Влияние нейротрофического фактора мозга (BDNF) на эпигенетически и генетически детерминированные нарушения поведения

Морозова, Марьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние нейротрофического фактора мозга (BDNF) на эпигенетически и генетически детерминированные нарушения поведения
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние нейротрофического фактора мозга (BDNF) на эпигенетически и генетически детерминированные нарушения поведения"

На правах рукописи

005010928

Морозова Марьяна Владимировна

Влияние нейротрофического фактора мозга (ВБОТ) на эпигенетически и генетически детерминированные нарушения поведения

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 МАР ¿012

Новосибирск 2012

005010928

Работа выполнена в Лаборатории нейрогеномики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт цитологии и генетики» СО РАН, г. Новосибирск

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Попова Н.К.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Идова Г.В.

Институт Физиологии СО РАМН г. Новосибирск

кандидат биологических наук Плюснина И.З.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение - Институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича РАМН, г. Москва.

Защита состоится _ 2012 г. в 10.00 на заседании диссертаци-

онного совета Д 001.014.01 при ФГБУ "НИИ физиологии" СО РАМН (630017, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "НИИ физиологии" СО РАМН

Автореферат разослан ^^ё/уСиМ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук . Бузуева И.И.

Актуальность проблемы

На протяжении многих десятилетий считалось общепризнанным, что «нервные клетки не восстанавливаются» и в зрелом мозге происходят только процессы нейро-дегенерации. Однако в 1965 году Altman и Das открыли, что во взрослом мозге, а именно, зубчатой извилине крыс, происходит нейрогенез. В 1982 году из мозга свиньи был выделен нейротрофический фактор мозга (BDNF), и на культуре клеток раскрыта его способность поддерживать выживание нейронов зрелого мозга (Barde et al., 1982).

BDNF является маленьким димерным протеином, который принадлежит к семейству нейротрофинов. Действует через общий для всех нейротрофинов p75NTR рецептор (р75 neurotrophin receptor) и специфичный для BDNF тирозинкиназный TrkB рецептор (Lu et al., 2008). Наибольшая экспрессия BDNF выявлена в таких структурах центральной нервной системы, как гиппокамп, мозжечок, кора (Davis, 2008), гипоталамус, перегородка (Katoh-Semba et al., 1997).

К настоящему времени открыто, что BDNF участвует в выживании и регуляции функционирования нейронов как на протяжении развития (Segal, 2003), так и во взрослом мозге (McAllister et al., 1999). Он вовлечен в формирование синапсов и оказывает сильное влияние на рост, реконструкцию и стабильность дендритов и аксонов в гиппокампальных и кортикальных нейронах (Elmariah et al., 2005).

Выявлено вовлечение BDNF в ряд патологий. Так, у людей страдающих депрессией, шизофренией, болезнью Альцгеймера уровень мРНК BDNF и белка BDNF в ряде регионов мозга, а также сыворотке и плазме крови, снижен (Phillips et al., 1991; Hock et al., 2000; Karege et al„ 2002; Toyooka et al„ 2002; Weickert et al, 2003; Karege et al., 2005 a; Lee et al., 2005; Laske et al., 2006; Xiu et al., 2009; Huang et al., 2008). Кроме того, есть данные, что возрастные изменения, происходящие в мозге, сопровождаются снижением содержания BDNF и для сохранения памяти и когнитивных функций необходим должный уровень нейротрофинов (Гомазков, 2011) .

Обнаружено, что BDNF способен защищать нервные клетки от токсических веществ, повышать их выживаемость, восстанавливать уже поврежденные, в том числе, ишемией/гипоксией и травмами (Goldberg et al., 2000; Galvin, Oorschot, 2003; Голосная, и др. 2004; Гомазков, 2006; Jiang et al., 2006; Liu et al., 2006).

С открытием нейропротекторной роли BDNF возник вопрос о возможности его использования для лечения патологий, связанных с повреждением нервной системы. На экспериментальных моделях было показано, что введение BDNF может облегчать симптомы ряда тяжелых нейродегенеративных болезней и эмоциональных расстройств, однако остается еще много невыясненных вопросов. В частности, недостаточно данных о способности BDNF ослаблять проявления эпигенетически и генетически детерминированных форм нарушения поведения. К таким генетически детерминированным нарушениям поведения относится реакция каталептического замирания. Следует отметить, что у человека каталепсия является симптомом тяжелых нервных и психических нарушений (Dixon, 1998). Другим генетически обусловленным девиантным поведением является патологически сниженная реакция прести-мульного ингибирования реакции вздрагивания на акустический сигнал, что является симптомом шизофрении (BrafF et al., 1999; Kumari et al., 2000; Ludewig et al, 2003).

цию генома (Roth, Sweatt, 2011). Посредством этого эпигенетического механизма внешние воздействия могут модифицировать функцию гена без изменения последовательности ДНК (Шишкина, Дыгало, 2010). Показано, что как стресс (Mueller, Bale, 2008; Mychasiuk et al., 2011), так и этанол (Vallès et al., 1997; Maier et al., 1999; Downing et al., 2011) в пренатальном периоде оказывают влияние на метилирование ДНК.

Алкоголь и стресс, действующие в пренатальном периоде, могут вызывать различные расстройства, объединенные названиями «Спектр фетальных алкогольных расстройств» (СФАР) и «Стрессовый синдром». СФАР - это группа нарушений, включающих физические, психические, поведенческие патологии и нарушения обучения, которые могут возникнуть у человека, чья мать употребляла алкоголь во время беременности (Calhoun et al., 2006; Raghavendra et al., 2008; Fiorentino et al., 2006).

Стресс в пренатальном периоде вызывает пристальный интерес исследователей с 1970-х годов, когда было обнаружено, что пренатальный стресс вызывает демаску-линизацию и феминизацию полового поведения у взрослых самцов крыс (Ward, 1972). В 1980-е годы Gunter Dorner выдвинул гипотезу о том, что пренатальный стресс может быть причиной гомосексуальности у мужчин (Dorner et al., 1980; Dorner et al., 1983). Позднее показали, что стресс в период внутриутробного развития предрасполагает к развитию психопатологии детского возраста (Ward, 1991) и повышает вероятность развития депрессии у мужчин (Watson et al., 1999).

Обнаружено, что стресс и этанол в периоде пренатального развития снижают экспрессию гена BDNF в ряде регионов мозга (Maier et al., 1999; Fumagalli et al., 2004; Caldwell et al., 2008) и даже сделаны попытки лечения нейротрофическими факторами дефектов, вызванных пренатальными факторами. Но эти попытки единичны, и проведены in vitro, за исключением исследования Bradley с коллегами (1999), показавшего in vivo, что нейротрофические факторы BDNF и GDNF (глиаль-ный нейротрофический фактор) защищают мотонейроны спинного мозга эмбриона цыпленка от нейротоксичности этанола.

Целью данной работы было изучение влияния BDNF на патологическое поведение взрослых самцов мышей, вызванное генетическими и эпигенетическими, пренатальными факторами.

Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1) Исследовать и сравнить эффекты центрального введения BDNF на поведение самцов мышей линии ASC, селекционированных на высокую предрасположенность к каталептическому замиранию и проявляющих депрессивноподобное поведение.

2) Изучить влияние BDNF на поведение самцов мышей линии СВА, предрасположенных к реакции каталептического замирания.

3) Изучить влияние BDNF на поведение самцов мышей линии DBA/2, проявляющих патологически сниженное престимульное ингибирование рефлекса вздрагивания.

4) Изучить сочетанное влияние комбинированного воздействия этанола и стресса в пренатальном периоде на поведение взрослых мышей.

5) Исследовать влияние BDNF на нарушенные формы поведения в модели пренатального действия этанола и стресса.

6) Исследовать влияние центрального введения другого нейротрофического фактора - GDNF, на нарушенные формы поведения в модели пренатального действия этанола и стресса.

Научная новизна

- Впервые показано облегчающее действие центрального введения BDNF на генетически детерминированную каталепсию у мышей линии ASC, но не линии СВА.

