Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2 при множественной экзостозной хондродисплазии и спорадических злокачественных новообразованиях

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чеснокова, Галина Геннадьевна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Клиническая характеристика заболевания.

1.2 Картирование и клонирование генов EXT.

1.2.1. Синдром Лангера-Гидиона (С ЛГ).

1.2.2. Синдром DEFECT 11.

1.2.3. Генетическое картирование МЭХД.

1.2.4. Клонирование гена ЕХТ1.

1.2.5. Клонирование гена ЕХТ2.

1.3. Возможная роль генов ЕХТ в процессе формирования скелета позвоночных.

1.3.1. Hedgehog белки как регуляторы эмбрионального развития.

1.3.2. Молекулярная регуляция дифференцировки хряща.

1.3.3. Предполагаемые функции и свойства ЕХТ белков.

1.4. Поиск причин, приводящих к озлокачествлению.

1.5. Поиск и характеристика мутаций.

1.5.1. Типы и номенклатура мутаций.

1.5.2. Методы идентификации мутаций.

1.5.3. Детекция мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Обследование больных.

2.2. Забор венозной крови.

2.3. Выделение геномной ДНК.

2.4. Рестрикция и электрофорез при проведении блотинг-гибридизации.

2.5. Гибридизация с радиоактивно меченым зондом.

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.7. Радиоактивная нерадиоактивная детекция точковых мутаций методом SSCP.

2.8. Анализ гетеродуплексов.

2.9. Определение нуклеотидной последовательности.

2.10. Программное обеспечение компьютерного анализа ДНК.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

3.1. Характеристика больных.

3.2. Стратегия поиска мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 в различных группах больных.

3.3. Исследование больных с наследственной формой МЭХД.

3.3.1. Анализ полиморфных ДНК-маркеров в семьях с МЭХД.

3.3.2. Поиск мутаций в генах ЕХГ у больных с наследственной формой заболевания.

3.4. Исследование больных со спорадической формой заболевания.

3.4.1. Точковые мутации в гене ЕХТ1.

3.4.2. Точковые мутации в гене ЕХТ2.

3.4.3. Структурные изменения в генах ЕХТ1 и ЕХТ2.

3.5. Исследование больных МЭХД с экзостозами, претерпевшими злокачественную трансформацию и больных со спорадическими формами злокачественных новообразований.

3.6. Характеристика полиморфных аллелей в гене ЕХТ1.

3.7. Анализ метилирования промоторной области генов ЕХТ1 и ЕХТ2 в

3.8. экзостозах, хондро- и остеогенных саркомах.

3.9. Частота и структура мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2 среди исследованных больных.

3.8.1. Спектр выявленных мутаций.

3.10. Причины, приводящие к озлокачествлению.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2 при множественной экзостозной хондродисплазии и спорадических злокачественных новообразованиях"

Актуальность проблемы.

Множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) - аутосомно-доминантное заболевание, встречающееся в популяции с частотой 1:50000, составляющее до 10% обращений в специализированные клиники и более чем в 70% представленное семейными случаями. МЭХД характеризуется наличием множественных хрящевых экзостозов (МЭ) в районах костного роста и проявляется до 4-х лет. Рост и оссификация экзостозов замедляет рост кости и, как следствие, вызывает деформации скелета. Экзостозы вызывают сдавливание крупных сосудов и нервов, что требует неоднократного операционного вмешательства по их удалению в течение периода роста и развития организма. До 14% МЭ имеют тенденцию к трансформации во вторичную хондрому и хондро-саркому. Заболевание генетически гетерогенно и гены МЭХД ЕХГ1 и ЕХТ2 картированы и клонированы на хромосомах Щ24Л и 11р12, соответственно. Предполагаемый третий ген картирован в коротком плече хромосомы 19, но до сих пор не клонирован. Поскольку гены МЭХД клонированы недавно, они недостаточно изучены. Предполагается, что гены ЕХТ1 и ЕХТ2 являются генами-супрессорами канцерогенеза, т.к. установлено их участие при злокачественной трансформации хрящевой и костной ткани. Спектр мутаций генов, приводящих к экзостозам, и злокачественной трансформации не определен. Изучение структуры генов, их мутаций и причин злокачественной трансформации является как фундаментальной проблемой, способствующей пониманию закономерностей развития и дифференцировки специализированных тканей и процессов неопластической трансформации, так и социально значимой задачей по диагностике, профилактике, прогнозированию течения этого заболевания.

