило выявить делецию 108 иуклеотидов, соответствующих 3' половине экзона 6, Первь шесть нуклеотидов делетированного района (СТААОС) соответствуют консенсусной последоОтельности донора сплайсинга (ОТДАСТ). Прямое секвенирование амплификата ДНК в экзон-интронной области показало однонуклеотидную замену (Э на А) в первом нуклеотиде донора сплайсинга. Нуклеотид в в этой позиции вляется критическим для нормального процессинга РНК. Так как у пациента произошла мутация, истинная граница между интроном и экзоном стала неразличима. Эффект этой мутации привел к тому, что белковый продукт РАХ6 дзлетирован на 36 аминокислот в С-концевом участке "связывающего" домена.

У четвертого пациента, при использовании метода химической обработки неспаренных участков в продукте РНК-ПЦР удалось показать наличие такого участка в 3' области открытой рамки считывания. Прямое секвенирование этого района выявило однонуклеотидную замену (С на Т) в экзоне 8, которая привела к замене аргинина (кодон СвО) в позиции 208 на триптофан (кодон Твв). Аргинин в этой позиции располагается за две аминокислоты перед началом го^собокса.

Таким образом, выявлено четыре точковых мутации в экзонах 6, 8, 9 и интронной области между экзонами 7 и 8, приведшей к полной потере экзона 8, гена РАХ6. В первых двух случаях произошла мутация в сайте сплайсинга, что привело к нарушению процессинга мРНК, в двух других -мутация внутри открытой рамки считывания. Они привели к нарушению структуры белка, особенно его С-концевого домена, тем самым нарушав его функцию, связанную с транскрибцией (Рис.6).

4. АНАЛИЗ КРИТИЧЕСКОГО РАЙОНА ХРОМОСОМЫ 15^1.2^13), ПОВРЕЖДАЕМОГО ПРИ СИНДРОМАХ ПРАДЕРА-ВИЛЛИ И АНГЕЛЬМАНА.

Впервые синдром Прадера-Вилли (СПВ) был описан в 1956 г. Основными диагностическими признаками являются: ожирение, мышечная гипотония, низкий рост, гипоганадизм, умственная отсталость различных степеней выраженности и признаки дисэмбриогенеза: долихоцефалия, миндалевидный разрез глазных щелей, гипертелоризм, эпикант, микрогнатия, рыбообразный рот, высокое небо, диспластичные ушные раковины, акромикрия, аномалии дерматоглифики и др. (Ргас)ег е1 а!., 1956). Частота синдрома в различных популяциях составляет 1:10000-20000 рождений (Са5э1с1у, 1984). Основная масса случаев возникает спорадически, хотя описаны семьи, где было выявлено несколько больных сибсов (С1эггеп е4 а1., 1977). Тип наследования долгое время оставался неустановленным, в

связи с тем, что свою коррекцию вносит явление имлринтинга. Синдром Ангельмана (СА) был описан в 1965 г. (Angelman, 1965). Основными диагностическими признаками являются: микробрахицефалия с уплощенным затылком, большая нижняя челюсть, приоткрытый рот с выступающим языком, макростомия, редко растущие зубы, гипопигментация, задержка умственного и моторного развития, атаксия, гипотония, судорожная готовность, гиперрефлексия и гиперкинезия в виде приступов неконтролируемого смеха, хлопанья в ладоши и специфического выражения лица. Частота синдрома в популяции составляет 1:20000 (Clayton-Smith et at., 1992). Основная масса случаев возникает спорадически, хотя описано значительное количество семей с несколькими больными (Robb et at., 1989; Clayton-Smith et at., 1992). Тип наследования невсегда соответствует аутосомно-доминантному в связи со значительной компонентой, вносимой импринтингом.

4.1. Высоко разрешающий хромосомный анализ критического района 15(q11.2-q13).

Нами обследовано 97 больных с СПВ, больше половины (66%) из которых имели структурную перестройку критического сегмента хромосомы 15q11.2. Кроме микроделеций у больных были выявлены: один случай делеции в результате тандемной транслокации хромосом 15 и 20, четыре случая частичной трисомии, один из них в результате транслокации хромосом 1 и 15, унаследованной от матери, один случай тетрасомии этого участка в результате инвертированной дупликации перицентромерного района в виде дополнительной бисателлитной микрохромосомы и по два случая пара- и перицентрических инверсий. Во всех случаях точка разрыва, локализована в участке 15(q11.2-q13) (Таблица 8).

Таблица 8.

