Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика района хромосомы 8q24.l, ответственного за синдром Лангера-Гидиона

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика района хромосомы 8q24.l, ответственного за синдром Лангера-Гидиона"

В 0.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Медико-Генетический Научный Центр

На правах рукописи УДК 575.113.2+616-056.7

НЕМЦОВА Марина Вячеславовна

Молекулярно-генетическая характеристика района хромосомы 8я24.1, ответственного за синдром Лангера-Гидиона.

03.00.15 "Генетика"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к.б.и. Д.В.Залетаев

Москва 199-1

Работа выполнена в лаборатории клинической цитогенетики Институ клинической генетики Медико-генетического научного центра РАМН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Л.В.Залетаев

Официальные оппонентьи доктор биологических наук

О.В.Евграфов

кандидат биологических наук П.А.Сломинский

Ведущая организация: Институт педиатрии МЗ РФ, Москва

Защита диссертации состоится .30. С^О^ 1994 Г. в Ю часов на заседании Специализированного Совета Д 001.16.0! по адресу: Москва, 115478, ул. Москворечье, д. I. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГНЦ РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф.Кур!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Настоящая работа посвящена молекулярло-генетическому изучению ло--куса длинного плеча хромосомы 8q24.1, являющегося "критическим" сегментом, повреждаемом при синдроме Лангера-Гндиона, и поиску полиморфных ДНК-маркеров для физического и генетического картирования гена множественной экзостозной хондродисплазии.

Актуальность теш. Физическое и генетическое картирование генома человека является фундаментальной проблемой. В настоящее время фрагментарно физически картированы все хромосомы человека. Картировано и изучается около 300 генов человека, многие из которых, при нарушении структуры и функционирования, сопровождаются патологическими проявлениями. Хромосома 8 человека содержит около 150 млн. пар оснований и составляет около 4% генома человека. Несмотря на довольно большие размеры, ее картирование значительно отстает от многих других. В последние 2 года усилия по молекулярно-генетическому изучению хромосомы в получили дополнительный импульс благодаря картированию на ней генов, ответственных за возникновение ряда заболеваний и, в частности, множественной экзостозной хондродисплазии (Wood et al.,1993). Участок длинного плеча хромосош sq24.l по величине составляет.10-20 млн. пар нуклеотидов, но подробной физической и генетической карты пока не существует. Однако, данные клинико-цитогенетических исследований свидетельствуют о насыщенности данного участка структурными генами, участвугадими в процессе эмбрионального развития человека. Об этом говорит выявляемая структурная патология этого хромосомного района, сопровождающаяся различными множественными врожденными пороками развития (МВПР) и некоторыми новообразовательными процессами. Одним из таких синдромальных МВПР является синдром Лангера-Гидиона (СЛГ), при котором всегда выявляется делецня хромосомы 8q24.l - наименьший участок перекрывания всех делеций составляет около 2.5 млн. пар оснований (Залетаев и др., 1987, 1990, Buhler.Malik, 1985, Horsthemke et at., 1991). Фенотип СЛГ представляет собой фенотнпнческую совокупность двух патологических состояний - трихо-рнно-фалангового синдрома I типа (ТРФС-1) и множественной экзостозной хондродисплазии (МЭХД), в отдельных случаях сопровождающихся аналогичной хромосомной патологией (Залетаев, 1990. Marchau et а!.. 1993). СЛГ, являясь синдромом сегментных анеусомий, проставляет собой объе г для генетического картирования. СЛГ достаточно редок - около 80 описанных случаев, тип наследования не известен, но предполагается аутосом-

ио-доминантный (3 семейных случая), ТРФС-J встречаеся чаще - более 400 описаний, так же предполагается аутосомно-доминантный тип наследования (около 30 семейных случаев), МЭХД - достаточно распространенная патология, составляющая до 10% обращений в специализированные клиники (более 70% семейных случаев). Около 25% множественных экзостозов при МЭХД имеют тенденцию к трансформации во вторичную хондрому и хондросаркому (Волков, Меерсон,1979). Таким образом, картирование гена МЭХЛ и выявление мутаций в нем является социально значимой задачей по диагностике, профилактике и прогнозированию течения этого наследственного аутосомно-дом^нантного заболевания.

В основу исследования заложена стратегия "позиционного клонирования", для реализации которой необходима физическая карта конкретного хромосомного участка и наличие полиморфных ДНК-маркеров, с помощью которых можно обнаружить генетическое сцепление с болезнью в семьях.

Все, выше сказанное, определило цель и задачи предлагаемого исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего иследования является молекулярно-генетическая характеристика района и поиск полиморфных ДНК-маркеров в районе хромосомы 8q24.l, повреждаемом при СЛГ, ТРФС-1 и МЭХД для физического и генетического картирования. Задачами исследования являются:

1. Характеристика космидных клонов, расположенных в "критическом" сегменте хромосомы 8q24.1 в отношении наличия микро- и минисател-литных последовательностей, умеренно повторяющихся последовательностей (Alu-, Крп- и других), СрО- богатых участков и белок-кодн-рующих последовательностей;

2. Субклонирование космидных клонов для получения клонотеки ДНК-маркеров и их анализ на предмет информативного полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, микро- и минисателлитного полиморфизма;

3. Секвенирование отдельных субклонов для получения STS и изучение их на предмет ПДРФ и однонитевого конформационного полиморфизма;

4. Характеристика делеций хромосомы 8q24.l у пациентов с СЛГ и ТРФС-1 по длине с целью делеционного картирования..

5. Изучение семей с СЛГ, ТРФС-1 и МЭХД на предмет сцепления с выявленными полиморфными ДНК-маркерами.

Научная новизна. В ходе данной работы впервые проведена комплексная молекулярно-генети еская характеристика шести космидных клонов общей длиной около 210 т.п.н., картированных в мало изученном

сегменте хромосомы 8q24.I. Получены новые ДНК-зонды, имеющие ПДРФ и уникальные ДНК-зонды, пригодные для проведения дозовых блот-гибриди-зационных экспериментов при характеристике делеций по длине. Выявлена повторяющаяся диспергированная последовательность с плечевой локализацией на отдельных хромосомах. Получены новые STS для физического картирования хромосомы 8. В общей сложности секвенировано более 2 т.п.н. в исследуемом районе. Выявлен фрагмент ДНК, имеющий CpG-островок и открытую рамку считывания. С использованием полученных ДНК-зондов проанализированы семьи с СЛГ, ТРФС-I и МЭХД и гаплотипи-рованы хромосомы, несущие мутацию, приводящую к МЭХД.