Цель и задачи исследования: Основной целью работы является изучение и характеристика структурных аномалий и точковых мутаций генов ЕХТ1 и ЕХТ2, приводящих к множественной экзостозной хондродисплазии и злокачественной трансформации экзостозов.

Задачами исследования являются:

1. Провести комплексный анализ области локализации гена ЕХТ1 в районе хромосомы 8q24.1 и гена ЕХТ2 в районе хромосомы lip 12 на предмет обнаружения микроструктурных нарушений;

2. Провести поиск и характеристику точковых мутаций в генах ЕХТ1 и ЕХТ2;

3. Изучить причины трансформации экзостозов в хондросаркому и остео-генную саркому в операционном материале и состояние генов ЕХТ в спорадических случаях тех же новообразований;

4. Разработать диагностические подходы для лабораторной ДНК-диагностики МЭХД.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования изучены частота и спектр мутаций генов ЕХТ у больных с МЭХД. Все выявленные в данной работе точковые мутации генов ЕХТ описаны впервые. Описаны три новых полиморфизма гена ЕХТ1, для двух из них определены частоты, как среди больных, так и контрольных индивидов. Показано, что для гена ЕХТ2 более характерны структурные изменения, чем точковые мутации. Два случая структурных изменений в области локализации гена ЕХТ1 затронули потенциально регуляторную область в 60 т.п.н. от 3' области гена, что заставляет предполагать наличие мутаций типа «эффект положения» в случаях, где точковых и структурных аномалий генов не выявлено при заболевании МЭХД. Впервые описаны мутации ЬгапсЬ-сайтов в интронах 7 и 10 гена ЕХТ1. Все структурные изменения и мутации в не кодирующих районах ЕХТ генов показаны впервые. Проведен анализ зиготности в операционном материале экзостозов и злокачественных новообразований, показавший потерю гетерозиготности по микросателлитным маркерам хромосомы 8, как в ткани экзостоза, так и при злокачественных новообразованиях. Описаны 3 новые терминальные мутации при озлокачествленных экзостозах. Впервые проведенный анализ метилирования и мутаций в промоторных областях ЕХТ генов патологии не выявил.

Практическая значимость работы.

В результате выполненного исследования разработаны подходы для мо-лекулярно-биологической лабораторной диагностики и характеристики микроструктурной патологии и мутаций генов ЕХТ при множественной экзостозной хондродисплазии. Сконструированы наборы олигонуклеотидных праймеров для обоих генов. ДНК-диагностика проведена у 36 больных с МЭХД и у 9 больных со злокачественными новообразованиями. Показано, что кроме мутаций, гены ЕХТ могут повреждаться в результате структурных изменений, в том числе и за пределами кодирующего района. Проведена пренатальная диагностика заболевания. Показано, что мутации, структурные перестройки и потерю гетерозигот-ности генов ЕХТ имеет смысл тестировать в операционном материале спорадических хондро- и остеогенных сарком. Социально-экономическая значимость результатов исследования связана с повышением точности лабораторной диагностики, пренатальной диагностикой, прогноза и профилактикой заболевания.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определены частота и спектр молекулярной патологии генов ЕХТ при МЭХД.

2. Описаны новые мутации и полиморфизмы в генах ЕХТ при МЭХД.

3. Районы локализации генов ЕХТ в ряде случаев повреждаются у больных со спорадическими остеогенными и хондросаркомами.

4. Аномалии метилирования промоторных районов генов ЕХТ не характерны при спорадических злокачественных новообразованиях и экзостозах, претерпевших злокачественную трансформацию.

5. Разработаны подходы для лабораторной ДНК-диагностики МЭХД.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Чеснокова, Галина Геннадьевна

выводы

1. Определена частота и структура молекулярной патологии генов ЕХТ при исследовании 36 семей с МЭХД. Патология выявлена в 28 случаях (78%), из них 20 (56%) - в гене ЕХТ1 и 8 (22%) - в гене ЕХТ2. 23 случая (64%) представлено точковыми мутациями, а 5 случаев (14%) структурными перестройками. Среди 9 больных со спорадическими злокачественными опухолями в 3 (33%) случаях выявлены структурные перестройки в области локализации генов EXT. Все точковые мутации и структурные изменения описаны впервые в мире.