Хромосомные аномалии, выявленные у больных с синдромом Прадера-Вилли.__

Формула кариотипа Число случаев

46,X(X)Y,del(15)(q11.2) 31

46,X(X)Y,del(15)(q11.2-q13) 24

45,XY,t(15;20)(q13;qter) 1

47,XX,+invdup(15p) 1

46,X(X)Y,dup(15)(q11.2-q13) 3

46,X(X)Y,inv(15)(p11.2;q12) 2

46,XY,inv(15)(q11.2;q14) 2

47,XY,+der(15),t(1;15)(q43;q13)mat 1

Практически все случаи синдрома, при которых не выявлена цито-генетическая патология, имели выраженный гетероморфизм гомологов а области хромосомы 15^11.2^13), и варианты полиморфизма короткого плеча, представленные как его делецией (реже), так и заметным увеличением (чаще).

Среди 13 больных с СА выявлено только 3 случая с явной делецией хромосомы 15(я11.2-я13). В остальных случаях отмечался гетероморфизм гомологов.

Цитогенетическое исследование показывает, что определить наличие микроделеции даже с использованием высокоразрешающих методов хромосомного анализа, трудно, т.к. перицентромерный участокдт.иного плеча хромосомы 15 достаточно вариабелен, и гетероморфизм гомологов может быть в части случаев обусловлен структурными изменением этого района. Поэтому для диагностики микроструктурной и субмикроскопической патологии необходимо использовать молекулярно-биологические методы.

4.2. Молекулярная биологическая характеристика субмикроскопической и функциональной патологии критического района при

СПВ и СА.

Нами проведено исследование ряда больных, имевших полное и неполное фенотипические проявления СПВ и СА, как имевших ци-тогенетически определяемую делецию, так и без таковой. Проведено делеционное картирование критического района с использованием дозового блот-гибридизационного анализа. Больные с цитогенетически определяемыми делециями служили контролем. Были использованы ДНК-зонды: р|р?39 (015518), рМ1.34 (01589), рТО189-1 (015513), рТОЗ 21 (015810) и 144Н12-3 (08867), служивший референсным маркером. Расположение локусов представлено на карте (Рис.7). Делеция на молекулярном уровне была выявлена у 5 из 8 больных без цитогенетически определяемой делеции.

Анализ ПДРФ для выявления делеций и выяснения их происхождения, с использованием выше указанных ДНК-зондов, в 5 семьях оказался неинформативным и достаточно трудоемким. В то же время, в исследованных случаях исключается родительская изодисомия (Немцова и др., 1994).

В целях диагностики функциональной патологии были использованы три ДНК-маркера, позволяющие выявить аномальное метилирование, родительскую изодисомию и структурные перестройки. Были использованы

Локусы

D15S18

* D15S9

D15S13

D15S63

**SNRPN

*PAR-5 PAR-7

*PAR-1 PAR-4

S»AR-2 E6-AP

D15S102 D15SU3

GABRB3

GABRA5

D15S12

D15S24

ДНК-маркеры

IR39

_ML34, ZnF127

189-1

. PW71

.KB1.7, S;nnl

Делении и SRO

■3-21 . LS6-1

№10

•CMW1

CA OIR

330kb

200kb

400kb

(с)

Рис. 7.Карта расположения локусов хромосомы 15 района 4! 1.2^13 , повреждаемых при синдромах Прадера-Вилли и Ангельмана . *-локусы . имеющие паттерны метилирования ДНК , при отцовском импринтинге

ДНК-маркеры: КВ17 и экзон а, соответствующие noKycy SNRPN, и PW71B----------

- -(D15S63). Патология обнаружена только в 4 случаях из 10 у больных с С,, что можно объяснить либо неверным клиническим диагнозом, либо более дистальным расположением аномалий. У больных с С ГШ функциональная патология выявлена у 7 из 13. Причем цитогенетические определяемые аномалии, представленные лерицентрической инверсной и «лстичной трисомией в результате материнской транслокации (1.15) не моказели каких-либо изменений. В то же время, выявлена необычная структурная патология локуса SNRPN у больного и его отца. Еще в трех <-пус«:; 5или вывлены необычные гибридизационные сигналы, свидетельствующие о каких-то изменениях в тестируемом районе, причем в двух случаях присутствовал нормальный отцовский аллель. Дозовый анализ и анализ функционального состояния критического района показали патологию в 11 случаях, что составило 55%. Все изменения произошли в наименьшем участке перекрывания делеций и соответствовали локусам D15S13, D15S63 hSNRPN,

Случаи, не показавшие ни структурных, ни функциональных изменений можно объяснить следующим образом: 1) микропврестройкой в неустановленном локусе; 2) перестройкой типа инверсий, когда не происходит потери генетического материала, а основой патологического фенотипа является эффект положения; 3) родительской изодиоомилй, представленной гетеросомией, другими словами пробанд несет хромосомы от деда и бабки, но прошедшие через родительский мейоз: 4) возможнее влияние крупных блоков гетерохроматина в коротком плече.

