Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Испольэование гетерохроматиновых маркеров хромосом в генетическом анализе у ржи Secale cereale L.

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Испольэование гетерохроматиновых маркеров хромосом в генетическом анализе у ржи Secale cereale L."

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДОРСТВЕНШЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 576.312:575.116:576.356.2:631.522.42:633.14X4

МИХАЙЛОВА Клена Игоревна

Использование гетерохроматиновых маркеров хромосом в генетической анализе у ржи ЯесаХе сегеа1е 1.

03. 00. 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1994

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

- кандидат биологических наук С.П.Сосшшша

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук А.Ф.Смирнов

- кандидат биологических наук О.П.Митрофанова

Ведущее учреждение - Ботанический институт РАН

им. В.Л.Комарова

Защита диссертации состоится 1&Э4 Г. В час.

на заседании Специализированного совета Д' 063.57.21 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических, наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Сиолого-гочвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория X.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского университета.

-¿¿¿¿Л

Автореферат разослан " / " . 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук / Л.А. Макон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуачьность проблемы. Интенсивная работа в области частной генетики растений невозможна без осуществления цитогенетических исследований, необходимым этапом которых является идентификация хромосом. Надежная идентификация хромосом важна для селекционных работ, одним из направлений которых являются инженерно-хромосомные метода по созданию различных амфидиплоидов, дополненных и замещенных линий, линий с перенесенными фрагментами хромосом. Однозначная идентификация всех семи хромосом набора у ржи затруднена отсутствием четких морфологических маркеров хромосом, сходством их в отношении длины и расположения первичной перетяжки, а также вследствие изменчивости распределения и размеров гетерохроматиновых блоков. Наиболее надежным способом классификации хромосом в терминах единой для всей подтрибы Тг11;1с1пае международной номенклатуры в настоящее время является изучение конъюгации хромосом у гибридов между изучаемыми образцами и тестерными линиями, имеющими маркерные узнаваемые в мейозе хромосомы (5уЬепйа,1983). С этой целью в лаборатории генетики растений СПбГУ проводится работа по созданию коллекций разнообразных озимых тестерных линий, например, линий с ге-терохроматжовыми маркерами, линий с транслокациями и др. Используя надежные цитологические маркеры хромосом, можно вести работу по установлению соответствия групп сцепления определенным хромосомам.

Спутничная хромосома ржи легко идентифицируется в даакинезе. Имеющийся в генетической коллекции лаборатории генетики растений СПбГУ набор линий, характеризующихся С-блоками разной величины в трех районах спутничной хромосомы - на обоих теломерах и в районе ядрышкового организатора, позволяет изучить частоту рекомбинации этих цитологических маркеров. Изучение совместного наследования С-блоков, морфологических признаков и изозимннх локусов с точной локализацией в спутничной хромосоме дает возможность построения генетической карты этой хромосомы.

Цель и задачи исследования. Целями работы были: 1. Идентификация хромосом, вовлеченных в транслокации Т, и Т2, и маркерных (с измененными С-блоками) хромосом инбредаих линий из коллекции лаборатории генетики растений СПбГУ. 2. Изучение, совместного наследования гетерохроматиновых маркеров спутничной хромосомы ржи, морфологических признаков и изозичных локусов. В задачи работы входило: 1.1. Изучение конъюгации хромосом в мейозе у гибридов, полученных я

результате скрещивания линий с маркерными хромосомами (1,6,6) и тестерыых линий с идентифицированными транслокациями (1в1'а).

1.2. Изучение конъюгации хромосом у гибридов, полученных от скрещивания гетерозигот по транслокации Т) с тремя тестерными линиями (18ТВ).

1.3. Изучение конъюгации хромосом у гибридов, полученных от скрещивания линий с гетерохроматиновыми маркерам и Jшний, несущих транслокации Т1 и Т^. из собственной генетической коллекции.

1.4. Выделение линий, гомозиготных по транслокациям Т, и Т2.

2.1. Получение гибрида Р,, гетерозиготного по морфологическим признакам, гетероморфного по трем гетерохроматиновым Олокам, гетерозиготного по изозимным локусам и проведение скрещивания гибрида с линией анализатором.

2.2. Анализ расщепления и оценка частоты рекомбинации во изучаемым морфологическим признакам в потомстве от анализирующего скрещивания гибрида .

2.3. Изучение при помощи метода дифференциальной окраски по Гимза всех вариантов сцутничшх хромосом и анализ расщепления по гетерохроматиновым маркерам в потомстве гибрида .

2.4. Анализ совместного наследования цитологических, морфологических и биохимических маркеров.

Научная новизна и значимость работы. Идентифицированы в терминах международной номенклатуры хромосомы, вовлеченные в изучаемые транслокации, и маркерные (с измененными С-блоками) хромосомы иноредных линий из коллекции лаборатории генетики растений СПбГУ".

Впервые выявлена гетерозиготные по транслокации растения, у которых частота клеток с бивалентным мейоаом достигла 100%, что позволяет существенно дополнить классические ' представления о конъюгации хромосом.

Получены лиши, гомозиготные по идентифицированным транслокациям 'Г, и Т2- Впервые устак влено сцепление между точкой разрыва транслокации Т^ и изозимным локусом Аагз (хромосома Зй).

Определены частоты рекомбинации между гетерохроматиновыми маркерами спутничной хромосомы (1Е), генами морфологических признаков (о предполагаемой локализацией в хромосома Ш и изозимным локусом (с точной локализацией в 1Н). Впервые установлено генетическое расстояние между изозимным геном Асо2 (хромосома БН) и генами И,

Hl(Mwl), что позволяет локализовать последние в хромосоме 5П рт. Теоретическая и практическая ценность работы. Идентифпсация в тер-мшах международной номенклатуры маркерных (с измененными С-блока-т) и транслоцированшх хромосом Г, и Г? позволяет использовать гомозиготные по ним линии в качестве тестерных при проведении цито-генетических исследований. Полонено начало построению генетических карт групп сцепления, соответствующих изученной транслокации Т2-Полученные в диссертации результата открывают дальнейшие перспективы для использования гетерохроматиновых блоков в качестве генетических маркеров, поиска сцепления с ними разнообразных признаков, в том числе хозяйственно ценных.

Апробация работа. Материалы диссертации представлены на всесоюзной конференции "Штогенетика зерновых культур" (Таллин, 1989), на III всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск, I99Ö), на ХШ конгрессе MJCARPIA (Angera,France, 1992), на VI съезде ВОГиС (Минск,1992), на II совещании "Изогенные линии и генетические коллекции (Новосибирск,1993). Публикащш. По материалам диссертации опубликовано 6 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах маиинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав с описанием материалов и методов исследования, результа-ми и обсуждением, заключения и выводов, содержит 1в таблиц, 39 рисунков. Список литературы включает 199 наименований.

МАТЕРНАЛ И МЕТОДЫ В работе для получения гибридов Р1 и использованы: I. инбредные линии из генетической коллекции диплоидной озимой ржи Seeale cereale L. лаборатории генетики растений СПбГУ, характеризующиеся соответственно:

1) маркерными хромосомами с особо крупными блоками гетврохроматина (1 и 6) и без теломерного гетврохроматина (5), 2) наличием в карио-типе отдельных растений транслокаций Т^ или Т2 в гетерозиготе (NTj или NT2), 3) нормальным кариотипом и определенными-вариантами изо-зимов, 4) спутничными хромосомами с С-блоками разной величины на обоих теломерах и в районе ядрышкового организатора (NOR); морфологическими признаками -нормальный рост, контрастны по наличию воскового налета на растении (Ерг и ерг);

II. Образец генетической коллекции озимой ржи ГК-&5, спутничныв хромосомы которого несут С~блоки среднего размера на обоих теломе-paj и NOR; морфологические признаки -короткостебельность (HI), отсутствие воскового налета (ерг), красные ушки листа (R);

III. Яровые инбредные линии рки, гомозиготные по идентифицированным транслокациям (Т3ТВ), из генетической коллекции доктора Дж.Сибенги (Нидерланды).

Для цитологического исследования колосья фиксировали по Нытко-т меру. Анализ диакинеза (Д) и метафвзы I (Ml) начинали с приготовления временных препаратов, окрашенных ацетокармином. Гетерохроматиновые блоки хромосом выявляли на тех же препаратах с использованием метода дифференциальной окраски по Гимза (Тихонович и др., 1987). Анализ проводил., на постоянных препаратах, а также на микрофотографиях. Долю стерильной пыльцы определяли .используя окраску ацетокармином.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Идентификация хромосом ржи в соответствии с международной номенклатурой о помощью тестерных линий, гомозиготных по известным транслокациям. Изучение изменчивости гетерохроматинового рисунка хромосом ржи в течение ряда лет проводилось в нашей лаборатории И.А.Тихоновичем. Им были выделены варианты гетерохроматинового рисунка всех 7 хромосом ржи, создана классификация хромосом, выделены маркерные, распознаваемые в мейозе хромосомы с особо крупными блоками гетерохроматина (1 й 6) и без теломерного гетерохроматина (6) (Тихонович,1975, Тихонович.Фадеева,1976).

Для осуществления перехода к международной номенклатуре в настоящем исследовании проведены скрещивания между тремя линиями с гетерохроматиновыми маркерами и двумя линиями, гетерозиготными по транслокациям NT, и HIv, из генетической коллекции лаборатории генетики растений и стандартным:: линиями с идентифицированными транслокациями Т8Та (de Vrles.Sybenga,(976, Sybenga et al.,1&S5).

У гибридов, являющихся гетерозиготными по транслокациям в зависимости от комбинации скрещивания, анализировали расположат« хромосом в мультивалэнтах, основываясь на расположении гетерохроматиновых блоков в тестершх хромосомах.

1.1. Изучение конъюгации хромосом у гибридов, полученгах в результата скрещивания линий с гетерохроматиновыми маркерами и линий с тестерними транслокациями. На основании проведенного конъюгацион-ного теста (табл.1) установлено, что хромосома 1 не соответствуем хромосомам 2Н,5Й,6Н; хромосома 5 не соответствует хромосомам ?й и 5Р.; хромосома 6 является либо хромосомой ЗИ, либо 5И.

1.2. Изучение мейоза у гибридов от скрещивания гетерозпгот по транслокации с тремя тестерними линиями и1 х для идентификации

хромосом, входящих в транслок&иию , стли ¡гроведены скрещивания растений, гетерозиготных по этой транслокации (№Г1) со стандартным набором линий З^Тд. Гибридные растения Р, возможны двух типов в соответствии о двумя классами гамет, возникающими у гетерозигот по транслокации Т1. Если в анализируемую и тестерйую транслокации вовлечены разные хромосомы, то в мейозе у гибрида предполагали обнару-зкить два четырехчленных кольца и три бивалента в том случае, если 5 гамета несла транслоцированные хромосомы. Когда одна из хромосом вовлечена как е анализируемую, так и в тестерную транслокации, то в мейозе у гибрида ожидали увидеть одно шестичленное кольцо и четыре бивалента. Если в сбе транслокации вовлечены одни и те жэ хромосомы, то в мейозе вероятнее всего было образование семи бивалентов и с меньшей вероятностью образование мультивалента. Во всех случаях, когда материнская гамета несла интактнне хромосомы, у гибрида должен был образовываться 1 тетравалент. Результате проведенного' конъюгацчснкого теста представлены в табл.2.

В результате проведенного детального анализа порядка конъюгации хромосом в шестичленном кольце и расположения в них с-блоков у гибридных растений $ М^ * о"тдтд2Н-5Н были сделаны выесды о том, что, во-первых, 2Й хромосома нэ вовлечена з транслокацию , во-вторых, 5Н хромосома участвует й данной аньлизируемоЯ тргнслокзции. 1.3. Изучение конъюгации хромосом у гибридов, полученных от скрещивания гетерозигот по трэнслокациям т^ и а'2, и линии с гетерохроматиновыми маркэрами аг собственной генетической коллекции, линии, одна из которых характеризуется наличием в кариотипе""транслокацю1 Т1 в гетерозиготэ, -другая - наличием транслокации Т.,, были выделены путем инбридинга кз гибридов сорнополэвой.ржи и автофертальних линий. Проведенный в лаборатории цитологический анализ показал, что гто две разные транслокации. В мейозе у гибрида между двумя этими

Таблица 1. Коашгация хромосом у гибридов между линиями с гетерохроматиновыми маркерами и линиями с гесгерныш транслокациями

Номер гибрида Родительские компоненты Результат конъюгацион-ного теста

Линия с гетерохроматиновым маркером £ Тестерная линия с транслокацией 1ВТ8 о"

X СтШ-З/бО 2ЕЬ-5ЙЗ .__2Н5« I хромосома не включена в мультлвалент, образованный хромосомам;! 2Й и 5И 1 хромосомами ( хромосома^2й

1 хромосома с увеличенным блоком на конце длинного плеча 5И2К 4>

2 - 2Нг-йН1 шва—1 |—ОН 1 хромосома не включена в мультивалвнт, образованный хромосомами 2К и 6Н 1 хромосома^бИ 1 хромосомами

И н

■2К6К

3 ■ Б - 26/58 2М>5аЗ ^_гл5* 5 хромосома но включена в мультивалвнт,' образованный хромосомам 2К и 5Н. 5 хромосома^ 5 хромосома^гй

5 хромосома, почти полностью лишенная гетеро-хроматина 4г

4 ББВбЛ - 2/66 6 хромосома с увеличенным блоком на конце короткого плеча • ЗИ-бШ. * спЗЙ зн£» . ч. 6 хромосома включена в мультивалент, образованный хромосомами Зй и 5й 6 хромосомами или 6 хромосома-5Н

Таблица 2. Конъюгация хромосом у гибридов ?1 между линиями с транслокацией Т, и линиями с тастерными транслокациями т3 .

Растение Варианты картин Вывод на основе

использованное Тастарлея линия кольюгации хромосом коныог анионного

в скрещивании с транслокацией Т3 в диакинезе - М1, теста

в качества ? материнского о* выявленные у гибридов

А) IV + 511 В Г, вовлечена

гнь-ж (Г305И) В) VI + 411 либо 2Д, либо 5Й хромосома

А) IV 4- 511 В Т, вовлечена

га, 4М.-5НЬ (Т501И) В) VI + 411 либо 4Н, либо 5Н хромосома

(И, ЗЯ-5Н1. (Т240») А) IV + 511 У гвтерозигот КТ1,бнли оплодотворены яйцеклетки с нереальными хромосомами

линиями было обнаружено два татравалентг.

Конъюгациошшй тест, который оыл проведен в серии скрещиваний с линиями, несущими маркерные хромосомы (табл.З), позволил сделать следующие вывода: в транслокацию вовлечены хромосомы 1 и 6; хромосома 5 на вовлечена ни в одну из этих тренслокаций.

Таблицы 3. Конъюгация хромосом у гибридов мовду линиями с гетерохроматиновыми маркерам и линиями, несущими транслокаций и Т2.

* Линия, несущая Т, Линия, несущая Т2

CT19I-3/60 и:." г., :t i'. -««а Хромосома 1 Хромосома 1 включена в мультива-дент, образованный хромосомами I,, вовлечена в Т^. Хромосома 1 до включена в мульти-ьалент, образованный хромосомами не вовлечена в Т2.

Б - 26/58 Хромосома 5 Хромосома Б не включена в мульти-валент, образованной хромосомами , не вовлечена в ! Хромосома б не включена в мульти-вэлент, образованный хромосомами Тг, не вовлечена в Т2.

ЕБВбЛ - 2/V6 «■-i---------г '« Хромосома G Хромосома 6 включена в мультива-■Л9НТ, образованный хромос.омаш , вовлечена в Т1. Хромосома 6 но включена в мульти-валент, образованный хромосомами не вовлечена в То.

Тот факт, что х^мосома 1 не является ни 2В., ей 5Е хромосомой (см. табл.1), позволяет предположить, что в транслокацию Т, вовлечены- хромосомы 1 и 5П. Образование шестичлешшх комплексов в Д-М1 мейоза у гибридов от скрещивания ^Ш1)чо"ТдТ34К-5К (табл.2) можно объяснить тем, что хромосома 5Н вовлечена одновременно в анализируемую транслокацию Т, и в тестериую транслокацию ДН-БИ. Две другие хромопомн, участвующие в данных транслокациях, различны между

собой. Таким образом, хромосома 1(по классификации И.А.Тихоновича) на является и хромосомой 4Н. Из вышесказанного следует, что хромосома 1 не соответствует 2Н,4Н,5Н,бН. Остается два возможных варианта Зй либо 7Й (исключая ядрышсовую 111).

О другой стороны, изучение распределения гетерохроматиновых блоков в хромосомах, образукздх тотеравалвнт, у гибрида между линией, маркерной по хромосоме 6, и тестерной линией ЗИ-5М, (табл.1) показало, что хромосома 6 является либо Зй, либо 5И хромосомой. Наличие в ее длинном плече двух своеобразных интеркалярных блоков (Тихонович,1975) говорит в пользу того, что хромосома 6 с большей вероятностью является хромосомой 5Я.

2. Получение собственной коллекции озимах линий ржи, гомозиготных по идентифицированным транслокацдям. В данном исследовании однозначная идентификация транслоцированных хромосом у гомозигот по транслокациям Т, и Т2 на Цитологических препаратах оказалась затруднена. Использование линий, у которых только часть растений нееэт трвнело-цированные хромосомы в гетеро- или гомозиготном состоянии усложняет как проведение конъюгационного теста, так и вовлечение этой транслокации в генетический анализ.

2.1. Гетерозиготность по чрандлокации и. фзрткльность у ржи. В линиях, несущих транслокации и Т2, был обнаружен повышенный уровень стерильности пыльцы (от 30,25 до 43,5%), однако он был характерен как для гомозиготных, так и для гетерозиготных по этим трапелокациям растений. Из литературных данных известно, что у многих растений наблюдается обратная зависимость мезду стерильность» пыльцы и частотой зигзагообразных мультизалзктов в Д-М1 мейоза у гетерогигот по трапелокациям (ЕиггЛага,1956,1962). Наии голики обнаружить подобную корреляцию не увенчались успехом, что на позволило использовать стерильность для дифференциации потомств гетерозигот N1^ и {й^ на гомо- и гетерозиготы по транслокации.

2.2. Получение линий, гомозиготных по транслокациям Т, и При получении линий, гомозиготных по данным транслокациям, проводился цитологический контроль количества бивалентов и мультивалентов в микроспороцитах на стадиях Д-М1 у родительских растений, в инбред-ных потомстгах и у гибридов. Итогом этой части работы является получение трэх линий Г} Г, и одной линии Г2г2- Эти -йшии будут ислоль-зованы как тестерныя, в частности для картирования точек разрывов

в хромосомах; вовлеченных в трчнслокации Т( и Т2.

В процессе выделения линий у отдельных растений, характеризующихся бивалентным мейозом, в инбредных и гибридных потомствах было выявлено расцепление то транслокации, или Т2), то есть часть потомков имела тетравалеита в Д-М1. Этот факт в значительной мере свидетельствовал в пользу гетерозиготности по транслокации самих родительских растений, в мейозе у которых наблюдалось 711. Полученные результаты не позволяют с определенностью сказать, что лежит в основе этого явления. Несомненно, что оно требует дальнейших исследований.

Б потомства от скрещивания между линией, несущей Т2, и линией, несущей транслокацию 1Й/6Н, обнаружены шестичленные кольца, ассоциированные с ядрышком. Это служит доказательством того, что общей хромосомой в транслокациях 1Й/6Н и Т2 является хромосома бй, так как з Т2 не входит ядрышкообразукзцая хромосома. 2.3. Анализ совместного наследования транслоцировандах хромосом Т2 ч изозикных маркеров Ааст, Ааи, АС01. Обнаружено тесное сцепление между точкой разрыва хромосом в транслокации Т2 к геном АагЗ. Среди проанализированных 50 растений,, полученных от возвратных скрещиваний, рекомоинантных комбинаций хромосом и аллелей, Т2-АагЗ-2 и Н-Лагз-1, обнаружено не было. Величина рекомбинации Аа{3- точка разрыва составила 0-1,9%, то есть величина рекомбинации может быть определена как г<5,7 при р<0,01. Поскольку ген AatЗ является Оиохм-ческим маркером хромосомы Зй у ржи, то полученные результаты позволяют заключить, что в транслокацию Т2 вовлечена хромосома ЗИ.

Таким образом, в транслокацию вовлечены хромосомы 5й (хромосома 6) и 7й (хромосома 1). В транслокацию Т2 зовлечеяы хромосомы Зк и 6Я. Хромосома 5 методом исключения и по гетерохроматиновому рисунку идентифицируется как хромосома ¿Я.

Изучение совместного наследования морфологических, биохимических маркеров и гетерохроматиновых блоков спутничвоЛ хромосомы. Схема скрещивания для изучения совместного наследования морфологических, биохимических и цитологических признаков представлена на рисунке X.

Для включения гетерохроматиновых маркеров спутничной хромосомы <'Н) в генетический анализ нами введено следующее их обозначение в соответствии с универсальной системой обозначения плеч хромосом р и

P: ГК-95 анализируемые гены: H1 R epr

ern~ii-

Ci 196-2/60

hl r Epr

ИЗ

генотип :

Hl hl

R r Epr epr

Enríe

Г~Т—1С

мегаспоры

ББВ-3/63 анализируемые

Г9НЫ: hl r epr

EL

hl r epr

микроспоры

ЮИЗС

ГЭШЮТШШ: Hl R Epr Hl H epr

Hl r Epr

Hl r epr

hl H Epr

hl R epr

hl r Epr hl r epr

Рис.1. Схема получения гибрида, гетерозиготного по морфологическим признакам и гетороморфного по трем гетерохроматиновым блокам спутничной хромосому у рта (Secóle céréale L), и ожидаемые типы мегаспор у этого гибрида.

q (Schlegel et al.,1936). ^еломерный гетерохроматиновый блок короткого плеча (р) ш обозначили рМ (middle), если он среднего размера, pS (small), если он уменьшен. Теломерный С-блок длинного плеча (q) обозначен как qrt и qL (large), если он увеличен. С-блок в районе вторичной перетяжки ( ядрыаясового организатора ) спутничной хромос<ш мы обозначила К и, аналогично обозначению теломерных блоков, IM соответствует блоку среднего размера, NS - уменьшенный Слок. С-Слогл среднего размера рМ, q!<, и КМ - принято считать признаками нормальной спутничной хромосомы (Тихонович и др.,1987).

3.1. Анализ расцепления по морфологическим признакам в потомстве гиорида t- j. скрещивание гиорвда i-j с линией ььь-а/ьз в отношение исследованных морфологических признаков было, по существу, анодирующим (рис.1). Расщепления, не отличающиеся от ожидаемого Ы, Оылк получены по каждому из трех генов : hi-m <*'=i.9 p>o.i>.

Ерг-эрг <*г-0.10 Р-0.75). R-r (/-0Л0 Р-0.75).

При изучении совместного наследования пар признаков было установлено, что длина стебля и наличие воскового налета наследуются независимо (*г=2.о р>о.ю>, так же как и окраске ушек и наличие воскового налета и2-э,э р>о.о25). Для Пари признаков короткосте-Оольность и окраска ушек подтверждено сцепленное наследование, наблюдается достоверное преобладание в потомстве двух родительских фанотипичэсквх классов hih и mr. Величина рекомбинации между hi и я Составила I3.2±i.9%,

3.2. Анализ расщепления по гетерохроматиновым блокам спутничной хроносо'м. Структура спутничных хромосом снла исследована у юз из э.ю растений в расщепляющемся потомстве. Пара спутничных хромосом (Ш гибрида F'1 была гэтероморфной по трем С-блокам. Поэтому у потомков этого гибрида от скрещивания с линией ББВ-3/&3, как и ожидалось (рис.1), были выявлены все, восемь вариантов спутничной хромосомы, из которых два - родительские, четыре могли образоваться в результате единичного кроссинговера в длинном или коротком плече, две варианта являлись двойными рекомбинантами. Вариант спутничной хромосомы, источником которой являлась линия-анализатор, был обнаружен у всех изученных растений. Мы установили, что С-блоки, рзопо-•гкжэншв в районе ядршскового организатора («s и ыи> , встречаются у потомков гибрида г1 равновероятно. Соотношение вариантов гетерохроматинового блока длинного плеча спутничной хромосомы ам и qL досто-

верно отличается от ожидаемого расщепления Ы u'-ä.i р<о.оп. Преобладают растения с нормальним блоком на длинном плече 1r хромосомы (qM> и значительно недостает растений с крупным теломерным блоком (qL). Та же закономерность, но менее выраженная, выявлена и для таломерных блоков короткого плеча. Преобладают растения с нормальным блоком рм, наблюдается недостаток растений с малым блоком гетерохроматина pS (**-4,2в р>о,о25).

Анализ совместного наследования вариантов гетерохроматиновых блоков по каждой из трех пар p-n. n-q и p-q позволил определить величину рекомбинации мевду ними. Она составила на участке p-n 20.4±э.9*. Для гетерохроматиновых маркеров вторичной перетякки и теломера длинного плеча, расположенных на значительном физическом расстоянии (около 3/4 длины всей хромосомы) процент кроссинговэра составил 44,7±4.9%. Эта величина не показывает достоверных отличив от 50* (t-1.08 Р<0.3).

При определении величины рекомбинации между двумя теломерныма С-блоками использовали поправки, приведенные в работе Бейли (Bailey, 1965), поскольку по кавдому из них в потомства гибрида Ft нарушено ожидаемое соотношение 1:1. Величина рекомбинации между двумя теломерными блоками составила 42.о-з.1*. При имеющемся обгеме выборки это значение не выявляет достоверных отличий от so* <t-i.63 р<ол>, то есть от частота кроссинговера меаду маркерами в случав их независимого комбинирования.

3.3. Анализ совместного наследования изучаемых морфологических при знаков и гетерохроматиновых блоков спутничной хромосомы. Сцепления короткостебельности, окраски ушек, наличия воскового налета с каким-либо из трех гетерохроматиновых маркеров не выявлено. Анализ таблиц сопряженности и расчет соответствующего х* показал, что во всех рассмотренных случаях маркера наследуются независимо.

3.4. Анализ совместного наследования биохимических маркеров с морфологическими и цитологическими. В качестве биохимических маркеров были взяты аконитаза I, аконитаза 2, пвроксидаза 7, контролирующие их гены Acoi. асо2. Per? локализуются соответственно в хромосомах 6R. 5ft и 1R (Kelz,Schlegel,Thiele,1992). Анализ таблиц сопряженности для пар маркеров Acoi-Hi, acoi-r. Aeoi-Epr. aco2-Epr показал, что они наследуются независимо, В случае a,co2-hi и aco2-r достоверно преобладают родительские сочетания асо2-2 -hi и Aco2-i -ы.

Асо2-2 -к и Асо2-1 -г. Частота рекомбинации между Асо2 и Н1 составила 21.меаду Асо2 и в - 2s1.5i5.1s5. На оснопе полученных данных о частотах рекомбинации между генами ш (оа»1). и и Аоо2. их последовательность на генетической карта хромосомы 5Я должна быть следующей ! я - нцм»1) - Асог.

Ген Рвг7 является биохимическим маркером спутничной хромосомы. Известно несколько обозначений этого гена, которые, по-видимому, являются синонимами СйеЬИвд еХ а!., 1585, КоёЬпег в1 а1.,1986, Ме1г,ТМ.е1е,1989) Нами использовано принятое в лаборатории обозначение - Ргх7. Сцепления гена Ргх7 и цитологических маркеров спутничной хромосомы на данном материале выявить не удалось. Также было ноказано независимое наследование гена Ргх7 и Н1, к. ерг.

Итак, идентифицированы в терминах международной номенклатуры хромосомы, вовлеченные в транслокации Т, и Т2, хромосомы, представленные в соотЕетсвуищих линиях генетической коллекции лаборатории генетики растений вариантами с особо крупными С-блоками и без тело-мерных блоков. Создана основа для вовлечения гетерохроматиновых маркеров изученных линий в генетический анализ.

Возможность использования С-блоков в генетическом анализе показана на примере спутничной хромосомы. Изучение совместного наследования и выявление сцеплений меаду С-блокаки и генами морфологических и биохимичэских признаков позволяет проводить цитологическую локализацию генов у ржи.

вывода

1. На основании результатов конъюгационного теста идентифицированы в соответствии с международной номенклатурой хромосомы, представленные в отдельных линиях специфическими, распознаваемы/® в мвйозе вариантами. Хромосома 1 с особо крупный блоком гетеро-хроматина на теломере длинного плеча соответствует хромосома хромосома 6 с большим блоком гетерохроматина на теломере короткого плеча соответствует хромосоме 5П, а хромосома 5, почти полностью лишенная гетерохроматина, является хромосомой 4й.

2. Идентифицированы хромосоглы, вовлеченные в транслокации Т, и Т2 в линиях, выделенных из популяции сорнополевой ржи и поддерживаемых в генетической коллекции в виде инбредных потомств гетерозигот И, и Ш^. В транслокацию Т, вовлечены хромосомы 5Й и 7Е, в транслокацию Т2 - хромосомы ЗН и 6Я.

3. В исследованных инбрадных потомствах гетарозигот по трьнслокаци-ям Т, и Т2 обнаружен повышешшй уровень стерильности пыльцы (от 30,236 до 43,5%). Он характерен как для гетерозиготных по транслокации, так и для гомозиготных растений. Доля стерильной пыльцы не зависит от частоты зигзагообразных мультивалентов.

4. Получены линии, гомозиготные па трвнслокзциям, Т^Т, и Т^г-Гомозиготносгь их доказана в результате детального анализа конъюгации хромосом в микроспорогенезе в гибридных и инбредных потомствах гетерозигот и 1И2.

5. Показано, что растения с бивалентным мейозом в инорэдних и гибридах потомствах гетерозигот по транслоквциям и 1'2 могут быть по кариотилу не только гомозиготами Ш или ТТ. но и гетерозиготами ОТ.

6. Установлено полное сцепление между точкой разрыва транслоцировашшх хромосом1 Т2 и геном Аа13, контролирующим изофермент аспвртвтаминотрансферазы. При изучении выборки в 50 растений рекомбияантов не обнаружено.

7. Определена величина рекомбинации мезду гетерохроматиновыми маркерами спутничной хромосомы. Меаду С-блоками тэломера короткого плеча и района ядрышкового организатора (ТОК) она составила 20,4^3,9%, КОН и теломером длинного плеча - 44,7±4,9$, между двумя теломврными С-блоками - 42,0-5,1%.

8. Показано независимое наследование гетерохроматиновых блоков спутничной хромосомы и генов Н1(С(1«1 ), Н, Ерг, контролирующих морфологические маркеры: короткостебельность, окраску ушек, наличие воскового налета.

Э. Выявлено сцепление между геном Асо2, контролирующим один из изоферменгов аконигазы, локализованным в 5й хромосоме, и генами Шдам) и И. Частота рекомбинации меаду Асо2 и Н1 составила 21,8±4,6%, между Асо2 и Л - 29,5-5,1%, между Й1 и Й - 13,2^,9«. Их последовательность на генетической карте хромосомы 5Й: й-НПСсМ )-Асо2.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлова Е.И..Соснихина С.П.,Мичурина Т.Г. Идентификация хромосом рки на основании конъюгационного теста в мейозе //Генетика. -1993. -Т.29. -№. -С.978-989.

г. Михайлова Е.И.,Соснихина С.П.,Нерусева Г.В.,Фам Тхань 4ыонг. Использование гетерохроматиновых маркеров хромосом в генетическом анализе у ржи Seeale cereale L. //Генетика. -1994. -T.3Q. -HI, -С.65-91.

3. Михайлова Е.И.,Соснихина С.П. Использование линий с гетерохроматиновыми маркерами в генетике ржи. III Всесоюзн.конф. по ген. и цитол. мейоза. Тез.докл. //Изв.СО АНСССР. -Новосибирск: Наука, 1990. -Вып.2., серия Биол.науки. -С.9.

4. Mlkhallova E.I.,Mlchurina T.G. Pollen sterility and tetravalent orientation In melosls In rye translocation heterozygotes. In: BooK oi Poster Abstracts ol XII Eucarpla Congr. -Angers, France, 1992. -V.101-102.

5. Соснихина С.П.,Михайлова Е.И..Кириллова Г.А..Прияткина С.Н., Мичурина Т.Г., Чакова H.H., Нерушева Г.В. Выделение и поддержание спонтанных Mel-мутантов и вариантов структурных перестроек квриотипа//В материалах II совет."Изогенные лиши и генетические коллекции". -Новосибирск, 1993. -С.130-132.

ft. Смирнов В.Г.,Соснихина С.П..Войлоков A.B.,Гладышева Н.М..Прияткина С.Н., Михайлова Е.И., Фам Тхань 4ыонг, Линц А., Егорова Л.Ф., Салтыковская H.A. Генетическая коллекция озимой ржи и возможности ее использования в исследованиях по генетике и селекционных программах. В сб.: Генетические коллекции растений. -Новосибирск, СО РАН, 1993. -Вып.). -С.82-116.

Подсшаано £ печати 3.08.94 Заказ 258 Тираж 100 Объем X п.л. ПМЛ СПГУ

19903^, Санкт-Петерйург, наб. Макарова,в.