Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эпигенетические и генетические особенности синдрома Ретта

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Эпигенетические и генетические особенности синдрома Ретта"

На правах рукописи

ЮРОВ Иван Юрьевич

ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ

СИНДРОМА РЕТТА

03.00.15 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики мозга Научного центра психического здоровья РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Е.И. Рогаев Научный консультант:

доктор медицинских наук П.В. Новиков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Ю. Асанов

доктор биологических наук В.Е. Голимбет

Ведущее учреждение:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится на заседании Диссертационного Совета Д 212.203.05 в Российском университете Дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

«31 »¿ицб^Х 2004г. в / Г час,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета Дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

О. Б. Гигани

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В настоящее время насчитывается более 200 синдромальных и несиндромальных форм умственной отсталости, сцепленных с хромосомой X, основным симптомом которых является аутизм. Изучение генетических и эпигенетических особенностей нервно-психических заболеваний, связанных с различными формами аутизма, является одним из наиболее актуальных направлений в современной психиатрической генетике. Особое место среди этой группы болезней занимают формы умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X. По данным ряда авторов суммарная частота данных заболеваний варьирует от 1:1000 до 1,8:1000 (Chiurazzi et al., 2001). Самым частым заболеванием из этой группы после синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X, является синдром Ретта (Hagberg et al., 2001).

Синдром Ретта (RTT) (MIM и OMIM, 312750) (McKusick, 1998) представляет собой тяжелое наследственное заболевание, сопровождающееся нарушениями нервно-психического развития. RTT характеризуется нормальным развитием ребенка до 6-18 месяцев с последующей утратой сформированных ранее навыков самообслуживания и целенаправленных движений рук, которые замещаются стереотипными "моющими" движениями, а также полной потерей речи. Это заболевание поражает преимущественно девочек. Случаи RTT у мальчиков встречаются крайне редко. Частота RTT составляет 1 на 10000 - 15000 детей женского пола, а в отдельных регионах — 1 на 3000 (Hagberg, 1985; Kozinetz et al., 1993; Hagberg, Hagberg, 1997), что позволяет говорить о RTT, как об одной из наиболее частых причин всех случаев умственной отсталости у девочек. Таким образом, RTT представляется одним из наиболее социально значимых среди заболеваний, сцепленных с хромосомой X.

В 1999г была определена генетическая причина болезни (Amir et al., 1999). Ген RTT, кодирующий метил-СрО-связывающий белок 2 — МЕСР2, расположен в хромосоме X (в районе q28) и участвует в регуляции транскрипции генома. RTT является болезнью, связанной с мутациями в гене-регуляторе, участвующем в эпигенетическом контроле транскрипции генов, наряду с такими болезнями как синдромы ATRX, FRAXE и несиндромальная умственная отсталость, вызванная мутациями в гене FOXP2 (Nokelainen, Flint, 2002). Эпигенетические процессы представляют собой наследуемые изменения в экспрессии генов, нарушающие менделевские принципы наследования, без количественного или качественного изменения последовательности ДНК (Kriaucionis, Bird, 2003). Учитывая небольшое количество болезней, связанных с мутациями в генах-регуляторах транскрипции, а также исключительно низкую частоту этих синдромов, можно считать, что RTT является уникальным заболеванием, изучение кот

11 эЧЯГеч№МЖШ5Твать

БИБЛИОТЕКА ]

оТ^т

---

фундаментальным - открытиям в области эпигенетического контроля экспрессии генов и определению причинно-следственной связи между генетическими аномалиями и эпигенетическими процессами, происходящими в клетках. Мутации гена МЕСР2 встречаются примерно у 70% детей с RTT. Известно, что многие изменения в последовательности гена МЕСР2 не могут быть классифицированы как патогенные мутации. В настоящее время патогенными перестройками в гене МЕСР2, приводящими к RTT, считаются восемь рекуррентных мутаций; нонсенс мутации в начале последовательности и в доменах MBD1 и TRD2, а также крупные делеции в кодирующей последовательности этого гена (Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003). Таким образом, определение мутаций гена МЕСР2 не является однозначным методом лабораторной диагностики RTT.

Помимо этого, неизвестна генетическая природа RTT у девочек без мутации в гене МЕСР2. Не определены также гены, в регуляции транксрипции которых участвует белок МеСР2. Теоретически, мутации в данных генах могут приводить к RTT, в связи с чем, поиск генов, в регуляции транксрипции которых участвует белок МеСР2, является приоритетным направлением в современной молекулярной генетике. Исследования последних лет направлены на обнаружение биологических маркеров (молекулярных и цитогенетических), которые можно использовать в доклинической и пренатальной диагностике RTT.

Анализируя современные данные о различных аспектах диагностики RTT, можно сделать вывод о том, что задача эффективной лабораторной диагностики RTT окончательно не решена (Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003; Weaving et al., 2003).

Несмотря на гипотезу о том, что RTT является Х-сцепленным доминантным заболеванием с внутриутробной летальностью среди мальчиков (Thomas, 1996), имеется ряд сообщений о мальчиках с фенотипическими проявлениями RTT (вплоть до полного соответствия всем обязательным диагностическим критериям -болезни) и мутациями гена МЕСР2 (Leonard et al., 2001; Vorsanova et al., 2001). Следует отметить, что мутации гена МЕСР2 у мальчиков приводят не только к классической или атипичным формам RTT, но также к врожденной энцефалопатии и умственной отсталости в сочетании с различными неврологическими отклонениями (Moog et al., 2003). Изучение влияния различных мутаций гена МЕСР2 на фенотипические проявления болезни у мальчиков представляется информативным при изучении зависимости течения болезни от типа и положения мутации, поскольку это позволяет исключить влияние нормального аллеля гена МЕСР2. Исключая неклассифицированные мутации гена МЕСР2, сравнение

1 MBD — meth)l binding domain (мстил-связывающий домен в гене МССР2 и беисе МеСР2).

« , f [ J i ''

TRD — transcriptional repression domain (домен транскрипционной репрессии в гене МЕСР2 и белке МсСР2).

) / ; » 4.1. ¡.J.I ; (

клинических характеристик мальчиков с одинаковыми мутациями показывает, что эти аномалии приводят к однотипной клинической картине (Villard et al., 2000; Hofibuhr et al., 2001; Leonard et al., 2001; Lynch et al., 2003). Тем не менее, попытка выявления корреляций фенотипических проявлений у мальчиков с мутациями гена МЕСР2 одного типа и положения показала отсутствие какой-либо достоверной связи между ними (Ravn et al., 2003).

Эпигенетические факторы, в частности, неравная инактивация хромосомы X и, по-видимому, биаллельная экспрессия гена МЕСР2 могут оказывать модифицирующее влияние на действие белка МеСР2 при RTT (Villard et al., 2001; Shahbazian, Zoghbi, 2002). Известно, что неравная инактивация, хромосомы X является характерной особенностью различных форм умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X (Plenge et al., 2002). Однако, в настоящее время неизвестно, характерен ли данный эпигенетический феномен для RTT или нет. В немногочисленных работах об особенностях инактивации хромосомы X при RTT получены противоречивые результаты. Исследователи приходят к выводу о том, что для характеристики феномена неравной инактивации при RTT необходимы дальнейшие исследования значительно большей группы детей (Camus et al., 1996; Amir et al., 2000; Auranen et al., 2001).

При попытке выявления корреляций фенотипических особенностей в зависимости от типа и положения мутаций гена МЕСР2, а также особенностей инактивации хромосомы X, определенной зависимости не обнаружено (Amir et al., 2000; Nielsen et al., 2001; Weaving et al., 2003). Многие исследователи отмечают, что отсутствие корреляции, вероятно, связано с несовершенством методов клинической оценки тяжести фенотипа. Кроме того, были попытки установить корреляцию между типом и положением мутаций гена МЕСР2 и течением болезни без учета модифицирующего влияния эпигенетического фактора инактивации хромосомы X. Ряд исследований эпигенетического феномена инактивации хромосомы X при RTT показали возможность влияния неравной Х-инактивации на клинические особенности RTT (Hofibuhr et al., 2001; Percy, 2001; Shahbazian et al., 2002; Weaving et al., 2003).

Современные данные об эпигенетическом контроле экспрессии генов хромосомы X, достигаемом за счет феномена Х-инактивации, позволили высказать предположение о модифицирующем влиянии некоторых веществ на этот процесс. В связи с этим, не исключается возможность лечения RTT. Помимо симптоматического лечения, коррекция этого заболевания предположительно основывается на том, что мутантный ген МЕСР2 каким-то образом можно инактивировать (Nan, Bird, 2001; Urnov, 2002). Таким образом, поиск возможностей инактивировать хромосому X с мутацией в гене МЕСР2 является перспективным направлением в генной терапии. Поскольку исследований в области экзогенного

эпигенетического контроля экспрессии генов хромосомы X проделано не было, данное утверждение стоит рассматривать исключительно как гипотезу. Таким образом, исследование феномена инактивации хромосомы X при RTT представляется крайне актуальным, так как это необходимо для экспериментального подтверждения модифицирующего влияния неравной X-инактивации на фенотипические проявления RTT.

В России изучение генетических особенностей детей с RTT проводится с 1993 г. Результаты обследования российской когорты больных показывают, что среди девочек с умственной отсталостью примерно 2,5% страдают RTT (Улас, 1994; Ворсанова и др., 1999). Некоторые больные с RTT охарактеризованы клинически, цитогенетически и молекулярно-цитогенетически (Ворсанова и др., 1998; Voгsanova et а1., 1996; 2001). Однако, изучение спектра мутаций гена МЕСР2, а также анализ особенностей инактивации хромосомы X у детей с RTT в России не проводились. В связи с вышесказанным, были сформулированы цель и задачи данного исследования.

Цель исследования

Основная цель работы заключалась в определении влияния эпигенетических и генетических факторов на фенотипические проявления при RTT на основе анализа особенностей инактивации хромосомы X и мутаций гена МЕСР2.

Задачи исследования 1. Провести анализ особенностей инактивации хромосомы X у 75 девочек с ^ГГ.

2.. Провести анализ особенностей инактивации хромосомы X у 75 матерей девочек с RTT, а также 5 матерей мальчиков с фенотипическими проявлениями RTT.

3. Определить спектр мутаций в гене МЕСР2 у 40 больных с классической и атипичными формами RTT, методом прямого секвенирования кодирующей области и фланкирующих интронов гена МЕСР2.

4. Определить эффективность лабораторной диагностики RTT на основе методов энзиматического теста для выявления рекуррентных мутаций в гене МЕСР2 и прямого секвенирования кодирующей последовательности гена МЕСР2.

5. Определить возможность корреляции между генотипом и фенотипом в группе детей с RTT на основе комплексной клинической балльной оценки и данных об эпигенетических (инактивация хромосомы X) и генетических (мутации в гене МЕСР2) особенностях RTT.

Научная новизна

Впервые изучен эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе девочек с RTT, и показано, что неравная инактивация хромосомы X является характерной особенностью RTT.

Впервые изучен эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе матерей детей с RTT и показано, что среди них могут присутствовать асимптоматические носители мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, включая мутации в гене МЕСР2.