- Выявлено положительное действие интрацеребровентрикулярного введения BDNF на реакцию вздрагивания на акустический сигнал и престимульное ингибирование у мышей DBA/2.

- Показано усиление половой мотивации после BDNF у мышей линий DBA/2 и ASC со сниженной половой мотивацией.

- Впервые установлена необычная длительность действия однократного центрального введения BDNF - 1,5 мес.

- Разработана эпигенетическая модель повреждающего действия пренаталь-ного алкоголя и стресса.

- Обнаружена терапевтическая эффективность BDNF на модели пренаталыюго стресса и алкоголя: снижение стереотипного поведения и восстановление нормального полового предпочтения.

Научно-практическая ценность

Разработана модель патологии, вызванной действием этанола и стресса в пренатальном периоде. Выявлены отклонения поведения, проявляющиеся обсессивно-компульсивными чертами и инверсией предпочтения полового партнера. Данная модель расширяет возможности исследования действия терапевтических средств.

Обнаружена эффективность BDNF в ослаблении нарушений, вызванных пренатальным действием этанола и стресса. Полученный результат показывает перспективность использования BDNF для лечения половых нарушений, в частности, гомосексуализма, а также в качестве антиобсессивно-компульсивного препарата.

На модели нарушений, вызванных пренатальными факторами показано, что GDNF значительно менее эффективен, чем BDNF.

Положения, выносимые на защиту

- Действие этанола и стресса во время беременности вызывает у потомков инверсию полового предпочтения, что может являться одной из причин развития гомосексуализма.

- Сочетанное влияние этанола и стресса в период внутриутробного развития вызывает стереотипное поведение, что предрасполагает к развитию обсессивно-компульсивного расстройства.

- BDNF оказывает терапевтическое действие как на генетических, так и на эпигенетических моделях патологий, имеющих, по-видимому, в своей основе нейродегенерацию.

- Такие свойства BDNF, как эффективность лечения эпигенетически и генетически детерминированных нарушений и необычная длительность действия делают данный препарат перспективным для дальнейшего изучения и разработки форм, лишенных основного недостатка BDNF -слабого проникновения через гематоэнцефалический барьер.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчётной сессии ИЦиГ СО РАН в 2010 г., 23 Congress of European College of Neuropsychopharma-cology (Амстердам, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Первой Всероссийской молодёжной научной конференции, посвя-щённой 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010), V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным препаратам» (Клязьма, Московская область, 2010), 10th International Conference "Neurotrophic Factors in Health and Disease" (Хельсинки, 2010), XLIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011).

Публикации

Материал диссертации представлен в 13 публикациях, в том числе в 7 статьях в отечественных (3) и зарубежных (4) реферируемых журналах.

Структура и объём работы

Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы (317 источников). Общий объем составляет 118 листов. Представлено 23 рисунка и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поведение животных автоматически регистрировали при помощи цифровой видеокамеры, соединенной с компьютером, и анализировали, используя компьютерную программу EthoStudio (Kulikov. et al., 2008).

В работе использованы мыши: каталептической линии CBA/LacJ (СВА) ASC DBA/2J (DBA/2) и ICR/J (ICR) линий.

Экспериментальные модели

Генетические модели

Инбредная линия мышей ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy)

Линия была выведена в лаборатории нейрогеномики поведения Института Цитологии и Генетики СО РАН, путем скрещивания на высокую предрасположенность к каталепсии из популяции бэккросов (CBAx(CBAxAKR))BC между подверженной каталепсии СВА и устойчивой к каталепсии AKR/J инбредных линий. Каталепсия у мышей ASC тесно связана с депрессивноподобным поведением (Базовкина и др. 2005),

Линия мышей DBA/2

Для выявления мышей со сниженным PPI (prepulse inhibition, престимульное ингибирование реакции вздрагивания на акустический сигнал - снижение реакции вздрагивания на основной стимул, если ему предшествует слабый) было протестировано 24 самца. Через 2 дня мышей, проявлявших сниженный PPI, протестировали снова в тесте вздрагивания на акустический сигнал и в дальнейшем эксперимент проводили на этих животных со стойким снижением PPI.

Поскольку DBA/2 мыши имеют наименьшее PPI среди всех исследованных линий мышей, некоторые авторы рассматривают этих мышей как экспериментальную модель шизофрении (Simosky et al., 2001; O'Neill et al., 2003). Эта линия мышей моделирует отдельные позитивные симптомы шизофрении (неспособность отделить главный стимул от второстепенных) без эмоциональных симптомов, таких как депрессия и агрессия (Popova et al., 2009).

Эпигенетическая модель пренатального воздействия стресса и алкоголя

С 1 по 21 дни беременности воду у самок СВА заменяли раствором этанола (11%). С 15 дня беременности до дня родов (21 день) самок подвергали эмоциональному стрессу, ограничивая в течение 2 ч при интенсивном освещении подвижность (Ward, 1972; Louvart et al., 2005; Pallares et al., 2007). Самцов-потомков (A+C) начинали тестировать в возрасте 3 мес. Контролем служили 3-мес. самцы, матери которых пили на протяжении беременности воду и не подвергались стрессу.

Тестирование поведения

Тест открытого поля (Open field)

Тест проводили на круглой арене диаметром 40 см с полупрозрачным полом и бортиками высотой 25 см (Куликов и др., 2007; Kulikov et al., 2008). Пройденный животным путь (см) и время пребывания в центре (%) измеряли автоматически в течение 5 мин. Число вертикальных стоек, число и продолжительность умываний измеряли полуавтоматически (Куликов и др., 2005). Также учитывали количество актов дефекации.

Тест «Свет-темнота» (Light/dark box)

Установка состояла из светлого и темного отсеков одинакового размера (20 х 20 х 25 см), соединенных перегородкой с отверстием (7x7 см). Определяли время нахождения мыши в светлом отсеке в течение 5 мин теста.

Тест приподнятого крестообразного лабиринта (Elevatedplus maze)

Установка состояла из двух закрытых и двух открытых рукавов по 35 х 7 см каждый, расположенных крестообразно на высоте 50 см. Регистрировали в течение 5 мин время пребывания в открытых рукавах и в центре, количество выглядываний в открытые рукава и заглядываний вниз.

Тест «Закапывание шариков» (Marble test)

Этот тест предложен как модель обсессивно-компульсивного расстройства, связанного с навязчивыми идеями и действиями (Joel, 2006; KorfF, Harvey, 2006; Li et al., 2006; Boulougouris et al., 2009). В клетку насыпали опилки слоем з'см, сверху раскладывали стеклянные шарики (D = 1 см). По истечении 30 мин подсчитывали число шариков, закрытых опилками более чем на 2/3 (Njung'e, Handley, 1991).

Тест na новизну (Novelty test)

За день до тестирования животное помещали в чистую арену (D = 40 см, бортики высотой 25 см) на 5 мин для привыкания. В день тестирования в центр арены помещали два одинаковых незнакомых животному предмета. Животное помещали между предметами и в течение 5 мин фиксировали время, на протяжении которого самец исследовал объекты (Desruisseaux et al. 2008).

Тест на каталепсию (Pinch-induced catalepsy)

Реакцию замирания вызывали, зажимая в течение 5 с кожу загривка, затем животное помещали на две параллельных перекладины, закрепленные в штативе на высоте 55 и 50 см. Тест считали положительным, если мышь сохраняла приданное ей положение не менее 20 с. Дня каждой мыши проводили 10 последовательных тестов. Животное, дающее три положительных теста из 10, считали каталептиком (Amir et al., 1981; Kulikov et al., 1993).

Тест «Tail suspension»

Тест «Tail suspension» является широко распространенным тестом на депрес-сивноподобное поведение у мышей (Stern et al., 1985; Trullas, 1989; Попова, Тибей-кина, 2009). Мышь на 5 мин фиксировали за хвост при помощи полоски липкой ленты на перекладине на высоте 30 см. Регистрировали общее время неподвижности.