Диагностический подход при этих синдромах должен осуществляться следующим образом: 1) высокоразрешающий хромосомный анализ; 2) анализ функционального состояния района, в случае отсутствия хромосомной патологии; 3) поиск родительской изодисомии, в случае отсутствия патологии в SRO, с использованием микросателлитных маркеров; 4) тестирование других локусов критического района с использованием дозового анализа и других методов. Такой подход может обеспечить наиболее полную и эффективную диагностику синдромов Прадеда-Вилли иАнгельмана.

4.3. Роль импринтинга в происхождении СП В и СА.

На сегодняшний день СПВ и СА являются общепринятой моделью для изучения явления импринтинга. Значительное количество семейных случаев СПВ и СА, как с хромосомной патологией, так и без нее, не укладываются в обычные рамки аутосомно-диминантного типа наследования. Как показано выше, ПВС развивается при делеции отцовской хромосомы или материнской изодисомии данного локуса, в то время как СА развизаегся п

результате материнской делеции или отцовской изодисомии. Во всяком случае, наличие только одной копии или двух гомологичных локусов 15q11.2 материнского или отцовского происхождения не обеспечивает нормального развития и приводит к СПВ или СА.

Было показано, что ряд локусов экспрессируются только в отцовской хромосоме, хотя другие локусы экспрессируются диаллельно. Предполагается, что кластер PAR-1, PAR-5, SNRPN , составляющий около 250 т.п.н., может быть частью импринтируемого транскрипционного домена (Glenn et а,., 1993; Nakao et al., 1994). Было предположено, что нормальная отцовская копия данного района требуется дпя создания и поддержания импринтируемого транскрипционного домена. Отцовский контролирующий район может быть рассмотрен как центр импринтинга, который регупирует аллель-специфическую экспрессию в cis-положении. Существует

значительное различие между материнской и отцовской копиями данного района в отношении ДКК-метилирования нескольких сайтов. Показано отцовское гипометилирование определенных локусов в контролирующем районе при СПВ, согласующееся с отцовской аллель-специфической активностью Эти данные позволяют предполагать, что ДНК-метилирование является наиболее реальным механизмом импринтинга.

Помимо аллель-специфического метилирования в исследуемом критическом районе, импринтинг также ассоциирован с ДНК-реппикационной ассинхронностью. Район отцовской хромосомы, содержащий локусы D15S63, D15S113, GABRB3, реплицируется раньше, чем материнский (Knoll et al., 1994). Предполагают, что этот район является регулируемым репликационным доменом (Knoll et al., 1994).

В связи с этим выдвинута гипотеза существования единого центра импринтинга, распопоженного между локусами D15S63 и SNRPN (Reed et al., 1994; Butting et al., 1995), делеции или мутации которого могут нарушать процесс импринтинга в этом районе и вызывать СПВ и СА.

СПВ и СА могут вызываться нестабильностью конкретного хромосомного района в результате наличия повторяющихся последовательностей семейства MN7, приводящих, как к структурным перестройкам, так и к нарушению процессов конденсации-деконденсации хроматина и его аномальному метилированию. Исследуемый хромосомный район, по-видимому, функционирует как единое целое и любое, даже незначительное его повреждение, приводит к комплексной реакции, обусловленной значительным количеством генов, расположенных в его пределах. В терминологическом плане было бы справедливее название не центр импринтинга, а комплекс импринтинга (CGIC - contigious gene imprinting complex), подразумевая функционирование последовательности генов или

генного комплекса как единого-механизмавопределенном хромосомном районе, подверженном импринтингу. Вариант заболевания будет определяться родительским происхождением хромосомы, в которой произошло нарушение В случае делеции, родительской изодисомии или какого-либо иного нарушения в критическом районе, отдельные клинические признаки при этих синдромах должны совпадать, т.к. в комплексе импринтинга могут

быть гены, ему не подверженные. Например, гипопигментацйя и гипотония при СПВ и CA.

Проведенная работа показала, что требуется дальнейшее исследование критического района хромосомы 15(q11.2-q13) и пе-рицентромерного района в целом, как для клонирования генов СПВ и CA, так и для более глубокого изучения структурно-функциональной организации ДНК в целях выяснения молекулярных основ импринтинга.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Современное состояние цитогенетических и молекулярно-биоло-гических исследований позволяет решать серьезные проблемы, связанные как с повышением разрешающей способности комплекса методов в диагностике микроструктурных и субмикроскопических аномалий хромосом, так и с проблемой физического и генетического картирования генома человека, картирования и изучения структуры и функции генов, патология которых приводит к определенным заболеваниям.