Впервые обнаружены корреляции между генотипом и фенотипом при RTT, обусловленные многофакторной зависимостью тяжести течения болезни от инактивации хромосомы X, а также положения и типа мутаций гена МЕСР2. Показано, что неравная Х-инактивация является основным фактором, определяющим клиническую гетерогенность RTT, и характерна как для легких, так и для тяжелых форм заболевания, в зависимости от направления сдвига X-инактивации.

Впервые показана эффективность и значение энзиматического теста на наличие рекуррентных мутаций в гене МЕСР2, позволяющего проводить эффективную лабораторную диагностику.

Обнаружено пять ранее неизвестных мутаций гена МЕСР2 у девочек с RTT.

Впервые охарактеризован редкий случай соматического мозаицизма рекуррентной мутации R270X у мальчика с мозаичной формой синдрома Клайнфельтера и мозаичной формой синдрома Тернера у его матери, а также, редкий случай монозиготных близнецов, конкордантных по мутации гена МЕСР2 (R255X) и дискордантных по сдвигу Х-инактивации.

Практическая значимость

Исследования особенностей инактивации, хромосомы X и спектра мутаций гена МЕСР2 показали необходимость использования данных об эпигенетических и генетических особенностях для лабораторной диагностики, анализа корреляций между генотипом и фенотипом и прогнозирования хода течения RTT.

Полученные данные позволяют охарактеризовать эпигенетические процессы в клетках с мутантным геном МЕСР2, что открывает новые перспективы для поиска генов, в регуляции транскрипции которых участвует белок МеСР2.

Определение эффективности энзиматического тестирования на наличие рекуррентных мутаций показало, что данный метод, имеющий ряд преимуществ по сравнению с секвенированием, является адекватным для лабораторной диагностики RTT.

На основе полученных данных об особенностях инактивации хромосомы X и мутациях гена МЕСР2 разработана оригинальная схема комплексной диагностики RTT.

Полученные результаты могут использоваться для эффективного медико-генетического консультирования с определением семейных случаев RTT, а также для разработки эффективных методов пренатальной и постнатальной диагностики RTT, особенно в доклиническом периоде заболевания.

Положения, выдвигаемые на защиту

1. Исследованы особенности инактивации хромосомы X у 75 девочек с RTT. Впервые показано, что эпигенетический феномен неравной инактивации хромосомы X является характерной особенностью RTT.

2. Особенности инактивации хромосомы X исследованы у 75 матерей девочек с RTT и 5-ти матерей мальчиков с фенотипическими проявлениями RTT. Впервые показано, что неравная инактивация хромосомы X среди матерей детей с RTT наблюдается достоверно выше, чем в контрольной группе. Среди матерей детей с RTT, по-видимому, имеются асимптоматические носители мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, включая мутации в гене МЕСР2.

3. На основе анализа происхождения инактивированной хромосомы. X показано, что у девочек с RTT преимущественно инактивируется отцовская хромосома X.

4. Определен спектр МЕСР2 мутаций в группе, состоящей из 40 детей с RTT. В том числе, у 33 из 39 (84,6%) девочек и одного мальчика определены мутации гена МЕСР2, тогда как у 6 девочек с RTT обнаружено отсутствие МЕСР2 мутаций. Обнаружено пять новых мутаций гена МЕСР2 у девочек с RTT. У мальчика с классической формой RTT обнаружена мутация гена МЕСР2.

5. Обнаружены корреляции между генотипом и фенотипом при RTT, обусловленные зависимостью тяжести течения болезни от инактивации хромосомы X, положения и типа мутаций гена МЕСР2. Показано, что неравная Х-инактивация является основным фактором, определяющим клиническую гетерогенность RTT, и характерна как для легких, так и для тяжелых форм заболевания в зависимости от направления сдвига Х-инактивации. Для дальнейшего корректного анализа влияния различных факторов на фенотип при RTT предложено изучение каждого конкретного случая. Показана необходимость учитывать как генетические, так и эпигенетические характеристики пробандов и их родителей (матерей).

Апробация диссертации Результаты исследования были представлены на Всемирном - конгрессе по синдрому Ретта (World Congress on Rett Syndrome), Каруизава, Япония, 2000; Всемирном конгрессе «Оказание помощи больным с синдромом Ретта» (Providing for the Needs of People with Rett Syndrome), Лондон, Великобритания, 2002; втором Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии, и детской хирургии», 2003, Москва. Результаты данного исследования были доложены и обсуждены на методическом совещании лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, на проблемной комиссии по генетике в отделе врожденных и наследственных заболеваний у детей с нарушением психики Московского НИИ

педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, а также на межлабораторном семинаре Научного центра психического здоровья РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, объект и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа изложена на 181 странице машинописного текста, содержит 21 таблицу и 20 рисунков. Библиографический указатель насчитывает 240 источников, включая 228 зарубежных и 12 отечественных работ,

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе проведены исследования 80 детей с клиническим диагнозом RTT (75 девочек и 5 мальчиков), 80 матерей этих детей, а также в контрольной группе, состоящей из 80 лиц женского пола, не имеющих близких родственников с подтвержденными наследственными болезнями, сцепленными с хромосомой X. Всего в работе с учетом сибсов было исследовано 242 индивидуума.

В работе использовались молекулярно-генетические, Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические методы исследования, а также проводилась клиническая оценка каждого случая RTT и статистическая обработка результатов.

Определение мутаций гена МЕСР2 методом секвенирования было проделано в сотрудничестве с отделом генетики и молекулярной медицины кафедры педиатрии флорентийского университета (г. Флоренция, Италия). Прямое секвенирование ДНК трех экзонов гена МЕСР2 проводили в соответствии с инструкцией, предоставленной фирмой-производителем вместе с наборами для секвенирования.

Энзиматический тест (enzymatic testing) на наличие восьми рекуррентных мутаций гена МЕСР2 проводили по ранее описанному протоколу (Wan et al., 1999; Bienvenu et al., 2002) с некоторыми дополнениями.

Изучение особенностей инактивации хромосомы X проводилось по методу Allen и др. (1992) с некоторыми изменениями (Villard et al., 2000; Plenge et al., 2002) при помощи метил-чувствительной рестрикции фланкирующей последовательности тринуклеотидных повторов (ЦАГ)п интрона 1 гена андрогенного рецептора (HUMARA) с последующей амплификацией данного участка. Метод количественной ПЦР с использованием меченных праймеров применяли для оценки концентрации данного продукта ПЦР, содержащего 5'-метилцитозин.

Цитогенетические исследования проводили в группе больных (75 девочек и 5 мальчиков с RTT), а также у 80 матерей детей с RTT в лаборатории молекулярной цитогенетики нервно-психических заболеваний Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ. Для анализа использовали препараты метафазных

хромосом, полученные из культивированных лимфоцитов периферической крови с помощью стандартных методов (Захаров и др., 1982; Ворсанова и др., 1999).

Флюоресцентную гибридизацию in situ на интерфазных и метафазных хромосомных препаратах проводили по методу, разработанному в лаборатории цитогенетики Научного центра психического здоровья РАМН (Соловьев и др., 1998; Soloviev et al., 1994; Yurov et al., 1996).

Количественная оценка клинических проявлений при RTT была разработана и проводилась в отделе врожденных и наследственных заболеваний у детей с нарушением психики Московского НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ. Эта система представляет балльную оценку степени выраженности 23 клинических признаков (Улас, 1994; Харабадзе и др., 2003). В настоящей работе применяли стандартные методы статистической обработки для медико-биологических исследований (Гланц, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования.

В результате цитогенетических исследований численные хромосомные аномалии были обнаружены у матерей одного мальчика и одной девочки с классической формой RTT — мозаичная форма синдрома Тернера с кариотипами 45, X [1]/46, XX [20] и 45, X [1]/46, XX [16], соответственно. У другой матери девочки с классической формой обнаружены мозаицизм по трисомии хромосомы X и дополнительная маркерная хромосома с кариотипом 47, XX, +mar [15]/48, XXX, +таг [2]. В результате молекулярно-цитогенетических исследований методом FISH был подтвержден и уточнен цитогенетический диагноз матерей с мозаичными формами синдрома Тернера и трисомии хромосомы X. Кроме того, определение происхождения маркерной хромосомы показало, что она не содержит материала хромосомы X, а также материала околоцентромерного гетерохроматина хромосом 1. 2, 3, 4, 6, 8, 9, 13, 14, 15, 16, 18 21, 22 и Y. У мальчика с классической формой RTT в клетках мышечной ткани был обнаружен клон клеток с дисомией хромосомы X (47, XXY) в 14%. У остальных детей с RTT и их матерей численных аномалий хромосом не выявлено с помощью метода FISH, что подтверждает данные, полученные с помощью классического цитогенетического анализа. Наличие мозаичной формы синдрома Клайнфельтера у мальчика с классической формой RTT подтверждает предположение о том, что классическая форма RTT может наблюдаться у мальчиков при условии наличия полной или мозаичной формы синдрома Клайнфельтера, а также при мозаицизме по мутации гена МЕСР2 (Thomas, 1996; Vorsanova et al., 1996; 2001). Кроме того, у восьми девочек из 75 (10,7%) было обнаружено увеличение гетерохроматиновых районов хромосомы 9 (9qh+) и у шести девочек (8%) — хромосомы 1 (lqh+). Полученные результаты

цитогенетических исследований согласуются с литературными данными (Ворсанова и др., 1998; 1999).

Молекулярно-генетические исследования мутаций гена МЕСР2 у детей с

синдромом Ретта.

Анализ кодирующей последовательности гена МЕСР2 и фланкирующих интронных последовательностей позволил обнаружить мутации гена МЕСР2 у 33 из 39 (84,6%) девочек с RTT и одного мальчика с классической формой RTT. Обнаружено 13 миссенс мутаций (39,4%) — R133C (3 индивидуума), Т158М (4 индивидуума), Т197М (1 индивидуум), R306C (4 индивидуума), Р388Т (1 индивидуум); 16 нонсенс мутаций (48,5%) — S65X (1 индивидуум), R168X (5 индивидуумов), R255X (6 индивидуумов), R270X (3 индивидуума), R294X (1 индивидуум); 4 делеции (12,1%) — del466-470 (155F/S), 691delG (230F/S), 732delG (239F/S), Р403Х (dell 157-1197). Вклад рекуррентных мутаций (R133C, Т158М, R168X, R255X, R270X, R294X, R306C) составил 79% (26 девочек). Изучение положения ? мутаций выявило следующее: мутация S65X локализована в начале кодирующей области в третьем экзоне до MBD (3% от общего количества мутаций); в четвертом экзоне в MBD локализированы три мутации R133C, четыре Т158М и del466-470 (155F/S) (24,3% от общего количества мутаций); между MBD и TRD обнаружено 5 мутаций R168X и Т197М (18,2% от общего количества мутаций); в TRD локализированы мутации 691delG (230F/S), 732delG (239F/S), шесть R255X, три R270X, R294X, четыре R306C (48,5% от общего количества мутаций); две мутации Р388Т и Р403Х (dell 157-1197) локализованы после TRD (6% от общего количества мутаций). На рисунке 1 представлен спектр МЕСР2 мутаций у детей с RTT, определенный в данной работе.