Тест принудительного плавания (Forced swimming test)

Этот тест считается тестом на депрессивноподобное поведение (Porsolt et al., 1977). Мышей на 6 мин опускали в прозрачную пластиковую коробку (15 х 15 х 25 см), заполненную водой с температурой 25°С до 20 см. После 120 с адаптации в течение 4 мин регистрировали суммарное время иммобильности.

Социальное взаимодействие (Social interaction)

К тестируемому самцу СВА (резидент) подсаживали ювенильного (3-4 нед.) самца ICR (интрудер) и в течение 10 мин регистрировали проявления социального неагрессивного поведения со стороны резидента (облизывание, обнюхивание).

Определение половой мотивации

За два дня до опыта самцов рассаживали по одному в клетки (28 х 14 х 10 см), разделенные на две половины прозрачной пластиковой перегородкой с отверстиями. В течение 10 мин учитывали количество подходов к пустой перегородке и продолжительность нахождения у перегородки с пустым отсеком. Затем в пустой отсек клетки с самцом помещали рецептивную самку. На протяжении 10 мин регистрировали время, которое самец проводил возле перегородки, касаясь ее носом или передними лапами, в попытках проникнуть к самке, и количество подходов к перегородке.

Тест «Предпочтение партнера»

Использовали металлические клегтки (45 х 15 х 10 см) из трех равных отсеков (15 х 15 х 10 см), разделенных прозрачными перегородками с отверстиями. В центральном отсеке помещался экспериментальный самец, в одном из боковых - самец линии ICR, в другом - рецептивная самка той же линии. Учитывали время, которое экспериментальный самец на протяжении 10 мин проводил возле перегородок, отделявших его от самца и от самки и количество подходов к перегородкам (Кузнецова и др., 2006).

Рефлекс вздрагивания, вызванный акустическим стимулом (acoustic startle reflex)

Реакцию вздрагивания измеряли с использованием прибора SR-Pilot (San-Diego Instruments, USA), состоящего из пластиковой камеры (15 х 19 х 25 см), пол которой располагается на пьезодатчиках. Мышь помещали в камеру и подавали 8 одиночных звуковых стимулов (115 дБ, 40 мс) с интервалом около 15 с. Реакцию вздрагивания регистрировали с помощью микрокомпьютера, встроенного в прибор, и выражали в условных единицах (Попова и др., 1999).

Для оценки PPI чередовали 4 одиночных сигнала с 4 комбинированными стимулами (предупреждающий за 100 мс престимул силой 85 дБ, 40 мс и основной -115 дБ, 40 мс). Величина престимульного ингибирования определялась по формуле

где Р - средняя амплитуда вздрагивания при предъявлении одиночного стимула, РР - средняя амплитуда вздрагивания при предъявлении престимула и стимула.

Препараты

Нейротрофнческие факторы (BDNF, GDNF)

Человеческий рекомбинантный BDNF (Sigma-Aldrich Со.) и человеческий ре-комбинантный GDNF (Prepotech Great Britain) разводили в физиологическом растворе и под легким эфирным наркозом вводили 0.3 мкг в объеме 5 мкл в левый боковой желудочек мозга мыши (АР: -0.5 мм, L: -1.6 мм, DV: 2 мм). При двукратном введении через 3 дня препарат в той же дозе вводили в правый боковой желудочек мозга. Контрольным животным вводили физиологический раствор в том же объеме. Эффекты введения BDNF и GDNF на поведение изучали через 7 дней после инъекции.

Для оценки продолжительности действия BDNF на мышах линии DBA/2 тестирование проводили через 7 дней и через 1,5 месяца после введения препарата.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы "Statistica 6.0". Оценка различий между группами животных производилась при помощи дисперсионного анализа: One-way ANOVA Repeated measures ANOVA (анализ повторных измерений), и сравнения post hoc с использованием критерия Фишера; значения, выраженные в процентах (% каталептиков, % самцов с инвертированным половым предпочтением), оценивали при помощи 2x2 таблицы, сравнение по критерию х2- Процент самцов линии DBA/2 с измененным после введения BDNF PPI оценивали при помощи критерия знаков

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения действия центрального введения BDNF на генетически детерминированное патологическое поведение были использованы три линии мышей - ASC СВА и DBA/2.

Влияние BDNE на поведение мышей линии ASC

В тесте на каталептическое замирание у контрольных животных ASC была выявлена явная предрасположенность к каталепсии. Это проявлялось в большом проценте животных, проявляющих каталепсию - 77% и в высоком среднем времени замирания. Было установлено отчетливое влияние двукратного введения BDNF на проявление каталепсии, что выражалось в уменьшении процента каталептиков до 33% (х = 7.14: df = 1: р < 0.05). Кроме того, в два раза снизилось среднее время неподвижности (F1i35 = 6,5, р < 0.05, рис. 1).

80 А 50

л о s 60 о 40

È É

ф к * S 30

со н 40 О. S

120

I <ъ 20 /у/. к

IT о Ж я10

G-£Г 0- Щ о. m - 0

Т *

/V, у

Контроль BDNF Контроль BDNF

Рис. 1. Поведение мышей линии ASC группы «Контроль» (п = 22) и «BDNF» (и = 15) в тесте на каталепсию. А - процент животных-каталептиков, Б - время замирания (с). * р < 0.05 по сравнению с группой «Контроль».

В тесте «Tail suspension» обнаружена тенденция к уменьшению времени неподвижности после введения BDNF: контрольные животные были неподвижны в течение 145.5 ± 13.8 с, а животные группы «BDNF» - 111.4 ± И 6 с (Fi?i =35 о = 0.074). ' ' F

Половая мотивация у самцов линии ASC существенно снижена по сравнению с родительскими линиями СВА и AKR (Тихонова и др., 2010).

Двукратное введение BDNF изменило проявление половой мотивации. Анализ повторных измерений выявил эффект препарата (Fu, = 8.0, р < 0.05), эффект присутствия рецептивной самки за перегородкой (FUi = 396.3, р < 0.001) и эффект взаимодействия между этими двумя факторами (F1î2i = 19.9, р < 0.001) на основной показатель половой мотивации - время, проведенное самцом у перегородки (рис. 2А). Число подходов к перегородке, отделяющей самца от самки также увеличилось (Fll21 = 181.8, р < 0.001), а кроме того, был выявлен эффект взаимодействия между факто-

рами присутствие рецептивной самки и введения BDNF (Fii2i = 6.8, р < 0.05, рис. 2Б). В присутствие рецептивной самки самцы группы «BDNF» чаще подходили к перегородке (р < 0.05) и проводили больше времени у перегородки (р < 0.001), чем контрольные самцы.

350

I 300

g. 250

i> 200

® 150

>• 100 о;

I 50

m 0

t*4 1

1 1

п 1 п 1

Пустой EZZ22 Самка

Контроль

BDNF

Контроль BDNF

Рис. 2. Время, проведенное у перегородки с пустым отсеком и с самкой (А) и количество подходов к перегородкам с пустым отсеком и с самкой (Б), самцами ASC группы «Контроль» (п = 12) и «BDNF» (и = 11) в тесте на половую мотивацию.

##р< 0.01 по сравнению с контролем; *** р < 0.001 по сравнению с пустым отсеком.

В то же время, в тесте на социальное взаимодействие, не обнаружено существенного влияния введения BDNF на продолжительность социального взаимодействия (Fi,2i = 0,51, р > 0.05) (298,7 ± 32,8 с для группы «Контроль» и 327,8 ± 24,7 с для группы «BDNF»),

Введение BDNF' не оказало влияния на поведение и в тесте открытого поля: локомоторную активность, исследовательскую активность, тревожность и эмоциональность (р > 0.05). Можно заключить, что изменение поведения мышей ASC в тестах на половую мотивацию и каталепсию после введения BDNF вызвано специфическим действием препарата именно на эти виды поведения, нарушенные у мышей линии ASC, и не связано с двигательной активностью.

Таким образом, двукратное центральное введение BDNF снижало проявление каталепсии, которая у данной линии тесно связана с депрессивноподобным поведением и может служить маркером «депрессивности» (Базовкина et ai., 2005), и на уровне тенденции уменьшало время неподвижности в тесте «Tail suspension», что говорит об антидепресантных свойствах BDNF.