Практическая ценность работы. Молекулярно-генетическая характеристика космидных клонов, локализованных в мало изученном районе длинного плеча хромосомы 8q24.1 является вкладом в изучение генома человека. Полученные STS, могут быть использованы для построения физической и генетической карты длинного плеча хромосомы 8. Получение ДНК-зонды, имеющие полиморфизм, могут быть использованы для поиска генетического сцепления с геном, отвечающим за развитие множественных экзостозов у человека. Неполиморфные ДНК-зонды могут быть использованы для диагностики и характеристики микроструктурной хромосомной патологии в участке 8q24.1. Получен новый диагностически ценный полиморфный ЛНК-зонд, позволяющий начать разработку процедур ДНК-диагностики.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на научных семинарах Института клинической генетики МГНЦ РАМН в мае 1993 г. и в апреле 1994 г., на III (1993 г.) и IV (1994 г.) Российских конференциях "Геном человека" в Черноголовке.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 20 рисунков. Список литературы включает 80 работ.

.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты поступали из КПО ВНМГЦ РАМН, Института педиатрии МЗ РФ и ШТО им. Приорова МЗ РФ. Было обследовано: больные с синдромом Лангера-Гидиона (ЛГС) - 7 человек, больные с трихо-рино-фаланговым

синдромом I типа (ТРФС-1) - 3 человека, больные с множественной эк-зостозной хондродисплазией (МЭХД) - 4 семьи (11 больных).

Основными критериями отбора пациентов служили <}>енотипические признаки. Все больные были обслельаны с использованием рентгенологических методов для подтверждения диагноза множественных экзостозов. Вь'сокоразрешакхций хромосомный анализ кариотипа пациентов и членов их семей проведен в лаборатории клинической цитогенетики ВНМГЦ РАМН.

Космидные клоны были любезно предоставлены профессором Вагнером из Хьюстонского университета. ЛНК-зонды LI, L24, L32, L40, L47, L48 были любезно предоставлены доктором Хорстхемке из Эссенского Института медицинской генетики.

ДНК из крови и лимфобластоидных клеточных линий выделяли методом, предложенным (Lindblon and Holmlund, 1988). Выход ДНК составлял 25-50 мкг на 1 мл крови.

рестрикцию и электрофорез при блот-гнбридизации проводили стандартно. Перенос ДНК из геля проводился на мембрану Hybond N с использованием метода вакуумного блоттинга.

Для мечения плазмидной ДНК использовали меченый по Р 32 dCTP произведенный в г. Обнинске с удельной активностью 3000 Кю/ммоль, метод ник-трансляции и набор Nick-translation kit производства Boerfnger, а также набор для ник-трансляции фирмы Биопол. Процедуру мечения проводили по протоколам фирм.

Для нерадиоактивного мечения ДНК- зондов из генома человека, а также синтетического (СА)л зонда использовали стандартный набор фирмы Boehrlnger " DNA labeling and detection kit nonradioactive." Гибридизацию проводили по стандартным протоколам фирмы Boehrlnger.

Приготовление компетентных клеток . трансформацию и отбор рекомби-нантных клонов проводили по методикам, описанным (Sambrook et al.,1989).

Встраивание фрагментов космид в плазмидный вектор проводили с помощью Т4-ДНК лигазы. производства НПО "Ферментас" (г. Вильнюс) пс протоколам фирмы.

Быстрое выделение плазмидной ДНК из малых объемов проводили стандартным методом (Sambrook et al., 1989).

Секвенирование фрагментов ДНК, клонированных в плазмидном векторе, проводи;"! по методу Сенгера (Sanger et al., 1977).

Полнмеразную цепную реакцию проводили при помощи программируемой термоцнклера РНС-2 фирмы Techne с использованием термофильно! ДНК-полимеразы НПО " Ферментас" г. Вильнюса. ПЦР проводили по стан

дартной схеме (Saikl, 1989) при подобранных специально для каждой пары праймеров параметрах реакции. Результаты амплификации оценивали в 6-12% ПААГ.

Для радиоактивной л^текции SSCP полиморфизма использовали меченные Р 32 праймгры или вводили меченный предшественник р амплификацию.

Для нерадиоактивной детекции полиморфизма использовали метод окраски бромистым этидием и ультратонкое окрашивание серебром (Lleber-man, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Молекулярно-биологическая характеристика космидных клонов.

В связи с поставленными задачами, нас интересовал участок хромосомы 8q24.12, являющийся наименьшим участком перекрывания всех цитоге-нетически определяемых делецнй (SRO) у больных с СЛГ, В HameM paci.j-ряжении было несколько космидных клонов, располагающихся в этом участке, перекрывающих около 2 М.п.н. и расположенных следующим образом:

cen - 10G8 (D8S98) - 59В5 (D8S51) - 144Н12 (D8S67) - 49С2 (D8S67) -62Н11 - 44012 (D8S43) - tel

Космидный клон 10G8 располагается проксимальнее SRO делеций при СЛГ. Космидный клон 59В5 содержит последовательность ДНК-зонда L48 и располагается в SRO, 300 т.п.н. проксимальней локуса D8S67. Космидный клон 144Н12 располагается в локусе D8S67, и перекрывает следующий космидный 49С2, расположенный так же в SRO 10-ю т.п.н, Космидный клон 62Н1I располагается в 300 т.п.н. дистальней локуса D8S67 и находится в SRO. Космидный клон 44G12 располагается дистальнее SRO и содержит последовательность ДНК-зонда LI 7.

2. Характеристика космидных клонов в отношении известных повторяющихся последовательностей.

В целях молекулярно-генетической характеристики космидные клоны были подвергнуты скринированию на наличие уже известных последовательностей посредством дот- и блот-гибридизации с радиоактивно меченными ДНК-зондами. Гибридизация с альфоидным саттелитом не дала результата по всем клонам. Незначит льное обогащение Al..-последовательностями (ДНК-зонд Blur 8) было выявлено только в одном клоне -59В5. Исследование на наличие рассеянных повторов типа Kpnl проводилось с использованием ПЦР (олигонуклеотидные праймеры и условия про-

ведения реакции указаны в работе Ledbetter et al.f 1990). Блоков Kpnl не выявлено. Использование ДНК-зонда (pHSR 26), содержащего прителомерный рассеянный повтор (Карпухин и др. 1993) положительного результата не дало. Таким образом, можно предполагать, что значительного количества общеизвестных диспергированных и кластеризованных повторяющихся последовательностей эти космидные клоны не содержат.

Один из субклонов - 49C2HI6, явился повторяющейся последовательностью, которая была выявлена перекрестной гибридизацией с другими космидными клонами. Локализация данного повтора на хромосомах человека была определена гибридизацией In situ. Анализ хромосом проводили на препаратах, прошедших жесткую отмывку после гибридизации. Хромосомы не идентифицировали, что позволяло определять только групповую принадлежность тех хромосом, которые имеют или не имеют метку. Все хромосомы были условно разбиты на 4 группы: I- нет зерен серебра; II- 1-3 зерна; III- 4-6 зерен; IV- 7-10 и более зерен на хромосому. В результате анализа по такой схеме, на основании подсчета зерен в 20 метафазах можно предположить, что ш имеем дело с диспергированным повтором с локализацией во многих хромосомах человека, за исключением, вероятно, одной пары хромосом из группы B,C,D,F,G и хромосомы 16.