Рисунок 1. Спектр мутаций гена МЕСР2, определенный в данной работе, у 33 девочек с 11ТТ.

-МВО -ТЯй

• иекоднрующая область

а

I

732с1е15 (239Р13)

965Х

И

5'1ГШ

/1

¡60 тысяч п.и,

ЭКЗОН 2

яшср

2Л «Г

т

Т197М

48»

«1$

Я2Э4Х

РЗЭ8Т

9»

у* 3 . ; 1

ясзсн 3,

756 п.м.

К2?ОХ{3)

Р403Х{й «И 157-11 97)

I«« У

зггга

Т168М{4) 691<»*1СКг30РГ31

Я305С(4)

-—-• экзомД —

Среди детей с классической формой RTT 28 из 33 (84,8%) имели мутации гена МЕСР2. Мутации в гене МЕСР2 были также определены у 5 детей из 6 (83,3%) с атипичными вариантами (две девочки — стертая форма, две девочки — врожденная форма и две девочки — вариант с сохранной речью).

Суммируя данные, полученные в результате исследования мутаций гена МЕСР2, и, анализируя соответствие полученных данных с литературными, можно сделать следующее заключение. Частота мутаций в гене МЕСР2, выявленных у девочек с RTT, в настоящем исследовании составила 84,6% и является более высокой по сравнению с большинством предыдущих исследований. Следовательно, подтверждается ранее выдвинутое предположение о том, что мутации в гене МЕСР2 являются характерной чертой классической формы RTT (Bienvenu et al., 2000; Auranen et al., 2001). Среди детей с атипичными вариантами пять из шести имели мутации в гене МЕСР2. Эти данные не соответствуют ранее полученным, поскольку в большинстве работ отмечается то, что среди детей с атипичными вариантами RTT наблюдается небольшое число детей с мутациями гена МЕСР2 (Cheadle et al., 2000; Hofïbuhr et al., 2001; Weaving et al., 2003). В связи с этим, исходя из полученных данных, можно предположить, что стертая форма и вариант с сохранной речью являются как фенотипическими, так и генетическими вариантами RTT, и связаны с мутациями в гене МЕСР2. Подробно анализируя спектр мутаций, определенный в настоящей работе, можно сделать вывод о том, что все типы мутации гена МЕСР2, обнаруженные в ходе исследования, являются патогенными. Обнаружено пять ранее неописанных мутаций: del466-470 (155F/S), 691delG (230F/S), 732delG (239F/S), Р388Т и Р403Х (dell 157-1197).

Анализируя случай врожденной формы RTT у девочки с мутацией Т197М и литературные данные об этой мутации, можно обоснованно предположить, что данная мутация является причиной некоторого субфенотипа RTT, характеризующегося наличием врожденных аномалий, подобных классической форме болезни. Анализ мутаций гена МЕСР2 у детей с вариантом с сохранной речью позволяет сделать вывод о том, что мутация R306C встречается в значительной степени чаще у детей с вариантом с сохранной речью, чем было показано ранее. В настоящей работе также предполагается, что при условии соответствующего сдвига Х-инактивации данная мутация приводит преимущественно к варианту с сохранной речью. Анализируя ранее полученные данные о мутациях, расположенных в 388 положении пептидной последовательности белка МеСР2, а также, учитывая наличие мутации Р388Т у девочки с классической формой RTT, выдвигается предположение о том, что консервативная полипролиновая последовательность имеет определенное влияние на функции белка МеСР2.

При исследовании мутаций гена МЕСР2 у детей с RTT при помощи энзиматического теста на наличие рекуррентных мутаций было обнаружено полное соответствие с данными о рекуррентных мутациях, определенных методом секвенирования. Помимо этого, было исключено наличие рекуррентных мутаций гена МЕСР2 у 8-ми детей с классической формой RTT. В результате исследования мутаций гена МЕСР2 этим методом была продемонстрирована правомочность использования данного метода в диагностике, так как результаты этого теста и метода секвенирования полностью совпадали. В настоящей работе показано, что трое из шести детей с атипичными формами RTT имеют рекуррентные мутации гена МЕСР2, что свидетельствует об эффективности энзиматического теста при исследовании детей с атипичными вариантами RTT. При оценке диагностической ценности метода энзиматического тестирования показано, что до 70% случаев RTT данный метод позволяет определить наличие МЕСР2 мутации. Поскольку эффективность энзиматического теста на наличие восьми рекуррентных мутаций представляется в достаточной степени высокой, этот тест следует рекомендовать как один из методов дифференциальной диагностики RTT. Применение этого метода в качестве первоначального при лабораторной диагностике RTT позволяет избежать существенных финансовых и временных затрат, поскольку метод секвенирования ДНК для определения мутаций гена МЕСР2 в таких случаях необходимо применять лишь при анализе от 30-70% детей с RTT.

Исследование особенностей инактивации хромосомы X у детей с синдромом

Ретта и их матерей.

Количественная оценка метилированых (неактивных) аллелей проводилась с помощью математического анализа цифрового изображения электрофореграмм, полученных с помощью секвенатора. На рисунке 2 представлены результаты количественного ПЦР-анализа инактивации хромосомы X при разных степенях сдвига.

В настоящей работе также было проведено исследование происхождения преимущественно инактивированной хромосомы X у девочек с RTT. Метод определения происхождения преимущественно инактивированной хромосомы X представлял собой сравнительный анализ данных об особенностях Х-инактивации у девочек с RTT и их матерей в каждой семье.

Рисунок 2. Количественный ПЦР-анализ инактивации хромосомы X при разных степенях сдвига у детей с RTT и матери ребенка (А — степень сдвига — 58%, Б — степень сдвига — 90%, В — степень сдвига — 100%).

В настоящем исследовании особенности инактивации хромосомы X методом анализа статуса метилирования фланкирующих участков экспансии (ЦАГ)п повторов гена HUMARA были определены: у 70 из 75 (93%) детей с RTT и одного сибса без клинических проявлений R1T; у 65 из 80 (81%) матерей девочек и одного мальчика с RTT, а также четырех матерей мальчиков с фенотипическими проявлениями болезни; у 76 из 80 (95%) женщин, составивших контрольную группу для настоящего исследования. Таким образом, общая эффективность данного

метода для всех образцов ДНК в настоящей работе составила 89,8%, что соответствует литературным данным (Allen et al., 1992; Sharp et al., 2000).

В результате анализа частоты неравной инактивации хромосомы X у девочек с RTT, исследованных на наличие МЕСР2 мутаций, было обнаружено, что 19 детей из 38 (50%) имели сдвиг инактивации более 75%, 16 (42,1%) — более 80% и 9 (23,7%) — более 90%. Среди девочек с RTT, неисследованных на наличие мутаций гена МЕСР2, 14 детей (43,8%) — более 75%, 10 (31,3%) — более 80% и 5 (15,6%) — более 90%. Среди матерей девочек с RTT число с неравной Х-инактивацией составило 20 женщин из 60 (33,3%) со сдвигом инактивации более 75%, 12 женщин из 60 (20%) —более 80% и 3 женщины из 60 (5%) — более 90%. В контрольной группе 5 женщин из 76 (6,5%) имели сдвиг инактивации более 75 и 80%, тогда как лишь двое имели сдвиг Х-инактивации более 90% (табл. 1).

Таблица 1. Удельный вес индивидуумов с неравной инактивацией хромосомы X среди девочек с RTT, исследованных и неисследованных на

наличие МЕСР2 мутаций, их матерей и в контрольной группе.

Девочки с RTT, Девочки с RTT,

исследованные на неисследованные Матери девочек с

наличие МЕСР2 на наличие МЕСР2 RTT (п=65) Контроль-

Степень сдвига X-инактивации мутации (п=38) мутации (п=32) ная группа,

Удельный вес детей с неравной X-инактивацией Р Удельный вес детей с неравной X-инактивацией Р Удельный вес женщин с неравной Х-инактивацией (%) Р удельный вес женщин с неравной Х-инактива-цией(%) (п=76)

(%) (%)

> 75% 50 р<0,001 43,8 р<0,001 33,3 р<0,001 6,5

> 80% 42,1 р<0,001 31,3 р<0,001 20 р<0,01 6.5

> 90% 23,7 pcO.OOl 15,6 р<0,001 5 р>0,4 2,6

Различие в частоте детей с неравной Х-инактивацией как в группе исследованной (41%), так и неисследованной (31,3%) на мутации гена МЕСР2 является статистически недостоверным (р>0,1). Сравнение полученных и литературных данных показало, что в настоящей работе изучена Х-инактивация в одной из самых больших групп детей с ЯТТ, и обнаружено достоверное увеличение числа девочек с неравной Х-инактивацией при ЯТТ.

Анализируя причины сдвига инактивации хромосомы X у детей с ЯТТ, а также особенности Х-инактивации у детей с ЯТТ без мутаций гена МЕСР2 и их матерей, можно сделать вывод о том, что белок МеСР2 регулирует транскрипцию генов хромосомы X. Данное утверждение имеет исключительное значение для

последующих молекулярно-биологических исследований процессов, происходящих в клетках с мутированным геном МЕСР2. Было обнаружено также, что среди матерей мальчиков с RTT и реттоподобными проявлениями аутизма у 3 из 5 (60%) имеется практически полная инактивация одной из хромосом X (95:5; 94:6; 100:0), что может свидетельствовать об Х-сцепленном характере наследования аутизма с реттоподобными проявлениями. В настоящей работе обнаружено статистически достоверное увеличение числа женщин с неравной инактивацией хромосомы X среди матерей детей с RTT. Показано, что носительницами мутаций гена МЕСР2 могут быть 7 матерей. Следовательно, не учитывая мутаций, случайный сдвиг X-инактивации обнаружен у 5 матерей. Подобные результаты получены и для контрольной группы. При оценке вклада семейных случаев при RTT было показано, что 10 случаев из 69 (14,5%) могут быть определены как семейные. В настоящее время принято считать, что 1% случаев RTT являются семейными (Shahbazian, Zoghbi, 2001), тогда как в данной работе их вклад составляет 14,5%. Таким образом, вклад семейных случаев больше, чем было показано ранее. Анализ происхождения преимущественно инактивированной хромосомы X показал, что третья часть детей (11 из 33) имеет преимущественно инактивированную материнскую хромосому X. Полученные данные отличаются от ранее опубликованных, где показано преимущественно отцовское происхождение мутантной хромосомы X (Girard et al., 2001; Тгарре et al., 2001). Этот факт объясняется тем, что предыдущие работы не анализировали особенности Х-инактивации у детей без мутаций с точки зрения их значения в общей группе больных, а также и то, что число семейных случаев RTT считалось крайне невысоким. Обнаружено также, что среди детей без мутаций гена МЕСР2 наблюдается неравная Х-инактивация у четырех девочек. Этот факт можно объяснить только тем, что RTT у этих детей вызван аномалиями хромосомы X.

Исследование зависимости фенотипической характеристики детей с синдромом Ретта от особенности инактивации хромосомы X и мутаций гена

МЕСР2.

В таблице 2 приведены результаты анализа фенотипических особенностей детей с RTT, их возраста и начала регресса, а также особенностей Х-инактивации и мутации гена МЕСР2.