2. В гене ЕХТ1 выявлено 16 точковых мутаций; 62,5% мутаций приводят к преждевременной терминации синтеза белка. Две мутации A1285G и 1633-39delC обнаружены у троих и двоих неродственных больных, соответственно. Выявлена структурная перестройка потенциально регуляторного района D8S67 гена ЕХТ1 в одной семье с МЭХД и аналогичная перестройка при спорадической хондросаркоме.

3. В гене ЕХТ2 выявлены 4 точковые мутации, три из которых приводят к преждевременной терминации синтеза белка. Выявлены 4 структурные перестройки в гене ЕХТ2 у больных МЭХД и две структурные перестройки - у больных со спорадическими новообразованиями.

4. Выявлено четыре полиморфизма в гене ЕХТ1 в экзонах 3 - С1065Т, 5 -A1296G, 9 - G1761A и 11 - C2170G. Три из них описаны впервые. Частота, ранее описанного, полиморфного аллеля в экзоне 9 составляет 52.5% среди больных МЭХД и здоровых индивидов, в экзоне 11 - 39.5% среди больных МЭХД и здоровых индивидов.

5. Анализ состояния зиготности районов хромосом 8q24.1 и lip 11.2 в операционном материале экзостозов и злокачественных новообразований показал потерю гетерозиготности (ПГ) по гену ЕХТ1 у трех больных МЭХД, экзостозы которых претерпели злокачественную трансформацию. У этих больных установлены терминальные точковые мутации гена ЕХТ1. ПГ по гену ЕХТ1 выявлена у четырех больных со спорадическими новообразованиями. Аналогичных изменений в области локализации гена ЕХТ2 не обнаружено.

6. Анализ метилирования CpG-последовательностей и мутаций в промоторных областях генов ЕХТ1 и ЕХТ2, как в тканях экзостоза, так и в злокачественных опухолях (спорадических и вторичных опухолях) показал отсутствие мутаций и аномального метилирования.

7. Разработаны подходы для лабораторной ДНК-диагностики МЭХД.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований среди 36 больных МЭХД (из них 11 - с наследственной формой) нами выявлены мутации в 28 случаях (78%). В гене ЕХТ1 точковые мутации выявлены в 19 (55%) случаях, в гене ЕХТ2 - в 4 (11%) случаях. В результате использования метода блот-гибридизации с ДНК-маркерами из районов локализации генов ЕХТ выявлены структурные перестройки у больных МЭХД в гене ЕХТ2 в 4 (11%) случаях. Также из 9 больных со спорадическими хондро- или остеогенными саркомами у двух выявлены структурные перестройки, затрагивающие ген ЕХТ2. Структурная перестройка в потенциально регуляторной области в 60 т.п.н. от 3'конца гена ЕХТ1 выявлена у одного больного МЭХД, аналогичная перестройка выявлена у больного со спорадической хондросаркомой, что позволяет предполагать наличие мутаций типа «эффект положения» в случаях, где точковых и структурных аномалий в генах ЕХТ не выявлено. Как точковые мутации, так и структурные перестройки в генах ЕХТ выявлены впервые. Проведенный анализ зиготности в операционном материале экзостозов и злокачественных новообразований показал ПГ по микросателлитным маркерам хромосомы 8 в образцах экзостозов в 3 случаях, в 3 образцах экзостозов, претерпевших злокачественную трансформацию, и в 4 образцах спорадических злокачественных опухолей. У трех больных МЭХД с озлокачествленными экзостозами выявлены точковые терминальные мутации во втором экзоне гена ЕХТ1 в двух случаях и в пятом экзоне того же гена в одном случае.

В результате проведенного исследования разработаны подходы для лабораторной ДНК-диагностики МЭХД.

1. Высокоразрешающий хромосомный анализ больных, позволяющий выявить микроструктурные аномалии в районах хромосом 8q24.1 и 11р12 или сбалансированные перестройки типа инверсий и транслокаций.