Прогресс в традиционной микроскопии, позволивший, благодаря использованию метода прометафазных хромосом, повысить разрешающую способность цитогенетического анализа на порядок, привел " выделению особой группы наследственных заболеваний .- синдромов МВПР с неустановленным типом наследования, сопровождающихся микроструктурными аномалиями хромосом. Наследование их не всегда укладывалось в рамки менделирования. Высоко разрешающий хромосомный анализ позволил в ряде . случаев выяснить причину и объяснить наследование этих заболеваний, однако далека не все. Другим принципиальным результатом использования высоко разрешающих методов стала возможность вычленения наименьшего участка перекрывания всех делеций (SRO) при этих синдромах, что позволяет картировать локус заболевания на хромосоме в пределах 2 м.п.н. Нами обследовано более 450 пациентов с микроделеционными синдромами, которые позволили в ряде случаев внести совершенно новый вклад в определение SRO (ТРФ синдромы, СВБ, WAGR). Но в значительном

количестве случаев патологию на урозне хромосом определить не удается, что можно объяснить либо гетерогенностью заболевания, либо недостаточным разрешением метода. В связи с этим возникла необходимость повышения разрешающей способности анализа критических районов хромосом, с целью выявления субмикроскопических стру^урных аномалий. На основании проделанной работы нами предложен алгоритм анализа и характеристики критических районов хромосом с использованием комплекса цитогенетических и молекулярных методов. Он заключается в реализации следующие основных этапов.

1. Поиск наименьшего участка перекрывания всех делеций или других хромосомных аномалий с использованием высоко разрешающих методов цитогенетического анализа. Анализ прометафазных хромосом позволяет выявить и охарактеризовать по длине микроструктурную перестройку и определить критический район для изучаемого синдрома МВПР.

2. Клонирование максимально возможного количества анонимных ДНК-маркеров в критическом районе, KäK уникальных, так и обладающих различными вариантами полиморфизма (ПДРФ, мини- и микросателлитный полимирфизм), клонирование точек разрыва при структурных перестройках. Физическая и генетическая карта исследуемого критического района необходима для. создания системы координат при более глубоком анализе. В то же время, на этом этапе закладывается необходимая инструментальная база для дальнейших исследований.

3. Поиск субмикроскопических аномалий в случаях нормального кариотипа с использованием полученных ДНК-маркеров, определение наименьшего участка перекрывания всех перестроек на уровне ДНК. Комплекс молекулярно-биологических методов позволяет определить SRO на уровне ДНК в критическом хромосомном сегменте и, тем самым, сузить еще на порядок район возможной локализации гена или. комплекса генов, ответственных за заболевание, до 200-300 т.п.н.

4. Поиск и характеристика гена-кандидата заболевания в определенном критическом районе. Уникальные возможности, представляемые модельными синдромами, типа WAGR и СЛГ, объединяющие в себе фенотипы нескольких самостоятельных заболеваний, позволяют картировать каждый ген в отдельности. Основными моментами этого этапа является поиск экспрессирующихся последовательностей (скрининг кДНК-библиотек, Нозерн-гибридизация, прямая кДНК-селекция, экзон-треппинг), поиск сигнальных последовательностей, свидетельствующих о наличии гена, компьютерный анализ первичной последовательности ДНК и анализ ее по базам данных.

5. Доказательство, что клонированный ген является искомым. Основным подтверждением этого является обнаружение в нем мутаций, приводящих к заболеванию. ДНК-диагностика располагает большим количеством разнообразных методов поиска и описания мутаций. В тоже время, иногда, и комплексный подход, может не дать желаемых 100% выявления мутаций, что связано с генетической гетерогенностью заболеваний, и было показано для МЭХД и опухоли Вилмса. В случае отсутствия гетерогенности синдрома, как показано для аниридии, СПВ и СА, мутации в известном локусе в некоторых случаях необнаруживаются. Свои коррективы вносят даа биологических явления, таких как эффект положения и импринтинг, молекулярные основы которых только начинают исследоваться.

Синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана являются модельными по изучению импринтинга и могут вызываться нарушениями определенной структурно-функциональной организации ДНК в* конкретном хромосомном районе в результате наличия повторяющихся последовательностей, приводящих как к структурным перестройкам, так и к нарушению процессов конденсации-деконденсации хроматина и его аномальному метилированию. Хромосомный район функционирует как единый комплекс импринтинга и любое, даже незначительное его повреждение, приводит к комплексной реакции, обусловленной значительным количеством генов, расположенных в его пределах. Можно предполагать такие комплексы во всех хромосомах в перицентромерных и прителомерных областях, так как в них располагаются повторяющиеся последовательности Любое нарушение, связанное с экстремальным увеличением копийности и его метилированием, может приводить к эффекту инактивации (экспансии инактивации) соседних районов, содержащих функционирующие гены, как это показано для ряда X-аутосомных транслокаций. Экстремальные варианты полиморфизма короткого плеча хромосомы 15, выявленные при СПВ и СА могут быть косвенным подтверждением этой гипотезы. Второй возможный механизм связан с повышенной нестабильностью областей, содержащих повторы и являющихся горячими, точками' мутагенеза. Амплификация повторов а митозе или мейозе свыше какого-то предела может приводить к выщеплению повтора, захватывая при этом соседние функционально значимые районы, как это показано для синдрома Мартина-Белла.