3. Характеристика космидных клонов в отношении микро- и миниса-теллитных последовательностей.

Чтобы наиболее полно охарактеризовать данный хромосомный район был проведен поиск высокополиморфных минисателлитных и микросател-литных повторов. В качестве минисателнта была взята сог-последова-тельность фага М 13, которая является гипервариабельной последовательностью человеческого генома и представляет собой (03Т02А)п/(G4T02A)п. Космидные клоны были в мягких условиях прогиб-ридизованы с этим фрагментом. Обогащение данной последовательностью изучаемого участка не выявлено.

Микросателлитные последовательности представляют собой двух-четы-рех нуклеотидные последовательности, повторенные несколько раз в блоке и широко распространены в геноме человека. Наиболее известным является (CA)n/(GT)n повтор, встречающийся с частотой 1 на 30 т.п.о.

Космидные клоны были протестированы на наличие (СА)п повторов с использованием синтетического (СА)п зонда, любезно предоставленного л-ром О.В.Евграфовым. Три космидных клона - I0G8, 59B5, 44G12, дали

положительный гибридизационный сигнал. Космида I0G8 на блоте имела сигнал с СА-зондом на фрагменте 7 т.п.н. При обработке космиды различными рестриктазами сигнал оставался единичным. По-видимому, этот космидный клон содерут крупный блок (СА)п и требует дальнейшего изучения. Другие космндные клоны не показали выражечной блоковой организации СА- повтора.

4. Характеристика космидных клонов в отношении "генной" организации.

Для выявления СрО обогащения в космидных клонах чаще используется н^Зор из двух ферментов - SacII и Hpall, позволяющих обнаружить до 75% таких районов (Davles, 1988). При использовании указанных рест-риктаз ОС-обогащенные районы были выявлены в трех из шести космидных клонах - 10Q8, 49G12 И 144Н12.

В процессе работы по получению STS, нами был выявлен фрагмент дк , показавший значительное CpG обогащение (72,3%), что достоверно превышает ожидаемую частоту встречаемости этих нуклеотидов. Анализ последовательности показал наличие двух сайтов узнавания редкскцепящего фермента BssHlI и фермента Hpall. Кроме того, выявлена открытая рамка считывания в положении 78 нуклеотида - кодон АТО, соответствующий метионину. Нуклеотидная последовательность представлена ниже.

В5СА8

CGACCTGCTC GAGCCCTATT GOCGCOCACG GGACGGCTGG OACCCCOCGC GGGGGCCGAG GTCCGAACGT CAGCGTCi(ivrGtrGCCGACCG GCTTCGACTG CGACAACGGC GTGGCTGTG

Этот фрагмент вполне может являться одним из генов-кандидатов, участвующих в формировании фенотипа СЛГ.

■ Нами так же проведен скрининг космидных клонов на содержание мотива последовательности, кодирующей белок, связывающий ионы цинка (2п-finger, сДНК-зонд VT33), т.к. он присутствует а генах, контролирующих процессы развития и дифференцировки тканей, а также в генах вовлеченных в опухолеобразующий процесс (Hoovers et.al., 1992). Только один космидный клон (49С2, субклон 49С2Н6) показал слабый гнбридизационный сигнал с зондом, что позволяет предположить наличие данного мотива в исследованном клоне.

5. Поиск и характеристика полиморфных ДНК-маркеров.

Однин из подходов к картированию генома основан на определении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).

В соответствие со второй задачей и для дальнейшей работы по ха-

- 10 - , рактеристике данного хромосомного участка космндные клоны были подвергнуты субклонированию. Субклонирование велось по рестриктазам EcoRi и Hindíll в вектор Bluescrlpt SK-.

Из каждого космидного клона получено от 5 до 9 субклонов с различной молекулярной массой (от 9 т.п.н. до 0,5 т.п.н.). полученный на-60D субклонов состаиляет клонотеку данного района.

Ряд полученных субклонов был изучен на наличие ПДРФ. Геномную ДНК 7 неродственных здоровых доноров обрабатывали ферментами рестрикции: EcoR I, Hind III, BamHI, EcoRV, Pst I, Msp I, Taq 1. Rsa 1, Bgl II, Sac I, Hint I. Bgl I, Ban II, Dra I, Apa I, Sty I, Kpn I, Pvu II, Hae III, Sea I, подвергали гель-электрофорезу, переносили на нейлоновый фильтр (Hybond N) и гибридизовали с радиоактивно мечёнными субклонами. В случае обнаружения полиморфизма, увеличивали количество хромосом с целью определения частот аллелей и информационного содержания полиморфизма (PIC), который подсчитывали по формуле Botstein (1980). Было проведено тестирование семей для подтверждения наследуемости маркера.

Были выявлены два субклона, которые показали наличие ПДРФ. В частности, субклон 49С2Н14, составляющий около 5 т.п.н., показал наличие двух диаллельных полиморфизмов. Один из них выявляется фермент-том Seal. Молекулярная масса аллелей: AI-S.0 т.п.н., А2-5,2 т.п.н. Гетерозиготность составила 43,3%, частота аллелей: А1»61,7% А2=38,3%, PIC - 0,36. Исследование проведено на 60 нормальных неродственных хромосомах.

Этот же субклон показал полиморфизм по ферменту Taq I. Молекулярная масса аллелей: BUI.5 т.п.н., В2«1,3 т.п.н. Гетерозиготность составила 34,4%, частота аллелей: BI-66%, В2>34%, Р1С - 0,37. Исследование проведено на 64 нормальных неродственных хромосомах.

Другой субклон - 10G8R27, составляющий 3 т.п.н., показал наличие диаллельного полиморфизма по ферменту Dra I. Молекулярная масса аллелей: AU4.9 т.п.н., А2-4.7 т.п.н. Гетерозиготность составила 27%. частота аллелей: Al»64%, А2-36%, PIC -0,355. Исследование проведено на 22 нормальных неродственных хромосомах.

Другие субклоны, изученные на наличие полиморфизма, оказались неинформативны и дали единичные или множественные гибридизационные сигналы. В частности, субклон 144HI2-3 дает единичный гнбридизацион-ный сигнал по ферментам рестрикции: Hindi II- 4,5 т.п.н., BamHI- 17 т.п.н., EcoRV- 5 т.п.н., Seal- 16 т.п.н., Bgll- II т.п.н., Mspl- 4 т.п.н. Субклон 10G8R27 кроме полиморфизма по ферменту Dral дает так-

же и единичный гибридизационный сигнзл по ферментам: MspI- 8 т.п.н., EcoRI- 20 т.п.н., HIndIII— 6,5 т.п.н., Pstl- 9 т.п.н. Субклон 49С2Н14 дает единичный гибридизационный сигнал по ферменту: hindi II-12,7 т.п.н.