Таблица 2. Оценка фенотипической характеристики детей с RTT (сумма количественной оценки признаков), особенности инактивации хромосомы X и

мутации гена МЕСР2; возраста детей и начала регресса.

семьи Общая количественная < оценка тяжести (в баллах) Особенности сдвига X-инактивации Мутация гена МЕСР2 Форма болезни Возраст больного (мес) Возраст начала регресса (мес)

1 30 60:40 — Классическая 33 18

2 59 56:44 — Классическая 23 8

3 49,5 62:38 — Классическая 48 18

4 31 52:48 — Классическая 48 19

5* 59 79:21 R255X Классическая 14 7

6»* 52 56:44 R255X Классическая 18 12

49 80:20 R255X Классическая 18 12

7 45 90:10 R168X Классическая 18 9

8 33 95:5 Р388Т Классическая 20 16

9 28 51:49 Т197М Врожденная 6 0

10 57 58:42 R168X Классическая 24 17

11 32 6:94 R306C Вариант с сохранной -речью 14 12

12 60 80:20 R168X Классическая 18 10

13Л 67 69:31 Т158М Классическая 15 11

14 44 51:49 Т158М Классическая 24 12

15 33,5 53:47 — Классическая 23 15

16 34 100:0 — Классическая 36 18

17 36 74:26 — Классическая 14 7

18 61,5 89:11 нет мутации Врожденная 4 0

19 35,5 84:16 нет мутации Классическая 18 5

20 61 55:45 R270X Классическая 8 7

21 60 69:31 нет мутации Классическая 23 6

22 53,5 61:39 R255X Классическая 14 7

23 61 93:7 нет мутации Классическая 32 12

24 52,5 64:36 нет мутации Классическая - 90 12

25 37,5 74:26 R168X Классическая 27 7

26 38 90:10 нет мутации Классическая 14 6

27 25 86:14 S65X Стертая 40 6

28 46 80:20 R255X Классическая 25 16

29 35 38:62 — Классическая 30 20

30 21 46:S4 Р403Х Классическая 14 12

31 31,5 84:16 RI33C Классическая 18 6

32 47 65:35 69IdelG Классическая 16 15

33 34 58:42 Т158М Классическая 15 10

34 26 90:10 R306C Вариант с сохранной речью 30 12

35 35 51:49 R294X Классическая 19 12

36 39 44:56 R270X Классическая 15 8

37 52 69:31 Т158М Классическая 36 6,5

38 35 76:24 R306C Классическая 30 9

39 31 29:71 — Классическая 12 7

40 44 17:83 del 466-470 Классическая 14 11

41 14.5 11:89 R133C Классическая 24 18

42ЛЛ 30 93:7 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 18 4

43 46 66:34 — Классическая 24 14

44 11 73:27 — Стертая 47 24

45 16 98:2 1ШЗС Стертая 15 4,5

46 25 88:12 — Вариант с сохранной речью 36 9

47 55 47:53 732<)еЮ Классическая 21 14

48 28,5 71:29 11270Х Классическая • 22 15

49 30,5 66:34 — Классическая 48 17

50 22,5 94:6 — Классическая 51 22

51лл 13 55:45 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 45 15

52ЛА 49 71:29 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 30 11,5

53 15 46:54 — Стертая 16 0

54ЛЛ 39 22:78 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 35 16

55ЛЛ 35,5 65:35 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 40 12

56 41,5 — Я255Х Классическая 40 18

57 39 7:93 — Классическая 36 8

58 32 60:40 — Классическая 18 10

59 30 75:25 — Классическая 32 17

60^ 30 83:17 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 25 14

61** 28 50:50 Отсутствие рекуррентных мутаций Классическая 37 24

62 32 21:79 И168Х Классическая 19 16

63 26,5 47:53 Ю06С Классическая 41 14

64 44 20:80 — Классическая 8 4

65 28,5 76:24 — Классическая 24 5

66 28 50:50 — Классическая 20 4,5

67 50,5 97:3 — Врожденная 27 0

68 19 50:50 — Классическая 8' 3

69 28 55:45 — Классическая 14 3

70 33 60:40 — Стертая 70 7

сибс — здоровая девочка со сдвигом Х-инактивации 56:44; "* — близнецы; Л — сибс — здоровый

мальчик; — отсутствие рекуррентных мутаций — ШЗС, Т158М, ГШвХ, Я255Х, (ШОХ. £294Х,

Я306С.

Для изучения влияния на клиническое состояние эпигенетических факторов, таких как инактивации хромосомы X, было предложено разделить детей с RTT на три группы по тяжести фенотипических проявлений болезни. Поскольку даже незначительный сдвиг Х-инактивации может повлиять на фенотипические

проявления RTT, сдвиг Х-инактивации также разделили на три группы: первая — от 50% до 65%; вторая — от 65% до 80%; третья — более 80%. Для анализа влияния положения мутаций гена МЕСР2 на фенотипические проявления RTT была изучена зависимость количественной оценки степени тяжести (в баллах) от положения мутаций в гене МЕСР2.

Анализ зависимости количественной оценки степени тяжести от положения мутаций в гене МЕСР2 показал, что мутации, приводящие к наиболее тяжелому течению болезни, расположены в участке от 158 до 270 а.о. Данный участок имеет исключительное значение для белка МеСР2, поскольку мутации в нем поражают функции связывания с CpG сайтами и подавления транскрипции (Yusufzai, Wolffe, 2000). Полученные результаты соответствуют литературным данным. Тем не менее, зависимость между типом мутации и тяжестью течения RTT не была установлена для всех случаев. Таким образом, следует отметить, что положение мутации является не основным фактором, влияющим на фенотип при RTT, и необходимо сказать, что инактивация хромосомы X может нивелировать или усугублять влияние на фенотип МЕСР2 мутации.

Поскольку в предыдущих работах при анализе корреляций генотип-фенотип среди больных RTT не было получено определенных результатов (Amir et al., 2000; Nielsen et al., 2001; Percy, 2001; Weaving et al., 2003), в настоящей работе впервые предложено проанализировать каждый случай в отдельности, а затем на базе этого анализа сделать выводы о наличии или отсутствии корреляций генотип-фенотип.

Из подробного анализа фенотипа у детей с RTT в зависимости от генетических особенностей видно, что на фенотипические проявления RTT влияют в некоторой степени тип и положение мутаций гена МЕСР2. Однако эти генетические особенности RTT не способны в полной степени объяснить различие фенотипических проявлений болезни у большинства исследованных детей.

Анализ особенностей Х-инактивации показал, что на проявление RTT преимущественно влияет этот эпигенетический феномен. Эффективность изучения корреляций генотип-фенотип, базируясь преимущественно на данных об X-инактивации, является исключительно высокой, так как лишь в 2-х случаях подобный анализ не дал определенных результатов. Тогда как, изучая только зависимость фенотипа от типа и положения мутаций гена МЕСР2, определенных корреляций в отношении каждого отдельного случая получить не удалось (особенно в случаях рекуррентных мутаций).

Суммируя вышесказанное, можно с уверенностью сказать, что, несмотря на исключительную клиническую и генетическую гетерогенность RTT, имеется возможность проведения корреляций генотип-фенотип. В предыдущих работах подобные корреляции изучались в аспектах общей выборки больных, и при этих исследованиях определенных результатов получено не было (Amir et al., 20006;

Bienvenu et al., 2000; Huppke et al., 2000; Auranen et al., 2001; Nielsen et al., 2001a; Weaving et al., 2003). Поскольку на клинические характеристики RTT влияет несколько факторов, в частности, инактивация хромосомы X, а также тип и положение мутации в гене, корреляционный анализ зависимости фенотипических проявлений от каждого параметра не может дать определенных результатов. В связи с этим, основываясь на полученных данных, необходимо рекомендовать при дальнейших изучениях корреляций генотип-фенотип при RTT анализировать каждый конкретный случай. Изучив каждый отдельно взятый случай, можно сделать вывод о влиянии различных феноменов на клиническую картину RTT.

Схема последовательных этапов диагностики синдрома Ретта, разработанная на базе полученных данных.

Суммируя данные о клинических, цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярных аспектах RTT, в настоящей работе была предложена схема последовательных этапов диагностики RTT (рис.3).

Схема представляет собой постадийный анализ каждого конкретного случая с помощью молекулярных, цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов лабораторной диагностики. Учитывая показанную в данном исследовании эффективность методов анализа Х-инактивации и энзиматического теста, можно сделать вывод о том, что данная схема будет успешно применяться в диагностике RTT, особенно в доклинической.

В качестве одной из стадий дифференциальной диагностики можно также предложить цитогенетический анализ, который позволяет определить численные и структурные хромосомные аномалии, поскольку наличие хромосомной аномалии у детей с RTT может считаться одним из исключающих критериев для диагностики RTT. Следует отметить, что у 90% детей, исследованных в настоящей работе, обнаружен особый тип репликации хромосомы X (тип С). Как было показано в ряде работ, этот тип репликации не обнаруживается у индивидуумов без фенотипических проявлений RTT (Vorsanova et al., 1996; 2001). Следовательно, эффективность применения цитогенетических и молекулярно-цитогенетических методов диагностики RTT может достигать 90%. Этого нельзя ни учитывать при исследовании случаев с RTT.

Рисунок 3. Оригинальная схема комплексной диагностики RTT.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведено исследование эпигенетических, генетических и клинических особенностей ЯТТ. Исследование репрезентативной группы детей с клиническим диагнозом КГТ позволило выявить наличие мутаций в гене МЕСР2 у 84,6%. В ходе исследования особенностей инактивации хромосомы X у детей с ЯТТ впервые было обнаружено, что неравная инактивация хромосомы X является одной из значимых эпигенетических особенностей ЯТТ. Неравная инактивация хромосомы X встречается у 37% детей с ЯТТ, что значительно выше, чем в контрольной группе (6,5%). Было обнаружено, что анализ Х-инактивации у детей с ЯТТ и их матерей является информативным методом для изучения клинической и генетической гетерогенности этой болезни, и в ряде случаев является более информативным для клинической характеристики больных, чем определение мутаций гена МЕСР2. Было обнаружено, что фенотипические особенности детей с КГТ в некоторой степени зависят от типа и положения мутации, хотя необходимо заметить, что без учета фактора Х-инактивации определение подобной зависимости не дает однозначных результатов. Неравная инактивация хромосомы X может

приводить как к относительно легкому течению болезни (в случае преимущественной инактивации хромосомы X с мутацией), так и к тяжелым формам течения болезни (в случае преимущественной инактивации хромосомы X без мутации). В ходе изучения было обнаружено, что случаи RTT без МЕСР2 мутаций не представляется возможным охарактеризовать с точки зрения генетических особенностей, не анализируя особенности Х-инактивации. Выделены два редких случая RTT, позволяющие расширить представления о генетических и эпигенетических особенностях этой болезни. Первый случай — монозиготные близнецы, конкордантные по мутации гена МЕСР2 (R255X) и дискордантные по сдвигу Х-инактивации. Второй случай — мальчик с классической формой RTT и рекуррентной МЕСР2 мутацией (R270X). Суммируя данные о клинических, цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярных аспектах RTT, в настоящей работе была предложена схема последовательных этапов диагностики RTT. Схема представляет собой постадийный анализ каждого конкретного случая с помощью методов лабораторной диагностики, представленных на схеме (рис.3).