Поскольку двукратное введение BDNF оказало существенное влияние на проявление каталепсии и половой мотивации, возник вопрос, будет ли однократное введение BDNF, которое экономически более выгодно, эффективно снижать проявление каталепсии, основного интересующего нас признака мышей ASC?

Через неделю однократное центральное введение нейротрофического фактора BDNF вызвало значительное снижение процента каталептиков - с 77 до 21 %, (%2 = 8.32: df = 1: р < 0.01, Рис. ЗА) и, на уровне тенденции, времени замирания (Fi^s = 3.92, р = 0.059; Рис. ЗБ).

Однако в тесте принудительного плавания, введение BDNF не оказывало существенного влияния на время неподвижности (F1>27 = 0.2, р > 0.05). В тесте открытого поля так же не выявлено изменений поведения (р > 0.05).

Таким образом, не только двукратное, но и однократное центральное введение BDNF снижало проявление генетической предрасположенности к каталепсии. Важно отметить, что для проявления действия BDNF необходимо продолжительное время. Это позволяет предположить, что наблюдаемые нами эффекты BDNF связаны

с его влиянием на выживание и функции взрослых нейронов, а также с усилением синаптической пластичности и роста дендритов (Post, 2007).

60,

| 80 5 во

«т

Ï 40

х 01 |20

Контроль BDNF

50 40 30 20 К. 10 0

со

Контроль BDNF

Рис. 3. Поведение мышей линии ASC группы «Контроль» (л = 13)

и «BDNF» (л = 14) в тесте на каталепсию.

А - процент животных-каталептиков, Б - время замирания (с).

** р < 0.01 по сравнению с группой «Контроль».

Основываясь на полученных результатах, в дальнейших исследованиях применялось однократное центральное введение BDNF.

Влияние BDNF на поведение мышей линии СВА

Животные контрольной группы показали высокую предрасположенность к каталептическому замиранию. Однако, в отличие от мышей ASC, центральное введение BDNF не изменило существенно поведение мышей СВА в данном тесте. Как процент каталептиков (Х2= 8.32: df = 1: р > 0.05; Рис. 5А), так и продолжительность замирания (F,, 27 = 0,72, р > 0.05) через неделю после введения препарата остались высокими.

В тесте «Tail suspension» введение BDNF не повлияло на время неподвижности (FU6= 0,87, р > 0.05).

Введение BDNF не повлияло на проявление половой мотивации, выраженной во времени у перегородки с самкой (Fi,23 = 1,23, р > 0.05) и на количество подходов к перегородке с самкой (Fi,23 = 0,99, р > 0.05). Следовательно, 3DNF не оказывает существенного влияния на исходно высокую половую мотивацию самцов СВА (Ам-стиславская, Храпова, 2002).

В тесте открытого поля не обнаружено значимого влияния введения BDNF на поведение (р > 0.05).

Таким образом, BDNF не влияет на поведение мышей этой линии спустя 7 дней. Хотя СВА является родственной линии ASC, предрасположенность к каталепсии у нее не сопровождается депрессивноподобным поведением. В то же время, мыши линии ASC характеризуются депрессивноподобным поведением (Базовкина и др., 2005), которое, как можно предположить, связано с нейродегенеративными нарушениями нервной системы. Это предположение объясняет антикаталептический эффект BDNF на линии ASC его действием на нейрогенез и синаптогенез, восстанавливающим нарушенные механизмы или структуры нервной системы.

Влияние BDNF на поведение мышей линии DBA/2

У контрольных мышей линии DBA/2 было резко снижено или вообще отсутствовало престимульное ингибирование акустического рефлекса вздрагивания.. Это соответствует данным, полученным ранее в нашей и других лабораториях (Simosky et al., 2001; O'Neill et al., 2003; Popova et al., 2009).

Анализ повторных измерений выявил влияние однократного центрального введения BDNF на величину пресгимульного ингибирования у мышей линии DBA/2.

Через неделю после введения BDNF PPI увеличилось более чем в б раз, по сравнению с исходным значением этого показателя у этих же животных (Fi,g = 8,55, р < 0.01, рис. 4А). Анализ изменения PPI при помощи критерия знаков выявил у 88,9 % мышей значительное увеличение значения PPI через неделю после введения BDNF (р < 0.05). Это говорит об усилении протекции центральной обработки информации (Graham, 1975) и увеличении сенсомоторного торможения, вызванного тем, что первый, слабый престимул подавляет моторный рефлекс, вызванный пугающим стимулом (Braff et al., 2001).

£ 450

Контроль

Контроль BDNF

Рис. 4. Величина престимульного ингибирования, % (А) и амплитуда вздрагивания, усл. ед. (Б) самцов мышей линии ПВА/2 до (контроль) и спустя 1 нед. после однократного центрального введения ВБОТ (л = 9). * р < 0.05 по сравнению с теми же животными до введения ВМФ.

Амплитуда вздрагивания на одиночный акустический сигнал у контрольных животных была также на низком уровне. Мыши данной линии представляют также интерес для исследователей, как модель связанной с возрастом кохлеарной патологии, включая потерю волосковых клеток и нейронов спирального ганглия (\Villott е! а1., 1995; \ViHott, Вгсж, 1996; НиИсгаШг, вра^Ьег^ 1997). Введение ВООТ увеличивало амплитуду вздрагивания у мышей ОВА/2 через неделю (Б^ = 7,53, р < 0.05, рис. 4Б). Этот результат позволяет предположить, что ВПИЕ7 способен в некоторой степени корректировать последствия наследственной нейродегенеративной патологии.

Поскольку у самцов БВА/2 значительно снижена половая мотивация по сравнению с рядом других линий (Амстиславская, Храпова, 2002), было изучено влияние центрального введения ВОМ- на половую мотивацию самцов ОВА/2.

Выявлено существенное повышение половой мотивации, выраженной в продолжительности нахождения возле перегородки с самкой, после введения препарата, по сравнению с поведением этих же животных до введения (Б1,8 = 20,57, р < 0.001, рис. 5А).

Количество подходов при этом не изменилось СР1,8= 1,74, р > 0.05, рис. 5Б), что говорит, о том, что двигательная активность не была изменена.

До настоящего времени не проводилось исследований продолжительности действия ВОМБ. Поэтому для оценки продолжительности действия центрального введения ВИМ7 самцов линии ОВА/2 протестировали спустя 1,5 мес. после введения препарата в тех же тестах, что и через 1 неделю после введения. Было установлено, что спустя 1,5 мес. после введения препарата показатель РР1 был существенно выше, чем до введения (Б1>8 = 5,22, р < 0.05, рис. 6А).

При этом амплитуда вздрагивания на акустический сигнал спустя 1,5 мес. не отличалась от реакции до введения (Б^ = 0,51, р > 0.05, рис. 6Б), однако была снижена на уровне тенденции по сравнению с реакцией через неделю после ВО№ (Б18 = 4,28, р = 0.07). Этот результат, по нашему мнению, снимает ограничение в исполь-

зовании мышей линии DBA/2 как модели шизофрении, которое было связано с мнением, что пониженное PPI является лишь следствием ухудшения слуха (Turner et al., 2005), поскольку показывает, что механизмы повышения и снижения РР1 и реакции вздрагивания, по-видимому, различны и независимы.

g250 |200

I150 §"100

£ SO £

Я о

Пустой Самка

Контроль ВОМР Контроль ВОМР

Рис. 5. Время, проведенное самцом линии БВА/2 у перегородки с пустым отсеком и с рецептивной самкой (А) и число подходов к перегородкам (Б) до (контроль) и через 1 нед. после однократного центрального введения ВО№ (и = 9).