Полученные уникальные субклоны выявлены в каждое космидном клоне, достаточно равномерно распределены в SRO и могут быт.ь использованы в эксперементах по дозовому анализу и характеристике делеций по длине в случае микроделеций при СЛГ и ТРФС-1, что повышает их диагностическую ценность.

Полученные нами полиморфные и неполиморфные ДНК-маркеры являются совершенно новыми, достаточно хорошо охарактеризованы, удобны в работе и могут быть использованы как для картирования конкретного участка хромосомы 8, так и для проведения процедур ДНК-диагностики.

На сегодняшний день физическая карта интересующего нас района может быть представлена следующим образом (Рис. 1).

6. Получение и характеристика STS.

На сегодняшний день одна из общепринятых стратегий физического картирования генома основана на получении и характеристика. STS. (Ward. Davles, 1993). Она заключается в получении и секвенировании уникальных последовательностей ДНК, конструировании олигонуклеотид-ных праймеров и подборе условий проведения ПЦР. Если STS обладает полиморфизмом, то это повышает его ценность и позволяет использовать его не только для скрининга и построения контигов YAC, но и для генетического картирования того или иного гена» расположенного в исследуемой области.

Подобная работа проведена нами на ДНК-маркерах, полученных из Эссена. Небольшие уникальные фрагменты ДНК были получены в результате микродиссекции участка хромосомы 8q24.1 (Horsthemke et al.,1989). Мы секвенировали эти маркеры и подобрали условия для проведения ПЦР. Сконструированные нами олигонуклсотидные праймеры незначительно отличались от таковых, сконструированных в Эссене, а праймеры к зонду L24 были намного удачнее и давали устойчивую амплификацию. Первичная последовательность секвенированных зондов, олигонуклеотидные праймеры » условия проведения ПЦР приведены ниже.

Локус D8S42 (L I) AGCAAGGACA TATAATTTGC TTTGGGTAAA TGCTTAGAAG CGAAATGACT АААТТАТАТТ TTTGAGTTGT GTTCCAGTTT TTAAGAAAAT GCCAAACTGA TTTCTAAAGT GATTGTGGGA АТТС

del SRO ruiC-l ЛГС

2.0 Mb

МЭХД

локус

cen I

D8S85 1

D8S49 I

D8S42 I

D8S50 I

D8S98 I

D8S51

I

I

D8S67

I

I

I

I

D8S43 I

D8S114 I

D8S48 I

D8S47 I

D8S45 I

D8S199 I

c-myc I

tel

- 12 -

ДНК-маркер/ Полиморфизм Космидный STS RFLP/STR клон

V 1.2

L 40

L I

L 47

I0G8R27 1008-90 L 48

49C2HI4 144H12-05

CA 6 аллелей. Sacl.BclI.Aspl Hindi 11.Taql.RV,Pst I Banll, Mspl Dral Sacl

Scal.Taql

62H11-18 44GI2-4

L 32 L 31 L 24 W 3,4 ХЫ6

Hindi 11.Mspl Asp700

CA 10 аллелей

10G8

59B5 I 300 kb 1

49C2

I44HI2

1

i 300 kb

62HI1

44G12

Рис. I. Молекулярная карта участка хромосомы 8q24.1 и SRO при СЛГ.

- 13-

Праймеры: 1А 5' ТСС GTG ААТ GAA OTT CCA ATA TGG IB 5' CAA GGA CAT ATA ATT TGC TTT GGG Тд - 94°С Г, То - 55°С Г, Тс - 72°С 1», завершение реакции - 72°С 10* Продукт - 80 п.н. концентрация праймеров - 500 пМ.

Локус D8S45 (L 24) CCCAGAGTAA ОСАТТСААТА AATGTTAGCT ATTATTGAAA АТСССАТААА.AATGAAACAA GAGTGTTCAA АТАТСТАСАТ GTTCACGTGG TCaAATTGAC ATAGGTGTTG GCTACAGTTG CTGTGG

праймеры: 24А 5' GAG TAA GCA TTC ААТ AAA TGT TAG С

24B 5« AAC TGT AGC CAA CAC СТА TGT С Тд - 94°C 1•. To - 58°C I \ Tc - 72°C I•, завершение реакции - 72°C 10' Продукт - 120 п.н.. концентрация праймеров - 500 пМ.

Локус D8S48 (L 32) ССАСАТТАСС САТАСАТААС TTAAATACGC ААТААААТТО АСГААМТГТ AATCTGCTTT TAAATAGTCA CCATGCTCAG АААТТСТТАА GTOG Праймеры: 32А5' CAC ТТА AGA ATT ТСТ GAG CAT GGT G

32В 5' CAT TAC CCA TAG ATA ACT TAA ATA CG Тд - 94°С 1', To - 53°C 1', Tc - 72°C 1'. завершение реакции - 72°C 10' Продукт - 78 п.н., концентрация праймеров - 500 пМ.

Локус D8S49 (L 40) CCACAAGTAT ACACATTTAG CAGTTTTTTG TTTGTTGTTT GTTTGAGAGT TGCTTGTTAA АСАТТТТССА GCACACCGGT GATCTTATAT GTCCAGCACA CATATCTGCC ААТТСГССТТ OCTGTTCATT GGAATTGG

Праймеры: 40А 5' CAA TTC CAA TGA АСА GCA AGC AG 40В 5' CCF CAA OTA TAC ACA TTT AGC AG Тд - 94°C 1•, То - 58°C t•, Tc - 72°C 1 ', завершение реакции - 72°C 10' Продукт - 68 п.н., концентрация праймеров - 500 пМ.

Локус D8S50 (L 47) ССАСАААААС TGAATGTGAG AAACTGAGTG ACTAGCCCGC TTATCCAAGA CCCTTAAGAG GTCTGTGOTT ATCTGAAGTT AATCGTGGTC TCTGCTTATC AGTAAAGGCA TAAATCAGCT СТСТТТАААА TAUCTTTCCT AAACTAGtGC ACAAGTGATT TTTCAGATTA AGATTCAGCA GAAAGCTCAT AATTTAAGtA TAGTGG

Праймеры: 47A 5' CAC AAA AAC TGA ATG TGA GAA ACT G

47B 5' CAC TAT ACT TAA ATT ATG AGC TTT CTG тд - 94°C 1'. To - 58°C.1\ Tc - 72eC I'. завершение реакции - 72°C 10' Продукт - 179 п.н.. концентрация праймеров - 500 пМ.