ВЫВОДЫ

1. Исследован эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе девочек с RTT. Установлена повышенная, частота неравной инактивации хромосомы X при RTT (37%) по сравнению с контрольной группой (6.5%). Доказано, что эпигенетический феномен неравной инактивации хромосомы X является характерной особенностью RTT.

2. Исследован эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе матерей девочек с RTT. Обнаружено, что частота неравной инактивации хромосомы X в три раза превышает контрольное значение (20% и 6.5%, соответственно). Научно обосновано предположение о наличии асимптоматических носительниц мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, среди матерей детей с RTT, включая ген МЕСР2.

3. На основе анализа происхождения инактивированной хромосомы X у девочек с RTT показано, что неравная инактивация хромосомы X преимущественно связана с инактивацией отцовской хромосомы по сравнению с материнской (67,7% и 33,3%, соответственно).

4. Определены частота и спектр мутаций гена МЕСР2, кодирующего метил-CpG-связывающий белок 2, локализованного в хромосоме X (участок q28). У 84,6% девочек с клиническим диагнозом RTT методом прямого секвенирования выявлены мутации гена МЕСР2. Определен следующий спектр мутаций гена МЕСР2 при RTT: 13 миссенс мутаций (39,4%) — R133C (3), Т158М (4), Т197М (1), R306C (4), Р388Т (1); 16 нонсенс мутаций (48,5%) — S65X (1), R168X (5), R255X (6), R270X (3), R294X (1); 4 делении (12,1%) — del466-470 (155F/S), 691delG (230F/S), 732delG (239F/S), Р403Х (dell 157-1197). Обнаружено пять новых мутаций гена МЕСР2 —

del466-470 (155F/S), 691delG (230F/S), 732delG (239F/S), P388T и Р403Х (dell 1571197). У мальчика с классической формой RTT обнаружена нонсенс мутация R270X.

5. Проведен анализ рекуррентных мутаций гена МЕСР2 (R133C, Т158М, R168X, R255X, R270X, R294X, R306C) с помощью метода энзиматического тестирования. Показана высокая эффективность энзиматического теста, позволяющего идентифицировать рекуррентные мутации с эффективностью до 79% у детей с клиническим диагнозом RTT.

6. Исследование корреляций генотип-фенотип в группе детей с RTT на основе комплексной клинической балльной оценки и данных о генетических (тип и положение мутации гена МЕСР2) и эпигенетических (неравная» инактивация хромосомы X и направление сдвига Х-инактивации) особенностях позволило установить корреляции генотип-фенотип при RTT, обусловленных зависимостью между тяжестью течения болезни и инактивацией хромосомы X, а также положением и типом мутаций гена МЕСР2. При этом неравная Х-инактивация является определяющим клиническую гетерогенность RTT фактором, а течение болезни зависит от направления сдвига Х-инактивации.

7. Эпигенетический феномен инактивации хромосомы X оказывает модифицирующее влияние на фенотип даже при идентичных генотипах монозиготных близнецов, конкордатных по МЕСР2 мутации и дискордантных по сдвигу Х-инактивации.

8. Научно обоснована схема проведения дифференциальной диагностики RTT, основанная на постадийном применении клинических, цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярных методов диагностики синдрома Ретта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Работы в отечественной печати:

1. Ворсанова С.Г., Улас В.Ю., Юров Ю. Б., Джовануччи-Узиелли М-Л., Демидова И.А., Жианти Л., Виллард Л., Юров И.Ю., Берешева А.К., Новиков П.В. Клинико-генетические корреляции при синдроме Ретта: изучение российской когорты больных.//Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова.2002.Т.102.№10. С.23-29.

2. Юров И.Ю., Виллард Л. Новые технологии в изучении синдрома Ретта: исследование инактивации хромосомы X у детей У/Материалы первого Всероссийского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».2002.С.136.

3.* Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Улас В.Ю., Узиелли М.-Л. Демидова И.А., Жианти Л., Виллард Л., Юров И.Ю., Берешева А.К., Соловьев И.В., Новиков П.В. Молекулярно-цитогенетические и молекулярные исследования синдрома Ретта.// Материалы первого Всероссийского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».2ОО2.С.12О.

4. Ворсанова СТ., Юров И.Ю., Шейнзон П.М., Юров Ю.Б. Современные представления о синдроме Ретта: клинические, генетические и биохимические аспекты .//Психиатрия.2003.1 .С.62-70.

5. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Улас В.Ю., Демидова И.А., Узиелли М-Л., Жианти Л., Виллард Л., Юров И.Ю., Берешева А.К., Соловьев И.В., Новиков П.В. Молекулярно-генетические исследования синдрома Ретта.//Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии (Материалы Всероссийской конференции с международным участием). 2003 .Томск.С.46-48.

6., Юров И.Ю., Виллард Л., Ворсанова СП, Улас В.Ю., Юров Ю.Б. Исследование особенностей инактивации хромосомы X у больных с синдромом РеттаУ/Сибирский вестник психиатрии и наркологии.2003.1.27.С.26-28.

7. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Улас В.Ю., Демидова И.А., Узиелли М-Л., Жианти Л., Юров И.Ю.; Берешева А.К., Новиков П.В. Клинико-генетические аспекты синдрома Ретта: изучение российской когорты больныхУ/Сибирский вестник психиатрии и наркологии. 2003.1.27.С.39-42.

8. Ворсанова СТ., Юров Ю.Б., Берешева А.К., Юров И.Ю. Современные методы исследования синдрома Ретта: возможность изучения действия различных препаратов на экспрессию ломкости хромосом //Десятый Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (тезисы докладов).2003.Москва. С.433.

9. Юров И.Ю.,. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б. Современные представления о синдроме Ретта: результаты клинических, генетических, биохимических

исследований. В: Методическое пособие: Современные достижения генетических исследований: клинические аспекты. Изд. РГМУ. Ростов-на-Дону 2003.С.81-97. 10. Юров И.Ю.; Ворсанова С.Г., Колотий А.Д., Соловьев И.В., Улас В.Ю., Виллард Л., Юров Ю.Б. Новые молекулярные и молекулярно-цитогенетические технологии в диагностике синдрома Ретта.//Материалы второго Российского конгресса: «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».200З.С.160-

Работы в зарубежной печати:

11. Vorsanova S.G., Yurov Yu.B., Kolotii A.D., Demidova I.A., Beresheva A.K., Iourov T.Y., Soloviev I.V. FISH analysis of replication and transcription of chromosome X-loci at Rett syndrome: new approach for genetic analysis of Rett syndrome.//WorId Congress on Rett Syndrome, Abstract book, Karuizawa, Nagano, Japan.2000.P.47.

12. Yurov Y.B., Vorsanova S.G., Kolotii A.D., Iourov I.Y. Molecular-cytogenetic investigation of skewed chromosome X inactivation in Rett Syndrome//Brain & Development. 2001.23. S.214-217.

13. Yurov Y.B., Vorsanova S.G., Kolotii A.D., Iourov I.Y., Sheinson P. Fish analysis of DNA replication ofchromosome X loci in Rett syndrome using interphase fluorescence in situ hybridization.//Brain & Development.2002.24.6.P.558-559.

14.. Vorsanova S.G., Yurov Y.B., Ulas V.Y., Giovannucci Uzielli M-L., Demidova I.A., Gianti L., Villard L., Iourov I.Y., Beresheva A.K., Novikov P.V. Molecular and cytogenetic studies of Rett syndrome (RTT): a retrospective analysis of Russian cohort of RTT patientsy/American Journal of Medical Genetics.2002.V.l 14.7.P.196.

15. Yurov Y.B., Vostrikov V.M., Vorsanova S.G., Monakhov V.V., Iourov I.Y. Interphase multicolor FISH study of individual human chromosomes in post-mortem brain at schizophrenia and Rett syndrome.//International conference "Providing for the Needs of People with Rett Syndrome": abstract book. London. UK. 2002.P.118.

16. Vorsanova S., Kolotii A., Iourov I., Ulas V., Soloviev I., Yurov Y. Evidence for epigenetic silencing of mutated MECP2 gene in Rett syndrome due to delay in replication timing7/Human Genome Meeting 2003, Cancun, Mexico. Abstract book. P. 102.

17. Iourov I.Y., Vorsanova S.G., Villard L., Ulas V.Y., Gianti L., Giovanucci-Uzielli M.L., Yurov Y.B. An extremely skewed X-inactivation in a women with a mosaic form of Turner syndrome having a boy with a mosaic form of Klinefelter syndrome and Rett syndromeV/Annales de Genetique.2003.46.N.2-3.P.198-199.

18. Iourov I.Y.. Villard L., Vorsanova S.G., Yurov Y.B. The study of X-inactivation pattern in Russian cohort of Rett syndrome girls.//American Journal of Medical Genetics.2003.V. 1.122В .Р.74.

161.

Юров Иван Юрьевич [Россия]

«Эпигенетические и генетические особенности синдрома Ретта».

Основная цель работы заключалась в установлении влияния эпигенетических и генетических факторов на фенотипические проявления при синдроме Ретта на основе анализа особенностей инактивации хромосомы X и мутаций гена МЕСР2. Определены частота и спектр мутаций гена МЕСР2. У 84,6% девочек с клиническим диагнозом синдром Ретта методом прямого секвенирования выявлены мутации гена МЕСР2. Проведен анализ рекуррентных мутаций гена МЕСР2 с помощью метода энзиматического тестирования, и показана высокая его эффективность. Исследован эпигенетический феномен инактивации хромосомы X у девочек с синдромом Ретта и доказано, что данный эпигенетический феномен является характерной особенностью синдрома Ретта. Исследован эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в группе матерей девочек с синдромом Ретта. Научно обосновано предположение о наличии асимптоматических носительниц мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, среди матерей детей с синдромом Ретта, включая ген МЕСР2. На основе комплексной клинической балльной оценки и данных об эпигенетических и генетических особенностях установлены корреляции генотип-фенотип в группе детей с синдромом Ретта. На базе полученных данных предложена схема диагностики синдрома Ретта.

Iourov Ivan Yur'evich [Russia]

"Epigenetic and genetic features of Rett syndrome".

The main aim of the present study was to reveal the epigenetic and genetic factor contribution to the phenotypic manifestation of Rett syndrome basing on chromosome X inactivation patterns and MECP2 gene mutations analyses. Spectrum and frequency of MECP2 mutations were determined. In 84.6% of girls with Rett syndrome the MECP2 mutations were detected by direct sequencing. MECP2 mutations were also studied by enzymating testing and its high efficiency was demonstrated. The epigenetic phenomenon of chromosome X inactivation in Rett syndrome girls group was studied and this epigenetic phenomenon was shown to be a common feature of Rett syndrome. The epigenetic phenomenon of chromosome X inactivation in the group of Rett syndrome girl mothers was studied. The presence of asymptomatic female carriers of X-linked mutations including MECP2 among mothers of affected girls is estimated. The genotype-phenotype correlations based on clinical scoring system and epigenetic and genetic feature data were determined in females with Rett syndrome. The original scheme of Rett syndrome diagnosis based on the data obtained was proposed.

»

IE7.390 8

Отпечатано в ООО «Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Подписано в печать 25.02.2004 г. Формат 60x90/16. 1,0 п.л. Тираж 100 экз. Бумага New SvetoCopy.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юров, Иван Юрьевич

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 II.1. Синдром Ретта 12 II. 1.1. Клиническая характеристика 12 II. 1.2. Диагностические критерии 18 II. 1.3. Классическая форма и атипичные случаи синдрома Ретта 20 II.2 Генетические особенности синдрома Ретта

11.2.1. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические исследования

11.2.2. Картирование гена, ответственного за синдром Ретта

11.2.3. Ген МЕСР2 (характеристика белка МеСР2 и гена МЕСР2)

11.2.4. Мутации в гене МЕСР

11.3. Инактивация хромосомы X

11.3.1. Феномен инактивации хромосомы X

11.3.2. Причины возникновения инактивации хромосомы X и её значение в патогенезе наследственных болезней

11.3.3. Роль инактивации хромосомы X при синдроме Ретта

11.4. Корреляции особенностей генотипа и фенотипа при синдроме Ретта

11.4.1. Корреляция фенотипа с типом и положением мутаций в гене МЕСР

11.4.2. Корреляция фенотипа с особенностями инактивации хромосомы X

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эпигенетические и генетические особенности синдрома Ретта"

Актуальность темы. В настоящее время насчитывается более 200 синдромальных и несиндромальных форм умственной отсталости, сцепленных с хромосомой X, основным симптомом которых является аутизм. Изучение генетических и эпигенетических особенностей нервно-психических заболеваний, связанных с различными формами аутизма, является одним из наиболее актуальных направлений в современной психиатрической генетике. Особое место среди этой группы болезней занимают формы умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X. По данным ряда авторов суммарная частота данных заболеваний варьирует от 1:1000 до 1,8:1000 (Chiurazzi et al., 2001). Самым частым заболеванием из этой группы после синдрома умственной отсталости, сцепленной с ломкой хромосомой X, является синдром Ретта (Hagberg et а!., 2001). Синдром Ретта (RTT) (MIM и OMIM, 312750) (McKusick, 1998) представляет собой тяжелое наследственное заболевание, сопровождающееся нарушениями нсрвгюпсихического развития. RTT характеризуется нормальным развитием ребенка до 6-18 месяцев с последующей утратой сформированных ранее навыков самообслуживания и целенаправленных движений рук, которые замещаются стереотипными "моющими" движениями, а также полной потерей речи. Это заболевание поражает преимуи1ественно девочек. Случаи RTT у мальчиков встречаются крайне редко. Частота RTT составляет 1 на 10000 15000 детей женского пола, а в отдельных регионах 1 на 3000 (Hagberg, 1985; Kozinetz et al., 1993; Hagberg, Hagberg, 1997), что позволяет говорить о RTT, как об одной из наиболее частых причин всех случаев умственной отсталости у девочек. Таким образом, RTT представляется одним из наиболее социально значимых среди заболеваний, сцепленных с хромосомой X. В 1999г была определена генетическая причина болезни (Amir et al., 1999). Ген RTT, кодирующий метил-СрС-связывающий белок 2 МЕСР2, расположен в хромосоме X (в районе q28) и участвует в регуляции транскрипции генома. RTT является болезнью, связанной с мутациями в гене-регуляторе, участвующем в эпигенетическом контроле транскрипции генов, наряду с такими болезнями, как синдромы ATRX, FRAXE и несиндромальная умственная отсталость, вызванная мутациями в гене F0XP2 (Nokelainen, Flint, 2002). Эпигенетические процессы представляют собой наследуемые из.мсиения в экспрессии генов, нарушающие мендслевские принципы наследования, без количественного или качественного изменения гюследовательности ДНК (Kriaucionis, Bird, 2003). Учитывая небольнюе количество болезней, связанных с мутация.ми в генахрегуляторах транскрипции, а также исключительно низкую частоту этих синдромов, можно считать, что RTT является уникальным заболеванием, изучение которого может способствовать фундаментальным открытиям в области эпигенетического контроля экспрессии генов и определению причипио-следственной связи между генетическими аномалиями и эпигенетическими процессами, происходящими в клетках. Мутации гена МЕСР2 встречаются примерно у 70% детей с RTT. Известно, что многие изменения в последовательности гена МЕСР2 не могут быть классифицированы как патогенные мутации. В настоящее время патогенными перестройками в гене МЕСР2, приводящи.ми к RTT, считаются восемь рекуррентных мутаций; нонсенс мутации в начале последовательности и в доменах MBD и TRD, а также крупные делеции в кодирующей последовательности этого гена (Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003). Таким образом, определение мутаций гена МЕСР2 не является однозначным методом лабораторной диагностики RTT. Помимо этого, неизвестна генетическая природа RTT у девочек без мутации в гене МЕСР2, Не определены также гены, в регуляции транксрипции которых участвует белок МеСР2. Теоретически, мутации в данных генах могут приводить к RTT, в связи с че.м, поиск генов, в регуляции транксрипции которых участвует белок МеСР2, является приоритетным направлением в современной молекулярной генетике. Исследования последних лет направлены на обнаружение биологических маркеров (молекулярных и цитогенетических), которые можно использовать в доклинической и пренатальной диагностике RTT. Анализируя современные данные о различных аспектах диапюстики RTT, можно сделать вывод о том, что задача эффективной лабораторной диагностики окончательно не решена (Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003; Weaving ct al., 2003). Несмотря на гипотезу о том, что RTT является Х-сцепленным доминантным заболеванием с внутриутробной летальностью среди мальчиков (Thomas, 1996), имеется ряд сообщений о мальчиках с фспотипичсскими проявлениями RTT (вплоть до полного соответствия всем обязательным диагностическим критериям болезни) и мутациями гена МЕСР2 (Leonard et al., 2001; Vorsanova et al., 2001). Следует отметить, что мутации гена МЕСР2 у мальчиков приводят не только к классической или атипичным формам RTT, но также к врожденной энцефалопатии и умственной отсталости в сочетании с различными неврологическими отклонениями (Moog et al., 2003). Изучение влияния различных мутаций гена МЕСР2 па фенотипичсскис проявления болезни у мальчиков представляется информативным при изучении зависимости течения болезни от типа и положения мутации, поскольку это позволяет исключить влияние нормального аллеля гена МЕСР2. RTT Исключая неклассифицированные мутации гена МЕСР2, сравнение клинических характеристик мальчиков с одинаковыми мутациями показывает, что эти аномалии приводят к однотипной клинической картине (Villard et al,, 2000; Iloffbuhr et al,, 2001; Leonard et al., 2001; Lynch et al., 2003). Тем не менее, попытка выявления корреляций фенотипических проявлений у мальчиков с мутациями гена МЕСР2 одного типа и положения показала отсутствие какой-либо достоверной связи между ними (Ravn el al., 2003). Эпигенетические факторы, в частности, неравная инактивация хромосомы X и, повидимому, биаллельная экспрессия гена МЕСР2 могут оказывать модифицирующее влияние на действие белка МсСР2 при RTT (Villard et al., 2001; Shahbazian, Zoghbi, 2002). Известно, что неравная инактивация хромосо.мы X является характерной особенностью различных форм умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X (Plenge et al,, 2002). Однако, в настоящее время неизвестно, характерен ли данный эпигенетический феьюмен для RTT или нет. В немногочисленных работах об особенностях инактивации хро.мосомы X при RTT получены противоречивые результаты. Исследователи приходят к выводу о том, что для характеристики фено.мена неравной инактивации при RTT необходимы дальнейшие исследования значительно большей группЕЛ детей (Camus et al., 1996; Amir et al., 2000; Auranen et al., 2001). При попытке выявления корреляций фенотипических особепностей в зависимости от типа и положения мутаций гена МЕСР2, а также особенностей инактивации хро.мосомы X, определенной зависимости не обнаружено (Amir et al., 2000; Nielsen ct al,, 2001; Weaving et al., 2003). Многие исследователи отмечают, что отсутствие корреляции, вероятно, связано с несовершенством методов клинической оценки тяжести фенотипа. Кроме того, были попытки установить корреляцию между тино.м и положением мутаций гена МЕСР2 и течением болезни без учета модифицирующего влияния эпигенетического фактора инактивации хромосомы X. Ряд исследований эпигенетического феномена инактивации хромосомы X при RTT показали возможность влияния неравной Х-инактивации па клинические особенности RTT (Hoffbuhr et al., 2001; Percy, 2001; Shahbazian et al., 2002; Weaving et al., 2003). Современные данные об эпигенетическом контроле экспрессии генов хро.мосомы X, достигае.\юм за счет феномена Х-инактивации, позволили высказать предположение о модифицирующем влиянии некоторых веществ на этот процесс. В связи с этим, не исключается возможность лечения RTT. Помимо симпто.матического лечения, коррекция этого заболевания предгюложитслыю основывается на том, что мутантный ген МЕСР2 каким-то образом можно инактивировать (Nan, Bird, 2001; Urnov, 2002). Таким образо.м, 8

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Юров, Иван Юрьевич

VI. выводы

1. Исследован эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе девочек с RTT. Установлена повышенная частота неравной инактивации хромосомы X при RTT (37%) по сравнению с контрольной группой (6,5%). Доказано, что эпигенетический феномен неравной инактивации хромосомы X является характерной особенностью RTT.

2. Исследован эпигенетический феномен инактивации хромосомы X в репрезентативной группе матерей девочек с RTT. Обнаружено, что частота неравной инактивации хромосомы X в три раза превышает контрольное значение (20% и 6,5%, соответственно). Научно обосновано предположение о наличии асимптоматических носительниц мутаций в генах, сцепленных с хромосомой X, среди матерей детей с RTT, включая ген МЕСР2.

3. На основе анализа происхождения инактивированной хромосомы X у девочек с RTT показано, что неравная инактивация хромосомы X преимущественно связана с инактивацией отцовской хромосомы по сравнению с материнской (67,7% и 33,3%, соответственно).

4. Определены частота и спектр мутаций гена МЕСР2, кодирующего метил-CpG-связывающий белок 2, локализованного в хромосоме X (участок q28). У 84,6% девочек с клиническим диагнозом RTT методом прямого секвенирования выявлены мутации гена МЕСР2. Определен следующий спектр мутаций гена МЕСР2 при RTT: 13 миссенс мутаций (39,4%) — R133C (3), Т158М (4), Т197М (1), R306C (4), Р388Т (1); 16 нонсенс мутаций (48,5%) — S65X (1), R168X (5), R255X (6), R270X (3), R294X (1); 4 делении (12,1%) — del466-470 (155F/S), 691dclG (230F/S), 732delG (239F/S), Р403Х (dell 157-1197). Обнаружено пять новых мутаций гена МЕСР2 — del466-470 (155F/S), 691delG (230F/S), 732delG (239F/S), Р388Т и Р403Х (dell 157-1197). У мальчика с классической формой RTT обнаружена нонсенс мутация R270X.

5. Проведен анализ рекуррентных мутаций гена МЕСР2 (R133C, Т158М, R168X, R255X, R270X, R294X, R306C) с помощью метода энзиматического тестирования. Показана высокая эффективность энзиматического теста, позволяющего идентифицировать рекуррентные мутации с эффективностью до 79% у детей с клиническим диагнозом RTT.

6. Исследование корреляций генотип-фенотип в группе детей с RTT на основе комплексной клинической балльной оценки и данных о генетических (тип и положение мутации гена МЕСР2) и эпигенетических (неравная инактивация хромосомы X и направление сдвига Х-инактивации) особенностях позволило установить корреляции генотип-фенотип при ШТ, обусловленных зависимостью между тяжестью течения болезни и инактивацией хромосомы X, а также положением и типом мутаций гена МЕСР2. При этом неравная Х-инактивация является определяющим клиническую гетерогенность ШТ фактором, а течение болезни зависит от направления сдвига X-инактивации.

7. Эпигенетический феномен инактивации хромосомы X оказывает модифицирующее влияние на фенотип даже при идентичных генотипах монозиготных близнецов, конкордантных по МЕСР2 мутации и дискордантных по сдвигу Х-инактивации.

8. Научно обоснована схема проведения дифференциальной диагностики ИТТ, основанная на постадийном применении клинических, цитогенетических, молекулярно-цитогенетических и молекулярных методов диагностики синдрома Ретта.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящей работе проведено исследование генетических, эпигенетических и клинических особенностей RTT. Исследование репрезентативной группы детей с клиническим диагнозом RTT позволило выявить наличие мутаций в гене МЕСР2 у 84,6% детей с RTT. Следовательно эффективность диагностики с помощью метода прямого секвепироваиия, который был использован в настоящей работе, составляет пе менее 80%. При анализе спектра мутаций гена МЕСР2 в группе 40 детей с RTT обнаружено 14 разных мутаций, пять из которых являются новыми, ранее неописанными. При изучении эффективности энзиматического теста па наличие восьми рекуррентных мутаций, было показано, что данный метод является в значительной степени необходимым при лабораторной диагностике RTT, позволяя определить мутации до 70% больных RTT.

В ходе исследования особенностей инактивации хромосомы X у детей с RTT впервые было обнаружено, что неравная инактивация хромосомы X является одной из важных эпигенетических особенностей RTT. Неравная инактивация хромосомы X встречается у 37% детей с RTT, что в значительно выше, чем в контрольной группе (6,5%). Полученные данные о неравной Х-инактивации у детей с RTT позволили предположить, что мутации гена МЕСР2 могут приводить к сдвигу инактивации хромосомы X. Эти данные согласуются с результатами исследования Plenge и др., (2002), которые обнаружили неравную Х-инактивацию примерно у 50% носителей мутаций, приводящих к умственной отсталости, сцепленной с хромосомой X. Механизм сдвига X-инактивации у детей с мутациями генов хромосомы X, в частности, гена МЕСР2, в настоящее время неизвестен. Можно предположить, что ген МЕСР2 кодирует белок, который участвует в регуляции транскрипции генов хромосомы X. Следовательно, мутации в гене МЕСР2, по-видимому, могут приводить к неправильной транскрипции генов хромосом X, что может являться причиной неравной Х-инактивации. Эти данные являются значительными для дальнейшего изучения RTT, поскольку выявление генов, в регуляции транскрипции которых участвует белок МеСР2, позволит не только понять молекулярные механизмы, приводящие к RTT, но также будет способствовать проведению фундаментальных исследований по метилированию генома (Kriaucionis, Bird, 2003).

В нашей работе у 15,4% девочек с RTT мутаций в гене МЕСР2 не обнаружено. Случаи RTT без МЕСР2 мутаций в настоящее время являются малоизученными. Можно предположить, что RTT в данных случаях обусловлен мутациями в других генах (Villard et al., 2001; Shahbazian, Zoghbi, 2002). При изучении инактивации хромосомы X в случаях RTT без МЕСР2 мутаций, в настоящей работе было показано, что сдвиг Х-ииактивации наблюдается у 4-х из б-ти детей. Таким образом, RTT у детей без МЕСР2 мутаций может быть связан с другими генами хромосомы X. Было обнаружено, что анализ X-инактивации у детей с RTT и их матерей является информативным методом для изучения клинической и генетической гетерогенности этой болезни, и в ряде случаев является более информативным для клинической характеристики больных, чем определение мутаций гена МЕСР2. Так, данный метод позволяет определить носительство мутации у матерей детей с RTT, происхождение хромосомы X с МЕСР2 мутацией (в сочетании с оценкой клинической тяжести), а также открывает перспективу изучения корреляций генотип-фенотип.

В работе проведена попытка выявить зависимость клинических характеристик детей с RTT от типа и положения мутаций, а также особенностей инактивации хромосомы X. Впервые показана возможность выявления корреляций генотип-фенотип при RTT. Необходимо отметить, что до настоящего времени не было выявлено четких корреляций генотип-фенотип при RTT (Amir et al., 20006; Bienvenu et al., 2000; Huppke et al., 2000; Auranen et al., 2001; Nielsen et al., 2001a; Percy, 2001; Shahbazian et al., 2002; Weaving et al., •2003). Было обнаружено, что фенотипические особенности детей с RTT в некоторой степени зависят от типа и положения мутации, хотя необходимо заметить, что без учета фактора Х-инактивации определение подобных зависимостей не дает однозначных результатов. Неравная инактивация хромосомы X может приводить как к относительно легкому течению болезни (в случае преимущественной инактивации хромосомы X с мутацией), так и к тяжелым формам течения болезни (в случае преимущественной инактивации хромосомы X без мутации). Следовательно, объединение этих случаев является неправомочным и приводит к нивелированию эффекта Х-инактивации в общей группе. В настоящей работе в качестве решения данной проблемы было предложено изучение каждого конкретного случая. Такой подход для определения корреляций генотип-фенотип полностью оправдал себя. На фенотипические проявления RTT влияет несколько факторов — инактивация хромосомы X, тип и положение мутаций гена МЕСР2. Необходимо особо отметить, что для подобных исследований детерминирующим фактором является инактивация хромосомы X. В предыдущих работах было обнаружено, что сдвиг Х-инактивации против хромосомы X без мутации гена МЕСР2 является в достаточной степени редким событием (Amir et al., 20006; Shahbazian et al., 2002). Однако, в настоящей работе показано, что данный феномен имеет значительную большую частоту, и это позволило объяснить наличие сдвига Х-ипактивации у детей с тяжелой формой RTT. В ходе изучения было обнаружено, что случаи RTT без МЕСР2 мутаций не представляются возможным охарактеризовать с точки зрения генетических особенностей, не анализируя особенности Х-инактивации.

Описано также два редких случая RTT, позволяющие расширить представления об генетических и эпигенетических особенностях этой болезни. Первый случай — мопозиготпые близнецы, конкордантные по мутации гена МЕСР2 (R255X). У близнецов выявлена дискордантность по сдвигу инактивации хромосомы X. Следовательно, такой эпигенетический фактор, как Х-инактивация, не всегда определяется непосредственно генотипом. Можно предположить, что экзогенные факторы имеют определенное влияние на феномен инактивации хромосомы X. Этот случай в очередной раз подчеркивает исключительное значение эпигенетического феномена неравной Х-инактивации для RTT. Второй случай — мальчик с классической формой RTT и рекуррентной МЕСР2 мутацией (R270X). У этого мальчика обнаружен нормальный кариотип (46, XY) в клетках крови, однако, молекулярно-цитогенетичсское изучение мышечной ткани с помощью интерфазной FISH выявило наличие клона клеток с дополнительной хромосомой X. Изучение этого случая позволило предположить, что аномальный клон 47, XXY может быть ткансспсцифичеи у мальчиков с RTT. Следовательно, у мальчиков с RTT и нормальным кариотипом в клетках крови необходимо проводить исследования на наличие тканевого хромосомного мозаицизма.

Как неоднократно было отмечено в предыдущих работах, вопрос эффективной диагностики RTT остается открытым (Ворсанова и др., 1999; Юров, Ворсанова, 2001; Shahbazian, Zoghbi, 2002; Kriaucionis, Bird, 2003; Miltenberger-Miltenyi, Laccone, 2003). Суммируя данные о клинических, цитогенетических, молекулярпо-цитогенетических и молекулярных аспектах RTT, в настоящей работе была предложена схема последовательных этапов диагностики RTT. Схема представляет собой постадийный анализ каждого конкретного случая с помощью молекулярных, цитогенетических и молекулярпо-цитогенетических методов лабораторной диагностики. Учитывая показанную в данном исследовании эффективность методов анализа Х-инактивации и энзиматического теста, можно сделать вывод о том, что с помощью предложенных методов можно не только изучать клинический и генетический полиморфизм при RTT, но и успешно проводить диагностику этого тяжелого заболевания, что особенно значимо в доклиническом периоде.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юров, Иван Юрьевич, Москва

1. Башина В. М. Аутизм в детстве. М.:Медицина. 1999.239с.

2. Ворсаиова С.Г., Юров Ю.Б., Демидова И.А. Бесфснольиый метод выделения ДНК из клеток крови для молекулярной диагностики наследственных болезней. МНИИПиДХ МЗ РФ.1989.Рац. предложение №747.Юс.

3. Ворсанова С.Г., Демидова H.A., Улас В.Ю., Соловьев И.В., Кравец B.C., Казанцева JI.3., Юров Ю.Б. Цитогенетическая и молекулярно-цитогенетическая диагностика синдрома Ретта у дстсй.//Журн. Неврол. Психиат. им. С.С.Корсакова. 1998.4.С.53-56.

4. Ворсанова С.Г., Улас В.Ю., Демидова И.А., Кравец B.C., Юров Ю.Б. Современные представления о синдроме Ретта: клинические, цитогенетические и молекулярные исслсдования.//Журн. Неврол. Психиат. им. С.С.Корсакова. 1999а.З.С.61-69.

5. Ворсанова С.Г, Юров Ю.Б, Чернышов В.Н. Хромосомные синдромы и аномалии. Классификация и номенклатура. Ростов-на-Дону: Изд.РГМУ. 19996.192с.

6. Глаиц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика. 1999.500с.

7. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов И.П., Барановская Л.И. Хромосомы человека. Атлас. М.: Медицина. 1982.264с.

8. Улас В.Ю. Роль цитогенетических и цитологических аномалий в проявлениях клинического полиморфизма синдрома Ретта у детей.//Автореф. канд. диссер., Москва, 1994.22с.

9. Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г. Молскулярно-цитогсиетические исследования хромосомных аномалий и нарушений при псрвпо-психических заболеваниях: поиск биологических маркеров для диагностики.//Вестник РЛМН.М.2001.С.26-31.

10. Aas Herder G., Skjeldal О., Hagberg В. Congenital Rett syndrome phenotype interstitial deletion chromosome 13 and retinoblastoma.//Eur. Child. Adolesc. Psychiatry. 1997.6. Suppl.l.P.92.

11. Adler D.A., Quaderi N.A., Brown S.D.M., Chapman V.M., Moore J., Tate P., Disteche C.M. The X-linked methylated DNA binding protein, Mecp2, is subjcct to X inactivation in the mouse.//Mamm.Genome.l995.6.P.491-492.

12. Akesson H.O., Wahlstrom J., Engerstrom WJ., Hagberg B. Rett syndrome: potential gene sources-phcnotypical variability.//Clin.Genet. 1995.48.P. 169-172.

13. Akesson H.O., Hagberg В., Wahlstrom J. Rett syndrome, classical and atypical: genealogical support for common origin.//J.Med.Genet. 1996.33(9).P.764-766.

14. Akhmanova A., Verkerk T., Langeveld A., Grosvcld F., Galjart N. Characterisation of transcriptionally active and inactive chromatin domains in neurons.//J.Cell Science. 2000.113Pt24.P.4463-4474.

15. Alembic Y., Dott В., Stoll C. Rett-like syndrome in fragile X syndrome.//Genet. Counsel. 1995.6.3.P.207-210.

16. Amir R.E., Van den Veyver I.B., Wan M., Tran C.Q., Francke U., Zoghbi II.Y. Rett syndrome is caused by mutations in X-linkcd MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein2.//Nat.Genet. 1999.23.P. 185-188.

17. Amir R.E., Dahle E.J., Toriolo D., Zoghbi H.Y. Candidate gene analysis in Rett syndrome and identification of 21 SNPs in Xq.//Am.J.Med.Genet.2000a.90.P.69-71.

18. Antonarakis S.E. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature working group.//Hum.Mutat. 1998.1 l.P.1-3.

19. Anvret M., Wahlstrom J., Skogsberg P., Hagberg B. Segregation analysis of the X-chromosome in a family with Rett syndrome in two generations.// Am.J.Med.Genet. 1990.37.P.31-35.

20. Archidiácono N., Lerone M., Rocchi M., Anvret M., Ozcelik T., Francke U., Romeo G. Rett syndrome: exclusion mapping following the hypothesis of germinal mosaicism for new X-linked mutations.//Hum.Genet,1991.86.P.604-606.

21. Armstrong J., Pineda M., Aibar E., Gean E., Monros E. Classic Rett syndrome in a boy as a result of somatic mosaicism for MECP2 mutation.//Ann.Neurol.2001.50.P.692.

22. Asthana J.C., Sinha S., Haslam J.S., Kingston H.M. Survey of adolescents with severe intellectual handicap.//Arch.Dis.Child.l990.65(10).P.l 133-1136.

23. Auranen M., Vanhala R., Vosman M., Levander M., Varilo T., Hietala M., Riikonen R., Peltonen L., Jarvela I. MECP2 gene analysis in classical Rett syndrome and in patients with Rett-like features.//Neurology.2001.13.56.P.611-617.

24. Balmer D., Goldstine J., Rao Y.M., LaSalle J.M. Elevated methyl-CpG-binding protein 2 expression is acquired during postnatal human brain development and is correlated with alternative polyadenylation.//J.Mol.Med.2003.81 .P.61-68.

25. Belmont J.W. Genetic control of X inactivation and processes leading to X-inactivation skewing.//Am.J.I lum.Genet. 1996.58.P. 1101-1108.

26. Bienvenu T., Villard L., de Roux N., Bourdon V., Fontes M., Beldjord C., Tardieu M., Jonveaux P., Chelly J. Spectrum of MECP2 mutations in Rett syndrome.//Genet.Test.2002. 6.1.P. 1-6.

27. Boltshauser E., Kunzle C.H. Prevalence of Rett syndrome in Switzcrland.//IIelvetica Paed.Acta. 1987.42.P.407-411.

28. Bourdon V., Philippe C., Labrune O., Amsallem D., Arnould C., Jonveaux P. A detailed analysis of the MECP2 gene: prevalence of recurrent mutations and gross DNA rearrangements in Rett syndrome patients.//! Ium.Genet.2001a.408.P.43-50.

29. Bourdon V., Philippe C., Bienvenu T., Kotning B., Tardieu M., Chelly J., Jonveaux P. Evidence of somatic mosaicism for a MECP2 mutation in females with Rett syndrome: diagnostic implications.//J.Med.Genet.20016.38.P.867-870.

30. Bourdon V., Philippe C., Martin D., Verloes A., Grandemenge A., Jonveaux P. MECP2 mutations or polymorphisms in mentally retarded boys: diagnostic implications.//Mol.Diagn.2003.7.P.3-7.

31. Boyd Y., Blair H.J., Cunliffc P., Masson W.K., Reed V. A phenotype map of the mouse X chromosome: model for human X-linkcd disease.//Gcnome Res.2000.10.3.P.277-292.

32. Brockdorff N. Ashworth A., Kay G.F., McCabe V.M., Norris D.P., Cooper P.J., Swift S., Rastan S. The product of mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and localized in the nuclcus.//Cell. I992.71.P.5I5-526.

33. Brockdorff N. X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA.//Trends Genet.2002.18.P.352-358.

34. Brown C.J, Ballabio A., Rupert J.L., Lafreniere R.G., Grompe M., Tonlorcnzi R., Willard H.F. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome.//Nature.l991.349.P.38-44.

35. Brusque L., Mio R., Mattioli J., Blais N., Lalonde Y., Maragh M., Gilliland D.G. Nonrandom X-inactivation patterns in normal females: lyonization ratios varies with age.//Blood. 1996.88.1 .P.59-65.

36. Burd L., Martsolf J.T, Randall T. Prevalence of Rett syndrome in North Dakota children.//Am.J.Med.Genet. 1991.3 8.P.565-568.

37. Buyse I.M., Ping Fang, Hoon K.T., Amir R., Zoghbi H.Y., Roa B.B. Diagnostic testing for Rett syndrome by DHPLC and direct sequencing analysis of the MECP2 gene: identification of several novel mutations.//Am.J.Hum.Gcnet.2000.67.P.1428-1436.

38. Camus P., Abbadi N., Pcrricr M.C., Chery M., Gilgenkrantz S. X chromosome inactivation in 30 girls with Rett syndrome: analysis using the probe.//Hum.Gcnct.l996.97.P.247-250.

39. Cattanach B.M., Williams C.E. Evidence of non-random X-chromosome activity in the mouse.//Genet.Res. 1972.19.P.229-240.

40. Chandler S.P., Guschin D., Landsberger N. Wolffe A.P. The methyl-CpG binding transcriptional repressor MeCP2 stably associates with nucleosomal DNA.// Biochcmestry.l999.38.P.7008-7018.

41. Chiurazzi P., Hamel B.C.J., Ncri G. XLMR genes: update 2000.//Eur.J.Hum.Genet. 2001.9.P.71-81.

42. Clayton-Smith J., Watson P., Ramsdcn S., Black G.C. Somatic mutation in MECP2 as a non-fatal neurodevelopmental disorder in males.//Lancet.2000.2.356.P.830-832.

43. Cohen D., Lazar G., Couvcrt P., Desportes V., Lippe D., Mazet P., Heron D. MECP2 mutation in a boy with language disorder and schizophrenia.//Am.J.Psychiatry. 2002.159.P.148-149.

44. Cohen D.R.S., Matrazzo V., Palmer A.M., Tu Y., Jeon O.H., Pevsner J., Ronnett G.V. Expression of MECP2 in olfactory receptor neurons is developmentally regulated and occurs before synaptogenesis.//Mol.Cell.Neuroscience.2003.22.P.417-429.

45. Colvin L., Fyfe S., Leonard S., Schiavello T., Ellaway C., de Klerk N., Christodoulou J., Msall M., Leonard H. Describing the phenotype in Rett syndrome using a population database.//Arch.Dis.Child.2003.88.P.38-43.

46. Curtis A.R., Headland S., Lindsay S., Thomas N.S., Boye E., Kamakari S., Roustan P., Anvret M., Wahlstrom J., McCarthy G. X chromosome linkage studies in familial Rett syndrome.//Hum.Genet. 1993.90.P.551 -555.

47. De Bona C., Zappella M., Hayek G., Meloni I., Vitelli F., Bruttini M., Cusano R., Loffredo P., Longo I., Renieri A. Preserved speech variant is allelic of classic Rett syndrome.//Eur.J.Hum.Genet.2000.8.P.325-330.

48. Delobel B., Delannoy V., Pini G., Zapella M., Tardieu M., Vallee L., Croquette M.F. Identification and molecular characterization of a small llq23.3 de novo duplication in a patient with Rett syndrome manifestations.//Am.J.Med.Genet,1998.80.P.273-280.

49. D'Esposito M., Quaderi N.A., Ciccodocola A., Bruni P., Esposito T., D'Urso M., Brown S.D. Isolation, physical mapping and northern analysis of the X-Iinked human gene encoding methyl CpG-binding protein, MECP2.//Mamm.Genome.l996.7.P.533-535.

50. Disteche C.M. Escape from X inactivation in human and mouse.//Trends Genet. 1995.11.1.P. 17-22.

51. Dragich J., Houwink-Manville I., Schanen C. Rett syndrome: a surprising result of mutation in MECP2.//Hum.Mol.Genet.2000.9.16.P.2365-2375.

52. Dunn II.G. Importance of Rett syndrome in child neurology .//Brain Dev.2001.23.S.38-43.

53. Easthaugh P., Smith L., Leonard II. Trisomy 21 associated with Rett syndrome phenotype.// Eur. Child. Adolesc. Psychiatry. 1997.6.Suppl.l.P.91.

54. Engerstrom I.W. Rett syndrome in Sweden. Neurodevelopment, disability, pathophysiology. //Acta Paediatr.Scand.Suppl.l990.369.P.l-60.

55. Engerstrom I.W., Forslund M. Mother and daughter with Rett syndrome.//Dev. Med. Child.Neurol. 1992.34.P. 1022-1023.

56. Farmer A.E., Owen M.J., McGuffin P. Bioethics and genetic research in psychiatry .//Br.J.Psychiatry.2000.176.P. 105-108.

57. Fuks F., Hurd P.J., Wolf D., Nan X., Bird A.P., Kouzarides T. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation.// J.Biol.Chem.2003.278.P.4035-4040.

58. Gale R.E., Wheadon H., Boulos P., Linch D.C. Tissue specifity of X-chromosome inactivation patterns.//Blood. 1994.83.10.P.2899-2905.

59. Gale R.E., Fielding A.K., Harrison C.N., Linch D.C. Acquired skewing of X-chromosome inactivation patterns in myeloid cells of the elderly suggests stochastic clonal loss with age.//Br. J. Haematol. 1997.98.P.512-519

60. Gartler S.M., Goldman M.A. Biology of the X-chromosome.//Curr.Opin.Pediatr. 2001.13.P.340-345.

61. Girard M., Couvert P., Carrie A., Tardieu M., Chelly J., Bcldjord C., Bienvenu T. Parental origin of de novo MECP2 mutations in Rett syndrome.//Eur.J.Hum.Genet.2001.9.P.231-236.

62. Gordon K., Siu V.M., Sergovich F., Jung J. 18q-mosaicism associated with Rett syndrome phenotype.//Am .J.Med.Genet. 1993.46.P. 142-144.

63. Goto T., Monk M. Regulation of X-Chromosome inactivation in development in mice and humans.//Microbiol. Mol. Biol. Rev.l998.62.2.P.362-378.

64. Goutieres F., Aicardi J. Atypical forms of Rett syndrome.//Am.J.Med.Genet.Suppl. 1986.1.P.183-194.77