*** р < 0.001 по сравнению с пустым отсеком; ## р < 0.01 по сравнению с контролем.

а а. С

rh 1

500 400 300 200 100 о

Контроль BDNF

Рис. 6. Величина престимульного ингибирования, % (А) и амплитуда вздрагивания, усл. ед. (Б) самцов мышей линии ОВА/2 до (контроль) и спустя 1,5 мес. после однократного центрального введения ВОЫГ (я = 9). * р < 0.05 по сравнению с теми же животными до введения ВО№

о 250 а:

§.200 о

g. 150 0)

с 100

>ч

§ 50 ф

& 0

ш 60

|50

о 40 с

8 зо

g 20

¡10 о

* о

*** I I Пустой Ш® Самка

Г+1

Контроль

BDNF

Контроль ВОМР

Рис. 7. Время, проведенное самцом линии ОВА/2 у перегородки с пустым отсеком и с рецептивной самкой (А) и число подходов к перегородкам (Б) до (контроль), и спустя 1,5 мес. после однократного центрального введения ВО№ (п = 9).

*р < 0.05, ***р < 0.001 по сравнению с пустым отсеком; # р < 0.05 по сравнению с контролем.

Таким образом, BDNF способен восстанавливать нарушенную реакцию пре-стимульного ингибирования и амплитуду вздрагивания на акустический сигнал, а также повышать сниженную половую мотивацию самцов линии DBA/2. Причем выявлено необычно долгое действие препарата наРР1 и половую мотивацию -1,5 мес.

Исследование влияния этанола и стресса в пренатальном периоде на поведение самцов мышей

Нами была разработана эпигенетическая модель патологии, вызванной этанолом и стрессом в период пренаталыюго развития (А+С). Комбинированное действие этанола и стресса было использовано потому, что стрессовые ситуации нередко сопровождаются потреблением алкоголя, особенно у лиц, склонным к этому. А по данным американских исследований, 12.2 % женщин употребляют алкоголь во время беременности (Denny et al., 2009). Ранее было показано (Кузнецова и др., 2006), что пренатальный стресс ослабляет у самцов мышей сексуальное предпочтение самки, но инверсии сексуального предпочтения отмечено не было. Наше исследование показывает совместное действие в пренатальный период алкоголя и стресса оказывают гораздо более выраженный повреждающий эффект.

Самцы группы А+С в тесте «Закапывание шариков■» закапывали значительно больше шариков (7,6 ± 0,85) по сравнению с животными контрольной группы (4,2 ± 0,76) (Fi,36= 8.73, р < 0.01), что указывало на повышение стереотипного поведения.

В тесте на социальное взаимодействие мыши группы А+С значительно дольше обнюхивали и облизывали ювенильного самца (300,5 ± 18,5 с) по сравнению с контрольными самцами (194 ± 15,3 с) (Fi,n = 19.89, р < 0.001). При этом согласно данным других работ, социальная активность у сгрессированных животных снижается (Marchlewska-Koj et al., 2003; Lee et al., 2007). Можно предположить, что увеличенная продолжительность обнюхивания и облизывания у животных А+С так же является проявлением обсессий и компульсий, свойственных для обсессивно-компульсивного расстройства.

В тесте на новизну, «Открытое поле», «Свет-темнота», приподнятого крестообразного лабиринта и в реакции вздрагивания на акустический сигнал влияния пренатальных факторов на исследовательскую, двигательную активность и тревожность А+С мышей не выявлено (р > 0.05). Наши данные хорошо соответствуют представлениям (Chung et al., 2005; Hougaard et al, 2005; Lee et al., 2007; Pallares et al., 2007) об отсутствии прямой связи стереотипного поведения в тесте «Закапывание шариков» с тревожностью.

Также у мышей А+С не было обнаружено изменений депрессивноподобного поведения в тесте «Tail suspension» (р > 0.05). Следует отметить, что способность пренатального стресса вызывать депрессивноподобное поведение может зависеть от времени действия. Так, было показано, что только стресс в первую неделю пренатального развития вызывал у потомков депрессивноподобное поведение (Mueller, Bale, 2008).

Эффект этанола, действующего на протяжении всего периода беременности в сочетании со стрессом в последнюю неделю беременности, особенно чувствительной к стрессу у грызунов (Fride, Weinstock, 1984; Ward, 1984; Ward et al. 1994; Koenig et al., 2005; Weinstock, 2008), на предпочтение полового партнера ранее не был изучен. В нашем эксперименте в тесте на предпочтение партнера контрольные самцы находились у перегородки с отсеком, в котором сидела самка, почти в 2 раза дольше, чем у перегородки, отделяющей самца (F19 = 23.79, р < 0.001, рис. 8).

о 200

150

100

к S

tu а оо

-h

] I Самка ^^ Самец

ri"

Контроль

перегородки,

А+С

за которой сидела

Контроль А+С Рис. 8. Время, проведенное самцом у

рецептивная самка, и у перегородки, за которой сидел самец (А), и число подходов к перегородкам (Б) самцами группы «Контроль» (п = 9) и группы А+С (и = 8) в тесте на предпочтение партнера.

р < 0.01, *** р < 0.001 по сравнению с перегородкой, за которой сидела рецептивная самка; ## р < 0.01, ### р < 0.001 по сравнению с контролем.

Анализ повторных измерений выявил значительный эффект взаимодействия между группой животных и полом партнера находящегося за перегородкой (Fj „ = 31.0, р < 0.001, рис. 8). У самцов-потомков А+С наблюдалась инверсия полового предпочтения, что проявлялось в существенном увеличении времени пребывания у перегородки за которой сидел самец по сравнению со временем, проведенного в попытках проникнуть через перегородку, отделявшую от рецептивной самки (р < 0.01). Половое предпочтение у самцов А+С проявлялось также в более частых подходах к перегородке, отделяющей их от самцов, чем к перегородке, отделяющей от самки (FU7 - 6.98, р < 0.01). У всех самцов в контрольной группе интерес к рецептивной самке превалировал над интересом к самцу, тогда как у 78% А+С мышей время, проводимое у перегородки с отсеком в котором сидел самец, превышало время у перегородки, отделяющей самку (%2 = 12,31 : df = 1 : р < 0.001).

Ранее в нашей лаборатории было показано, что только пренатальный стресс понижает предпочтение самки и увеличивает предпочтение самца, однако инверсии полового предпочтения получено не было (Кузнецова и др., 2006). Это совпадает и с данными других авторов, показавших, что у пренатально стрессированных самцов крыс половая мотивация была демаскулизирована, но не феминизирована, и такие самцы демонстрировали отсутствие предпочтения самца или самки (Wang et al., 2006). Полагают, что фундаментальной основой для маскулинизации и дефеминиза-ции полового поведения являются пики тестостерона на 18-19 дни беременности крыс (Weisz, 1980; Rhees et al., 1997) Феминизирующий эффект пренатального действия этанола вероятно вызывается понижением уровня тестостерона у плода (Ward et al., 1994; Rhees et al., 1997). Пренатальный стресс так же, как было показано понижает уровень тестостерона (Ward et al, 1994) на протяжении критичных периодов половой дифференциации мозга самцов. Наши результаты наводят на предположение о синергичных механизмах действия алкоголя и стресса на протяжении развития.

Выше приведенные результаты позволяют заключить, что алкоголь и стресс в пренатальном периоде вызывают у мышей увеличение стереотипного поведения и инверсию предпочтения полового партнера - самцы предпочитают больше времени находиться у перегородки отделяющей самца, а не с самку.

о 150

, 100

Г+1

* А 40 т

й +1 ## о S х 30

ct о с

i 1 S 20 ь

<5 5 10 1

у 0

] Самка 3 Самец

Контроль А+С BDNF(A+C)

Рис. 9. Время, проведенное самцами группы «Контроль» (п = 14), «А+С» (п = 14) и «BDNF(A+C)» (п= 14) рядом с перегородкой, за которой сидела рецептивная самка и с перегородкой, за которой сидел самец (А), и количество подходов к перегородкам самцами группы «Контроль» (п = 14), «А+С» (и = 14) и «BDNF(A+C)» (и = 14) (Б).

* р < 0.05, *** р < 0.001 по сравнению со временем пребывания у перегородки, за которой была самка; ##р< 0.01 по сравнению с самцами А+С.