Локус D8S51 (L 48) CACCTTGCCA TATAGAATAA GTTGTTTGTA CAATGTCACT TATGTCCTGT TGTCAATGTA CTACTTTGAT ATTATTCTTA CTATACAGTA GATGTGATTA CCTATGGCTG CTGCAGATTG AATAAATTCA CTATCAGCTA TCGAAACCYi ATTGCAACTT CATTCACAAG TGG Праймеры: 48A 5' CTT GTG AAT GAA GTT GCA ATA TGG 48B 5' CAL CTT GCC ATA TAG AAT AAG AAG Тд - 94°C 1'. To - 55°С Г, Тс - 72°C Г, завершение реакции - 72°С 10' Продукт - 127 п.н., концентрация праймеров - 500 пМ.

Нами были секвенированы небольшие субклоны, полученные при субклонировании космидных клонов. Анализ базы данных (Genbank, ИМБ РАН) показал, что это человеческие последовательности, не имеющие гомологии с прокариотами и вирусами, и могут служить STS. Нами выбраны четыре последовательности, соответствующие локусам хромосомы 8q24.t, для которых пока не существовало подобных маркеров. Первичная последовательность и условия амплификации приведены ниже.

Локус D8S43 (44G12-4) acagagagca GGCTTGAAAC GCTCTTGTTG TCGAATTTGC AAGTGGAGAT TTCAGCCGCC GCTTTGAGGT CAATGGTAGA ATAGGAAATA TCCTTCGTTA TAGAAACTAG ACAGAAGTAT TCTCATGAAC TCCTTTGTGA TGTGTGCGTT CAACTCACAG AGTTTAACCT ТТСТТТТСАС GACCGTTAGC AACTCTCTGT TTGTACACAG TCTCGCAAGT GCGATCGTTC AGACCTCT1T GAGGCCTTCC GTTGGAA

Праймеры: 5' CAG AGA GCA GGC TTG AAA CGC 5' CAA CGGAAG GCC TCA AAG AGG Тд - 94°C 1'. To - 66°C 1,5', Tc - 72°C 2', завершение реакции - 72е С 10'. Продукт 245 п.н. Концентрация праймеров - 300 нМ.

Локус D8S67 (144Н12-05) CTCGCCATCA TGATTATTCC GTACATTGCG GCGGTAATGC GTGATGTGTT CGAACAAACC CCGGTGATGA TGAAAGAGTC GGCCAACGGT ATTGGCTGCA CCACCTGGGA AGTTATCTTG GCGTATCGTT CTTCCGTTCA CCAAAAATTG GTGTTATCGG CGGCATCATG TGGGGTGGGT TGGGGG

Праймеры: 5' СТС GCC АТС ATG ATT ATT CCG 5* CAA ССС АСС CCA CAT CAT GC Тд - 94°С Г, То - 60°С 1,5', Тс - 72°С 2', завершение реакции - 72е С 10'. Продукт 182 п.н. Концентрация праймеров - 250 нМ.

Локус D8S43 (62НИ-18) TGTCTATP'C GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG TGTAGATAAC TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGGCC CAGTTGTGCA ATGATACCGC GAGACCCACG CTCAGGGGCT CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCUGG CGAGTAGAAG TGGTCCTGAA TTTATTGTGG CTCATCCAGG ТСТАТТААГГ GTTTGGGGAA AGTGAGAGTO AAGTAGTTGT GAC

- 15 -

Праймеры: 5' СТА ТТТ CGT ТСА ТСС ATA GTT GCC

5' СТА СТТ САС ТСА СТС ТСА СТТ ТСС СС ТД - 94°С Г, То - 64°С 1,5'; Тс - 72°С 2'. завершение реакции - 72° С 10'. Продукт 221 п.н. Концентрация праймеров 500 нМ.

Локус D8S98 (10G8-90) TAGGGCTGGG GCAAATCCAC CGTCTCTTTG СТААААСАСА GCAAGACTCA СССТТАТТСС ААТТСССААС AAGTTCCTCA TCTCCATCTG AGATCACCTG AGTTCAGGAG TTCAAGACCA GCCTGGCCAA CATGGTGAAA CCCCGTCTCT АСТАААААТА CAAAATTAGC CAGGTTGGTG GCGGAAGCTA TTTAGGGATC TGTGAGCTAC TGGAGCTACG CTACTGGAGC TAG Праймеры: 5' CTG GGG CAA АТС САС CGT СТС 5' СТА GCT ССА GTA GCG TAG СТС Тд - 94°С 1', То - 62°С 1,5', Тс - 72°С 2', завершение реакции - 1;° С 10'. Продукт 228 п.н. Концентрация праймеров 500 нМ.

Полученные STS приближают нас к построению оптимальной физической карты с разрешением 100 т.п.н. для исследуемого района хромосомы 8q24.1.

7. Краткая клинико-цитогенетическая характеристика пациентов. Пациент 1. Классический фенотип СПГ. Кариотип: 46,XY, del(8)(q24.1l-q24.13). Кариотип родителей без патологии. Пациент 2. Классический фенотип СЛГ. Кариотип: 46,ХУ, del(8)(q24.1l-q24.2). Кариотип родителей без патологии. Пациент 3. Классический фенотип СЛГ. Кариотип: 46,XY, del(8)(q24.11-q24.12). Кариотип родителей и сибса без патоло-чи. Пациент 4. Классический фенотип СЛГ. Кариотип: 46,XX, del(8)(q23-q24.12). Кариотип родителей без патологии. Пациент 5. Классический фенотип СПГ. Кариотип: 4tí,XX, del(8)(q24.11-q24.2). Кариотип родителей без патологии. Пациенте. Классический фенотип СЛГ. Кариотип: 46,XY, del(8)(q24.Il-q24.13). Кариотип родителей без патологии. Пациент 7. Классический фенотип ТРФС-1. Кариотип: 46,XX. Пациент 8. Классический фенотип ТРФС-1. Кариотип: 46,XX, del(8)(q24.ll). Кариотип родителей без патологии. Пациент 9. Классический фенотип ТРФС-1. Кариотип: 46,XV del(8)(q23-q24.11). Кариотип родителей без патологии.

Пациенты с МЭХД и члены их семей имели нормальный кариотип. Ми<> жественные экзостозы в семейных случаях подтверждены рентгенолог!! чески.

8. Характеристика длины делеций и поиск SRO у пациентов с СЛГ и I »MC-1.

В целях характеристики делеций у пациентов с СЛГ > ТРФС-1 по длине и выявления наименьшего участка перекрыванля всех делеций нами были проведены эксперименты по анализу дозы гена с использованием ЛНК-маркеров, неимеющих полиморфизма и дающих единичный гибридизационный сигнал при блот-гибридизации с геномной ДНК. в частности, были использованы ДНК-маркеры: 10G8R27 (D8S98), дающий гибридизационный сигнал в районе 6,5 т.п.н. при рестрикции геномной ДНК ферментом Hindi II, L48 (D8S51), дающий гибридизационный сигнал в районе 4,.5 т.п.н. при рестрикции геномной ДНК ферментом Hindi II и 144HI2.3 (D8S67), дающий гибридизационный сигнал в районе 4,5 т.п.н. при рестрикции ДНК тем же ферментом. В качестве референсного маркера был использован ДНК-зонд pML34 (D15S9), картированный на хромосоме 15 и дающий гибридизационный сигнал в районе 6,3 т.п.н. при гидролизе ДНК ферментом НIndIII. Эти маркеры были выбраны в связи с тем, что ранее было установлено, что наименьшим участком перекрывания всех делеций у пациентов с СЛГ является локус D8S51 (Horsthemke et а!.,1991) и локус D8S67 (Parrlsh et al.,1991). Результаты этого исследования представлены в таблице 1. Радиоавтографы оценивали визуально и с помощью денситометра.

Как видно из таблицы, все больные с СЛГ имеют только одну догу гена по всем тестируемым маркерам. Это неудивительно, т.к. все он* имеют цитогенетически определяемую делецию, затрагивающую "критический" участок хромосомы 8q24.l2. Трое больных с ТРФС-1 имели несколько иную картину. В частности, все пациенты имели делецию локусос D8S98 и D8S51 в то время как локус D8S67 был неповрежден. Это подтверждает наше предположение, что гены, отвечающие за формирование фенотипа ТРФС-1, располагаются проксимальнее, а ген МЭХД - дисталь-нее, в участке перекрывания делеций при СЛГ. Таким образом, делеци-онное картирование позволяет нам сузить область поиска возможной гена-кандидата МЭХД и начать его с области локуса DoS67. Кроме того, часть пациентов с СЛГ и ТРФС-1 были изучены на предмет ПДРФ и происхождения делеций.

9. Анализ ПДРФ у пациентов с СЛГ, ТРФС-1 и МЭХД.

Нами был исследован ПДРФ в семьях, страдающих МЭХД и в семьях < СЛГ и ТРФС-1. Это исследование было проведено с целью выяснения.про исхождения делеций при СЛГ и ТРФС-1, возможной характеристики вели'

Таблица I.

Результаты дозового блот-гибридизационного анализа пациентов с cjii ■

ТРФС-1

Пациенты / Локусы D8S98 D8S51 D8S67 Dl.'iiW

Пациент 1 СЛГ ♦ Н.т.

Пациент 2 СЛГ и.т. + +

Пациент 3 СЛГ ♦ + + «

Пациент 4 СЛГ ♦ н.т. +

Пациент 5 СЛГ ♦ •f + +»

Пациент 6 СЛГ н.т. +

Пациент 7 ТРФС-1 н.т. +

Пациент 8 ТРФС-1 + ♦

Пациент 9 ТРФС-1 +

чины делеций и для поиска сцепления полиморфных маркеров с МЭХД. в исследование были взяты ДНК-маркеры, полученные нами - 49С2НМ (ПДРФ по Seal и Taql), а так же полиморфные маркеры Li, L24, L32, L40, L47, L48. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Семья Дж. оказалась гомозиготной по локусу D8S51, хромосома, несущая мутацию гена МЭХД имеет аллель DI. По локусу D8S67 (ПДРФ по Seal) нее больные в семье имеют аллель AI. Использование этого же маркера, имею щего ПДРФ по Taql, показало появление дополнительного гибрид лационно го сигнала в области 6,8 т.п.н. (условно - аллель С), который наследи вался совместно с аллелем В1 у всех больных с МЭХД. По локусу D8sr осе больные имели аллель Е2, а по локусу D8S50 - аллель F2.

Семья Ум. по локусу D8S5I была гетерозиготна, по локусу D8S67 (ПДРФ по Seal) больные в семье наследовали аллель AI. По этому же локусу (ПДРФ по Taql) все больные показали наличие дополнительного сигнала - аллель С, который наследовался совместно с аллелем В1. По локусу DRS12 больные наследовали аллель El, а по локусу D8S50 все члены семьи били гетерозиготны.

Больные в семье Сав. наследовали аллель DI по локусу D8S5I. аллел> А2 по локусу D8S67 (Seal) и показали наличие дополнительного аллели С, который наследовался совместно с аллелем В2 (ПДРФ по Taql). В ло-кусе D8S42 наблюдалась гомозиготность по аллелю Е2, а в локусе D8Sc>o заболевание наследовалось совместно с аллелем FI.

В семье Шах. заболевание наследовалось с аллелем d1 по локусу D8S51. В локусе D8S67 (Seal) заболевание сопровождалось аллелем А2, а по ферменту Taql появляется дополнительный аллел С, который наследуется совместно с аллелем В1. Локус D8L.2 не информативен, т.к. все члены семьи гетерозиготны, а по локусу D8S50 заболевание наследуется с аллелем F2.

Таким образом, наибольший интерес представляет ДНК-зонд из локуса D8S67 (ПДРФ по TaqlJ который во всех четырех семьях с МЭХД показал появление дополнительного гибридизационного сигнала в области 6.8 т.п.н. (Рис. 2). Можно предполагать, что этот ДНК-маркер является внутригенным или расположенным в непосредственной близости от гена. Можно так же предполагать, что мутации в гене МЭХД скорее всего представлены делециями в определенном участке, которые повреждают один или несколько сайтов узнавания для фермента Taql. Кроме того, этот ДНК-зонд обогащен CpG-нуклеотидами (радиоактивно меченный dCTP имеет включение в 6 раз большее, чем dATP при проведении ник-трансляции). Во всяком случае, использование ДНК-зонда 49С2Н14 в целях ДНК-диагностики может оказаться весьма продуктивный,.

Исследование пдрф в семьях с слг и трфс-l подтвердило результаты экспериментов по делеционному картированию, в частности, в семье Сыс. пробанд с трфс-1, не имевший цитогенетически определяемой деле-ции, показал гомозиготность по локусам d8s51 и d8s50 и гетерогигот-ность по локусам d8s42 и d8s67, что может свидетельствовать о небольшой делеции. Семья Мур. (пробанд с трфс-1) оказалась мало информативной по локусу d8s67 (пдрф по Seal). Другие локусы не тестировались. Семья Коз. (пробанд с трфс-1) показал наличие делеции в локусе d8s51, а в локусах d8s50 и d8s42 ее можно предполагать. Локус d8s67 не поврежден.

Пробанд с СЛГ (семья Ив.) имеет цитогенетически определяемую деле-цию и гомозиготность по всем тестируемые локусам. Семейный анализ локуса D8S50 показывает, что делеция произошла в материнской хромосоме.

Пробанд с СЛГ (семья Анд.) показывает гомозиготность по всем тестируемым локусам. Семейный анализ не позволяет определить происхождение делеции.

Пробанд с СЛГ (семья Неч.) так же демонстрирует гомозиготность по ноем локусам. Поскольку семья неполная, трудно говорить о происхож-лгнии делеции.

Учитывая факт наличия цитогенетически определяемых делеций у паци-

Таблица 2.

Анализ ПДРФ в семьях с МЭХД, СЛГ и ТРФС-1.

Локусы

Семьи Кариотип D8SSI D8S67 D8S42 08SS0

D-Sacl A-Scal E-Hlndlll F-Mspl B.C-Taql

Д* отец (МЭХД) N DIDI A1A2 BIB2C E1E2 F2F2

мать N DIDI A2A2 B2B2 EIE1 FIF2

дв.снбс пр. (МЭХД) Ы D1D1 A1A2 BIB2C E1E2 FIF2

.пробанд 1МЭХД) N DIDI A1A2 BIB2C E1E1 F2F2

пробаид (МЭХД) N DIDI A1A2 B1B2C E1E2 FIF2

Ум отец N D1D2 A2A2 B1B2 E2E2 FIF2

мать (МЭХД) N D1D2 A1A2 BIBIC E1E2 F1F2

пробанд (МЭХД) N D1D2 AIA2 B1B2C E1E2 FIFI

дочь проб. N D1D2 AIA2 B1B1C E1EI FIF2

сав отец N D1D2 Al Al BIBI E2E2 F1F2

мать (МЭХД) N DIDI A2A2 BIB2C E2E2 FIFI

пробанд (МЭХД) N DIDI AIA2 BIB2C E2E2 FIF2

Шах отец N DID2 AIAI BIBI E1E2 F1F2

мать (МЭХД) N DID2 A1A2 BIBIC E1E2 F2F2

пробанд (МЭХД) N DIDI AIA2 BIBIC EIE2 F2F2

Сыс отец N D1D2 A1A2 BIB2 EIEI FIFI

мать N DIDI A2A2 BIB2 E2E2 FIF2

пробанд (Т WC- 1) N Dl- AIA2 BIBI E1E2 F1-

Ивн отец N DID2 AIA2 B1B2 EIE2 F1F2

мать N DIDI A2A2 B1B2 E2E2 FIFI

пробанд tCÍI Г) del(8q) Dl- A2- Bl- E2- F2-

Анд отец N DID1 A1A2 - E2E2 F1FI

мать N DIDI AIAI B1B2 E2E2 FIF2

пробанд (СЛГ) del(8q) DI- Al- B2- E2- Fl-

Мур отец мать N N m AIA2 AIAI "* ™

пробанд (ТРФС-1) del(8q). - Al- - - . -

Коз мать DIDI A2A2 BIBI EIE2 F2F2

пробанд (ТРФС-1) del(8q) D2- A1A2 BIB2 E2- F2-

Неч отец DID1 AIA2 BIB2 E2E2 FIF2

пробанд (СЛГ) del(8q) Dl- Al- Bl- E2- 1-2-

Савч. bJox

М О » М О Р

м «им»

6.8 6.5

''не. 2. Гибридизация ДНК-зонда 49C2HI4 с ДНК, гидролизованной ферментом Taql, в семьях с МЭХД. Необычный гибридизационный сигнал в области 6,8 т.п.н. ука'зан стрелкой.

ентов с СЛГ и ТРФС-1, видимая гомозиготность по тестируемым лону^м скорее всего является гемиэиготиостью.

Анализ ГЩРФ подтвердил что у больных с ТРФС-1, в отличие от бит. ных с СЛГ, локус D8S67 не поврежден делециями. В тоже время, ни у одного из больных не выявлен дополнительный аллель С в этом локу. <• (ПДРФ по Taql), что может являться подтверждением тому, что возм. ный ген-кандидат МЭХД локализован именно в этом локусе. Можно пред полагать, что мутация или делеция повреждает ген-кандидат МЭХД 1<«ь же значительно, как и делеция при СЛГ, а это в свою очередь, при»., дит к недостаточному функционированию гена в гемизиготном состоянии Это предположение может свидетельствовать о том, что предполагаемым ген МЭХД является регуляторным.

10. Анализ мнкросателлитных аллелей и SSCP у пациентов с СЛ1. ТРФС-1 и МЭХД.

Для более полной характеристики хромосом, несущих мутацию, мы использовали два мнкросателлитных (СА)п маркера, расположенных на расстоянии 6,6 сМ друг от друга и фланкирующих область делеций при СЛГ (Cook et. al., 1993). Первый - расположен проксимально, соответс твует локусу D8S85 и имеет 6 аллелей (Weber et al.,1989). Второй -расположен дистально, соответствует локусу D8S199 и имеет 10 аллелей (Tomfohrde et al.,1992). Мы использовали опубликованные праймеры и условия проведения ПЦР. Олигонуклеотидные праймеры и условия прове дения ПЦР: D8S85

VI 5' AGC TAT CAT CAC ССТ ATA AAA Т W2 5' AGT TTA ACC ATO TCT CTC CCG

Тд - 94°С 1', То - 55°С 2', Тс - 72°С 2'. Завершение реакции -72'С 10'. Продукт - 72-85 П.Н. D8S199

W3 5' ССТ ТСТ ТТТ ТСТ ОСТ СТО CT W4 5' AGT CAC AGA OTA ААТ GAT GG

Тд - 94°C I', To - 55°C 2'. Tc - 72°C 2'. Завершение реакции -72°C 10'. Продукт - 208-230 п.н.

Аллелн в 6% ПААГ выявляли нерадиоактивно с использованием окрась» AgN03.

Результаты анализа оказались мало информативны и показывают, чк. микросателлнтные аллели наследуются потомством без рекомбинационмкч событий в семьях. У пациентов в семьях с СЛГ и ТРФС-1 делении м.

затронули исследуемых локусов.

Одним из наиболее успешно используемых методов детекции мутаций в определенных участках ДНК является метод анализа Б8СР, основанный на различной подвижности в.денатурирующем ПААГ последовательностей ДНК различного нуклеотидного состава (ОгНа е! а 1.,1991). Обнаружить од-нонитевой конформационный полиморфизм в исследуемых семьях не удалось. Это свидетельствует о том, что указанные локусы не повреждаются мутацией, приводящей к МЭХД. В то же время результаты экспериментов показывают, что метод БйСР не пригоден для выявления крупных делений.

11. Гаплотипирование семей с МЭХД.

Результатом исследования различных вариантов полиморфизма ДНК явилась попытка гаплотипирования семей с МЭХД с целью выявления группы сцепления ДНК-маркеров в хромосоме, несущей мутацию в предполагаемом гене МЭХД. Мы прекрасно понимаем, что количество семей и их качественный состав не позволяет сделать окончательного вывода, тем не менее, это первая попытка использования значительного количества достаточно плотно расположенных полиморфных ДНК-маркеров в предполагаемой области мутации. Результаты исследования суммированы на рисунке 3.

Безусловно, наиболее ценным полиморфным ДНК-зондом является полученный нами субклон 49С2Н14, демонстрирующий появление нового фрагмента в области 6,8 т.п.н. при рестрикции геномной ДНК больных МЭХД ферментом Тая I, что может свидетельствовать о том, что это внутри-генный маркер или раположенный в непосредственной близости от гена-кандидата. Это является многообещающим для дальнейшей разработки процедур косвенной ДНК-диагностики МЭХД.

О

и XI

В* Е1

Рг Гд

01 01

А» А2

Ва Ъг

Ъ Ух

Ди».'

и X.

Ег £<

&

Р, №

А< Ал

СВд в2

У5 Уг

Хх *1 х> Хг

1г С, и Е.

Ра Р»

Р* 01 0. 0«

А< Аа А. А«

СВ, Вг С8( в*

Уз У. У» У«

О

Х| XI

Ех Е«

Я. Рх

0. 01

А* А,

съ

Ух У*

X, Х4

Е« Е,

XI X» Рх Га

Е* Е* 01 02

Рх • А1 А1

Вх &1

А. Ах У' Уд

сь 6.

Ух У4 Сав:

а В

X* X«

& £1

р» Р1

0« 01

А. Аг

В,

У»

X, X,

Ех Сг

Р«

о1 Оа

А» А.

СВ. Б1

У4 У»

-Ум:

Хг XI

& е*

Р1 Р*

0| 02

Ах Аг

Св. Вх

1г У1

■О

XI х»

Е* Ег

Г4 Р«

01 01

Ал Ал

01 В,

Ух У2

■О

% Хг

Е. Ег X» Хг

Рх Р* Б1 е1

0« Ох Р1

А« Аг 01 0<

С8. В« Ад А»

У» У* СВ,

Уж У*

Л X*

Е1 Ел

Р4 Р»

01 01

А, А1

СВ* 61

У4 Ух

XI X»

Ех Е»

Рх Рг

Рг П1

А» Ад

бх в!

Л Уг

Уаа.

Рис. 3. Гаплотипирование хромосом, несущих мутацию, в семьих с МЭХД.

ВЫВОДЫ

1. Проведена молекулярно-генетическая характеристика 210 т.п.н. расположенных в наименьшем участке перекрывания делеций при СЛГ в участке хромосомы 8q24.l. Показано отсутствие обогащения распространенными повторяющимися последовательностями. В то же время, в трех космидных клонах (10G8, 59В5 и 44G12) выявлено обогащение микросателлитным повтором (СА)п, выявлен новый диспергированный повтор с плечевой локализацией на хромосомах, обнаружено обогащение CpG-последовательностями клонов (10G8, 49С2 и 144Н12).

2. Проведен поиск ПДРФ в полученных субклонах по 20 ферментам рестрикции. Выявлено два новых ДНК-маркера, имеющих ПДРФ, Один из них (10G8R27) имеет диаллельный полиморфизм по ферменту Dral, другой (49С2Н14)- два диаллельных полиморфизма по ферментам Seal и Taql. Ряд субклонов показал отсутствие полиморфизма и единичные гибри-дизационные сигналы, что позволяет их использование для проведения дозового блот-гибриднзационного анализа при характеристике делеций хромосомы 8q24.1 по длине.

3. Получены новые секвенированные маркерные участки (STS), пригодные для физического картирования. В общей сложности секвенировано более 2 т.п.н. в исследуемом районе. Выявлена последовател1 ность ДНК, содержащая CpG-островок и открытую рамку считывания, которая может являться геном-кандидатом, участвующим в формировании фенотипа СЛГ.

4. Проведено делеционное картирование пациентов с СЛГ и ТРФС-I, имеющих делецню хромосомы 8q24.1, с использованием полученных ДНК-зондов. Определена область наиболее вероятного расположения гена-кандидата для МЭХД.

5. Выявлен ДНК-маркер 49С2Н14, расположенный в области локализации предполагаемого гена МЭХД. Комплексная характеристика полиморфизма ДНК позволила определить гаплотип хромосом, несущих мутацию, в семьях с МЭХД и подойти к разработке процедур ДНК-диагностики.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Д.В.Залетаев, М.В.Немцова, Е.О.Поэднякова, Н.П.Кулешов."Цитоге-нетнческое и молекулярно-биологическое изучение хромосомного района 8q24.1."// Ill Российская конференции "Геном человека", Черноголовка, - 1993.- тезисы докл. - С. 74

2. М.В.Немцова, Д.В.Залетаев, А.Н.Яценко, Н.П.Кулешов, Т.Г.Цветко-ва. "Цнтогенетическая и молекулярная диагностика синдрома Ланге-ра-Гидиона и множественной экзостозной хондродисплазии." // Сборник "Молекулярная диагностика наследственных заболеваний и медико-генетическое консультирование."- М.- МОНИКИ,- - 1994.

3. Д.В.Залетаев, М.В.Немцова, А.Н.Яценко, Т.Г.Цветкова, Н.П.Кулешов "Молекулярно-биологическая диагностика микроструктурной хромосомной патологии и характеристика "критических" хромосомных районов при синдромах Лангера-Гидиона и Прадера-Вилли." // IV Российская конференция "Геном человека", Черноголовка, - 1994. - тезисы докл. -С.

4. D.V.Zaletayev, M.V.Nemtsova. N.P.Kuleshov, T.G.Tsvetkova, L.Y.Frolova. "Towards the dlagnosys of the cytogenetic anomalies on the TRPS, type 1 and II and multiple exostoses." // 25 Ann. Meeting ol European Soc. Hum. Genet. Abstr, 1993.- P.110.

5. M.V.Nemtsova, A.N.Yatsenko, N.P.Kuleshov, D.V.Zaletayev. "Deletions length and SRO detection on patients with LGS and TRP°-I." // 26 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstr, 1994.- P.

6. D.V.Zaletayev, M.V.Nemtsova, A.N.Ytsenko, N.P.Kuleshov. "Attempts to hereditary multiple exostoses gene fine mapping". // 26 Ann. Meeting of European Soc. Hum. Genet. Abstr, 1994.- P.

Положения, выдвигаемые на защиту.

/

1. Проведена молекулярно-генетическая характеристика 210 т.п.н., расположенных в мало изученном районе перекрывания всех делеций при синдроме Лангера-Гидиона в участке хромосомы 8q24.1.

2. Получены новые, имеющие ПДРФ, ДНК-маркеры, и охарактеризованы частоты их аллелей.

3. Получены новые секвенированные маркерные участки (£15) для физического и генетического картирования участка хромосомы 8я24.1.

4. Определена область локализации предполагаемого гена-кандидата для множественной акаостозной хондродисплазии.

УЧАСТОК МНОЖИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ ВОНЦ АМН СССР

пода к ПЕ1АТИ24А94 л---1 заказ 6 % тираж '00 аа.