2. Поиск субмикроскопической хромосомной патологии в лимфоцитах и операционном материале: а). Блоттинг-гибридизация геномной ДНК с ДНК-зондами, соответствующими различным участкам критических районов и с кДНК генов. б). Анализ районов локализации генов, с использованием высокополиморфных микросателлитных последовательностей для детекции субмикроскопических делеций и/или определения гаплотипа поврежденной хромосомы при наследственной форме заболевания.

3. Поиск точковых мутаций в геномной ДНК и/или кДНК с использованием методов анализа SSCP и гетеродуплексов с последующей характеристикой мутаций секвенированием.

Результаты представленной и опубликованных в последние два года работ по выявлению точковых мутаций в генах ЕХТ у больных МЭХД показали, что в 20-25% случаев причины возникновения заболевания выяснить не удается, а в ряде случаев, и в семьях, для которых строго установлено сцепление с одним из клонированных генов EXT. Очевидно, для более полного выявления причин заболевания необходимо проводить анализ некодирующих и регуляторных областей генов ЕХТ, в частности, промоторных районов генов, экзонов 1а и lb гена ЕХТ2, представляющих собой 5' нетранслирующий район, интрона 1 гена ЕХТ1, составляющего 250 т.п.н., и др.

Результаты анализа состояния зиготности в операционном материале спорадических злокачественных новообразований по микросателлитным маркерам хромосомы 8 и 11 и анализа ПДРФ с использованием ДНК-зондов из области локализации генов ЕХТ показали, что в 5 случаях в опухолевом материале больных произошли изменения в гене ЕХТ1 (в 4 случаях - ПГ) и в 2 случаях - в гене ЕХТ2 (структурные перестройки). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что гены ЕХТ относятся к генам-супрессорам опухолевого роста. В связи с этим, был проведен анализ метилирования промоторных областей генов ЕХТ, в результате которого выявлено, что промоторные области генов ЕХТ не претерпевают аномального метилирования как в экзостозах, так и в злокачественных новообразованиях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чеснокова, Галина Геннадьевна, Москва

1. Берглезов М.А., Раззоков A.A. //Диагностика, лечение и диспансеризация детей и подростков с экзостозной хондродисплазией.// Методические рекомендации. М. 1985,17 с.

2. Волков М.В., Меерсон Е.М., Нечволодова O.JL, Самойлова Л.И., Юкина Т.П. //Наследственные системные заболевания скелета.// М.: Медицина. 1982, 320 С.

3. Горбунова В.Н., Баранов B.C. //Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.// Санкт-Петербург: Специальная литература, 1997,286 с.

4. Залетаев Д.В. //Цитогенетическое изучение менделирующих форм МВПР.// В кн."Хромосомы человека в норме и патологии" М. 1989, с. 105-117.

5. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П., Лурье И.В., Маринчева Г.С. //Синдром Лан-гера-Гидеона и делеция длинного плеча хромосомы 8.// Генетика, 1987, т.23, N.5, с.907-912.

6. Залетаев Д.В., Кулешов Н.П., Фролова Л.Ю., Сотникова E.H. //Изучение врожденных пороков развития с применением высокоразрешающих методов хромосомного анализа.// В кн: "Медицинская генетика: теория и практика."// М. 1989, с.46-52.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. "Молекулярное клонирование"// М., "Мир", 1984, 479 с.

8. Немцова М.В., Яценко А.Н., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. //Молекулярно-генетическая характеристика области делеций хромосомы 8q24.1 при синдромах Лангера-Гидиона и трихо-рино-фалангового, I типа.// Генетика. 1996, т.32, N7, с.1-7.

9. Раззоков A.A. //Множественная экзостозная хондродисплазия у детей и подростков.// Авт. канд. дис. М. 1986.

10. Axton R., Hanson I. //Conformation-based mutation detection.// J. Med. Genet., 1997, v. 34, p. 279-286.

11. Bellaiche Y., The I., Perrimon N. //Tout-velu is a Drosophila homologue of the putative tumour suppressor EXT-1 and is needed for Hh diffusion.// Nature, 1998, v. 394, p. 6688 85-8.

12. Bianco P., Cancedda F., Riminucci M., Cancedda R. //Bone formation via cartilage models: the "borderline" chondrocyte.// Matrix. Biol., 1998, v. 17, p. 3185-92.