Влияние центрального введения BDNF на поведение самцов мышей, пре-натально подвергавшихся действию этанола и стресса

Поскольку нами было установлено, что пренатальные факторы, этанол и стресс, влияют на поведение самцов мышей в трех тестах - закапывание шариков, социальное взаимодействие и предпочтение полового партнера, то в следующей серии экспериментов вновь полученные животные А+С были протестированы в этих же тестах. Подтвердилось отрицательное пренатальное действие этанола и стресса и затем им бьш введен в латеральный желудочек мозга BDNF Было установлено выраженное влияние BDNF на измененные у А+С мышей формы поведения.

Через неделю после введения BDNF число закопанных шариков у А+С животных (4,4 ±1,1) снизилось достоверно по сравнению с этими же животными до введения препарата (7,86 ±1,1) (FU3 = 7,29, р < 0.05).

Продолжительность обнюхивания и облизывания в тесте на социальное взаимодействие также снизилась у группы А+С после введения BDNF (207 ± 19,5 с), по сравнению с этими же животными до введения препарата (300,8 ± 20,7 с) (Fj,u = 12,32, р < 0.01).

Наиболее распространенным средством лечения обсессивно-компульсивных расстройств являются ингибиторы обратного захвата серотонина (Greist, Jefferson, 2007). Поскольку в ряде работ было показано, что BDNF понижает функциональную активность серотонинового транспортера и таким образом снижает обратный захват серотонина (Siuciak et al.,1997; Mossner et al., 2000; Deltheil et al. 2006), можно предположить, что восстановление поведения А+С самцов до уровня контрольных животных после центрального введения BDNF связано с его действием как ингибитора обратного захвата серотонина.

В тесте на предпочтение партнера самцы А+С после введения BDNF значительно меньше времени проводили у самца, по сравнению с этим же показателем до введения препарата (Fi,j3 = 9,54, р < 0.01, рис. 9).

Также снизился процент животных с инверсией предпочтения партнера с 78,6% до 21,4% (х2 = 9,14: df = 1: р < 0,01). Есть данные, полученные на крысах, что этанол в пренатальном периоде приводит к значительному уменьшению объема ядер полового диморфизма (Ahmed et al., 1991) и общего количества клеток этих ядер у самцов (Barron et al., 1988). Можно предположить, что действие BDNF на предпоч-

тение полового партнера на нашей модели пренатального стресса и алкоголя связано с его нейротрофическими функциями, а также стимуляцией нейрогенеза и синаггго-генеза.

Можно заключить, что центральное введение BDNF оказывает корректирующее воздействие на все виды поведения, измененные пренатальным воздействием этанола и стресса: уменьшает число закопанных шариков в тесте «Закапывание шариков», снижает продолжительность обнюхивания и облизывания ювенильного самца в тесте на социальное взаимодействие, уменьшает время у перегородки, отделяющей самца, и снижает процент животных с инвертированным половым предпочтением в тесте на предпочтение партнера.

Влияние центрального введения GDNF на поведение самцов мышей, пре-натально подвергавшихся действию этанола и стресса

Поскольку мы получили положительный эффект BDNF на модели пренатального алкоголя и стресса, мы провели исследование влияния центрального введения GDNF в той же дозе, что и BDNF на данной модели.

Через неделю после введения GDNF число закопанных шариков у А+С животных не изменилось (Fuo = 0,22, р > 0.05). При этом продолжительность социального взаимодействия с ювенильным самцом снизилась после введения GDNF с 274 ± 24 с до 119,3 ± 14,7 с (Fuo = 40,4, р < 0,001).

В тесте на предпочтение партнера продолжительность нахождения у перегородки, отделяющей самку (F,,9 = 0,08, р > 0.05), и самца (F,,9 = 2,37, р > 0.05) после GDNF изменилась незначительно по сравнению с данными показателями до введения препарата. Количество подходов к перегородкам с отсеками, в которых сидела самка (Fi,9 = 0,002, р > 0.05) и самец (F,., = 1,44, р > 0.05) также не отличалось существенно от соответствующих показателей до введения GDNF.

До введения GDNF процент самцов, предпочитающих самца, а не самку составлял 80%, а после введения - 70% (%2 = 0,27: df = 1 : р > 0.05).

В целом, можно заключить, что на данной модели патологий, вызванных этанолом и стрессом в пренатальном периоде, GDNF оказался гораздо менее эффективным, чем BDNF.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, BDNF оказал положительное влияние на ряде генетических и эпигенетических моделей нейропатологий, которые проявлялись нарушениями поведения мышей. На мышах линии ASC, с депрессивноподобным поведением и высоким проявлением каталептического замирания выявлено снижение каталепсии после введения BDNF. У мышей линии DBA/2, которая является моделью одного из синдромов шизофрении (резко сниженное престимульное ингибирование рефлекса вздрагивания), BDNF увеличивал выраженность престимульного ингибирования Кроме того, отмечено стимулирующее действие препарата на сниженную половую мотивацию у мышей обеих линий. Установлена необычная длительность действия препарата - 1,5 месяца.

Полученная нами эпигенетическая модель пренатального воздействия этанола и стресса характеризовалась инверсией полового предпочтения, а также повышением времени обнюхивания и облизывания ювенильного самца и усилением стереотипного поведения в тесте закапывания шариков, что рассматривается как проявление обсессивно-компульсивно-подобного поведения. Введение BDNF нормализовало половое предпочтение самцов и снижало стереотипное поведение.

Полученные результаты позволяют рассматривать BDNF как потенциальное эффективное терапевтическое средство с продолжительным действием для лечения ряда генетически детерминированных и эпигенетических нарушений поведения, в основе которых, по-видимому, лежат нейродегенеративные процессы.

ВЫВОДЫ

1. Интрацеребровентрикулярное введение BDNF снижает проявление каталептического замирания и увеличивает сниженную половую мотивацию у мышей каталептической линии ASC с депрессивноподобным поведением.

2. У мышей DBA/2 с резко сниженным престимульным ингибированием рефлекса вздрагивания введение BDNF повышает амплитуду вздрагивания на акустический сигнал, повышает величину престимульного ингибирования и увеличивает сниженную половую мотивацию. Влияние BDNF на величину престимульного ингибирования и половую мотивацию сохраняется на протяжении 1,5 месяцев.

3. У самцов СВА BDNF не влияет существенно на проявление каталепсии и половой мотивации.

4. Алкоголь и стресс в пренатальном периоде вызывают у самцов линии СВА инверсию полового предпочтения и проявление стереотипного поведения, что проявляется в увеличении числа закопанных шариков в тесте «Закапывание шариков» и увеличении времени облизывания и обнюхивания в тесте на социальное взаимодействие.

5. BDNF оказывает корригирующее влияние на поведение, нарушенное под действием пренатального алкоголя и стресса: уменьшает число закопанных шариков, снижает продолжительность обнюхивания и облизывания, снижает время, проведенное у перегородки, отделяющей самца в тесте на предпочтение полового партнера и уменьшает процент животных с инвертированным половым предпочтением.

6. GDNF на модели пренатального алкоголя и стресса понижает продолжительность социального взаимодействия. Число закопанных шариков, а также время у самца и самки в тесте на предпочтение полового партнера GDNF изменяет не значительно.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.V. Kulikov, M.V. Morozova, V.A. Kulikov, V.S. Kirichuk, N.K. Popova. Automated analysis of antidepressants' effect in the forced swim test H J. Neurosci. Meihods. - 2010. - V. 191, № 1. - P. 26-31.

2. M.A. Tikhonova, A.V. Kulikov, D.V. Bazovkina, M.V. Morozova, V.S. Nau-menko, N.K. Popova. Antidepressant-like effects of central BDNF administration in mice of antidepressant sensitive catalepsy (ASC) strain II Chinese Journal of Physiology. - 2012. - V. 55, № 4. - P. 1-10 (в печати).

3. N.K. Popova, M.V. Morozova, T.G. Amstislavskaya. Prénatal stress and ethanol exposure produces inversion of sexual partner preference in mice II Neurosci. Letters. - 2011. - V. 489, № 1. - P. 48-52.

4. N.K. Popova, M.V. Morozova, V.S. Naumenko. Ameliorative effect of BDNF on prenatal ethanol and stress exposure-induced behavioral disorders // Neurosci Letters. - 2011 - V. 505, № 2. - P. 82-86.

5. M.A. Тихонова, A.B. Куликов, B.C. Науменко, MB. Морозова, Д.В. Базовки-на, Н.К. Попова. Внутримозговое введение нейротрофического фактора BDNF снижает выраженность каталептического замирания у мышей с генетической предрасположенностью к каталепсии // Бюлл. экспер. биоп мед -

2009. - Т. 147, № 12. - С. 649-652.

6. М.В. Морозова, А.В. Куликов. Влияние генотипа и времени суток на поведение мышей в тестах «открытое поле» и «свет - темнота» // Жури. высш. череп, деят. - 2010. - Т. 60, № 5. - С. 625-629.

7. М.В. Морозова, Н.К. Попова. Сочетанное влияние алкоголя и стресса в пре-натальном периоде на поведение взрослых мышей // Росс, физиол журн -

2010.-Т. 96, №11. -С. 72-79.

8. M.V. Morozova, N.K. Popova. Prenatal stress and alcohol produce obsessive-compulsive-like behavior in mice // European Neuropsychopharmacolosy - 2010 -V. 20,Suppl. 3.-P. S279.

9. M B. Морозова. Влияние алкоголя и стресса в пренатальном периоде на половое предпочтение самцов мышей // Труды Томского гос. университета -2010. - Т. 275. - С. 215-217.

10. М.В. Морозова, А.В. Куликов. Влияние генотипа и времени суток на двигательную активность и тревожность мышей // XXI съезд Физиологического общества им. ИП.Павлова. Калуга, 2010. - С. 418.

11. М.В. Морозова. Влияние алкоголя и стресса в пренатальном периоде на половое предпочтение самцов мышей // Первая Всероссийская молодёжная научная конференция, посвященная 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии». ТГУ, Томск, 2010. - С. 99-100.

12. М.А. Тихонова, М.В. Морозова. Изучение антидепресантных свойств BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) на генетической модели депрессивнопо-добного состояния у мышей // V Международная конференция «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным препаратам». Клязьма, 2010. - С. 13-14.

13. М.А. Tikhonova, M.V. Morozova, A V. Kulikov. Effects of central BDNF administration on behavior and hippocarapal mRNA level of Arc in mouse genetic model of depressive-like state // X Intern, conference "Neurotrophic Factors in Health and Disease". Helsinki, Finland, 2010. - C. 41.

Подписано к печати 06.02.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 Заказ № 18

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Морозова, Марьяна Владимировна, Новосибирск

61 12-3/1071

Российская Академия Наук Сибирское отделение Институт цитологии и генетики

На правах рукописи

Морозова Марьяна Владимировна

Физиология - 03.03.01

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.м.н., проф. Н.К. Попова

Новосибирск 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение......................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Нейротрофические факторы как перспективное терапевтическое средство в лечении эмоциональных и нейродегенеративных расстройств.....................................................11

1Л. Семейства нейротрофических факторов........................................11

1.2. ВБ^: общая характеристика.....................................................14

1.2.1. Функции ВБ№................................................................16

1.2.2. ВБМБ и патологические состояния........................................21

1.2.3. Участие ВБ№ в механизмах действия антидепрессантов...........25

1.2.4. Терапевтические эффекты ВБ№.........................................27

1.3. ОБ№: общая характеристика.....................................................31

1.3.1. Функции вБ^..................................................................33

1.3.2. Терапевтические эффекты ОБ№.........................................35

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...............................................39

2.1. Экспериментальные модели.......................................................39

2.1.1. Генетические модели........................................................39

2.1.2. Эпигенетическая модель пренатального воздействия стресса и алкоголя.............................................................................. 40

2.2. Экспериментальные методы......................................................41

2.2.1. Тестирование поведения.......................................................41

2.2.2. Препараты. Введение препаратов........................................46

2.2.3. Статистическая обработка данных........................................46

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................47

3.1. Изучение действия центрального введения ВБ№ на генетически

детерминированное патологическое поведение мышей..........................47

3.1.1. Влияние ВБ№ на поведение мышей линии АБС....................47

3.1.2. Влияние ВБЫР на поведение мышей линии СВА...................53

3.1.3. Влияние ВБ№ на поведение мышей линии БВА/2................57

3.2. Эпигенетическая модель пренатального воздействия этанола и стресса....................................................................................61

3.2.1. Исследование влияния этанола и стресса в пренатальном периоде на поведение самцов мышей.............................................61

3.2.2. Влияние центрального введения на поведение самцов мышей, подвергавшихся пренатально действию этанола и стресса......66

3.2.3. Влияние центрального введения на поведение самцов мышей, подвергавшихся пренатально действию этанола и стресса.....69

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................73

ВЫВОДЫ...................................................................................87

Список цитируемой литературы.......................................................88

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

На протяжении многих десятилетий считалось общепризнанным, что «нервные клетки не восстанавливаются» и в зрелом мозге происходят только процессы нейродегенерации. Однако в 1965 году Altman и Das открыли, что во взрослом мозге, а именно, зубчатой извилине крыс, происходит нейрогенез. Этому предшествовало открытие в начале 50-х годов ростового фактора нервов (NGF), который на протяжении многих десятилетий был известен как прототипичный нейротрофический фактор (Levi-Montalcini, 1987). Многолетние исследования действия NGF in vivo и in vitro показали жизненно важную роль данного фактора в развивающихся симпатических и сенсорных нервных клетках, а также способность управлять ростом и регенерацией аксонов сенсорных и симпатических нейронов в соответствии с его концентрационным градиентом (нейротропизм) (Johnson, 1999; Levi-Montalcini, 1987). Однако данные эффекты были выявлены на периферии, а не в центральной нервной системе. В 1982 году уже непосредственно из мозга свиньи был выделен нейротрофический фактор мозга (BDNF), и на культуре клеток раскрыта его способность поддерживать выживание сенсорных нейронов зрелого мозга (Barde et al., 1982). Начался новый этап развития нейронауки.

BDNF является маленьким димерным протеином, который принадлежит к семейству нейротрофинов. Действует через p75NTR (р75 neurotrophin receptor) рецептор, общий для всех нейротрофинов, и специфичный для BDNF тирозинкиназный TrkB рецептор (Lu et al., 2008).

Наибольшая экспрессия BDNF выявлена в таких структурах центральной нервной системы, как гиппокамп, мозжечок, кора (Davis, 2008), гипоталамус, перегородка (Katoh-Semba et al., 1997). Кроме того, обнаружена экспрессия данного нейротрофического фактора в ганглиях задних корешков спинного мозга, спинном мозге, сердце, селезенке (Yamamoto et al., 1996), печени (Katoh-Semba et al., 1997), нейронах тазовых ганглиев (Squillacioti et al., 2008), в тромбоцитах крови (Pliego-Rivero et al., 1997; Watanabe et al., 2010).

синапсов и оказывает сильное влияние на рост, реконструкцию и стабильность дендритов и аксонов в гиппокампальных и кортикальных нейронах (Elmariah et al., 2005).

Выявлено вовлечение BDNF в ряд патологий. Так, у людей страдающих депрессией, шизофренией, болезнью Альцгеймера уровень мРНК BDNF и белка BDNF в ряде регионов мозга, а также сыворотке и плазме крови снижен (Phillips et al., 1991; Hock et al., 2000; Karege et al., 2002; Toyooka et al., 2002; Weickert et al., 2003; Karege et al., 2005 a; Lee et al., 2005; Laske et al., 2006; Xiu et al., 2009; Huang et al., 2008). Кроме того, есть данные, что возрастные изменения, происходящие в мозге, сопровождаются снижением содержания BDNF и для сохранения памяти и когнитивных функций необходим должный уровень нейротрофинов (Гомазков, 2011).

Создана нейротрофическая гипотеза депрессии (Duman, Monteggia, 2006), которая предполагает, что пониженная экспрессия BDNF и, возможно, других ростовых факторов играет существенную роль в развитии депрессии, а повышение BDNF вносит вклад в действие антидепресантного лечения.

Существует также нейротрофическая гипотеза шизофренических психозов (Durany et al., 2001). Предполагается, что изменения в экспрессии нейротрофических факторов могут быть ответственны за нарушения нейронального развития и нарушенную нейрональную пластичность, являясь, таким образом, важным событием в этиопатогенезе шизофренических психозов.

таким генетически детерминированным нарушениям поведения относится реакция каталептического замирания. Следует отметить, что у человека каталепсия является симптомом тяжелых нервных и психических нарушений (Dixon, 1998). Другим генетически обусловленным девиантным поведением является патологически сниженная реакция престимульного ингибирования реакции вздрагивания на акустический сигнал, что является симптомом шизофрении (Braff et al., 1999; Kumari et al., 2000; Ludewig et al., 2003).

Среди эпигенетических факторов, значительно влияющих на последующее развитие, особый интерес представляют алкоголь и стресс, действующие в периоде пренатального развития. Эпигенетические эффекты, вызываемые этими факторами, связывают с химическими изменениями хроматина (ДНК и связанных с ней белков гистонов), которые помогают регулировать транскрипцию генома (Roth, Sweatt, 2011). Посредством этого эпигенетического механизма внешние воздействия могут модифицировать функцию гена без изменения последовательности ДНК (Шишкина, Дыгало, 2010). В настоящее время, ДНК метилирование является наиболее изученным эпигенетическим механизмом в отношении понимания событий ранней жизни и нейробиологических последствий (Roth, Sweatt, 2011). Показано, что как стресс (Mueller, Bale, 2008; Mychasiuk et al., 2011), так и этанол (Vallès et al., 1997; Maier et al., 1999; Downing et al., 2011) в пренатальном периоде оказывают влияние на метилирование ДНК. Последствия эпигенетических модификаций, очевидно, могут проявляться спустя значительное время после их формирования. Основой таких эффектов может быть изменение экспрессии специфических генов в формирующемся организме и сопутствующие ему длительные нарушения структуры и функции его мозга (Шишкина, Дыгало, 2010). Обнаружено, что стресс и этанол в периоде пренатального развития снижают экспрессию гена BDNF в ряде регионов мозга (Maier et al., 1999; Fumagalli et al., 2004; Van den Hove et al., 2006; Caldwell et al., 2008; Fiore et al., 2009).

Алкоголь и стресс, действующие в пренатальном периоде, могут вызывать различные расстройства, объединенные названиями «Спектр фетальных алкогольных расстройств» (СФАР) и «Стрессовый синдром». СФАР - это группа нарушений, которые могут возникнуть у человека, чья мать потребляла алкоголь во время беременности, включая физические, психические, поведенческие патологии

и нарушения обучения (Calhoun et al., 2006; Nayak et al., 2008; Fiorentino et al., 2006). Фетальный алкогольный синдром (ФАС), который является наиболее тяжелой, резко выраженной формой СФАР (Fiorentino et al., 2006), в США обнаруживается с частотой 0,5-2 случая на 1000 новорожденных, в Южной Африке его частота значительно больше и составляет 72,1 на 1000 (CDC, May et al., 2007).

Стресс в пренатальном периоде вызывает пристальный интерес исследователей с 1970-х годов, когда было обнаружено, что пренатальный стресс вызывает демаскулинизацию и феминизацию полового поведения у взрослых самцов крыс (Ward, 1972). В 1980-е годы Gunter Dörner выдвинул гипотезу о том, что пренатальный стресс может быть причиной гомосексуальности у мужчин (Dörner et al.,1980; Dörner et al., 1983). Позднее показали, что стресс в период внутриутробного развития может вносить вклад в развитие психопатологии детского возраста (Ward, 1991), а также повышает вероятность развития депрессии у мужчин (Watson et al., 1999).

В исследованиях эффектов пренатальной алкоголизации на мышах обнаружено снижение уровня белка BDNF в медиальной фронтальной коре и снижение уровня мРНК BDNF в медиальной фронтальной коре и гиппокампальной формации (Caldwell et al., 2008), также снижение уровня BDNF в гиппокампе и мозжечке (Fiore et al., 2008). Пренатальный стресс также уменьшает уровень белка BDNF в обонятельных луковицах и гиппокампе (Van den Hove et al., 2006). При этом важно учитывать, что потребление этанола часто тесно связано со стрессом.

В экспериментах на культурах клеток было обнаружено, что GDNF (McAlhany et al., 2000) и BDNF (Mitchell et al., 1998) могут улучшать выживаемость нервных клеток, подвергнутых токсическому действию этанола.

Таким образом, показано вовлечение нейротрофических факторов в патофизиологию СФАР и «Стрессового синдрома», при этом попытки лечения дефектов, вызванных пренатальными факторами, при помощи нейротрофических факторов единичны, и проведены in vitro, за исключением исследования Bradley с коллегами (1999), показавшего in vivo, что нейротрофические факторы BDNF и GDNF защищают мотонейроны спинного мозга эмбриона цыпленка от нейротоксичности этанола.

Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:

5) Исследовать влияние BDNF на нарушенные формы поведения в модели пренатального действия этанола и стресса.

Научная новизна

- Показано усиление половой мотивации после BDNF у мышей линий DBA/2 и ASC со сниженной половой мотивацией.

- Впервые установлена необычная длительность действия однократного центрального введения BDNF - 1,5 мес.

- Разработана эпигенетическая модель повреждающего действия пренатального алкоголя и стресса.

- Обнаружена терапевтическая эффективность ЕШИР, но не на модели пренатального стресса и алкоголя: снижение стереотипного поведения и восстановление нормального полового предпочтения.

Научно-практическая ценность

Обнаружена эффективность в ослаблении нарушений, вызванных

пренатальным действием этанола и стресса. Полученный результат показывает перспективность использования ВОИР для лечения половых нарушений, в частности, гомосексуализма, а также в качестве антиобсессивно-компульсивного препарата.

На модели нарушений, вызванных пренатальными факторами показано, что ОБОТ значительно менее эффективен, чем ВО№.

Положения, выносимые на защиту

- ВО№ оказывает терапевтическое действие как на генетических, так и на эпигенетических моделях патологий, имеющих, по-видимому, в своей основе нейродегенерацию.

- Такие свойства ВВ№, как, эффективность лечения эпигенетически и генетически детерминированных нарушений и необычная длительность действия делают данный препарат перспективным для дальнейшего

изучения и разработки форм, лишенных основного недостатка BDNF -слабого проникновения через гематоэнцефалический барьер.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчётной сессии ИЦиГ СО РАН в 2010 г., 23 Congress of European College of Neuropsychopharmacology (Амстердам, 2010), XXI съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010), Первой Всероссийской молодёжной научной конференции, посвященной 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010), V Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным препаратам» (Клязьма, Московская область, 2010), 10th International Conference "Neurotrophic Factors in Health and Disease" (Хельсинки, 2010), XLIX международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2011).

Публикации

Структура и объём работы

Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы (317 источников). Общий объем составляет 118 машинописных листов. Представлено 23 рисунка и 6 таблиц.

ГЛАВА 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Нейротрофические факторы как перспективное терапевтическое средство в лечении эмоциональных и нейродегенеративных расстройств

1.1. Семейства нейротрофических факторов.

В настоящее время известны не менее 7 семейств нейротрофических факторов: нейротрофины, нейропоэтины, инсулин-подобные ростовые факторы, трансформирующий ростовой фактор р, факторы роста фибробластов, другие факторы роста, которые частично представлены в табл. 1. Следует отметить, что у разных авторов встречаются некоторые расхождения в классификации нейротрофических факторов. Особый ин

Информация о работе

Морозова, Марьяна Владимировна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2011
ВАК 03.03.01

Диссертация

Влияние нейротрофического фактора мозга (BDNF) на эпигенетически и генетически детерминированные нарушения поведения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы