Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ПОИСК ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ МНОГОЛЕТНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ У РЖИ (SECALE L.)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "ПОИСК ИЗОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ МНОГОЛЕТНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ У РЖИ (SECALE L.)"

'В & ш

На правах рукописи

ЗАБРОДИНА Марина Владимировна

ПОИСК 1ВОФЕРМЕНТНЫХ МАРКЕРОВ МНОГОДЕТНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ К ГРИБНЫМ БОЛЕЗНЯМ У РЖИ (SECALE L.)

Специальность 03.00.23 — биотехнология 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Э.Е.Хавкнн

Официальные оппоненты; доктор биологических наук, профессор

Н.Н.Новиков

кандидат биологически к наук

Н.В.Кудряковя Ведущая организация: Главный ботанический сад РАН

Защита диссертации состоится "_"_2002 г. в_ часов

на заседании Диссертационного Совета Д.006,027.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42. Т/факс (095) 977 09 47

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН,

Автореферат разослан "_* апреля 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета -

Актуальность проблемы. В последние десятилетия селекция растений все чаще использует технологии, основанные на генетических и ыолекулярно-генетических методах анализа. В частности, широкое применение нашли молекулярные маркеры генов, которые позволяют идентифицировать генотипы растений, ускорит» поиск новых ценных аллелей в генетических коллекциях и контролировать перенос генов, ответственных за хозяйственно полезные признаки, в геном новых сортов (marked-assisted selection). Использование биотехно логических методов, основанных на применении в качестве маркеров генов генетически идентифицированных фрагментов ДНК, изоферментов иди белков, определяется как молекулярная селекция.

Дикорастущая многолетняя рожь Secale montanum Guss., предок современной культурной ржи, является уникальным источником генов, определяющих признаки зимостойкости и устойчивости к грибным заболеваниям, и широко используется при создании новых сортов пшенииы, ржи. и тритикале, Для решения этой селекционной проблемы методами биотехнологии необходимо найти молекулярные маркеры генов, ответственных за признаки устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, н локалитовать эти гены в хромосомах дикорастущей ржи. Обязательным предварительным этапом исследован и ¡1, направленных на создание молекулярных маркеров генов, являегся оценка генетического полиморфизма растений, перспективных для селекции в качестве источников хозяйственно-ценных аллелей.

Цель и задачи. Целью данной работы является поиск тоферментных маркеров хозяйственно-ценных признаков ржи, в частности, признаков зимостойкости и устойчивое™ к грибным болезням. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- изучить полиморфизм ржи, пшенииы и трнтнкалс по нескольким нзоферментным системам н выяснить генетическую природу этого полиморфизма:

- оценить генетическую изменчивость и органную специфику экспрессии изоферментов.

- определить частоты фенотипов и аллелей для серии образцов дикой

многолетней, культурной однолетней ржи и их : кбридовг'-

1ЬНЛЯ

"■■и. ¡отккл

подобрать изофермектные маркеры зимостойкости и устойчивости ржи к грибным болезням;

проследить за изменениями частот маркерных аллелей в процессе отбора растений на повышенную устойчивость.

Научная новизна. Проведена идентификация локусов эстераз и аспартат-

аминотрансфераз н определена органная специфика экспрессии эстераз и

аспартат-аминотрансфераэ ржи. Впервые описаны три локуса эстераз - Estll,

Esí¡2 и Ei!¡3. Идентифицирован генетический материал ржи И пшеницы в

составе генома дву- и триродовых гибридов ржи с пшеницей и пыреем

(тритикале и ПРПГ) и описак характер замещения и потери отдельных

хромосом. Определены аллельные частоты эстераз и аспартат-аминотрансфераз

в коллекции дикой многолетней, культурной однолетней ржи и форм,

полученных с их участием, в том числе межвидового гибрида многолетней и

однолетней ржи - ржи Державина и Цкцина. Выделены изоферментные маркеры

признаков зимостойкости и устойчивости ржи к грибным болезням (листовая и

стеблевая ржавчина, мучнистая роса я снежная плесень).

Практическая ценность. Выявленные изоферментные маркеры можно

использовать в селекции ржи, пшеницы и тритикале на повышенную

зимостойкость и устойчивость к грибным болезням.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей.

Материалы диссертации были доложены на симпозиуме "Молекулярио-

генэтические маркеры и селехция растений" (Киев, 1994), научно-методическом

совещании "Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости

сельскохозяйственных растений" (Москва, Немчниовка, 1994), Ш Российском

симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущиио-на-Оке, 1995),

конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве,

животноводстве и ветеринарии (Москва, 1996), VIII конференции "Новые

направления биотехнологии (Москва, 1998), симпозиуме "Молекулярные

механизмы стрессовых ответов у растений" (Москва, 1998), конференции

"Проблемы интродукции растений и отдаленной гибридизации" (Москва, 1998),

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав

"Обзор литературы", "Материалы и методы™, "Результаты и обсуждение",

заключения, выводов и списка цитируемой литературы (232 названия). Работа

изложена на 119 стр. машинописного текста и включает 9 таблиц и 13 рисунков,

2

Материалы и методы исследования.

Для определения генетического полиморфизма изоферментов ржи (Seeale L.) были взяты следующие растения: 32 формы трех подвидов дикорастущей многолетней ржи S. manlanum Guss, = S. siriclum Hammer ssp. ktiprijonovii, montamtm (sirictum) и anato!kum\ 1! сортов озимой ржи (о, cereale L.) отечественной селекции, районированных в различных областях Европейской части России; 4 сорта яровой ржи (S cereale L.) западноевропейского происхождения; 6 образцов культурной многолетней ржи Державина и Цнщша (5, derzhavinii Ts vet. = S. cereale L. x S, monitinum Guss.); многолетние формы Иммунная 1-3 и Иммунная 4, отобранные соответственно из популяций S. tiKmiiinum Guss ssp, kuprijmovü и ржи Державина на повышенную устойчивость к грибным патогенам; и однолетняя форма Иммунная S, полученная нз S. сегеаЫ (беккросс Саним х Россиянка), а также гибриды многолетней ржи S. moraanvun Guss ssp. kuprijanovii с озимой рожью (Вятка, Петка, EMI): И мерят I//J, Имериг 3, Имериг ЗЛУ (Кобылянский. 1982). Схема происхождения исследованных форм ржи представлена на рис. 1. Семена этих форм были любезно предоставлены сотрудниками ВИР (Санкт-Петербург), Института генетики растений и изучения культурных растений (Гатерслебеи, Германия), Главного Ботанического Сада РАН, Ставропольского СХИ и Селекционно-Генетической стан г (ни Московской сельскохозяйственной академии им, Тимирязева.

Для анализа органоспецифнчной экспрессия изоферментоа использованы эталонные формы S. cereale - Dakoid, Imperial, King 2, с которыми работали другие исследователи, а также растения озимой ржи отечественной селекции, сорта Восход 2 и Саратовская 5 и озимая пшеница Безостая I. Кроме того, был исследован ряд форм тритикале - Trilicale rimpaui (Wium) Müntz, и пшепичло-ржано-пырейные шбридов селекции Ставропольского НИИСХ и формы пшеницы и пырея, входящие в их состав. Семена этик растений получены из Ставропольскою СХИ и ВИР. Для идентификации изоферментных локусов и анализа замещений хромосом была использована серия аиеуплоидных форм пшеницы Chinese Spring. Семена анеуплоидов были любезно предоставлены О. В. М итрофа новой (ВИР) и Дж.П.Густафсоком (/.Р. Gustafson, US DA/ARS. University of Missouri, Columbia, USA).

Secale monianum Cuss, subspecies

Se cale ccreale L. copia

ktiprijuuovii monianum anutoikum

Иммунная I, Иммунная 2, Иммунная 3

Южные и юго-восточные озимые Авангард, Безенчукская,

Лисицына, Немы шля некая Таращанская

Северозападные озимые

Восход 2, Вятка 2, Россиянка, Сш ¡госте

Западные яровые

Мюльфиртлер Отелло, Петкуе, Самро

Рис. 1, Формы ржи, использованные в исследовании, и их происхождение.

Для анализа генетической изменчивости растения выращивали на делянке Селекционно-Генетической станции МСХА. Пробы листьев отбирали в год посева, в фазе кушей ня, осенью или весной. Выборка для каждого генотипа (формы или сортообразца) составляла обычно 18 индивидуально анализируемых растений. Для исследования орган ос пецифич ной экспрессии изоферментов растения выращивали в термос rai с s m и кллмокамеро; анализировали iHiîocnepMbL покоящихся зерновок, эндоспермы и зародыши прорастающих зерновок (18 час,), колеонтили и этиолированные листья 4-5-диевиых проростков, выращенных в темноте, зеленые листья и корни 8-Ю-дневных проростков, выращенных на свету.

Пробы растительного материала гомогенизировали Fia холоду s 0.05М три с-глициновом буфере, рН 8,3, содержащем 0,05М 2-мсркантоэтанола и 20% глицерина. Гомогенат иентрифугироаали 40 мин при 12000 g н подвергали

электрофорезу в вертикальных блоках 7,5% поли акрил амидвого геля в буферной системе Девиса. Затем гели инкубировали в 0,1 М Тпз-НС? буфере, рН 8,5, содержащем 0,5% аспартата, 0,1% 2-оксоглутарата и 0,2% смеси прочного синего Б и ЕБ для выявления активности аепартат-аминотрансферазы, или в 0,05% фосфатном буфере, рН 5,0 или 0,05 трис-малеатном буфере рН 5,0-5,6, содержащем альфа- к бета-нафтилацетат и прочный синий РР, для выявления активности эстеразы.

Результаты

Генетическая идентификация и зо<!)ерментных маркеров у ржи Для использования изоферменгов в качестве маркеров генов, необходима генетическая интерпретация нзоферменшых спектров. При решении этой задачи мы использовали три подхода: (1) сопоставление с эталонными формами ржи, для которых уже определена генетическая структура изоферментных спектров; (2) идентификация локусов ло заранее известной органной специфичности их экспрессии; (3) различение шоферментов по чувствительности к специфичным

Таблица 1. Физиопогические и генетические характеристики эстераз ржи.

Зона Электро- форетическая подвижность* Ор ганоспецифичес кая экспрессия изофермеитов Чувствятелы юсть к ингибиторам" Локус, хромосома, плечо

ДДВФ севин

1 1,30-5,42 все органы, кроме эндосперма +++ +-Н -

2 1,19-1,26 та же +++ + -

3 1,07-1,14 та же 0 0 -

4 1.00 все органы и ткани +++ 0 Esil 0RS)

5 0.S6 Колеоптиль 0 0 ЕШ (3RL)

6 0,83 листья и другие осевые органы + + Esl4

7 0,79 та же + 0 Exil

S 0,65 все органы и ткааи +++ 0 Еы8

9а 0.26-0,59 Эндосперм + ++ Est5 (6RL), £.«6 {2 RS)

96 0.26-0,59 листья и другие осевые органы + +++ -

10 0,18 Листья +++ ++ Est7 (2RL)

Примечания: * подвижность измеряли по отношению к зоне 4; ** +,++ и +•++- -

слабое, среднее и полное подавление активности фермента, 0 - отсутствие ингибирующего действии.

END ENG

Î0

Рис, 2. Спектры эстераз в органах проростков ржи Восход 2 . END- эндосперм покоящихся зерновок, ENG - эндосперм прорастающих зерновок (18 часов), EMG - зародыш прорастающих зерновок (18 часов), COL - колеоптиль 4-5-дневных темновых проростков, ETL - этиолированные листья 4-5-дневных темновых проростков, GRL - зеленые листья 8-10-дневных световых проростков, RTS - корни 8-10-дневных световых проростков.

л

»00

с

IMJ

Рис. 3. Аллели, фенотипы и состав субъеднииц димсрной ас пар тагам ин сп ра н с феразы ржи (локус Л о/1/4),

А - моио- и диаллелмше сочетания; В - три- и тетрааллельиые сочетания;

С - двухполосные спектры; D —аллелышй состав субъединиц по классификации (Rebordinos and Percude la Veea. 1988); ' 6

E - аллельный состав субъединиц по классификации (WehÜng, 1985,1991). I - 4 - аллели.

ингибиторам. Для идентификации локусов эстеразы была исследована оргаиоспецифическая экспрессия изофсрмситов эстераз у ржи. Спектр езнодных эсгераз при разделении в системе Девиса включает до 20 полос. Среди «их есть конститутивные и органоспецкфичные изоферменты (рис, 2), На основе данных Uu and Gale (1990), часть этих юн отождествлена с картированными ранее л оку са.ч и эстераз (табл. 1). Применение гру ппоспедиф и чн ьгх ингибиторов эстераз (диметнл-2,2- дихлорвиния фосфат - ДДВФ - ингибитор карбоксил эстераз и карбарил, или севин, - ингибитор пссвдохолинэстераз) позволило идентифицировать компоненты наиболее подвижного комплекса анодных изоферментов (EST1, ESTU,EST12 и EST13). В отличие от эстераз, экспрессия аспартат-аминотрансферазы не обнаруживает заметной орган оспе циф и чыости.

Ге^ическин полиморфизм изоферментов у ржи

Существуют две генетические модели димерной ДАТ1 у ржи. Первая предполагает существование трех основных локусов Aatl-3 и еще трех минорных локусов, при этом межлокусное взаимодействие их продуктов при образовании димеров отсутствует (Яаска, 1981). Вторая модель (ReborcLinos and Регег de ia Vega, í 988- Wehiing, 1935,1991) исходят из дупликации локуса Aat! и комплементации продуктов локуса Aat! (11 и 33) с продуктами локуса-двойника Aat -f (22 и 44), как это показано на рис. 3. Изоферментные спектры A ATI ржи отличались значительным разнообразием (см. рис, 3). В большинстве случаев их можно интерпретировать в соответствии с моделью 2, которая исх одит из дупликации локуса Aal! и межлокусной комплементации продукте» лок уса Aat! (аллели 1 и 3) с продуктами локуса-двойника Áot4 (аллели 2 и 4). Лн!_иь у 4% обследованных растений спектр ААТ]Абылдвухподосным, Три таких спектра

И 12 22 23 33

Рнс, 4. Аллели, фенотипы и состав субъединиц димерной аспартат-

зминотрансферазы ржи (локус Аа(3). Í-3 -аллели.

6

(11+22, 11+33, 22+33) можно интерпретировать только в рамках модели 1.У многолетней и однолетней ржи встречались практически все варианты спектра, так что качественные различия в спектре ААТ1/4 между видами ржи не обнаружены.

Локус Лай был мономорфным, а локуе АшЗ (рис. 4) представлен тремя аллелями. Аллель 1, кодирующий наиболее быстрый нзофермент этой группы, найден только у дикорастущей многолетней ржи 5. montanum и отсутствует у однолетней ржи и ржи Державина. Аллель 3, кодирующий наименее подвижный нзофермент характерен для S. сегеак, встречается у ржи Державина и не найден у $. montanum. Аллель 2, кодирующий продукт промежуточной подвижности встречается со значительной частотой у всех форм ржи.

Анализ аспартат-амииотрансфераз у серии анеуплоидов Chinese Spring (рис. S) подтвердил данные о локализации Aaû на хромосоме 3, a Aull на хромосоме 6 (Tang and Hart, 1975) пшеницы и позволил определить замещения и потери хромосом у ряда озимых и многолетних тритикале.

Генетику иэоферментов эстераз изучали в нескольких лабораториях, и их номенклатура не стандартизировала. Мы следовали номенклатуре Lin and Gaie (Î990) (см. табл. 1). В литературе можно встретить сообщения о дн мери ой природе эстеразы EST1, однако мы не наблюдали гибридных триплетов в этой зоне ни у однолетней, ни у многолетней ржи. Эстеразы EST3, EST4, ESTU, EST12 и ESTI3 также являются мономерньши.

Анализ эстераз у серии анеушюияов Chinese Spring и тритикале (рис. 6) подтвердил данные о локализации Estï на хромосоме 3 (Barber, 596?) пшеницы и тритикале и позволил определить замещения и потери хромосом у ряда озимых и м н о голетн и х трити кале.

На рис. 7 представлен генетический полиморфизм шести локусов эстеразы в листьях дикой многолетней И культурной ржи. Локус Eni представлен четырьмя аллелями. Аллели 1 и 2, кодирующие наиболее подвижные изоформы, характерны для дикорастущей многодетный ржи S. томапит, встречаются у ржи Державина и совершенно отсутствуют у S. сегеак, У Я сегеак найден только аллель 3, Аллель 4 шредка встречается у S. moniamtm. Л оку с ы EstJ и EstJ представлены каждый двумя аллелями, Estl2 также двумя, a Est! 1 и Est!3 - тремя аллелям,

Геном

ААТЗ

AA, НЯ АЯ

AB, АО,

№ od. во

ААТ2

RR

АН. BR

АЛ, ВВ. AB. DR AD. SD DO

AAT1

Тритикале Рожь ЛВРЯ К

Пшеница (Chinese Spring) ABD BBD ADD

n3At3B n3Bt30

ABR

CissjJO-ГЮПЬСКЯЙ ?

Тритикале

В DR AAR

стиро- прп(-польски* 1

n6At6B

n6Bt6D

+

Рис. 5. Фенотипы ААТ1 - ААТЗ у пшеницы, ржи и тритикале.

АВО - геномы пшеницы , Я - геном ржи. п - нуллисоми ки, I - тетрасомики.

Геном Тритикале Рожь

ABDR

Пшеница (Chinese Spring) n3At3B n3Bt3D ABD BBD ADD

Ставропольский 2

ABR

Тритикале

Ставропольский 1

BDR

ПРПГ AAR

Рис, 6. Фенотипы Е8Т1 у пшеницы, ржи и тритикале.

АЕЮ - геномы пшеницы, Я - геном ржи, п - нуллисомики, I - тетрасомики.

ЁБТЗ

£$Т4

Е5Т13

Ё5Т12

Рис.7. Изоферментные спектры эстераз ЕБТ! г ЕБТЗ, В5Т4, ЕЭП 1, Е5Т12 и Ев'ПЗ в листьях ржи. А - суммарный образец $есц/е то та пит, О, С, Е - К - варианты спеирои у Л1, топгапит, О - сегеа!е. 1-4 - аллельпые формы.

Secute топшит Guss, ■■ ssp. umtiolicum

Secóle montanum Guss.^-t ssp, kuprijanovU

Secule montanum Goss.— ssp, monianum

Иммунная 1-3 "

(отбор из S. montanum Guss,)

Иммунная 4 -

(отбор из S.derzhav.)

S.derzhovimí Tsvel. —— (S.cereale я S.monttitmm)

Secute cereala L,

Нмериг 1,3 (5, топшпит x S. cereale)

0 0.500

Генетические расстояния Иея

Рис.8. Степень родства форм ржи (кластерный анализ аллельных частот аспартат-ам ннотран сфераз и эстераз)

Мы определили частоты аллелей ipex локусов аспартаг-амннотрансферазы (Aatl/4 и Aatl) и шести яокусои эстеразы (Eatl, Extl, и Est! ¡-¡S) и обнаружили качественные и существенные количественные различия между однолетней и многолетней рожью по локусам Aatl/4, Auí3 и Estl.

Кластерный анализ аллельных частот ржи но локусам AuiW4t Aut3 и Esi¡, с использованием усредненных значений стандартных генетических расстояний Нея, показал, что классификация на основе нзоферментных маркеров (рис. S) хорошо согласуется с ботанической классификацией исследованных форм ржн:

- подвиды многолетней ржн kuprtjanovií и пюмапит гораздо ближе друг к другу, чем к anatolicum, в эту же группу попали формы Иммунная 1-3, отобранные из ssp. kuprijanovii'.

3

- несмотря на ограниченно многолетний образ жизни (2-3 года в условиях Московской области), рожь Державина и отобранная из нее Иммунная 4 тяготеют к однолетней ржи S. сегеак^ и это согласуется с классификацией ржи Державина как подвида S. cereale;

- все формы S .cereale и однолетние гибриды Имериг I и 3 составляют единую группу.

Таким образом, распределение маркерных аллелей изоферментов хорошо отражает реальные взаимоотношения внутри рода Secate.

Аллели проферментов как, маркеры признаков устойчнвосги к неблагоприятным факторам внешней среды

Надежными маркерами многолетности могут служить аллель 1 АшЗ (см. табл. 2), который встречается у S.montanum (частота 0,Ш), но совершенно отсутствует у ржи Державина и однолетней ржи, и аллели ] и 2 Esll, с общей частотой 0,728 у S. топГапит, 0,145 у ржи Державина и 0 у однолетней ржи. Менее определенные результаты дает сопоставление форм ржи по аллелям Aatl/4: у многолетней ржи, включая рожь Державина: нуль-аллель^ Аш4 явно преобладает над аллелем напротив, у однолетней ржи частота аллеля

АШ4А гораздо выше, чем АШ-0. Резкие различия в аллелъных частотах Aat3 и Est! между дикорастущей и культурной многолетней рожью хорошо согласуются с ограниченным проявлением признака многолетности у ржи Державина.

После двух перезимовок в условиях, способствовавших выпреванию озимых, рожь Державина полностью выпала на нашей делянке, однако четверть всех растений S. montatmm выжила в этих условиях. У растений дикорастущей многолетней ржи 5. montamtm, обнаруживших повышенную зимостойкость в условиях средней полосы России, частота гчщоепецифиччых аллелей Aat3-1 и Estl'l и 2 заметно выше, чем в исходной популяции многолетней ржи (табл. 3). Межвидовой гибрид - многолетняя рожь Державина - резко уступает отцовской многолетней форме по проявлению признаков многолетности и зимостойкости, и это хорошо согласуется с отсутствием у ржи Державина аллеля AatS-1 и низкой частотой аллелей EstlA и 2.

Таблица 2, Частоты маркерных аллелей аспартат-аминотраисферазы {Âai) н

эстеразы (Est) у многолетней к однолетней ржи и их гибридов.

Формы ржи Жизненная Число форм и Частоты аллелей

форма растений Aat4-0 Aat-f-4 AaiSA Aatï-3 Esti-1,2 Est 1-3

Secale montamtm Guss., ssp kitprijanovii многолетняя 10/144 0,209 0,025 0,132 0 0,706 0,259

Secale montamtm Guss,, ssp. montanum многолетняя 13/195 0,195 0,036 0,092 0 0,761 0,18!

Secale momanum Guss., ssp. anatolicum многолетняя 9/149 0,162 0.036 0,114 0 0,655 0,255

Secale montamtm Guss., средн евзвеше иные многолетняя 32/488 0,191 0,032 0,111 0 0,728 0,2 !3

Иммунная 1-3 (отбор из S montanumj многолетняя 3/54 0,095 0,068 0 0 0,639 0,259

Рожь Державина (S cereal« х S. тшапит) многолетняя 6/114 0,179 0,075 0 0,076 0,145 0,855

Иммунная 4 (отбор из ржи Державина) многолетняя 1/18 0,375 0 0 0 0,056 0,944

Secek cereale L. (южные и юго-восточные сорта) однолетние, озимые 9/143 0,101 0,184 0 0,213 0 1.000

Secale cereale L. (северозападные сорта) однолетние, озимые 2/36 0,086 0,200 0 0,139 0 1.000

Sécala céréale L. (западные сорта) однолетние, яровые 4/72 0,156 0,156 0 0,181 0 Î.000

Steak cereale L., средневз вешенные однолетние 15/251 0,113 0,179 0 0,167 0 1.000

Имериг 1 и 3 (S. tnontanum к S. cereale") однолетние 3/46 0,043 0,217 0 0,273 0 ¡.O00

Саним однолетние 1/18 0,083 0,208 0 0,500 0 1.000

Иммунная 5 однолетние 1/18 0,182 0,136 0 0,333 0 1.000

Таблица 3. Частоты аллелей аспартат - аминотрансферазы (Aat) иэстеразы

(Est) у многолетней ржи (Secale montanum Guss.) до и после перезимовки.

Варианты опита Число растений Локуеы и аллели

Aai4-0 AatA-A АаЗЛ Aat3-3 Estl-1,2 £«/-3

Все растения в первый год жизни (1992) 409 0,210 0,037 0,И4 0 0,668 0,256

Растения, уцелевшие после зимы 1993 -1994 гг., в том числе: 158 0,229 0,021 о,ш 0 0,669 0,275

плохо перезимовали 90 0,233 0,026 0,060 0 0,633 0,304

хорошо перезимовали 68 0,219 0,015 0,191 0 0,729 0,208

Растения, уцелевшие после зимы 1994 -1995 гг. 98 0,239 0,031 0,117 0 0,676 0,257

Растения, уцелевшие после зимы 1995 -1996 гг. 82 0,243 0,024 0,116 0 0,694 0,241

Таблица 4. Изменение частот аллелей аспартат-амннотраисфераз при отборе многолетней ржи на устойчивость к грибным болезням

Формы ржи Локусы и аллелн

Aatl/4 Aati

1-0 1 3 ■i-0 2 4 1 2

Исходная популяция 5, топ1апит Оизз киргЦаполт 0,060 0,321 0,144 0,209 0,241 0,025 0,132 0,868

Иммунная 1 - 3 0,027 0,338 0,297 0,095 0,176 0,068 0 1,000

Таблица 5, Изменение частот аллелей эстераз при отборе многолетней ржи на устойчивость к ¡рибиым болезням.

Формы ржи Локусы н аллели

ЕмЗ ЕШ Est 1J EstI3

1 2 1 2 1 2 3 1 2 3

Неходкая популяция 5, тогЛапит йизз 85р. киргцат\<и 0,536 0,464 0,153 0,847 0,143 0,200 0,657 0,149 0,410 0,441

Иммунная 1 - 3 0,731 0,269 0,407 0,593 0,060 0,380 0.560 0,407} 0,3 80 0,213

Сравнение нзофермектных спектров у исходных популяций многолетней ржи н форм Иммунная 1-3 обнаружило несколько аллелей аспартаг-аминотрансфсраз и зсгераз, частота которых значительно изменялась при отборе на устойчивость к грибным патогенам. В локусе AatIM отбор на устойчивость привел х существенному повышению частоты аллеля 3 при падении частоты аялеля 4-0 (табл. 4), Особый интерес представляет исчезновение при отборе аялеля Aat3-U специфичного для S. томатт и отсутств)тощего у S. céréale. Вероятно, признаки многодетности и устойчивости к грибным болезнями не связаны напрямую. Среди изоэстераз многолетней ржи резкие изменения аллельных частот при отборе на устойчивость к патогенным грибам отмечены в локусах Esl3t 4, II и Ii (табл. 5).

Обнаруженные нами изменения в аллельных частотах изоферментов позволяют предполагать, что вблизи изоферментных л оку сов, затронутых отбором, расположены лО!сусы, связанные с устойчивостью к грибным болезням. Однако нам не удалось найти аллелей, которые наблюдались бы только в исходной популяции и полностью исчезали при отборе, или, наоборот, отсутствовали в исходных формах многолетней ржи и появлялись у Иммунной 1-3, т.е. были бы полноценными маркерами чувствительности или устойчивости к патогенам.

Обсуждение

Зимографический анализ индивидуальных растений в коллекции однолетней ржи (Seeale cereale L.)t дикорастущей многолетней ржи (S. montanum Guss.) и культурной многолетней ржи Державина (5. cereale х S. montanum) позволил выделить аллельные маркеры, характерные только для S. montanum: аллель 1 локуса Лай и аллели 1 и 2 локуса Esti. У ржи Державина эти аллели встречаются крайне редко или не встречаются вовсе. Четыре перезимовки в полевых условиях привели к полному выпадению ржи Державина и гибели трех четвертей растений S, monlanum, что позволило отобрать растения S. томатт, отличающиеся наибольшей степенью проявления признаков многодетности и зимостойкости. Эти растения отличает повышенная, в сравнении с исходной популяцией, частота фенотипов, включающих видоспецифичные аллели Aaii и Estt.

Судя по генетической карте S, cereale (Schlegel et aî, 1998), АагЗ и Est I локализованы на длинном плече хромосомы 3. Наши данные позволяют

17

предположить, что поблизости должны быть расположены некоторые из генов роста и развития, определяющих комплекс признаков многодетности. Единственный известный сегодня кандидат на эту роль, ген äw3, локализован на хромосоме 3 без указания на плечо. Aat4 локализована на длинном плече хромосомы 4 (Schlege! et al, 1998). На этой же хромосоме локализованы Два гена развития chv5 и gr2t однако неясно, насколько далеко расположены эти гены от изоферментного маркера.

Для того, чтобы оценить степень связи гена äw3 или других, пока еще не картированных, генов развития с нашими изоферментиыми маркерами на хромосоме 3, обратимся к другим локусам хромосомы 3 - генам устойчивости к мучннсгой росе и стеблевой ржавчине, селекционным источником которых также является S. яютапит (Кобылянекий. 1982). Гены устойчивости к мучнистой росе РтЗ и стеблевой ржавчине Sr2 локализованы на коротком плече хромосомы 3 (Schlegel et al, 3998), Однако многолетние формы Иммунная 1-4, отобранные по устойчивости к этим патогенам, не обнаруживают повышенных частот аллелей Aat3* 1 и Es!JA и 2 по сравнению с общей выборкой montanum. Отсутствие связи генов РтЗ и Sr2, локализованных на коротком плече, с изоферментными маркерами многодетности, локализованными на длинном плече хромосомы 3, позволяет оценить чувствительность метода и служит косвенным подтверждением тому, что именно длинное плечо хромосомы 3 несет гены многолетнего образа жизни ржи.

Сравнение изоферментных спектров исходных популяций многолетней ржи и форм Иммунная 1-3 показало значительное изменение аллельных частот в я о кусах AatlM, Aat3, Est3, Esi4. EstH и Est IJ при отборе на устойчивость к грибным патогенам.

Сопоставить локализацию этих изоферментов и генов устойчивости к

листовой (бурой) и стеблевой ржавчине, 1т и $г, и к мучнистой росе, Рю

затруднительно из-за недостаточной информации о локализации

соответствующих генов у ржи (Schlegel el al., 1998). У пшеницы локус Est4

картирован на длинном плече хромосомы 6 (Liu, Gale, 1994). Здесь же

локализованы гены Lr3, Lr9. SrS, Sri I, Sr]3, Sr26, Sr29, Pm2i (Schlegel, Melz,

1993; Koimer, 1996; Qi et al, 1996). Локус Est3 картирован на коротком плече 7

хромосомы (Liu, Gale, 1994). Кроме того, на основании нулли-тетрасомного

анализа мы предполагаем, что на хромосоме 7А находится локус Esll3. У

18

пшеницы на этой хромосоме расположено большое количество генов устойчивости к грибным болезням, в том числе на коротком плече локализованы гены Lr29. Lr34. Рт)5 (Kolmer, 1996; Mclnfosh et al, 1990; Schlegel, Melz. 1993). Таким образом, у пшеницы локализация генов эстераз к генов устойчивости к ржавчине и мучнистой росе хорошо согласуется. Однако сопоставление молекулярных карт шестой и седьмой хромосом у пшеницы н ржи (Devos et al., 1993) показывает, насколько затруднительным может оказаться использование генетических карт пшеницы для локализации генов у ржи. Поэтому обнаруженное нами сцепление нескольких локусов эстераз с признаками устойчивости к грибным болезням у ржи пока трудно связать с известными локусами устойчивости к листовой и стеблевой ржавчине и му'шистой росе на хромосомах 6 и 7 ржи.

Выводы

1. Опнсана генетическая и органоспецнфичная изменчивость и идентифицированы локусы аспартэт-аминотрансфераз и эстераз ржи, Эстеразы обнаруживают значительную органоспецифнческую изменчивость. Аспартат-аминотрансферазы такой изменчивостью не обладают.

2. Определены частоты фенотипов и аллелей в коллекции дикой многолетней, культурной однолетней ржи, межвидовых гибридов ржи и межродовых гибридов ржи с пшеницей и пыреем. Выделены видоепецнфичкые изоферментные маркеры и предполагаемые маркеры многодетности и зимостойкости.

3. Показано возрастание частот аллелей эстераз и аспартат-аминотрансфераз - предполагаемых маркеров многодетности и устойчивости - в процессе естественного отбора при перезимовке растений многолетней ржи в течение четырех лет.

4. Частоты маркерных аллелей аспартат-амннотрансфераз и эстераз существенно различались у исходных форм дикорастущей многолетней ржи {Secale тамапит Guss.) и многолетних форм Иммунная 1-3, отобранных ко устойчивости к листовой и стеблевой ржавчине и снежной плесени,

5. Выявленные изоферментные маркеры можно использовать в селекции ржи, пшеницы и тритикале на повышенную зимостойкость и устойчивость к грибным болезням при классических и отдаленных скрещиваниях и селекции в изолированной культуре,

Слисок статей, опубликованных по тем« диссертации

М.В.Забродина, Э.Е.Хавкин. Орггшоспецифичнэя экспрессия эстераз у ржи//Доклады РАН, 1993, т. 329, № 1, с. 110-112.

М.В. Забродина, Д. Я,Си лис и Э.Е.Хавкин, Изоферменты аспартат-амииотрансферазы у ржи Державина и ее предполагаемых родительских форм// Доклады РАН, 1993, т. 332, № 3, с, 393-395.

Э.Е.Хавкин, М.В.Забродина, Д.Я.Силис. Изофсрментные маркеры многолетности и устойчивости к болезням у дикорастущей ржи и ее гибридов// Физиология растеннй, 1994, т. 41, №4, с, 599-602.

М.В, Заброди на, Д.Я.Силис, Э.Е.Хавкин, Связь изоферментных маркеров многодетности с зимостойкостью ржи// Физиология растений, 1996, т. 43, № 2, с, 230-225.

E.E.Khavkin, M.V.Zabrodina, and D.Ya.Silis, Isoenzymes of aspartat-aminotransferase in perennial and annua! rye, and their hybrids// Genome, 1996, V, 39, N3, p. 513-519.

М.В.Забродина, АЛ.Шзденков, Э.Е.Хавкин, Поиски изоферментных и ДНК-маркеров устойчивости многолетней ржи (Secale montamim Guss.) к грибным болезням'/ Доклады РАСХН, 1998, № 3, с, 3-4.

М.В.Забродина, Д.Я.Силис, Э.Е.Хавкин, Сравнение однолетней и многолетней ржи и их гибридов с помощью изоферментного анализа// Генетика, 1998, т. 34, № 6, с. 778-787.

Объем 1,25 п.л.

Зак. 228

Тираж! 00 экз.

АИО «Издателыпчш МСХА» 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44