13. Bird A. //CpG-rich islands and function of DNA methilation.// Nature, 1986, v.321, p.209-213.

14. Bitgood M., McMahon A. // Hedgehog and Bmp genes are coexpressed at many diverse sites of cell-cell interaction in the mouse embryo.// Dev Biol, 1995, v.172, p. 1126-38.

15. Blanton S. //Hereditary multiple exostoses: confirmation of likage to chromosomes 8 and 11.//Am.J.Med.Gen., 1996, v.62, p. 150-159.

16. Brenholz P., Swayne L., Twersky S., Arbeitel B., Singer N. //Dominant inheritance of the Langer-Giedion syndrome.//Am. J. Hum. Genet., 1989, v.45, p. 41.

17. Buhler E., Buhler U., Beutler C., Fessler R. //A final word on the tricho-rhino-phalangeal syndromes.// Clin. Genet., 1987. v.31, p.273- 275.

18. Buhler E., Buhler U., Stalder G., Jani L., Jurik L. //Chromosome deletion and multiple cartilaginous exostoses. Europ. J. Pediat., 1980, v. 133, p. 163-166.

19. Buhler E.M. //Molecular approaches to cytogenetics.// In:"Molecular aspects of human disease.", 1989, v.l, p.134-146.

20. Chen W., Hou J., Wagner M., Wells D. //An integrated physical map covering 25 cM of chromosome 8.// Genomics, 1996, v.32, p.l 17-120.

21. Clines, G. A., Ashley, J. A., Shah, S., Lovett, M. //The structure of the human multiple exostoses 2 gene and characterization of homologs in mouse and Caenorhabditis elegans.// Genome Res., 1997, v. 7, p. 359-367.

22. Collins F. //Positional clonning moves from perditional to traditional.// Nature Genetics, 1995, v.9, p.347-350.

23. Cotton R., Edkins E., Forrest S. //Mutation detection. A practical approach.// Oxford University Press, Oxford, 1998, 242 p.

24. Davies K. //Genome analysis.// CSH Press, Cold Spring Harbor, 1990, p.39-81.

25. Davies K.E., Read A.P. //Molecular basis of inherited disease.// Oxford University Press, 1988, 77 P.

26. Emanuel B. //Molecular cytogenetics: toward dissection of the contiguous gene syndromes.// Am. J.Hum.Genet., 1988, v.43, p.575-578.

27. Fennell S., Benson J., Kindley A., Schwarz M., Czepulkowski B. //Partial deletion 8q without Langer-Giedion syndrome: a recognisable syndrome.// J. Med. Genet., 1989, v.26, p.167-171.

28. Philippe C., Porter D., Emerton M., Wells D., Simpson A., Monaco A. //Mutation screening of the EXT1 and EXT2 genes in patients with hereditary multiple exostoses.// Am. J. Hum. Genet., 1997, v. 61, p. 520-528.

29. Friedmann T. //The human genome project some implication of extensive "reverse genetic" medicine.// Am.J.Hum.Genet., 1990, v.46, p.407-414.

30. Fritz T., Gabb M., Wei G., Esko J. //Two N-acetylglucosaminyltransferases catalyze the biosynthesis of heparan sulfate.// J. Biol. Chem., 1994, v. 18 269, p.46 28809-14

31. Frye R., Benz C., Liu E. //Detection of amplified oncogenes by differential polymerase chain reaction.// Oncogene, 1989, v.4, p. 1153-1157.

32. Ghiselli G., Lindahl U., Salmivirta M. //Foam cell conversion of macrophages alters the biosynthesis of heparan sulfate.// Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, v. 247, p. 790-5.

33. Gustavson K., Anneren G., Wranne L. //Two cases of llpl3 interstitial deletion and unusual clinical features.// Clin.Genet., 1984, v.26, p.247-249.

34. Hall B., Langer L., Giedion A., Smith D., Cohen M. //Langer-Giedion syndrom.// Birth. Defect., 1974, v.12, p.147-164.

35. Hall J., Wilson R., Kalousek D., Beauchamp R. //Familial multiple exostoses no chromosome 8 deletion observed.// Am. J. Med. Genet., 1985, v.22, p.639-640.

36. Hennekam R. //Hereditary multiple exostoses.// J.Med.Genet., 1991, v.28, p.262-266.

37. Karpen G. //Position effect variegation and the new biology of heterochromatin.// Curr. Opin. Genet. Dev., 1994, v.4, p.281-291.

38. Kingsley D. // What do BMPs in mammals? Clues from the mouse short-ear mutation.// TIG January, 1994, v. 10, p. 16-21.

39. Koyama E., Leatherman J., Noji S., Pacifici M. //Early chick limb cartilaginous elements possess polarizing activity and express hedgehog-related morphogenetic factors.// Dev. Dyn., 1996, v. 207 p. 3344-54.

40. Kronenberg H., Lanske B., Kovacs C., Chung U., Lee K., Segre G., Schipani E., Juppner H. //Functional analysis of the PTH/PTHrP network of ligands and receptors.// Recent. Prog. Horm. Res., 1998, p. 53283-301; discussion 301-3.

41. Kumar S., Balczarek K., Lai Z. // Evolution of the hedgehog gene family.// Genetics, 1996, v. 142, p. 3 965-72.

42. Kusche-Gullberg M., Eriksson I., Pikas D., Kjellen L. // Identification and expression in mouse of two heparan sulfate glucosaminyl N-deacetylase/N-sulfotransferase genes.// J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 11902-7

43. Landegren U. //Laboratory protocols for mutation detection.// Oxford University Press, Oxford, 1996, 127 p.

44. Le Merrer M., Ben Othmane K., Stanescu V., Lyonnet S., Van Maldergem L., Royer G., Munnich A., Maroteaux P. //The gene for hereditary multiple exostoses does not map to the Langer-Giedion region (8q23-q24).// J. Med. Genet., 1992, v.29, p.713-715.

45. Le Merrer M., Legeai-Mallet L., Jeannin P., Horsthemke B., Schinzel A., Plauchu H., Toutain A., Achard F., Munnich A., Maroteaux P. //A gene for hereditary multiple exostoses maps to chromosome 19p.// Hum. Molec. Genet., 1994, v.3, p.717-722.

46. Ledbetter D., Cavenee W. //Molecular cytogenetics: Interface of cytogenetics and monogenic disorders.// In: "The metabolic basis of inherited disease" Sixth edition. London, 1989, p.343-371.

47. Legeai-Mallet L., Munnich A., Maroteaux P., Le Merrer M. //Incomplete penetrance and expressivity skewing in hereditary multiple exostoses.// Clin. Genet., 1997, v. 52, p. 12-16.

48. Lewin B. //Genes 5.// "Oxford University Press.", 1994,1272 P.

49. Li J., Hagner-McWhirter A., Kjelliin L., Palgi J., Jalkanen M., Lindahl U. //Biosynthesis of heparin/heparan sulfate. cDNA cloning and expression of D-glucuronyl C5-epimerase from bovine lung.// J. Biol. Chem., 1997, v. 31 272, p. 44 28158-63.

50. Ligon A., Potocki L., Shaffer L., Stickens D., Evans G. //Gene for multiple exostoses (EXT2) maps to ll(pll.2pl2) and is deleted in patients with a contiguous gene syndrome.// Am. J. Med. Genet., 1998, v. 75, p. 538-540.

51. Lin X., Wells D. //Isolation of the mouse cDNA homologous to the human EXT1 gene responsible for hereditary multiple exostoses.// DNA Seq., 1997, v. 7, p. 199202.

52. Lin X., Gan L., Klein W., Wells D. //Expression and functional analysis of mouse EXT1, a homolog of the human multiple exostoses type 1 gene.// Bioch. Bioph. Res. Commun., 1998, v. 248, p. 738-743.

53. Lind T., Lindahl U., Lidholt K. //Biosynthesis of heparin/heparan sulfate. Identification of a 70-kDa protein catalyzing both the D-glucuronosyl- and the N-acetyl-D-glucosaminyltransferase reactions.// J. Biol. Chem., 1993, v. 5268, p. 28 20705-8.

54. Lind T., Tufaro F., McCormick C., Lindahl U., Lidholt K. //The putative tumor suppressors EXT1 and EXT2 are Glycosyltransferases required for the biosynthesis of heparan sulfate.// J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 26265-68.

55. Lindahl U., Kusche-Gullberg M., Kjellen L. // Regulated diversity of heparan sulfate.// J. Biol. Chem., 1998, v. 273, p. 24979-82.

56. Lidholt K., Lindahl U. //Biosynthesis of heparin. The D-glucuronosyl- and N-acetyl-D-glucosaminyltransferase reactions and their relation to polymer modification.//Biochem. J., 1992, v. 1 287, p. 21-29.

57. Luckert-Wickland C., Pauli R., Johnston D., Hecht J.// Natural history study of hereditary multiple exostoses.// Am.J.Med.Genet., 1994, v.55, p.43-46.

58. Ludecke H.-J., Senger G., Claussen U., Horsthemke B. //Cloning defined regions of the human genome by microdissection of banded chromosomes and enzymatic amplification.// Nature, 1989, v.338, p.348-350.

59. Ludecke H.-J., Wagner M., Nardmann J., La Pillo B., Parrish J., Willems P., Haan

60. E., Frydman M., Hamers G., Wells D., Horsthemke B. //Molecular dissection of a contiguous gene syndrome: localization of the genes involved in the LangerGiedion syndrome.// Hum. Molec. Genet., 1995, v.4, p.31-36.

61. Ludecke H., Ahn J, Lin X., Hill A., Wagner M., Schomburg L., Horsthemke B., Wells D. //Genomic organization and promoter structure of the human EXT1 gene.// Genomics, 1997, v. 40, p. 351-354.

62. Marigo V., Scott M., Johnson R., Goodrich L., Tabin C. // Conservation in hedgehog signaling: induction of a chicken patched homolog by Sonic hedgehog in the developing limb.// Development, 1996, v. 122, p. 1225-33.

63. Matsuno T., Ichioka Y., Yagi T., Ishii S. //Spindle-cell sarcoma in patients who have osteochondromatosis: a report of two cases.// J. Bone Joint Surg., 1988, v.70, p.137-141.

64. McCormickC., Leduc Y., Martindale D., Mattison K., Esford L., Dyer A., Tufaro

65. F. // The putative tumour suppressor EXT1 alters the expression of cell-surface heparan sulfate.//Nature Genetics, 1998, v. 19, p. 158-161.

66. McGaughran J., Ward H., Evans D. //WAGR syndrome and multiple exostoses in patient with del(l l)(pl 1,2pl4.2).// J.Med.Genet., 1995, v.32, p.823-824.

67. Mertens F., Rydholm A., Kreicbergs A., Willen H., Jonsson K., Heim S., Mitelman F., Mandahl N. //Loss of chromosome band 8q24 in sporadic osteocartilaginous exostoses.// Genes Chromosomes Cancer, 1994, v.9, p.8-12.

68. Milot E., Fraser P., Grosveld F. //Position effect and genetic diseases.// TIG, 1996, v.12, p.123-126.

69. Ming J., Roessler E., Muenke M. // Human developmental disorders and the Sonic hedgehog pathway.// Molecular Medicine Today, 1998, v.4, p. 343-349.

70. Parrish J., Wagner M., Hecht J., Scott C., Wells D. //Molecular analysis of overlapping chromosomal deletions in patients with Langer-Giedion syndrome.// Genomics, 1991, v.ll, p.54-61.

71. Pfeiffer R. //Langer-Giedion syndrome and additional congenital malformations with interstitial deletion of the long arm of chromosome 8: 46,XY,del8(ql3-22). //Clin. Genet., 1980, v. 18, v. 142-146.

72. Philippe C., Porter D., Emerton M., Wells D., Simpson A., Monaco A. //Mutation screening of the EXT1 and EXT2 genes in patients with hereditary multiple exostoses.// Am. J. Hum. Genet., 1997, v. 61, p. 520-528.

73. Potoki L., Greenberg F., Shaffer L. //Interstitial deletion of Il(pll.l2-pl2): a rare chromosomal syndrome with mental retardation, pariental foramina and multiple exostoses.// Am.J.Hum.Genet., 1995, v.57, p.688.

74. Potocki L., Shaffer L. //Interstitial deletion of ll(pll.2pl2): a newly described contiguous gene deletion syndrome involving the gene for hereditary multiple exostoses (EXT2).// Am. J. Med. Genet., 1996, v. 62, p. 319-325.

75. Quirini G., Meyer J., Herman M., Russell E. //Osteochondroma of the thoracicspine: an unusual cause of spinal cord compression.// Am. J. Neuroradiol., 1996, v.i17, p. 961-964.

76. Schmidt A., Schafer E., Buddecke E. //Isolation and characterization of two proteoheparan sulfate species of calf arterial tissue.// Eur. J. Biochem., 1988, v.173, p.661-6.

77. Stickens D., Evans G. // A sugar fix for bone tumours?// Nature Genetics, 1998, v. 19, p. 110-112.

78. Stickens D., Clines G., Burbee D., Ramos P., Thomas S., Hogue D., Hecht J., Lovett M., Evans G. //The EXT2 multiple exostoses gene defines a family of putative tumour suppressor genes.// Nature Genet., 1996, v. 14, p. 25-32.

79. Stickens D., Evans G. // Isolation and characterization of the murine homolog of the human EXT2 multiple exostoses gene.// Biochem. Molec. Med., 1997, v. 61, p. 16-21.

80. Stirzaker C., Millar D., Paul C., Warnecke P., Harrison J., Vincent P., Frommer M., Clark S. //Extensive DNA methylation spanning the Rb promoter in retinoblastoma tumor.// Cancer Res., 1997, v. 57, p. 2229-2237.

81. Strachan T., Read A.P. //Human Molecular Genetics." // BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, 1996, 596 p.

82. Van Hul Wim, Wuyts W., Ramlakhan S., Hecht J. //Refined localization of the Multiple Exostoses Locus EXT2 to a 3 cM interval on Chromosome 11.// Abstrats 27th Annual Meeting of the ESHG, Berlin, 1995, p.216.

83. Van Hul W., Wuyts W., Hendrickx J., Speleman F., Wauters J., De Boulle K., Van Roy N., Bossuyt P., Willems P. // Identification of a third EXT-like gene (EXTL3) belonging to the EXT gene family.// Genomics, 1998, v.47, p. 230-237.

84. Vortkamp A., Pathi S., Peretti G., Caruso E., Zaleske D., Tabin C. // Recapitulation of signals regulating embryonic bone formation during postnatal growth and in fracture repair.// Mech. Dev., 1998, v. 71, p. 1-2 65-76.

85. Vortkamp A., Lee K., Lanske B., Segre G., Kronenberg H., Tabin C. //Regulation of rate of cartilage differentiation by Indian hedgehog and PTH-related protein.// Science, 1996, v. 273, p. 5275 613-22.

86. Wells D., Hill A., Lin X., Ahn J., Brown N., Wagner M. //Identification of novel mutations in the human EXT1 tumor suppressor gene.// Hum. Genet., 1997, v. 99, p. 612-615.

87. Wicklund C., Pauli R., Johnston D., Hecht J. //Natural history study of hereditary multiple exostoses.// Am. J. Med. Genet., 1995, v. 55, p. 43-46.

88. Wise C., Clines G., Massa H., Trask B., Lovett. //Identification and localization of the gene for EXTL, a third member of the multiple exostoses gene family.// Genome Res., 1997, v. 7, p. 10-6.

89. Wood S., Othman K.B., Bergerheim U.S.R., Blanton S.H., Bookstein R. //Report of the first international workshop on human chromosome 8 mapping. In:" Workshop on human chromosome 8 mapping".// Cytogenet.Cell Genet., 1993, v.66, p. 16.

90. Yang Y., Guillot P., Boyd Y., Lyon M., McMahon A. //Evidence that preaxial Polydactyly in the Doublefoot mutant is due to ectopic Indian Hedgehog signaling.//Development, 1998, v. 125, p. 16 3123-32.

91. Yoshiura K., Inazawa J., Koyama K., Nakamura Y., Niikawa N. //Mapping of the 8q23 translocation breakpoint of t(8,13) observed in a patient with multiple exostoses.// Genes Chromosomes Cancer, 1994, v. 9, p. 57-61.

92. Zaletajev D., Marincheva G. //Langer-Giedion syndrome, in a child with complex structural aberration of chromosome 8.// Hum. Genet., 1983, v.63, p.178-182.

93. Zou H., Wieser R., Massague J., Niswander L. // Distinct roles of type I bone morphogenetic protein receptors in the formation and differentiation of cartilage.// Genes. Dev., 1997, v. 11, p. 17 2191-203.