По-видимому, возможны, как минимум, два пути возникновения импринтинга: посредством метилирования ДНК и посредством изменения пространственной организации ДНК благодаря переходу эухроматина в гетерохроматин и наоборот. Импринтинг, таким образом, наряду с целым рядом систем регуляции экспрессии генов, может регулировать активность генов и поведение хромосом в пространстве и во времени. Дальнейшее

изучение геномного импринтинга имеет существенное .значение для понимания тонких механизмов регуляции генной активности в онтогенезе и его связи с синдромами МВПР и злокачественными новообразованиями.

Накопление фактических данных по поиску мутаций в генах наследственных заболеваний привело к обнаружению и подтверждению на молекулярном уровне хорошо известного явления эффекта положения. Описано значительное количество генов заболеваний, при которых мутации не выявляются. Мутация происходит не в самом гене, а на значительном расстоянии от него, повреждая какие-либо элементы его регулирующие. Наиболее распространенными факторами, вызывающими эффект положения, являются структурные изменения, представленные транслокациями, инверсиями, делециями, дупликациями и ретровирусной интеграцией.

Одним из наиболее реальных механизмов, лежащих в основе эффекта положения, может быть конденсированное состояние гетеоохроматина, которое распространяет инактивирующий эффект на эухроматиновые районы, вызывая репрессию транслоцированных генов. Известно, что такой эффект распространяется на расстояние до 2 м.п.н. Интеграция ретровирусов в регуляторные области гена может подавлять или активировать его экспрессию. В основе импринтинга и позиционного эффекта могут .лежать структурно-функциональные изменения ДНК вне конкретного гена, но тем не менее, приводящие к определенной патологии. Таким образом, почти все патологии, описанные в настоящей работе, могут возникать как в результате явных структурных изменений в гене, так и в результате явлений импринтинга и эффекта положения.

В предпринятом исследовании был проведен комплексный цито-генетический и молекулярно-генетический анализ трех критических районов хромосом 15^11.2-ц13), 11р13 и 8q24.1, повреждения в которых вызывают достаточно распространенные синдромы. Представленные в настоящей работе результаты отражают разные этапы структурно-функционального анализа определенных участков хромосом человека и определенных локусов ДНК в норме и при патологии. Показано, что все исследованные критические районы содержат несколько генов, а структурное изменение критического района приводит к синдромальному фенотипу. В заключение, мы бы хотели еще раз акцентировать внимание на том, что исследованные синдромы МВПР могут возникать не только в результате структурных изменений в критических районах или мутаций в конкретных генах, но и в результате функциональных изменений и различных изменений вне генов заболеваний. По-видимому, явления, типа эффекта положения, импринтинга и взаимодействия структурной и

функциональной организации ДНК в определенном хромосомном районе составят предмет исследований патогенетических механизме наследственных болезней в недалеком будущем.

ВЫВОДЫ

1. Высоко разрешающие методы хромосомного анализа подтвердили наличие критических районов хромосом, патология которых приводит к определенным синдромам МВПР. Общая частота выявления микроструктурной хромосомной патологии составила 25%. При синдромах Лангера-Гидиона, WAGR, Смита-Магениса, патология выявлена в 100% случаев, при синдроме Прадера-Вилли - в 66%, при ТРФС-1 типа - в 50%, при синдроме Ангельмана - в 20%, при ретинобластоме - в 10% случаев.

2. Делеционное картирование критического района хромосомы 8q24.1 на молекулярном уровне позволило определить области локализации ТРФС-1 -район локуса D8S98 и МЭХД - район локуса D8S67, расположенные на расстоянии 3,9 м.л.н. Получены и охарактеризованы новые, полиморфные и неполиморфные ДНК-маркеры, новые STS и EST в области критического района, пригодные для физического и генетического картирования и ДНК-диагностики. Секвенировано более 10 т.п.н. этого района.

3. Проведено генетическое картирование, частичное клонирование и секвенирование гена-кандидата МЭХД (EXT I), имеющего гомологию с протеогликанами, в локусе D8S67. Поиск мутаций у больных с МЭХД позволил выявить изменения в девяти семьях и в секционном материале экзостоза и хондросаркомы. Генетическое картирование второго i жуса МЭХД (ЕХТ 2) в районе хромосомы 11р12 показало, что наиболее вероятной областью локализации является район локуса D11S903, составляющий около 3 м.п.н. Подтверждена генетическая гетерогенность заболевания.

4. Делеционное картирозание при полных и неполных формах синдрома WAGR с использованием прометафазного анализа хромосом, нерадиоактивной гибридизации in situ (FISH), дозового блот-гибридизационного анализа и ПЦР показало, что все. делеции повреждают критический участок хромосомы 11р13, а минимальный размер делеции составляет около 750 т.л.н. Разработан вариант множественной дифференциальной ПЦР для определения дозы гена и характеристики длины делеций.

5. Выявлен и охарактеризован ряд новых мутаций в гене аниридии (РАХ6), представленных точковыми мутациями в сайтах сплайсинга и внутри открытой рамки считывания, и, повреждающих функционально важные домены белка - регулятора транскрипции.

6. Анализ критического района хромосомы 15(q11.2-q13) У больных с синдромами Прадера-Вилли и Ангельмана показал, что частота хромосомной патологии этого района составляет 66% и 20%, соответственно. Молекулярная диагностика позволила выявить структурную и функциональную патологию при этих синдромах еще в 12% и 21%, соответственно. Наименьшим участком перекрывания всех делеций при СПВ является область локуса D15S13. Функциональная патология при СПВ, вызванная аномалиями метилирования без структурных изменений, составляет от 2 до 5%. Введено новое понятие "комплекс импринтинга".

7. На значительном клиническом материале показана эффективность использования комплекса высоко-разрешающих цитогенетических и молекулярно-биологических методов, позволяющих значительно повысить разрешение в диагностике и характеристике микроструктурной и субмикроскопической хромосомной патологии у больных с синдромами МВПР. Эта патология является основой для физического и генетического картирования генома, картирования и клонирования генов наследственных заболеваний человека. Предложен алгоритм анализа критических районов хромосом.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Zaletayev D.V., Marincheva G.S. Langer-Giedion syndrome, in a child with complex structural aberration of chromosome 8. "Hum.Genet.", 1983, v.63, .178182.

2. Zaletayev O.V., Marincheva G.S. To etiology of Langer-Giedion syndrome. Abstracts of XYlth symposium on Cytogenetics Bratislava, 1983, p.30.

3. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П., Левина Л.Я., Цветкова Т.Г., Антоненко В.Г. Цитогенетическая характеристика исследованных групп больных. "Регистр хромосомных болезней человека". Москва, 1984, с.46-47.

4. Залетаев Д. В. Регистр отдельных случаев структурных перестроек хромосом. "Регистр хромосомных болезней человека". Москва, 1984, с.31.

5. Залетаев Д.В., Л.И.Барановская, А.Ф.Захаров. Хромосомный анализ в диагностике наследственных синдромов. В кн."Диагностика наследственных болезней". Москва, 1986, с.30-52.

6. Залетаев Д.В. Анализ прометафазных хромосом в медико-генетическом консультировании больных с синдромальными формами МВПР. Всесоюзный симпозиум "Актуальные вопросы профилактики наследственных болезней". Вильнюс, 1986, с.34-35.

7. Залетаев Д.В., Кортина Х.Д. Реальность существования цикроструктурных хромосомных мутаций у человека. Y съезд ВОГиС

Тезисы. Москва, 1987, т.2, с.38.

8. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П., Лурье И.В., Маримчева Г.С.. Синдро.., Лангера-Гидиона и делеция длинного плеча хромосомы 8. "Генетика", 1987, т. XXIII, N 5, с. 907-912. '

9. Лиснянский И.Е., Гарькавцева Р.Ф., Залетаев Д.В., Кузьминов A.M. Наследственные синдромы множественных эндокринных неоплазий. "Вопросы онкологии", 1987, т. XXXIII, N.6, с.57-61.

10. Залетаев Д. В. Цитогенетические исследования при врожденных заболеваниях скелета. В сб.Тенетические и иммунологические методы исследования больных с заболеваниями опорно-двигательного аппарата". Москва, 1988, с.38-45.

11. Фролова Л.Ю., Залетаев Д.В., Кулешов Н.П. Ген с-тус при трихо-ринофаланговом синдроме II типа и множественных экзостозах человека. Тезисы симпозиума по молекулярной и клеточйой онкобиологии. Таллин, 1988, с.38.

12. Казеев К.Н., Лиснянский И.Е., Залетаев Д.В., Куратеев Л.Е., Авдеева Т.Ф. Синдром множественных эндокринных неоплазий IIB типа. "Проблемы эндокринологии", 1988, T.XXXIY, N.6, с.45-47.

13. Zaletayev D.V., Kuleshov N.P., Frolova L.Y., High resolution techniques of chromosome analysis in studying of congenital malformations in man. Abstacts of 21st symposium on Cytogenetics Prague, 1988, p.64.

14. Залетаев Д.В., Купешов Н.П., Фролова Л.Ю., Сотникова E.H. Изучение врожденных пороков развития и применением высоко разрешающих методов хромосомного анализа. В кн:"Медицинская генетика: теория и практика". М.1989, с.46-52.

15. Залетаев Д.В. Цитогенетическое изучение менделирующих форм МВПР. В кн."Хромосомы человека в норме и патологии" М. 198Í, с. 105-117.

16. Запетаев Д.В., Кулешов Н.П., Барцева О.Б., Фролова Л.Ю.,Сотникова E.H. Молекулярные методы в диагностике хромосомных нарушений. Тезисы. I Всесоюзной конф.Теном человека" М. 1990, с.26.

17. Залетаев Д.В. Молекулярно-цитогенетические подходы к диагностике структурных перестроек хромосом. Тезисы. 2-Я Научно-практическая конференция по цитогенетике. М.1991, с.8.

18. Залетаев Д.В. Отдельные случаи структурных перестроек хромосом. 2-я Научно-практическая конференция по цитогенетике. М.1991, с.ЗО.

19. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П. Возможность создания дозовых PCR-диагностикумов. Тезисы II Всесоюзной конф.'Геном человека" М.1991, с.110-111.

20. Залетаев Д. В., Кулешов Н.П. Комплексный молекулярно-цитогенетический анализ больных с синдромом WAGR. Тезисы II Всесоюзной конф.Теном человека" М.1991, с. 111-112.

21. Залетаев Д.В., Бабаева Е.В., Кулешов Н.П. Молекулярно-цитогенетические подходы к изучению "критического" сегмента 8q24.1 при синдроме Лангера-Гидиона. Тезисы YI съезда ВНОМГ, Минск 1992

22. Jordan Т., Hanson I., Zaletayev D., Hodgson S., Prosser J., Seawright A., Hastie N., van Heyningen V. The human PAX6 gene is mutated in two patients with aniridia. "Nature Genetics", 1992, v.1, p. 328-332.

23. Карпухин A.B., Богуш А.И., Салимов А.Г., Вейко Н.Н., Немцова М.В., Захарьев В.М., Залетаев Д.В., Спитковский Д.М. Повторяющаяся последовательность ДНК, представленная в прителомерных участках хромосом человека. "ДАН", 1993, т.329, N.3, с.365-368.

24. Немцова М.В., Залетаев Д.В., Кулешов Н.П. Цитогенетическая и молекулярно-биологическая диагностика микроструктурной патологии хромосомы 15q11.2 при синдроме Прадера-Вилли. Тезисы III конференции "Геном человека". М. 1993, с.90.

25. Nemtsova M.V., Zaletayev O.V., Kuleshov N.P. Radioactive and nonradioactive detection of subchromosomal deletions on the Prader-WiW chromosome region. Abstracts of Europian Society of Human Genetics 25th Annual Meeting, Barcelona 1993, p. 76.

26. Залетаев Д.В., Немцова M.B., Позднякова E.O. Цитогенетическое и молекулярно-биологическое изучение хромосомного района 8q24.1. Тез.докл. на III конференции "Геном человека", 1993, с.74.

27. Zaletayev D.V., Nemtsova M.V., Kuleshov N.P., Frolova L.Y. Towards the diagnosys of the cytogenetic anomalies on the TRPS, type I and II and multiple exostoses. Abstracts of Europian Society of Human Genetics 25th Annual Meeting, Barcelona, 1993 p.110.

28. Hanson I., Seawright A., Hardman K., Hodgson S., Zaletayev D., Fekete G., van Heyningen V. PAX6 mutations in aniridia. "Human Molecular Genetics", 1993, v. 2, p.915-920.

29. Залетаева T.A.,Кулешов Н.П., Залетаев Д.В., Барцева О.Б. Современные методы хромосомного анализа в клинико-генетических исследованиях. Учебное пособие ЦОЛИУ врачей МЗ М.1994, 66 с.

30. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Яценко А.Н. Кулешов Н.П. Подходы к картированию множественной экзостозной хондродисплазии в районе хромосомы 8q24.1. Тезисы докладов IY съезда медицинских генетиков. Москва. 1994, с.22.

31. Немцова М.В., Яценко А.Н., Залетаев Д.В. Кулешов Н.П. Делеционное картирование области хромосомы 8q24.1, повреждаемой при синдромах

Лангера-Гидиона и трихо-рино-фаланговом I типа. Тезисы докладов IY съезда медицинских генетиков. Москва. 1994, с.43-44.

32. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П. Молекулярно-биологическая диагностика микроструктурной хромосомной патологии и характеристика "критических" хромосомных районов при синдромах Лангера-Гидиона и Прадера-Вилли. Тезисы докладов 4-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1994, с.34-35.

33. Nemtsova М., Yatsenko A., Kuleshov N., Novikov P.V., Meerson Ё.М., Zaletayev D.V. deletion length and SRO detection on patients with LGS and TRPS-I. Abstracts of the 27th Annual European Meeting for Human Genetics. 1994. Paris, p.342.

34. Zaletayev D.V., Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P. Attempts to hereditary multiple exostoses gene fine mapping. Abstracts of the 27th Annual Europian Meeting for Human Genetics. 1994. Paris, p.468.

35. Немцова M.B., Залетаев Д.В., Кулешов Н.П. Цитогенетическая и молекулярная диагностика синдрома Прадера-Вилли. В кн. "Молекулярная диагностика наследственных болезней". МОНИКИ, М.1995, с. 103-108.

36. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П. Цитогенетическая и молекулярная диагностика синдрома аниридия-опухоль Вилмса (WAGR). В кн: "Молекулярная диагностика наследственных болезней". МОНИКИ, М. 1995, с.133-139.

37. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П. Обнаружение мутаций в гене аниридии. Сборник научных трудов МОНИКИ "Молекулярная диагностика наследственной патологии". М. 1995 (в печати).

38. Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П. Залетаев Д.В. Цитогенетическая и молекулярная диагностика синдрома Лангера-Гидиона и множественной экзостозной хондродисплазии. Сборник научных трудов МОНИКИ "Молекулярная диагностика наследственной патологии". М. 1995. (в печати).

39. Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P., Zaletayev D.V. Molecular genetics investigation of the Langer-Giedion chromosome region 8q24.1 on LGS, TRPS-I and EXT patients. Abstracts of the 2nd International Workshop on Human Chromosome 8 Mapping. "Cytogenet. Cell Genet". 1995, v.68, p. 158.

40. Spurr N.. Blanton S., Zaletayev D. Report of the Second International Workshop on Human Chromosome 8 Mapping. "Cytogenet. Cell Genet". 1995, v.68, p.147-164.

41. Wuyts W, Ramlakhan S, Van Hul W., Hecht J., Raskind W„ Hofstede F„ Zaletayev D., Weissenbach J., Wagner M., Bakker E., Halley D., Willems P Refinment of the multiple exostoses locus (EXT 2) to a 3-cM interval on chromosome 11. "Am.J.Hum.Genet". 1995, v.57, p.382-387.

42. Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P., Zaletayev D.V. Is the 5' of the hereditary multiple exostoses gene-candidate localized at D8S67 locus? Abstracts of the 27th Annual Meeting of the European Society of the Human Genetics, Berlin, 1995, p.242.

43. Zaletayev D.V., Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P. New STSs and ESTs from the Langer-Giedion chromosome region. Abstracts of the 27th Annual Meeting of the European Society of the Human Genetics, Berlin, 1995, p.245.

44. Nemtsova M.V., Yatsenko A.N., Kuleshov N.P., Pozdnyakova E.O., Kuzina N.Y., Demina N.A, Zaletayev D.V. Deletion and methylation pattern analysis on patients with typical and atypical Prader-Willy syndrome. Abstracts of the 28th Annual Meeting of the European Society of the Human Genetics, London, 1996, p.77.

45. Яценко A.H., Немцова M.B., Кулешов Н.П., Чеснокова Г.Г., Хаспеков Г. Л., Залетаев Д. В. Картирование гена-кандидата множественной зкзостозной хондродисплазии (ЕХТ 1) в участке хромосомы 8q24.1. Тезисы докладов 5-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1996, с.88-89.

46. Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П., Новиков П.В., Меерсон Е.М., Залетаев Д. В. Делеционное картирование участка хромосомы 8q24.1. Тезисы докладов 5-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1996, с.87-88.

47. Немцова М.В., Кулешов Н.П., Позднякова Е.О., Кузина Н.Ю., Чеснокова Г.Г., Демина Н.А., Залетаев Д.В. Молекулярная диагностика микроструктурных аномалий хромосомы 15q11.2 при синдроме Прадера-Вилли. Тезисы докладов 5-ой конференции "Геном человека". Черноголовка. 1996, с.86-87.

48. Залетаев Д.В. Молекулярно-биологические подходы к диагностике и характеристике микроструктурных и субмикроскопических хромосомных аномалий при менделирующих синдромах МВПР. Сборник материалов республиканского совещания "Принципы организации и профилактики инвалидизирующих наследственных болезней". Москва, 1996, с.23-26.

49. Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. Молекулярно-генетическая характеристика области делеций хромосомы 8q24.1 при синдромах Лангера-Гидиона и трихо-рино-фалангового, I типа. Генетика. 1996, т.32, N7, с.1-7.

Информация о работе

Залетаев, Дмитрий Владимирович
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.15

Автореферат

Цитогенетический и молекулярно-генетический анализ критических районов хромосом, повреждаемых при менделирующих синдромах МВПР - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы