Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы функционирования нейронных сетей in vitro в процессе развития и при воздействии стресс-факторов
ВАК РФ 03.03.01, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Механизмы функционирования нейронных сетей in vitro в процессе развития и при воздействии стресс-факторов"
На правах рукописи d
Ведунова Мария Валерьевна
Механизмы функционирования нейронных сетей in vitro в процессе развития и при воздействии стресс-факторов
03.03.01 — физиология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
8 АПР 2015
005566904
Пущине - 2015
005566904
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации и федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского».
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор
Мухина Ирина Васильевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Александрова Мария Анатольевна
(зав.лаб. экспериментальной нейробиологии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН, Москва)
доктор биологических наук Савватеева-Попова Елена Владимировна
(зав. лаб. нейрогенетики Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург)
доктор биологических наук Кудряшова Ирина Владимировна (в.н.с. лаборатории функциональной биохимии нервной системы Институт высшей нервной деятельности и физиологии РАН, Москва)
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Казань
Защита диссертации состоится «20» мая 2015 в 1_5 часов 30 минут на заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке ПНЦ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, и на сайте ИТЭБ РАН: http://web.iteb.psn.ru.
Автореферат разослан «_»_2015 года
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук
Ланина Н. Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям минимальной функциональной единицей нервной системы является нейронная сеть. Именно на уровне нейронной сети происходят процессы консолидации памяти, обработки и передачи информации (Schlingloff et al., 2014, Eskandari Sedighi et al., 2014, Tong et al., 2014). Изучение процессов сохранения структурно-функциональной целостности нейронных сетей головного мозга при действии стресс-факторов, а также поиск веществ, способных стимулировать частичное восстановление нарушенной функциональной активности нейронных сетей после действия стресс-факторов - является одной из основных проблем современной нейробиологии и медицины в целом.
Исследование молекулярно-клеточных особенностей формирования и функционирования отдельных нейронных сетей на уровне целого мозга в настоящее время практически невозможно. Это связано со сложностью строения, многообразием функций и невозможностью исследовать отдельные звенья нейронных сетей с использованием неинвазивных методов. Основным свойством гиппокампальных нейронных сетей является генетически детерминированная локальность, особенности клеточного состава и относительная простота строения этого отдела головного мозга, что делает первичные культуры клеток гиппокампа одной из оптимальных моделей для изучения нейронных сетей мозга. Однако, традиционно при исследовании клеточных культур особое внимание уделялось морфологии и жизнеспособности клеток, большинство современных исследований клеточных механизмов ориентировано на изучение одиночных нейронов, группы нейронов, не образующих полноценные полиморфные сети (Хаспеков Л.Г., 1995, Стельмашук и др., 2014, Wang et al., 2014). Исследование функциональной активности локальных нейронных сетей in vitro стало методически возможным только при внедрении инновационных методов долговременной неинвазивной прижизненной детекции нейронального сетевого сигнала. Мультиэлектродные системы регистрации внеклеточных потенциалов действия нейронов рассматриваются как наиболее перспективные методы изучения работы нейронных сетей (Мухина И.В. и др., 2009).
Культивирование клеток различных структур головного мозга на мультиэлектродной матрице дает уникальную возможность долговременного наблюдения изменений морфофункционального состояния нейронных сетей, как в условиях моделирования различных патологических состояний, так и при изучении действия нейропротекторов. Работа нейронной сети зависит не только от активности нейронов - ее основных компонентов, но во многом определяется активностью астроцитов и морфофункциональной стабильностью, определяемой внеклеточным матриксом. Одним из стресс-факторов, влияющих прежде всего на жизнеспособность и гомеостаз нейронов, является гипоксия, так как нейроны наиболее чувствительны к кислородной депривации организма. Субстратное голодание может рассматриваться, как стресс-фактор, оказывающий свое действие прежде всего на процессы астроцитарной регуляции нейронной активности. Еще одна группа стресс-факторов, связанных с изменением гомеостаза и возможности пластических изменений нейронной сети, включает воздействия, обусловленные нарушением структуры внеклеточного матрикса.
Среди молекул внеклеточной сигнализации, которые способны оказывать влияние на развитие и уровень адаптации нейронных сетей к стресс-условиям, наибольший интерес представляют белки: нейротрофический фактора головного мозга (BDNF) и глиальный нейротрофический фактор (GDNF), а также один из эндоканнабиноидов N-арахидоноилдофамин (N-ADA) липидной природы. Данные молекулы могут оказывать синергическое действие, так как их эффект реализуется на разных уровнях поддержания гомеостаза нейронных сетей. Эндоканнабиноиды оказывают влияние на самых ранних стадиях развития адаптационных реакций и могут стимулировать синтез нейротрофических факторов. Глиальный нейротрофический фактор является одним из основных факторов, выделяемых глиальными клетками для поддержания жизнеспособности нейронов в стрессогенных условиях. Реализация его нейропротективного действия связана с активацией синтеза BDNF (Chen et al., 2013, Wang et al., 2013). Активация внутриклеточных метаболических каскадов, индуцированных связыванием BDNF, ведет к активации генов «раннего» ответа и комплексу реакций, приводящему к снижению концентрации ионов Са2+ в цитоплазме (Tian et al, 2013). Показана возможность влияния BDNF не только на метаболические процессы в клетках, но и непосредственно на ионные каналы, оказывая прямое действие на процессы передачи информации в нейронных сетях (Kim G, Kim Е., 2013). Эндоканнабиноидная система также связана с индукцией сигнальных путей BDNF (Velayudhan, et al., 2013, Wei et al., 2014).
Особый интерес представляет вопрос о возможности репарации нарушенной морфофункциональной организации нейронных сетей. Известно, что гибель части нейронов может приводить к потере функциональной активности всей сети. Вопрос о возможности частичного восстановления функциональной активности нейронных сетей под действием молекул внеклеточной сигнализации на сегодняшний день остается открытым.
В связи с этим, целью исследования явилось изучение структурно-функциональной организации нейронных сетей культуры клеток гиппокампа в процессе развития и при воздействии стресс-факторов.
Задачи исследования:
1. Исследовать закономерности развития структурно-функциональной организации нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа мыши. Выявить основные этапы формирования структурно-функциональной организации нейронных сетей гиппокампа in vitro;
2. Изучить возможности формирования нейронных сетей, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток человека;
3. Установить механизмы функциональной реорганизации нейронных сетей in vitro при воздействии различных стресс-факторов, влияющих на целостность нейронных сетей (гипоксии, глюкозной депривации, энзиматической деградации внеклеточного матрикса мозга);
4. Изучить влияние молекул внеклеточной сигнализации BDNF, GDNF, NADA, участвующих в формировании и регуляции сетевой активности, на сохранение функциональной целостности нейронных сетей при воздействии острой гипоксии;
5. Исследовать влияние молекул внеклеточной сигнализации BDNF, GDNF, N-ADA на репарацию функциональной активности нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа после воздействия гипоксии и глюкозной депривации.
Научная новизна.
В диссертации впервые проведено комплексное исследование основных этапов развития сетей дифференцированных нейронов, полученных из эмбрионального гиппокампа мышей (El8), не только на морфологическом, но и на функциональном уровне. В работе реализованы новейшие методы изучения клеточной организации функционально активных нейронных сетей in vitro. Сочетание традиционных методов исследований (морфологических, электронно-микроскопических, биохимических) и инновационных (мультиэлектродные системы, кальциевый имиджинг, иммуноцитохимические исследования) позволили всесторонне изучить закономерности развития локальных нейронных сетей как сложной системы взаимосвязанных элементов. Впервые выявлено, что при развитии нейронных сетей in vitro наблюдаются те же основные закономерности развития, которые обнаружены другими авторами при развитии нейронных сетей в нативном мозге.
Впервые проведено изучение особенностей формирования нейронных сетей, полученных из культуры индуцированных плюрипотентных клеток, дифференцированных по дофаминергическому пути. Впервые проведено сравнение спонтанной биоэлектрической активности нейрональных культур, полученных из фибробластов здоровых доноров и больных с генетически детерминированными формами болезни Паркинсона.
В исследовании использованы усовершенствованные автором методы моделирования стресс-факторов, влияющих на структурно-функциональную целостность нейронных сетей. В работе впервые охарактеризованы различия в действии отдельных факторов ишемии (гипоксии и глюкозной депривации) на структурно-функциональную организацию нейронных сетей. Впервые выявлены эффекты ферментативной деградации внеклеточного матрикса мозга на функциональную активность сформированных нейронных сетей. Показано развитие характерной эпилептиформной спонтанной биоэлектрической и кальциевой активности. Впервые раскрыты молекулярно-рецепторные механизмы развития гиалуронидаза-индуцированной активности. Охарактеризованы основные особенности реакции нейронных сетей на воздействие стресс-факторов, влияющих как на жизнеспособность нейронов, так и на функционирование вспомогательных компонентов сети - астроцитов и внеклеточного матрикса.
Впервые исследована роль регуляторных молекул BDNF, GDNF, N-ADA как корректоров функциональной активности нейронных сетей в условиях действия стресс-факторов. Показана возможность регулирования процессов функциональной активности нейронных сетей при моделировании гипоксии. Доказаны антигипоксические и нейротропные свойства BDNF, GDNF, N-ADA, выявлены некоторые механизмы их действия.
Впервые показана возможность частичного восстановления функциональной активности структурно поврежденных нейронных сетей при аппликации нейротрофического фактора головного мозга (BDNF). При исследовании сетевой организации выявлены основные закономерности восстановления спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей после гибели части функционально активных нейронов при моделировании гипоксии in vitro.
Практическая и теоретическая значимость работы.
Полученные в работе данные о закономерностях структурно-функционального развития нейронных сетей гиппокампа in vitro расширяют
теоретические представления о функционировании головного мозга и подтверждают возможность использования диссоциированных культур клеток гиппокампа как модельных систем для изучения локальных сетей нейронов. Выявленные особенности функционирования нейронных сетей гиппокампа in vitro при моделировании стресс-факторов углубляют фундаментальные знания о механизмах развития стресс-реакций в центральной нервной системе. Показана возможность антигипоксического и нейротропного действия регуляторных молекул BDNF, GDNF и N-ADA. Раскрытие механизмов их действия позволяет выявить новые молекулярные мишени для разработки инновационных терапевтических подходов в коррекции нарушений работы центральной нервной системы. Разработана скрининговая биологическая модель нейронной сети in vitro для изучения механизмов действия любых фармакологических агентов, проходящих через гематоэнцефалический барьер, а также новых лекарственных средств, обладающих нейропротективным и нейротропным действием.
Положения, выносимые на защиту:
1. Закономерности развития нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа, полученных из эмбрионального материала (El8), соответствуют основным закономерностям развития нейронных сетей нативного мозга в раннем онтогенезе;
2. Нейронные сети, формирующиеся из индуцированных плюрипотентных клеток человека, дифференцированных по дофаминергическому пути, являются функционально неполноценными и не обладают стабильной спонтанной биоэлектрической активностью;
3. Ферментативное разрушение гиалуроновой кислоты - одного из основных структурных элементов внеклеточного матрикса вызывает стойкие изменения в показателях функциональной активности нейронных сетей диссоциированных культур гиппокампа. Формирующаяся эпилептиформная активность модифицируется при восстановлении внеклеточного матрикса и применении селективных блокаторов АМРА-рецепторов и потенциалзависимых кальциевых каналов L-типа;
4. Молекулы межклеточной сигнализации BDNF, GDNF и N-ADA являются компонентами эндогенной антигипоксической системы и могут предотвращать необратимые деструктивные изменения в структурно-функциональной организации нейронных сетей, вызванные гипоксическим воздействием.
5. Среди изучаемых молекул межклеточной сигнализации только нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) способен стимулировать восстановление функциональной активности нейронных сетей после повреждающего воздействия факторов ишемии (гипоксии и глюкозной депривации).
Внедрение результатов исследования.
Результаты исследования, а также разработанные и модифицированные методы и методические подходы внедрены в научно-исследовательскую работу Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России и Научно-исследовательского института «Институт живых систем» ННГУ им. Н.И.Лобачевского. Кроме того, результаты проведенных исследований внедрены в учебный процесс кафедры Нейродинамики и нейробиологии биологического факультета ННГУ им Н.И. Лобачевского.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2009), Всероссийской конференции «Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях» (Н.Новгород, 2009), Международном симпозиуме "Topical Problems of Biophotonics — 2009" (H. Новгород, 2009), Объединенном симпозиуме на Международном семинаре по нелинейной динамике в биологических системах и биофизики мягкой материи (Тайвань, Тайпей, 2009), XV Международной конференции по нейрокибернетике (Ростов-на-Дону, 2009), XIV и X сессиях молодых ученых и студентов «Современные решения актуальных научных проблем в медицине» (Н.Новгород, 2009,2011), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва-Калуга, 2010), Седьмом международном форуме по нейронауке FENS-2010 (Амстердам, 2010), Международной конференции «Фундаментальные проблемы оптики» (Санкт-Петербург, 2010), Седьмом международном междисциплинарном конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2011), Всероссийской молодежной конференции - школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011,
2013), Третьем международном симпозиуме Topical Problems of Biophotonics (Санкт-Петербург, 2011), Восьмом международном форуме по нейронауке FENS-2012 (Барселона, 2012), IV Съезде биофизиков России (Н.Новгород, 2012), IX международном конгрессе Международной Ассоциации Травмы мозга (Эдинбург, 2012), IV Международном симпозиуме Topical Problems of Biophotonics - 2013 (Н.Новгород, 2013), XXII Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), Восьмом международном симпозиуме по нейропротекции и нейровосстановлению (Магдебург, 2014), Международной научной школе «Горизонты современной нейронауки» (Н.Новгород, 2014), Международном конгрессе по нейронаукам (Красноярск, 2014), Девятом международном форуме по нейронауке FENS-2014 (Милан, 2014), Десятом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак,
2014), Симпозиуме «Новейшие методы клеточных технологий в медицине» (Новосибирск, 2014), Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2014).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 83 научные работы. Из них 20 статей в российских и зарубежных журналах (18 - статей в журналах из списка РИНЦ, 11 статей в ведущих рецензируемых научных изданиях, индексируемых в системах цитирования Scopus, 9 публикаций в ведущих рецензируемых научных изданиях, индексируемых в системах цитирования Web of Science), 55 тезисов докладов на международных, российских и региональных конференциях. Получены 2 Патента на изобретение, 1 программа для ЭВМ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, включающего 598 источников. Работа иллюстрирована 91 рисунками и 10 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследований in vitro послужили культуры диссоциированных клеток гиппокампа, полученные от 18 дневных мышиных эмбрионов линии C57BL/6 и культуры индуцированных плюрипотентных клеток человека. Всего в экспериментах было использовано 938 первичных культур гиппокампа мыши и 77 культур индуцированных плюрипотентных клеток человека.
В опытах in vivo использовались четырехнедельные самцы мышей линии C57BL/6 в количестве 216 особей, массой 16-18 грамм. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 708н от 23.08.10 «Об утверждении Правил лабораторной практики» и были согласованы с этическим комитетом при ГБОУ ВПО НижГМА Минздравсоцразвития России.
Культивирование первичных диссоциированных клеток гиппокампа. Диссоциирование нервных клеток достигалось путем обработки ткани гиппокампа 0,25% трипсином (Gibco). Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде Neurobasal™ (Invitrogen) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen), глутамином (Invitrogen), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко) и культивировали, согласно ранее разработанному протоколу (Мухина И.В. и др., 2009), в течение 28 дней in vitro (DIV) на мультиэлектродных матрицах систем МЕА60 (Multichannel Systems, Германия) и MED64 (AlfaMed Science, Япония). Для исследования кальциевой активности и иммуноцитохимических исследований посадка культур проводилась на покровные стекла размером 18x18 мм, для оценки жизнеспособности посадка культур проводилась на 48-луночные планшеты (Costar). Исходная плотность культур на матрицах составляла 9000 кл./мм2. Жизнеспособность культур поддерживалась в С02-инкубаторе при температуре 35,5°С и газовой смеси, содержащей 5% С02.
Культивирование индуцированных плюрипотентных клеток человека. Исследовались индуцированные плюрипотентные клетки нескольких клеточных линий (iPS): человеческие iPS клетки, полученные из фибробластов кожи здоровых доноров (линия ipsl2 линия) (Lagarkova et. al., 2010) и доноров с болезнью Паркинсона (линия Ку Парк) (Некрасов Е.Д и др., 2011). Клеточные линии индуцированных плюрипотентных клеток и их последующая дифференцировка были получены сотрудниками института Общей Генетики им. Н.И.Вавилова РАН (Москва) (Лагарькова М.А., Киселев С.Л. и др., 2010-2012). Культивирование нейросфер, содержащих iPS, осуществлялось в 48-луночном планшете с антиадгезивным покрытием. Для поддержания прогениторности клетки культивировались в среде DMEM/F12 (Sigma), с добавлением N2 (Invitrogen), глутамина (Sigma), антибиотика (гентамицин), 20 нг/мл EGF (Invitrogen) и 10 нг/мл bFGF (Sigma). Поддержание жизнеспособности культуры осуществлялось в условиях С02 инкубатора.
Для исследования спонтанной биоэлектрической активности клетки в виде нейросфер пересаживались на мультиэлектродные матрицы или стекла, предварительно покрытые адгезирующим субстратом. После пересадки клетки культивировались в среде NBM (Invitrogen), содержащей добавку В27 (Invitrogen), глутамин (Sigma), антибиотик (гентамицин), 2 нг/мл GDNF (PeproTech) и 2 нг/мл BDNF (PeproTech). Поддержание жизнеспособности культуры в течение двух недель осуществлялось в условиях С02 инкубатора.
Регистрация и анализ спонтанной биоэлектрической активности культур диссоциированных клеток гиппокампа. Спонтанную биоэлектрическую активность нейронов регистрировали с помощью мультиэлектродных систем MED64 (Alfa Med Science, Япония), и МЕА60 (Multichannel Systems, Германия). Исследовали следующие параметры спонтанной биоэлектрической активности: количество малых сетевых пачек; количество спайков в малой сетевой пачке, длительность малой сетевой пачки. Критерием малой сетевой пачки являлось наличие спайков минимум на 4-х различных электродах матрицы с межспайковым интервалом не более 100 мс. Для получения и анализа данных использовался набор программного обеспечения Conductor™ (Alpha Med Science, Япония) и MC Rack , а также разработанный в программной среде Matlab оригинальный пакет алгоритмов Meaman.
Функциональный кальциевый имиджинг. Для имиджинговых исследований функциональной активности по параметру изменения концентрации внутриклеточного кальция, отражающих состояние кальциевого гомеостаза клеток, использовался лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 510 (Zeiss, Германия). В качестве флуоресцентного зонда был выбран специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 ВАРТА-1 AM (OGB1) (Invitrogen). Излучение флуоресценции разделялось по каналам регистрации с помощью дихроичных зеркал и светофильтров с полосой пропускания 500-530 нм для выделения флуоресценции OGB1. Регистрировались временные серии изображений поля флуоресценции красителя. Выделение кальциевых осцилляций, полученных при помощи флуоресцентной конфокальной микроскопии, проводили с помощью оригинального программного пакета «Astroscanner». Анализировались записи функции F(t) средней интенсивности флуоресценции OGB1 выделенной области поля (совпадающей, как правило, с телом или частью отростка клетки) от времени. Для определения времени начала (Tstart) и конца (Tend) осцилляции был взят порог отклонения от среднего значения в размере стандартной квадратичной ошибки F(t). Учитывались следующие параметры: общая длительность осцилляции и частота осцилляций, процент работающих клеток.
Иммуноцитохимическое маркирование клеточных структур. Для маркирования структуры нейронной сети, выраженности рецепторов использовалось иммуноцитохимическое окрашивание. После 15 минутной фиксации в 4% параформальдегиде культуры трижды отмывались фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) (Sigma), затем в течение 30 минут проводилась демаскирование антигенов 0,03% раствором ТритонаХЮО (Sigma). После демаскировки культуры в течение 2 часов инкубировались во влажной камере с раствором первичных антител с 1% бычьим сывороточным альбумином при комнатной температуре. Затем после трехкратной промывки PBS культуры в течение 2 часов инкубировались с раствором вторичных антител с 5% бычьим сывороточным альбумином во влажной камере. После отмывки вторичных антител, стекла заключали в среду для флуоресцентной иммуноцитохимии, проводилась визуализация полученных результатов. Для трехцветного окрашивания использовали вторичные антитела, конъюгированные с Alexa 647, Alexa 555, Alexa 430. Двухцветное окрашивание проводили с любой попарной комбинацией флуорохромов. Для визуализации использовался конфокальный микроскоп Zeiss LSM 510 (Zeiss, Германия) (Иммуноцитохимические методы..., 2011).
Для анализа полученных изображений использовали программу ImageJ (Wayne Rasband (NIH)) (анализ распределения каннабиноидных рецепторов первого и второго типа) и Cellscan, созданной в программной среде MatLab (автор Пимашкин A.C.) (анализ распределения аггрекана и TrkB).
Электронно -микроскопический метод исследования ультраструктуры диссоциированных культур. Обработка ткани проводилась по стандартной методике. В качестве фиксаторов использовали последовательно 2,5% раствор глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) и 1% раствор четырехокиси осмия. Материал обезвоживали в спиртах восходящей концентрации. Обработанную ткань заключали в смесь ЭПОН-АРАЛДИТ (Саркисов, 1996). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме ULTRACUT (Reichert-yung). Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по методу Reynolds. Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FIE, США).
Биохимические методы исследования. Метаболические показатели жизнедеятельности клеток (глюкоза, лактат) определялись в культуральной среде с помощью диагностических наборов Vital Diagnostic (Санкт-Петербург). Измерение оптической плотности производилось на планшетном спектрофотометре Synergy MX (BioTek, США).
Оценка жизнеспособности клеток в диссоциированных культурах. Для изучения показателя жизнеспособности диссоциированных культур гиппокампа при моделировании стресс-условий проводилась окраска клеточных культур пропидий иодидом (Sigma) и бис-бензимидом (Sigma) с целью обнаружения ядер погибших клеток и общего количества клеток в диссоциированной культуре соответственно. Визуализация окрашенных клеток проводилась с помощью инвертированного микроскопа Leica DMIL HC (Leica, Германия). Осуществлялся подсчет числа клеточных ядер, окрашенных пропидий иодидом и ядер, окрашенных бис-бензимидом. Количество живых клеток рассчитывалось как процентное соотношение между бис-бензимид позитивными и пропидий иодид позитивными клетками.
Моделирование нормобарической гипоксии in vitro проводилось путем замены нормоксической культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода в течение 10 минут. Опытной группе за 20 минут до гипоксии в культуральную среду добавляли растворы факторов внеклеточной сигнализации (BDNF, GDNF, N-ADA). В контрольную группу вошли культуры, которым гипоксия проводилась без превентивного добавления факторов. Для получения культуральной среды с обедненным содержанием кислорода использовался герметичный сосуд, в котором воздух был замещен на инертный газ - аргон. Для определения эффективности вытеснения кислорода из культуральной среды использовалась методика йодометрического титрования определения концентрации растворенного кислорода (Лурье, 1973). Поскольку в среде содержится ph-зависимый краситель, конечную точку титрования определяли с помощью планшетного спектрофотометра Synergy MX (BioTek, США).
Моделирование глюкозной депривации (ГД) in vitro проводили путем замены культуральной среды на среду, не содержащую глюкозу, пируват и лактат. В исследовании использовалась специально разработанная среда, соответствующая по составу среды Neurobasal, но не содержащая перечисленных энергетических субстратов. Разработка среды осуществлялась по данным литературы и прописи
Neurobasal Medium (Invitrogen). Приготовление среды осуществлялась по заказу научно-исследовательским отделом ПанЭко (Россия).
Моделирование нарушений структуры внеклеточного матрикса. В опытной группе в культуральную среду однократно на 17-й день развития in vitro вносили 75 ЕД/мл гиалуронидазы (Streptomyces hyalurolyticus, Sigma). Через сутки после добавления фермента проводили смену культуральной среды с заменой 50% ее объема. Непосредственно перед использованием, фермент растворяли в PBS. В контрольных группах в среду культивирования добавляли равное по объему количество PBS или инактивированного 30-минутным кипячением при нормальном атмосферном давлении фермента. Для сравнительной оценки биоэлектрической активности, вызванной гиалуронидазой, использовали блокатор калиевых каналов - 4-аминопиридин (4-АР, Sigma), 50 мкмоль, вызывающий эпилептоподобную активность in vivo и in vitro. Для изучения механизмов модулирующего действия гиалуронидазы на синаптическую передачу в нейронных сетях культуры гиппокампа применяли фармакологический анализ, включающий изучение действия блокатора потенциалзависимых кальциевых каналов L-типа (L-VGCC) - дилтиазема, 10 мкмоль (Sigma), 6-циано-7-нитрокино-ксалин-2,3-диона (CNQX), 10 мкмоль (Sigma) как антагониста АМРА-рецепторов и 3-(2-карбоксипиперазин-4-ил)пропил-1-фосфорной кислоты (СРР), 10 мкмоль (Sigma) как конкурентного антагониста NMDA-рецепторов.
Моделирование острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) in vivo. Для моделирования острой гипобарической гипоксии использовалась вакуумная проточная барокамера при внешней температуре 20—22°С. Мыши помещались в условия, соответствующие подъему на высоту 10000—10500 м со скоростью 183 м/с (Методические рекомендации, под ред. Лукьяновой Л.Д., 1990).
Регистрируемыми параметрами являлись: время жизни на «смертельной площадке» (Тж, мин); время потери позы (Тпп, мин); время восстановления позы (Твп, мин); выживаемость (Вж,), устойчивость (%).
Водный лабиринт Морриса. Лабиринт представляет собой циркулярный бассейн (диаметром 90 см), заполненный непрозрачной водой, в которую погружена небольшая платформа (диаметром 10 см), не видимая животному. Протокол теста состоял из пяти сеансов обучения, по пять попыток в каждом с промежутком в 48 часов. Помещение животных с края бассейна проводилось в одном и том же секторе лабиринта, выбранного случайным образом. Расположение платформы было стационарным и находилось в противоположном от запуска животного секторе на границе зоны тигмотаксиса. Максимальная длительность первого сеанса составляла 90с. После обнаружения платформы, животное находилось на ней 30с. Последующие 4 сеанса по продолжительности составляли 60с. Через 24 часа после воздействия острой гипобарической гипоксии проводилось тестирование на сохранение долговременной памяти, включающее в себя попытку длительностью 60с при отсутствии платформы в бассейне. Определяли отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти (оКс) -доля времени пребывания мыши в квадранте, где находилась платформа, по отношению к общему времени пребывания мыши в лабиринте (D'Hooge R. and De Deyn P.P., 2001).
Методы статистической обработки результатов. Полученные результаты in vivo и in vitro обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel, и SigmaPlot 11.0. Данные представлены в
форме "среднее значение ± стандартная ошибка среднего". Проверка гипотезы о нормальном распределении проводилась с применением критерия Пирсона, который не зависит ни от вида распределения случайной величины, ни от ее размерности. Достоверность статистических различий выборок, имеющих нормальное распределение, проверялась с помощью t-теста Стьюдента. Различия между выборками, имеющими распределение, отличающееся от нормального, оценивались с использованием непараметрических критериев в программе SigmaPlot 11.0, либо с использованием программного обеспечения ANO VA. Различия между выборками считались статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование основных закономерностей развития нейронных сетей первичных культур in vitro. На первом этапе исследований были изучены изменения структуры первичных культур гиппокампа в процессе формирования и развития нейронных сетей (рис. 1). Проведенные исследования показали, что развитие нейронных сетей in vitro представляет собой сложный многоэтапный процесс, связанный как со структурными, так и с функциональными перестройками.
Рисунок 1. Микрофотографии культуры диссоциированных клеток гиппокампа.
Размер ячейки - 200x200 мкм
Стадии развития функциональной активности клеток совпадают со стадиями развития синаптических контактов и метаболическими изменениями. В процессе развития нейронных сетей in vitro можно выделить несколько критических генетически детерминированных этапов. Первый этап (0-7 день развития in vitro) - формирование сетевой структуры и случайных (не специфических) клеточных контактов. В этот период клетки активно двигаются (рис. 2), изменение направления движения клеток, может свидетельствовать о решающей роли внеклеточной сигнализации в данном процессе. На 3-5 день развития в первичной диссоциированной культуре наблюдаются единичные спайки импульсов и несинхронные слабовыраженные кальциевые осцилляции. Таким образом, можно говорить о том, что в данный период сетевая структура отсутствует. Формируются
сложные нейрон-нейронные и нейрон-глиальные взаимодействия. Глиальные клетки имеют вытянутую форму, что, по всей видимости, связано с активном участием глии в перемещении клеток (рис. 3). Функциональная активность в данный период не стабильна, несмотря на большое число нейронов в культуре, связанных щелевиднымн контактами, сетевая активность не зафиксирована.
> I I*
2Qjvim
. Перемещение
Рисунок. 2. Перемещение клеток в диссоциированной культуре гиппокампа в процессе развития морфофункциональной структуры: А - зависимость средней скорости перемещения тел клеток гиппокампа от времени культивирования in vitro; Б - траектория перемещения клеток первичных культур гиппокампа в первые шесть суток развития in vitro на произвольно выбранном участке. Цифрами I и VI обозначены места положения тела клетки в 1 и 6 сутки культивирования.
Второй этап (7-14 день развития in vitro) - формирование функциональной структуры. В данный период движение клеток ограничено наличием огромного числа связей между клетками и развитием внеклеточного матрикса (рис.4). Начиная с 7 дня развития in vitro, в культуре наблюдается постепенное становление сетевой биоэлектрической и кальциевой активности (рис. 5). Глиальные клетки приобретают характерную распластанную форму, что может быть связано со стабилизацией нейрон-глиальных взаимоотношений и утратой функций радиального направления нейронов. Формирующиеся нейрон-глиальные взаимодействия объединяют культуру в единую метаболическую и функциональную сеть. Интересно отметить, что 10-й день развития in vitro является переломным моментом формирования нейронной сети. Это проявляется как в электрических, так и в метаболических показателях. В этот период происходит отмирание большей части функционально не востребованных нейронов.
Третий этап (14-21 день развития) - стабилизация функциональных связей в нейронной сети. В данный период морфологические и метаболические связи стабильны. Идет усложнение структуры синапсов и функциональной сетевой структуры. 14-16 день характеризуется появлением аксошипиковых зрелых контактов, в том числе перфорированных синапсов (рис.6), усложнением рисунка пачечной активности сети в виде сложных пачек и повышением частоты единичных Са2+-осцилляций (рис.7). К 21-28 дню культура достигает стабильного состояния. На этом этапе доминируют зрелые синаптические контакты, сложные инвертированные пачки и кальциевые суперосцилляции. Все это свидетельствует о формировании морфофункциональной зрелой нейронной сети. Последующее
развитие культуры гиппокампа характеризуется стабильностью функциональной активности, появлением более сложных форм синапсов (перфорированные, конвергентные и дивергентные) (рис.6). В таком стабильном состоянии нейронная сеть и вся культура может находиться достаточно долго (в условиях хронического эксперимента доказана возможность культивирования вплоть до 287 дня развития in vitro).
Рисунок 3. Иммуноцитохимическое исследование структуры первичных диссоциированных культур гиппокампа на 5-й (а, б, в), 10-й (г, д, е), 14-й (ж, з, и) день развития in vitro
В результате проведенных нами исследований показано, что нейронные сети первичных культур клеток гиппокампа являются адекватной моделью нейронных сетей головного мозга и обладают не только морфологическими, но и всеми функциональными признаками нейронных сетей головного мозга. Развитие молекулярной биологии делает возможным получение культуры человеческих нейронов от доноров и пациентов, страдающих генетически-детерминированными патологиями. Представляет интерес возможность исследования процессов формирования и особенностей функционирования нейронных сетей, полученных из человеческих фибробластов.
3 б 9 12 15 17 19 20 24 26 29 32
День развития in vitro
Рисунок 4. Процент аггрекан-положительных клеток в диссоциированной культуре гиппокампа на разных сроках развития in vitro
А.
g ^ 3000 1= 2000 1'! 1000
1 § 20 | |
1 Ё 10
# *
10 15 20 25 День развития In vitro
*
L
10 15 20 25 30 День развития In vitro
5 10 15 20 25 30
День рвзантпл In Wiro
Рисунок 5. Изменение показателей спонтанной биоэлектрической активности нейронной сети в зависимости от дня развития диссоциированной культуры: А -межпачечный интервал, Б - количество спайков в пачке, В - длительность пачки, Г — средняя частота спайков в пачке. * - статистически значимое отличие с 5 днем развития in vitro (р <0,05, критерий Уилкоксона)
Рисунок 6. Электронно-микроскопические изображения первичных культур гиппокампа на 5 (а, б), 7 (в, г), 14 (д), 21 (е) и 30 (ж, з) день развития культуры in vitro, а - сома-соматический симметричный контакт, б - аксо-аксональный симметричный контакт, в - смешанный аксо-аксональный контакт, сочетающий в себе десмосому и ассиметричный контакт, г - аксо-дендритный десмосовидный контакт, синаптические везикулы не подходят к пресинаптическому уплотнению синапса, д - аксо-шипиковый перфорированный и аксо-дендритный синапсы, е -аксо-дендритный ассиметричный конвергентный контакт, ж - аксо-шипиковый ассиметричный контакт, з - перфорированный аксо-дендритный ассиметричный синапс. Обозначения: стрелка - контакт; псевдоцвета: зеленый - аксон, синий -дендрит, розовый - дендритный шипик, желтый - сома, оранжевый - ядро. Масштаб: 0,5
I
О, п
7 10 14 21 30
День развития ¡п vltro
Б.
0,40 0.350,30 0.250.20 0.15 0,10 0,05 0,00
п.П.О
7 10 14 21 3
День развития 1п уНго
□ Средние осцилляции □ Суперосцилляции в Осцилляции внутри суперосцилляций
Рисунок 7. Показатели функциональной кальциевой активности на разных этапах развития диссоциированной культуры гиппокампа: А - длительность Са2+ осцилляций; Б - частота Са2* осцилляции суперосцилляций, В - процент клеток, проявляющих спонтанную кальциевую активность.* - статистически значимое отличие, р <0,05, **- статистически значимое отличие, р <0,01 (критерий Манна Уитни)
Исследование нейронных сетей, формирующихся в культуре индуцированных плюрипотентных клеток человека, дифференцированных по нейрональному пути, показали возможность возникновения функционально нестабильных нейронных сетей (рис.8). Спонтанная биоэлектрическая активность появлялась в течение первой недели, в среднем через 3-5 суток культивирования. К 8-10 дню появляется несетевая пачечная активность. Не выявлено стабилизации показателей спонтанной биоэлектрической активности при долговременном культивировании. Это, возможно, связано с неполноценностью клеточного состава формирующихся сетей. Задачей исследования являлось не только изучение возможности формирования функциональных нейронных сетей, но и изучение особенностей системной организации нейронных сетей с генетически-детерминированным дефектом. В качестве примера подобных сетей была выбрана модель нейронных сетей, формирующихся из индуцированных по
дофаминергическому пути. Генетически-детерминированная форма болезни Паркинеона связана с гибелью части дофаминергических нейронов и, по всей видимости, с реорганизацией функциональной активности нейронных сетей на системном уровне. Показано, что дифференцированные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки больного болезнью Паркинеона в культуре активно взаимодействуют друг с другом, формируя структурную сеть. Данная сеть динамична, поскольку постоянно происходит перемещение клеток в пространстве, происходит как формирование новых связей, так и разрыв старых. Стабилизация морфофункциональной структуры нейронных сетей не происходит. Наши исследования не выявили особенностей развития спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей, полученных от здоровых доноров и людей с генетически-детерминированным вариантом болезни Паркинеона.
Рисунок 8. Спонтанная биоэлектрическая активность культуры индуцированных плюрипотентных клеток человека, полученных из фибробластов кожи больных болезнью Паркинеона (10 день культивирования): А - регистрация активности с 60 электродов; Б - морфология культуры; В - регистрация мини-пачек с одного электрода
Проведенные исследования показали, что в культурах нейронов индуцированных плюрипотентных клеток человека дифференцированных по дофаминергическому пути не обнаружены стабильные функционально активные нейронные сети. Однако, представляет особый интерес изучение закономерностей реорганизации функциональной активности нейронных сетей головного мозга при действии стресс-факторов. Таким образом, дальнейшее исследование возможности реорганизации нейросетевой активности проводили на модели первичных культур клеток гиппокампа.
Изучение влияния стресс-факторов на функциональное состояние нейронных сетей. Морфофункциональная целостность нейронной сети зависит от ряда факторов. Согласно современным представлениям работа нейронной сети определяется не только наличием сложно устроенной, функционально-гетерогенной совокупности связанных нейронов, но и присутствием дополнительных компонентов - астроцитов и внеклеточного матрикса. Астроциты активно участвуют в метаболизме нейронов и передаче нервного импульса за счет поглощения нейромедиаторов и перераспределения потоков питательных веществ.
Внеклеточный матрике обеспечивает стабилизацию синаптических контактов и участвует в гомеостатической пластичности функциональных связей между нейронами. В связи с этим, для исследования особенностей функционирования нейронных сетей в условиях лимитирующих факторов нами выбраны разнонаправленные по действию стресс-факторы.
Факторы ишемии (гипоксия и глюкозной депривация) вызывают гибель части функционально активных нейронов и необратимые изменения спонтанной биоэлектрической активности. Нейроны - наиболее чувствительные к гипоксии клетки, глюкозная депривация вызывает нарушения в работе мембранных обменников глюкозы и лактата.
Исследование спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей культур диссоциированных клеток гиппокампа показало достоверные изменения как в процессе моделирования глюкозной депривации, так и после нее. В течение первых пяти минут глюкозной депривации количество пачек увеличевается более чем в 2 раза по сравнению с исходным уровнем, одновременно наблюдается достоверное снижение числа спайков в пачке (рис. 9) и увеличение длительности пачки. Под воздействием глюкозной депривации происходит резкое уменьшение количества спайков в пачке. После первых пяти минут глюкозной депривации этот показатель уменьшается в 6 раз по сравнению с исходным уровнем, через 30 минут глюкозной депривации снижается в 30 раз и более чем в 50 раз через 60 минут голодания. Через 2 часа депривации наблюдается элиминация электрической активности. На протяжении 7 суток после глюкозной депрвации количество сетевых пачек импульсов велико, при этом количество спайков в сетевых пачках импульсов остается небольшим (рис.10). Наблюдается полное разобщение сетевой активности, тенденции к восстановлению спонтаной биоэлектрической активности не обнаружено.
А.= зоо
S 250
* 200
л se
¡I 150.
ш
S loo
I 60 0.
Интактные культуры опытные культуры Интактные культуры опытные культуры
Рисунок 9. Спонтанная биоэлектрическая активность диссоциированной культуры гиппокампа в течение долговременной (120 минут) глюкозной депривации: А -количество малых сетевых пачек в минуту; Б - количество спайков в секунду. * -статистически значимое отличие с исходным уровнем, # - статистически значимое отличие с контролем (р <0,05, критерий Уилкоксона)
После глюкозной депривации сетевая пачечная активность регистрируется на 30% электродов. Наблюдается большое количество нескоординированных спайков. Изменяется патерн спонтанной биоэлектрической активности, исчезают синхронные пачки с характерным профилем активности, начинают преобладать низкосинхронизированные пачки без четкой структуры.
до ГД 5_30 60_90 1201
Глюкозная депривация Время, минуты
до ГД [__5_30 60_90 120|
Глюкозная депривация время, минуты
Изучение показателей функционального кальциевого имиджинга нейронных сетей показало, что глюкозная депривация вызывает элиминацию спонтанной кальциевой активности нейронов. Паттерн спонтанной активности, регистрируемый с помощью конфокальной микроскопии, изменялся за счет постепенного снижения частоты кальциевых осцилляций. В зависимости от исходной активности культуры к 80-120 минуте ГД в сети полностью прекращалась кальциевая активность. Исследование жизнеспособности клеток в культуре показало достоверное увеличение мертвых клеток через 3 суток после глюкозной депривации (контроль 3,34±2,48%, глюкозная депривация 19,98±4,67%).
После ГД После ГД
Рисунок 10. Изменение биоэлектрических показателей под влиянием двухчасовой глюкозной депривации: А - количество сетевых пачек импульсов; Б- количество спайков в пачке импульсов. * - статистически значимое отличие с исходным уровнем (до ГД) (р<0,01, ANO VA)
При исследовании влияния гипоксии на показатели функциональной активности показано, что начиная со второй минуты наблюдается угнетение спонтанной биоэлектрической активности (рис. 11). Через 3 мин гипоксии мультиэлектродной матрицей в контрольной серии регистрируются в основном отдельные электрического события (малые сетевые пачки или отдельные спайки).
Исследование паттерна спонтанной активности показало, что гипоксическое воздействие не только снижает основные биоэлектрические показатели в отдаленном постгипоксическом периоде (количество спайков за 50 мс уменьшается через 7 дней после гипоксии в среднем в 2 раза (р<0,05) (рис.12), но и изменяет функциональные характеристики сетевой пачки импульсов, что регистрируется в виде изменения паттерна активации сетевой пачки. Известно, что паттерн активации является параметром, отражающим индивидуальную структуру нейронной сети.
Исследование функциональной кальциевой активности показало, что гипоксия существенно меняет показатели спонтанной кальциевой активности. В исходном состоянии в диссоциированных культурах гиппокампа наблюдается синхронизованная спонтанная кальциевая активность, частота возникновения кальциевых осцилляций в нейронной сети составляла 6,83±1,78 осцилляций в минуту. При замене нормоксической культуральной среды на среду с низким
содержанием кислорода наблюдается снижение спонтанной кальциевой активности клеток гиппокампа вплоть до полного ее исчезновения (рис. 13).
123456789 10
Время, мин
Нормоксия -о-Гипоксия
Время, мин
-»-Нормоксия -о-Гипоксия
Рисунок 11. Спонтанная биоэлектрическая активность диссоциированной культуры гиппокампа в течение 10 минут гипоксии (0,37 мл/л 02 в культуральной среде). А -количество малых сетевых пачек в минуту; Б - количество спайков в секунду. * -статистически значимое отличие с исходным уровнем, # - статистически значимое отличие с группой «Нормоксия» (р<0,05, АЫОУА)
Б.
& £
У 2(Ю
ж
Рисунок 12. Количество спайков за 50 мс (сверху) и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности диссоциированной культуры гиппокампа (снизу). А -активность культуры до гипоксии; Б - активность культуры через 24 часа после моделирования нормобарической гипоксии; В - активность культуры через 7 дней после моделирования нормобарической гипоксии
Т, мин
Т, мин
Т, мин
Исходная активность Гипоксия Реоксигенация
Рисунок 13. Растровая диаграмма Са2+ осцилляций в культуре клеток гиппокампа при моделировании гипоксии. Моменты возникновения кальциевых осцилляций отмечены точками.
Активность сохраняли всего 5,01±1,84% изначально работающих клеток. После реоксигенации активность возобновлялась, однако частота кальциевых импульсов достоверно (р<0,05) ниже, чем до гипоксического воздействия. Морфологические изменения, возникающие при моделировании гипоксии и глюкозной депривации, схожи и имеют одинаковые временные закономерности. Однако, морфологические исследования показали, что количество некротизированных клеток через 7 день после моделирования глюкозной депривации больше, чем после моделирования нормобарической гипоксии. При иммуноцитохимическом маркировании основных белков цитоскелета нейронов (MAP) и астроцитов (GFAP) обнаружено, что уже через сутки после моделирования факторов ишемии наблюдается частичная редукция отростков нейронов (дендритов), которая продолжается как минимум в течение 7 дней (рис.14). Особый интерес представляет изучение изменения морфологии астроцитов. Через сутки после моделирования нормобарической гипоксии происходит изменение формы и расположения астроцитов. Начинается вытягивание астроцитарных элементов, при этом астроциты объединяются в единые морфологически неразделимые образования. Через 7 дней после моделирования гипоксии в культуре обнаруживаются глиальные тяжи, в структуре которых невозможно различить отдельные клетки.
Обнаружены схожие закономерности деградации нейронных сетей при моделировании гипоксии и глюкозной депривации. Механизм действия глюкозной депривации связан не только с непосредственным действием на нейроны, но и с разобщением глутамат-зависимых потоков энергии между нейроном и астроцитом. Влияние глюкозной депривации во многом определяется временем воздействия. Кратковременная глюкозная депривация может рассматриваться как фактор прекондиционирования. Эффект, оказываемый гипоксией, связан с разобщением окислительного фосфорилирования активацией свободно-радикальных процессов и, как следствием, запуском сигнальных путей, связанных с гибелью клетки.
Рисунок 14. Морфология диссоциированной культуры гиппокампа через 7 дней после моделирования нормобарической гипоксии. Красный (А,Б) - маркер зрелых нейронов (МАР2), синий (В,Г) - глиальный фибриллярный кислый белок (ОБАР). А,В - контроль, Б,Г - культуры, перенесшие гипоксию. Масштаб 20 мкм
Для изучения роли внеклеточного матрикса в функционировании нейронных сетей первичных диссоциированных культур гиппокампа была исследована морфология аггрекан-положительных перинейрональных сетей (аггрекан - один из основных белковых компонентов перинейрональных сетей мозга). На 17 день развития в культуре зафиксировано 76,03±5,13% аггрекан-положительных нейронов. Однократное добавление гиалуронидазы (75 ЕД/мл) в среду вызывало разрушение перинейрональных сетей (рис. 15).
Через 2 дня после воздействия гиалуронидазы в культуре зафиксировано достоверное (р=0,001) снижение количества нейронов, окруженных аггрекан-положительной перинейрональной сетью. Количество нейронов, сохраняющих перинейрональные сети после обработки гиалуронидазой, составляет 11,6 ± 1,34 %. Исследования морфологии перинейрональных сетей в течение 9 дней после обработки показало, что количество аггрекан-положительных нейронов не восстанавливается в течение выбранного периода наблюдения. Однако, обнаружено достоверное (р<0,05) увеличение аггрекан-положительных нейронов на 9 день после воздействия гиалуронидазы.
Разрушение с помощью гиалуронидазы перинейрональных сетей приводит к изменению нативной функциональной активности нейронных сетей первичных культур гиппокампа. Характерно появление суперпачек (длительность 25-35 с) (рис. 16) и суперосциляций (рис.17) с длительными периодами «молчания»
(полного отсутствие спайков, сетевых пачек или осцилляций). Изменения, возникающие при разрушении внеклеточного матрикса стабильны, но нивелируются в течение времени, что связано с частичным восстановлением внеклеточного матрикса (рис.17).
• МАР2! ■ fi \; Aggrecan ч . /. - V merge
У \ г -: JJ ■ и , .ч- "■ .. i К Yf v / V
• /..• 'ЧД. у V- \ , Vj
К -у - V
X ." v. Л"- ■■'.'-л....
fr Л - ' V . • —л-
В МАР2 Aggrecan Merge ■ . v ; • "к.
С МАР2 V А f : > ■ Aggrecan vrl' ' - Я • V Merge •f \/; * ь . У К" W *> • ; - 1
Рисунок 15. Иммуноцитохимическое маркирование аггрекан-положительных перинейрональных сетей А - контроль, Б - через 2 дня после обработки гиапуронидазой (75 Ед/мл), В - через 9 дней после обработки гиалуронидазой (75 Ед/мл). Масштаб 20 мкм
Д ЮшУ
--""'I 11' | 1 *—..... > 1 1 \
-О.ЮтУ-!---
0> 51 101 151 20» 25> 301 3!
^ 10mV О OOmV
-О 10mV
Oi Si 10i 15i 20s 25s 30s 31
Рисунок 16. Характерный пример спонтанной биоэлектрической активности диссоциированной культуры гиппокампа: А - 17 день развития in vitro, (Б) через 48 часов после аппликации гиалуронидазы
гиалуронидаза, период после аппликации
48 чаше 72 часа
гиалуронидаза,
- период после
аппликации
Рисунок 17. Показатели спонтанной кальциевой активности диссоциированных культур гиппокампа после воздействия гиапуронидазы (75 Ед.): А - длительность кальциевых осцилляций после аппликации гиапуронидазы 75 Ед/мл; Б - число кальциевых осцилляций за 30 с; * - статистически значимое отличие с группой «Контроль (PBS)», р<0,05, ANOVA
Гиалуронидаза-индуцированная активность распадается при блокаде АМРА-рецепторов и нормализуется при блокаде кальциевых каналов L-типа. Это может быть связано с тем, что внеклеточный матрикс тормозит пересинатическую транслокацию АМРА-рецепторов (Frischknechtetal.,2009). Нарушение в структуре внеклеточного матрикса, вызванное действием гиапуронидазы, нарушает баланс между возбуждением и торможением в сторону возбуждения, что может рассматриваться как одна из причин развития эпилептоподобной активности.
Для выявления механизмов формирования гиалуронидаза-индуцированной активности нами был проведен фармакологический анализ с использованием блокаторов ионных каналов и антагонистов глутаматергических рецепторов. Показано, что гиалуронидаза-индуцированная активность не изменялась при блокаде NMDA-рецепторов конкурентным антагонистом СРР (10 мкМ), но блокировалась антагонистом АМРА-рецепторов (CNQX, 10 мкМ) и блокатором L-VGCC дилтиаземом (20мкМ). Таким образом, гиалуронидаза-индуцированная активность связана с работой АМРА рецепторов и кальциевых каналов L-типа.
Показано, что гипоксия и глюкозная депривация вызывают однонаправленные необратимые изменения в функциональной активности нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа. Гибель части функционально значимых нейронов ведет к реорганизации нейронной сети и упрощению ее структуры. Ферментативное деструкция компонентов внеклеточного матрикса вызывает гомеостатические изменения, не связанные с гибелью значимой части клеток культуры. Дальнейшие наши исследования были связаны с оценкой эффективности превентивного действия различных компонентов эндогенной компенсаторной системы клеток головного мозга.
Исследование нейротропного и антигипоксического действия факторов межклеточной сигнализации. Развитие и функционирование нейронных сетей опосредована действием факторов, которые определяют способность к гомеостатической регуляции в условиях стресса (Turrigiano, Nelson, 2004). Основой сохранения функциональной целостности нейронной сети в условиях стресса является сбалансированность системы регуляции жизнедеятельности клеточных
элементов. Пусковым механизмом огромного числа патологических состояний ЦНС является увеличение выброса глутамата и, как следствие, увеличение концентрации кальция в постсинаптической терминали (Moosmang et al., 2005а,б, Chamberlain, Yang, Jones, 2008a,б, Santucci, Raghavachari, 2008, Srivastava et al., 2008, Fukushima et al., 2009). Защитным механизмом при увеличении концентрации кальция является активация фосфолипазы С и выработка эндоканнабиноидов, которые способны не только влиять на проницаемость каналов на постсинатпической мембране, но и уменьшать количество экзоцитируемых везикул на пресинапсе (Beltramo et al., 2000, Bisogno et al., 2000, McFarland et al., 2004) (рис. 18). Активация эндоканнабиноидной системы так же ведет к увеличению синтеза BDNF (Climent et al., 2000, Rose et al., 2004). Связывание BDNF с тирозинкиназным рецептором инициирует внутриклеточные каскады, которые способствуют либо локальному увеличению кальциевых токов, либо, напротив, торможению последствий эксайтотоксического действия глутамата (Segal, 2003, Rose et al., 2004, Martin, Finsterwald, 2011).
Рисунок 18. Влияние факторов внешней сигнализации на функционирование нейронной сети.
BDNF активирует процессы синаптической пластичности в нейронных сетях, с чем, по всей видимости, может быть связана роль данного нейротрофического фактора в обучении и консолидации памяти (Schabitz et al., 2000, Chang et al., 2004, Downward, 2004, Shishkina et al., 2010). Показано изменение уровня экспрессии BDNF при развитии стресса (Castren et al., 1992, Patterson et al., 1992, Castren, 1995, Neeper et al., 1995, Bramham et al., 1996, Rocamora N., 1996, Días B.G. et al., 2003). Также отмечена роль TrkB-опосредованного действия BDNF на астроцитарные кальциевые токи. Следовательно, BDNF, действуя дистанционно, не только объединяет нейроны в единое морфофункциональное образование, но и участвует в привлечении астроцитов к механизмам гомеостатческой регуляции сети. Следующим этапом внеклеточной регуляции сетевой активности является глиальный нейротрофический фактор. Данный нейротрофин способен влиять на гомеостаз клеток, лишенных рецепторов к GDNF (Lin et al., 1993, Не et al., 2008). Внутриклеточные сигнальные механизмы GDNF связаны не только с влиянием на апоптотические процессы, но и с синаптической пластичностью посредством фосфорилирования NR2 субъединиц NMDA-рецепторов (Salter, Kalia, 2004). Образование активного GDNF-GFL-RET комплекса влияет на активность фосфолипазы С, активируя выработку эндоканнабиноидов (Nakamura, Shiomi, 1999, Ahluwalia, 2002). Таким образом, BDNF, GDNF и эндоканнабиноидная система вовлечены с единую взаимозависимую систему регуляции гомеостаза нейронной сети в норме и в условиях адаптации к стрессу.
При исследовании действия факторов внеклеточной сигнализации нами оценивались нейротропные (способность модифицировать спонтанную биоэлектрическую активность), антигипоксические (влияние на выживаемость клеток и животных, влияние на устойчивость животных при моделировании гипоксии) и нейропротективные свойства (сохранение функциональной сетевой активности в постгипоксический период, сохранение пространственной памяти и стратегии поиска цели). Проведенные исследования показали, что все исследуемые факторы внеклеточной сигнализации способны оказывать защитное действие при гипоксии. Однако эффекты применения каждого из этих факторов различны. Это обусловлено механизмами действия каждого из факторов внеклеточной сигнализации.
Из всех исследуемых регуляторных молекул, BDNF проявляет выраженное нейротропное действие. Действие нейротрофического фактора головного мозга связано с изменением структуры сетевой пачки и увеличением длительности пачки при сохранении среднего количества спайков в пачке. Эффект действия BDNF развивается в течение 10-15 минут после аппликации. Действие BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность связано с метаболическими процессами, опосредованными запуском сигнальных каскадов при взаимодействии BDNF с рецептором TrkB и последующей активацией - NMDA и АМРА-рецепторов (Caldeira M.V. et al., 2007, Porcher С. et al., 2011). Для реализации данных реакций необходимо наличие сформированных химических синаптических контактов в нейронной сети. Этим объясняется отсутствие изменений спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур на раннем сроке развития (7 DIV). Обнаруженные нейротропные эффекты N-ADA ограничиваются определенной стадией развития нейронных сетей (14 день развития in vitro), что, по всей видимости, связано со скоростью экспрессии рецепторов. Не выявлен
нейротропный эффект GDNF. При исследовании антигипоксического действия (рис. 19) факторов внеклеточной сигнализации показано, что наиболее выражены антигипоксические свойства у глиального нейротрофического фактора (1нг/мл). Исследования in vitro продемонстрировали, что превентивное применение исследуемых регуляторных молекул способствует сохранению жизнеспособности клеток нервной системы в постгипоксический период, в связи с чем, особую важность приобретает вопрос о сохранении антигипоксических свойств при исследованиях in vivo. Для изучения защитных свойств факторов внеклеточной сигнализации нами было проведено изучение действия регуляторных факторов на животных в условиях острой гипобарической гипоксии.
Показано, что превентивное введение всех исследуемых факторов внеклеточной сигнализации при моделировании острой гипобарической гипоксии увеличивает выживаемость и устойчивость животных (рис 20, таблица 1).
3 сутки 7 сутки
1 сутки
Постгипоксический период Время, сутки
D Гипоксия а Гипоксия ♦ BDNF. 1 i
"Т
Пастгнпокснчсекий период Время, сутки
:ин в Гипоксия + GDNF, 1 ы/мл
<и
5
НтН *# п * 1+| п
1
1 сутки 3 сутки 7 сутки г
Постгипоксический период Время, сутки
ü Гипоксия ■ Гипоксия +N-ADA, ЮмкМ
Рисунок 19. Влияние факторов внеклеточной сигнализации на показатели жизнеспособности клеток первичных культур гиппокампа.
Данные нормированы относительно группы "Нормоксия".
* - достоверность различий с группой "Нормоксия";
# - статистически значимое отличие с группой "Гипоксия", р<0,05 (А>ТОУА)
NaCl, 0.9% реамберин bonf 4 миг/кг BDNF 40 мкг/кг
■ Низкоустойчивые ПСреднеустойчивые ввысокоусторнюые
Рисунок 20. Степень устойчивости животных к воздействию острой гипобарической гипоксии (в % от общего числа мышей С57В176 в группе)
Таблица1
Показатели устойчивости животных к условиям острой гипобарической гипоксии
Группа животных Коэффициент защиты Время жизни на высоте, мин Время потери позы, мин Время восстановления позы, мин
Контроль (NaCl, 0.9%) - 6,18±0,76 2,23±0,22 4,29±1,17
Группа сравнения (Реамберин, 150 мг/кг) 1,4 8,35±0,59 2,50±0,11 3,60±0,98
BDNF, 4 мкг/кг 1,3 9,40±0,41* 2,44±0,21 2,42±1,15
BDNF, 40 мкг/кг 1,6 8,63±0,49* 2,72±0,23 3,92±1,11
GDNF, 4 мкг/кг 1,5 09,12±0,98* 0,37±0,04* 3,29±1,01
GDNF, 40 мкг/кг 1,2 8,22±0,72 1,15±0,09 3,55±1,08
Контроль 2 (растворитель NADA) 1,0 7,07±0,79 2,15±0,47 4,25±1,52
N-ADA 2,5 мг/кг 1,2 7,97±0,69 2,22±0,25 3,94±1,52
N-ADA 6 мг/кг 1,3 8,45±0,66* 1,88±0,39 4,05±1,43
N-ADA 10 мг/кг 1,6 8,95±0,55* 2,41 ±0,27 2,91 ±1,12
* - статистически значимое отличие с контрольной группой (физиологический раствор), ANOVA р < 0,05.
Из данных, представленных в таблице видно, что наибольшим коэффициентом защиты обладают ВЭЫР (40 мкг/кг), СО№ (4 мкг/кг), Ы-АОА (10 мкг/кг). Применение факторов внеклеточной сигнализации в данных дозах увеличивает устойчивость и выживаемость животных в условиях острой гипобарической гипоксии. Особый интерес представляет группа животных с
превентивным введением ОБОТ (4 мкг/кг). Несмотря на увеличение коэффициент защиты и времени жизни на высоте, в данной группе наблюдается достоверное (р<0,01) уменьшение времени потери позы. Поддержание позы животного является рефлекторным, а потеря ее коррелирует со степенью поражения центральной нервной системы.
Показано, что все используемые факторы внеклеточной сигнализации обладают данными свойствами. При сравнении эффектов действия различных факторов внеклеточной сигнализации на спонтанную биоэлектрическую активность выявлено, что превентивное применение нейротрофических факторов (00№ 1нг/мл, ЕШОТ 1 нг/мл) практически полностью нивелирует отрицательные последствия гипоксии (рис. 21). Наблюдается сохранение числа сетевых пачек и количества спайков в пачке.
+ + + 4 + +
BDNF,1nr/ufl GDNF,1nr/iui N.ADA,10 ккМ BDNF.Inr/мл GDNF.lhr/мл N^DA,10 икМ
Рисунок 21. Показатели спонтанной биоэлектрической активности первичных культур гиппокампа через 7 суток после моделирования нормобарической гипоксии Данные нормированы относительно исходного уровня. А - количество малых сетевых пачек; Б - количество спайков в пачке. * - статистически значимое отличие с исходным уровнем, # - статистически значимое отличие с группой "Гипоксия", р < 0,05, ANOVA.
Исследование функциональной кальциевой активности показало, что факторы внеклеточной сигнализации не влияют на частоту и длительность измененных в результате действия гипоксии осцилляций. Достоверно увеличивается процент клеток культуры, проявляющих спонтанную активность (рис.22).
Изучение механизмов действия факторов внеклеточной сигнализации выявило, что блокада тирозинкиназного рецептора В типа (к252а, 150 нМ) полностью нивелирует анигипоксические и нейропротективные эффекты BDNF. Защитное действие N-ADA опосредовано работой каннабиноидных рецепторов первого типа и ваниллоидных рецепторов. При блокаде одного из этих типов рецепторов положительное действие N-ADA достоверно (р<0,05) снижается.
*й
*# i—t— ■ ■ ■ I
Нормоксия Гипоксия Гипоксия + Гипоксия + Гипоксия+
BNDF, 1 нг/мл GDNF, 1 нг/мл N-ADA, 10 мкМ
Рисунок 22 Процент клеток, проявляющих спонтанную кальциевую активность в
первичной культуре гиппокампа через 7 суток после моделирования гипоксии.
* - статистически значимое отличие с исходным уровнем,
# - статистически значимое отличие с группой "Гипоксия", р<0,05, ANOVA.
При изучении нейропротективного действия факторов внеклеточной сигнализации in vivo проведена оценка коэффициента сохранения пространственной памяти и стратегии поиска цели в водном лабиринте Морриса.
При обучении мышей в водном лабиринте были выявлены основные стратегии поиска животными скрытой под водой платформы: (1) прямое достижение цели - животное непосредственно направлялось к месту расположения платформы (время трека составляло 3-1 Осек); (2) активный поиск - животное осуществляло циркулярные и радиальные поисковые движения, достигая цели в течение 10-20 сек; (3) хаотичный поиск - отсутствие выраженной стратегии достижения цели (более 20 сек); (4) отрицательный результат - животное не нашло платформу в течение попытки (рис. 23). Показано, что при первом помещении в водный лабиринт большинство особей выбирали хаотичный поиск цели. Животные плавали вдоль стенок бассейна, что объяснялось врожденной программой поведения - тигмотаксисом. При анализе последующих попыток у мышей наблюдались процессы формирования пространственной памяти. По мере обучения время нахождения животными платформы сокращалось, поиск цели становился направленным, как правило, характеризующимся циркулярными и радиальными движениями. Острая гипобарическая гипоксия вызывает снижение коэффициента сохранения памяти и существенно влияет на выбор стратегии поиска цели (рис. 23). Гипоксия существенно сказывается на пространственной памяти животных.
Показано, что применение факторов внеклеточной сигнализации (BDNF 40 мкг/кг, N-ADA 2,5 и 10 мкг/кг) способствует сохранению пространственной памяти. Коэффициент сохранения достоверно (р<0,05) выше, чем в контрольной группе и соизмерим с показателями группы сравнения. Также показано сохранение стратегии поиска цели в группе с превентивным введением BDNF и N-ADA (рис. 23). Несмотря на то, что GDNF обладает выраженным антигипоксическим эффектом, нейропротективные свойства показаны только в экспериментах in vitro.
Проведенные эксперименты показали, что все исследуемые факторы внеклеточной сигнализации обладают выраженными антигипоксическими и нейропротективными свойствами. Однако, в настоящее время остается актуальным вопрос о возможности образования новых или регенерации старых нейронных сетей после гипоксического повреждения в поздний постнатальный период.
S5 80 -
0 S и
г s
|| 40-
1 г 20-
■
£ о__Шя_I
Прямой поиск
Отрицательный
Trace ir» selected area
Активный
Trace - searching platform
Хаотический
Trace - searching platform
Интактные Контроль Реамберин BDNF,4 мкг/кг BDNF,40 мкг/кг GDNF,4 мкг/кг GDNF, 40 мкг/кг N-ADA, 2,5 мг/кг N-ADA, 6мг/кг N-ADA, 10 мг/кг
i Прямой поиск Ш Активный поиск □ Хаотический поиск ■ Отрицательный результат Рис. 23. Распределение стратегий поиска цели при отсроченном тестировании животных в водном лабиринте Морриса.
Trace • searching platform
Особый интерес представляют данные, полученные при исследовании влияния факторов внеклеточной сигнализации на восстановление спонтанной биоэлектрической активности нейронных сетей гиппокампа после моделирования острой нормобарической гипоксии. Проведенные нами исследования показали, что при хроническом применении факторов внеклеточной сигнализации в постгипоксический период возможно частичное восстановление спонтанной биоэлектрической активности (рис. 24).
Б.
Постгипоксический период Время, сутки
Постгипоксический период Время, сутки
Рисунок 24. Показатели спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа через 12 суток после начала введения факторов внеклеточной сигнализации: А - количество малых сетевых пачек, Б - среднее количество спайков в пачке. Данные нормированы относительно уровня активности на 3 сутки после моделирования нормобарической гипоксии (исходный уровень); * - статистически значимое отличие с исходным уровнем, р<0,05, АЫОУА
Наблюдается не только стабилизация деградирующей функциональной активности, но и увеличение показателей сетевой пачечной активности. При этом наиболее выраженный эффект восстановления в постгипоксический период
показан для BDNF (1нг/мл). При изучении хронического применения BDNF (1нг/мл) в период после моделирования долговременной глюкозной депривации, также обнаружен выраженный репарационный эффект. Следовательно, применение нейротрофического фактора головного мозга в период после кислородного и глюкозного голодания может существенно скорректировать отрицательные последствия ишемического повреждения головного мозга.
Заключение
Одной из актуальных проблем современной биологии и нейромедицины является изучение клеточных механизмов регуляции функциональной активности нейронной сети. Изучение гомеостаза клеток нервной системы дает возможность коррекции метаболизма с стресс-условиях. Особый интерес представляют данные, полученные с применением мультиэлектродных систем регистрации, так как данные методы позволяют оценить процессы развития и адаптации клеток головного мозга на системном уровне. Проведенные нами исследование формирования нейронных сетей в первичной культуре гиппокампа показало, что в процессе развития культуры формируются полноценные нейронные сети. Продемонстрировано поэтапное развитие сложных аксоно-дендрических и аксоно-сомических химических синапсов, морфологически структурированные нейрон-глиальные конгломераты, разветвленные перинейрональных сетей. Особый интерес представляют данные о развитии функциональной биоэлектрической и кальциевой активности в диссоциированных культурах. Показано, что формирование полноценной стабильной сетевой активности происходит параллельно морфологическим изменениям. Изучение влияния регуляторных молекул на процессы жизнедеятельности клеток при моделировании стресс-факторов позволяет говорить о том, что изучаемые биоактивные вещества являются неотъемлемой частью эндогенной антигипоксической системы и способны значительно регулировать клеточный гомеостаз. Данные о антигипоксическом и нейропротективном действии факторов внеклеточной сигнализации, полученные при исследованиях in vitro, полностью подтверждаются исследованиями in vivo. Результаты исследований защитных и репарационных эффектов факторов внеклеточной сигнализации могут стать основой для разработки инновационных терапевтических стратегий и прототипов лекарственных средств (рис.24). Особый интерес представляют результаты, подтверждающие возможность частичного восстановления функциональной активности нейронных сетей мозга после гибели части активных нейронов.
Нейронные сети диссоциированных культур гиппокампа в сочетании с комплексом разработанных и модифицированных методов оценки функциональной сетевой активности и жизнеспособности, могут использоваться для скрининга большого круга веществ, предположительно обладающих нейропротективными, нейротропными или антигипоксическими свойствами.
Нейротропный
эффект:
BDNF
N-ADA
GDNF
Репарационный эффект: BDNF N-ADA
GDNF
Свойства факторов
внеклеточной сигнализации
Антигипоксический Нейропротективный
эффект: эффект:
ЭОЫР ВОЫР
ВОЫР ООЫР. Г^-АОА И-АРА
Рисунок 24. Действие факторов внеклеточной сигнализации на структурно-
функциональную организацию нейронных сетей диссоциированных культур гиппокампа
ВЫВОДЫ:
1. Охарактеризованы основные морфофункциональные закономерности формирования нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа с выделением трех критических периодов. Процесс развития нейронных сетей сопровождается формированием сложных химических синапсов, перинейрональных сетей внеклеточного матрикса мозга и стабильной функциональной активностью. Функциональные нейронные сети в составе первичных культур клеток гиппокампа, длительно культивируемых на мультиэлектродных матрицах, являются адекватной биологической моделью изучения локальной сетевой активности мозга in vitro;
2. Разработан способ оценки морфофункционапьного состояния индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, дифференцированных в дофаминергические нейроны. Показано, что полученные нейрональные культуры не проявляют стабильную функциональную активность. Отсутствие полноценной нейросетевой активности связано с морфологически динамичным состоянием нейронов в культуре;
3. Нарушения кислородного и энергетического метаболизма вызывают необратимые изменения в структурно-функциональной организации нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа. Реорганизация и упрощение структуры нейронных сетей связаны с гибелью части функционально значимых нейронов в составе сети;
4. Функциональная активность нейронных сетей зависит от целостности перинейрональных сетей внеклеточного матрикса мозга. Разрушение внеклеточного матрикса индуцирует развитие эпилептоподобной активности в виде длительных сетевых суперпачек и кальциевых суперосциляций. Эпилептиформная активность, возникающая после энзиматического разрушения матрикса, элиминируется при блокаде потенциал-зависимых кальциевых каналов L-типа и АМРА-рецепторов;
5. Антигипоксическое действие факторов внеклеточной сигнализации мозга (BDNF, GDNF, N-ADA) связано с поддержанием функциональной сетевой активности и рецептор-зависимом торможении деструкции нейронных сетей (гибели клеток и элиминации сетевой активности) в постгипоксический период;
6. Антигипоксическое действие факторов внеклеточной сигнализации подтверждено при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo. BDNF, GDNF, N-ADA не только увеличивают устойчивость животных к стресс-условиям, но и способствуют сохранению когнитивных функций мозга (пространственной памяти, стратегии поиска цели) в постгипоксическом периоде;
7. Продемонстрирована возможность функциональной репарации нейронной сети первичной культуры клеток гиппокампа после повреждающих воздействий. Среди изучаемых факторов внеклеточной сигнализации наибольшим репаративным потенциалом обладает нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Работы, опубликованные в рецензируемых журналах
1. М. Vedunova, Т. Sakharnova, Е. Mitroshina, М. Perminova, A. Pimashkin, Yu. Zakharov, A. Dityatev, I. Mukhina Seizure-like activity in hyaluronidase-treated dissociated hippocampal cultures // Frontiers in cellular neuroscience. 2013. V.7 (article 149). doi: 10.3389/fncel.2013.00149.
2. Ведунова M.B., Митрошина E.B., Сахарнова T.A., Бобров М.Ю., Безуглов В.В., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Влияние N-арахидоноилдофамина на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа при моделировании гипоксии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. 156 №10. С. 447-451.
3. Ведунова М.В., Коротченко С.А., Балашова А.Н., Исакова А.О., Хаспеков Л.Г., Казанцев В.Б., Мухина И.В. Влияние кратковременной глюкозной депривации на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа на мультиэлектродной матрице // Современные технологии в медицине. 2010. №1. С. 7- 13.
4. Mironov V.l., Romanov A.S., Simonov A.Y., Vedunova M.V., Kazantsev V.B. Oscillations in a neurite growth model with extracellular feedback // Neurosci Lett. 2014. V 570. P. 16-20. doi: 10.1016/j.neulet.2014.03.041.
5. Ведунова M.B., Сахарнова T.A., Коротченко С.А., Балашова А.Н., Мухина И.В. Влияние BDNF на функционирование нейронной сети первичной культуры гиппокампа в условиях глюкозной депривации // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2011. Т. 2. № 2. С. 237-242.
6. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Мухина И.В. Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и его роль в функционировании центральной нервной системы // Нейрохимия. 2012. Т. 24. № 4. С. 269-277.
7. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Широкова О.М., Захаров Ю.Н., Калинцева Я.И., Мухина И.В. Оценка динамики функционального состояния диссоциированной культуры гиппокампа in vitro // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 2011. № 2(2). С. 283-286.
8. Захаров Ю.Н., Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Калинцева Я.И., Потанина A.B., Мухина И.В. Флуоресцентный анализ паттернов
метаболической активности нейрон-глиальной сети // Оптический журнал. Название англоязычной копии Journal of Optical Technology. 2012 T 79 №6 С 4751.
9. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Миронов A.A., Сахарнова Т.Д., Пимашкин A.C., Бобров М.Ю., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Нейропротекторное действие каннабиноида N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипобарической гипоксии мозга // Неврологический вестник им. Бехтерева. 2012 № 1.С. 14-19.
10. Мухина И.В., Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Дитятев А.Э. Модуляция биоэлектрической активности первичной культуры гиппокампа посредством энзиматического воздействия на внеклеточный матрикс // Современные технологии в медицине. 2012. Т. 1. С. 7-14,
11. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Митрошина Е.В., Мухина И.В. Антигипоксические свойства нейротрофического фактора головного мозга при моделировании гипоксии в диссоциированных культурах гиппокампа // Современные технологии в медицине. 2012. №4. С. 17-23.
12. Широкова О.М., Фрумкина Л.Е., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Захаров Ю.Н., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Морфофункциональные закономерности развития нейронных сетей диссоциированных культур гиппокампа in vitro // Журнал Современные технологии в медицине. 2013. №2. С. 6-13.
13. Лебедева О.С., Лагарькова М. А., Киселев С. Л., Мухина И. В., Ведунова М. В., Усова О. В., Ставровская А. В., Ямщикова Н. Г., Федотова Е. Ю., Гривенников И. А.,. Хаспеков Л. Г, Иллариошкин С. Н. Морфофункциональные свойства индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных из фбробластов кожи человека и дфференцированных в дофаминергические нейроны // Нейрохимия. 2013. Т.30. №3. С. 233-241.
14. Куракина A.C., Ведунова М.В., Щелчкова H.A., Григорьева В.Н., Мухина И.В. Прогностическое значение нейротрофических факторов и нейронспецифической енолазы у пациентов с внемозговыми опухолями головного мозга // Современные технологии в медицине. 2014. Т6. №3. С. 6-13.
15. Гладков A.A., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Захаров Ю.Н., Балашова А.Н., Мухина И.В. Развитие пространственно-временной структуры нейрональной сети гиппокампа in vitro II Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2011. № 2-2. С. 243-248.
16. Кокая A.A., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Сахарнова Т.А., Кокая Н.Г., Козяков В.П., Мухина И.В. Устойчивость нейронов к нормобарической гипоксии in vitro при воздействии низкоинтенсивным электромагнитным излучением // Вестник Российской Военно-Медицинской Академии. 2014. №1 С 127-131.
17. М.В. Ведунова, Т.А. Сахарнова, Е.В. Митрошина, И.В. Мухина Изучение роли тирозинкиназного рецептора (TrkB) в реализации нейропротективного и антигипоксического действия нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) при моделировании нормобарической гипоксии in vitro И Биомедицинская радиоэлектроника. 2014. №4. С. 13-14.
18. Е.В. Митрошина, М.В. Ведунова, Т.А. Сахарнова, М.Ю. Бобров, Л.Г. Хаспеков, И.В. Мухина Влияние N-арахидоноилдофамина на распределение каннабиноидных рецепторов 1- и 2-го типа в первичных культурах гиппокампа при
моделировании острой гипоксии in vitro II Биомедицинская радиоэлектроника. 2014. №4. С. 54-55.
19. Т.А. Сахарнова, М.В. Ведунова, Е.В. Митрошина, И.В. Мухина Антигипоксическое и нейропротекторное действие нейротрофических факторов BDNF и GDNF в условиях острой гипобарической гипоксии in vivo II Биомедицинская радиоэлектроника. 2014. №4. С. 71-72.
20. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Митрошина Е.В., Шишкина Т.В., Астраханова Т.А., Мухина И.В. Антигипоксические и нейропротективные свойства нейротрофических факторов BDNF и GDNF при гипоксии in vitro и in vivo II Современные технологии в медицине. 2014. №4. С. 38-47.
21. Мухина И.В., Цыбусов С.Н., Ведунова М.В., Трифонова A.C., Треушников В.М., Колмогоров Ю.Н., Треушников В.В., Сорокина О.В. Матрица для клеточной трансплантологии // Патент на изобретение №2521194 от 16.11.2011г.
22. Иллариошкин С.Н., Хаспеков Л.Г., Федотова Е.Ю., Лагарькова М.А., Киселев С.Л., Мухина И.В., Ведунова М.В., Усова О.В. Способ оценки морфофункционального состояния дифференцированных в дофаминергические нейроны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток больных Паркинсонизмом // Патент на изобретение № 2501853 от 20.12.2013г.
23. Куракина A.C., Ведунова М.В., Щелчкова H.A., Григорьева В.Н., Мухина И.В. Способ прогнозирования развития направленности патологического процесса у больных с опухолями головного мозга // Заявка на изобретение регистрационный номер 2014148226 от 28.11. 2014
24. Кастальский И.А., Пимашкин A.C., Ведунова М.В., Митрошина Е.В, Казанцев В.Б., Семьянов A.B. «Мониторинг и оценка функционального состояния нейрон-глиальных сетей мозга по данным флуоресцентного имиджинга» // Свидетельство о государственной регистрации Программа для ЭВМ RU 2014662670
25. Баграташвили В.Н., Антонов E.H., Королева A.A., Попов В.К., Тимашев П.С., Миронов A.B., Чичков Б.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Сахарнова Т.А., Мухина И.В., Разработка пористых полимерных матриксов-носителей для нейротрансплантатов, Нейродегенеративные заболевания: от генома до целостного организма // под ред. М.В. Угрюмова. - в 2-х томах - М. : Научный мир, 2014. с. 805-832.
Работы в региональных изданиях и материалах конференций
26. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Захаров Ю.Н., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Мультиэлектродные матрицы - новые возможности в исследовании пластичности нейрональной сети. // Современные технологии в медицине. 2009. № 1. С. 8-15.
27. Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Казанцев В.Б., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Бобров М.Ю., Фрумкина Л.Е., Захаров Ю.Н., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Функциональные характеристики клеток гиппокампа в нейроглиальной сети, развивающейся in vitro: кальциевый имиджинг и спонтанная активность в культуре на мультиэлектродной матрице // Международная конференция: Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей под ред. Зинченко В.П., Колесниковой С.С., Бережновой A.B. Пущино. 2009. Т.1. С. 138-142.
Тезисы докладов
28. Mukhina I.V., Kazantsev V.B., Khaspekov L.G., Zakharov Y.N., Vedunova JVI.V., Mitroshina E.V., Korotchenko S.A., Koryagina E.A., Martyanov E.P. Study the functional properties of low density hyppocampal neuronal networks using multiclectrode arrays // Joint Symposium on International Workshop on Nonlinear Dynamics in Biological Systems and Soft-matter Biophysics. Taipei, Taiwan. 2009. P.35.
29. Митрошина E.B., Мухина И.В., Ведунова M.B. Изучение влияния N-арахидоноилдофамина на уровень внутриклеточного кальция в диссоциированной культуре гиппокампа // Материалы XIV Нижегородской сессии молодых ученых. Естественные науки. Н.Новгород. 2009. С. 110-111.
30. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротчснко С.А., Корягина Е.А. Исследование пластичности нейроналной сети гиппокампа in vitro при культивировании на мультиэлектродной матрице MED64 // Материалы Всероссийской конференции "Нелинейная дннамика в когнитивных исследованиях". Нижний Новгород: ИПФРАН. 2009. С.97-99.
31. Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Казанцев В.Б., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Бобров М.Ю., Фрумкина Л.Е., Захаров Ю.Н. , Коротченко С.А., Корягнна Е.А. Функциональные характеристики клеток гиппокампа в нейроглнальной сети, развивающейся in vitro-, кальциевый имиджинг и спонтанная активность в культуре на мультиэлектродной матрице // Международная конференция: Рецепция и внутриклеточная сигнализация. Сборник статей под ред. Зинченко В.П., Колесниковой С.С., Бережновой А.В. Пущино. 2009. Т.1. С. 138-142.
32. Khaspekov L.G., Mukhina I.V., Bobrov M.Yu.. Kazantsev V.B., Frumkina L.E., Zhakharov Yu.N., Mitroshina E.V., Vedunova M.V. Cannabinoid receptor agonist N-arachidonoyldopamine modulates neuron-to-astrocyte calcium signaling in hippocampal cell culture // Материалы международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics - 2009". Нижний Новгород. 2009. C.247-249.
33. Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Казанцев В.Б., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Фрумкнна Л.Е., Коротченко С.А., Корягина Е.А Спонтанная активность нейронов в сети в культуре клеток гипокампа на мультиэлектродной матрице MED64 // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Гнппокамп и память: норма и патология». Пущино. 2009. С 46-47.
34. Мухина И.В., Хаспеков Л.Г., Ведунова М.В., Митрощина Е.В., Бобров М.Ю., Захаров Ю.Н Исследование нейротропных свойств N-арахидононлдофамина в диссоциированной культуре гиппокампа // Материалы XV Международной конференции по нейрокибернетике. Ростов-на-Дону. 2009. С. 41-44.
35. Мухина И.В., Казанцев В.Б., Хаспеков Л.Г., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Корягина Е.А. Динамнка развития функциональной активности нейронной сети гиппокампа in vitro при культивировании на мультиэлектродной матрице MED64 // Материалы XV Международной конференции по нейрокибернетике. Ростов-на-Дону. 2009. С. 124-127.
36. Ершова А.В., Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Мухина И.В., Захаров Ю.Н. Анализ синхронности кальциевых осцилляций в нейрон-глнальных сетях по изображениям лазерного сканирующего микроскопа // Труды XIII научной конференции по радиофизике, посвященной 85-летию со дня рождения М.А. Миллера. Нижний Новгород: изд. «Талам». 2009. С. 113-114.
37. Mukhina I.V., Kazantsev V.B., Vedunova M.V., Khaspekov L.G., Mitroshina E.V., Zakharov Y.N., Korotchenko S.A., Koryagina E.A. Cultured hippocampal function network during development and its N-arachidonoyldopamine modulation // 7th FENS
forum of European Neuroscience, Amsterdam. 2010. Ref.: FENS Abstr. Vol.5. Abstract no: 192.37.
38. Ведунова M.B., Мухина И.В., Коротченко С.А., Сахарнова Т.А., Исакова А.О., Митрошина Е.В. Роль энергетических субстратов в формировании и развитии нейрон-глиальных сетей // Материалы XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва-Калуга. 2010. С. 110-111.
39. Митрошина Е.В., Мухина И.В., Ведунова М.В., Захаров Ю.Н. Действие глутамата на кальциевый гомеостаз нейрон-глиальной сети мозга in vitro II Материалы XXI Съезда Физиологического общества им. Павлова. Москва -Калуга. 2010. С. 408.
40. Мухина И.В, Митрошина Е.В., Коротченко С.А., Ведунова М.В., Захаров Ю.Н. Флуоресцентный анализ паттернов метаболической активности нейрон-глиальной сети // Сборник трудов международной конференции и семинаров «Фундаментальные проблемы оптики». Спб. 2010. Т.1. С. 164-167.
41. Ведунова М.В. Использование наноэлектродных матриц в исследовании пластичности нейроглиальных сетей головного мозга в условиях эксайтотоксического действия глутамата // Материалы IX научной сессии молодых ученых и студентов "Современное решение актуальных проблем в медицине". Нижний Новгород. НижГМА, 2010. С. 177-179.
42. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Коротченко С.А., Мухина И.В. Ненропротективная роль BDNF при моделировании глюкозной депривации первичной культуры гиппокампа in vitro II Материалы Седьмого международного междисциплинарного конгресса "Нейронаука для медицины и психологии". Судак, 2011.
43. Ведунова М.В., Исакова А.О. Моделирование эпилептиформной биоэлектрической активности в диссоциированной культуре гиппокампа // Медицинский альманах. Материалы Х-ой научной сессии молодых ученых и студентов "Современное решение актуальных научных проблем в медицине". Нижний Новгород. 2011. С. 102.
44. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Мухина И.В. Влияние нейротрофического фактора BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) на спонтанную биоэлектрическую активность нейронных сетей диссоциированной культуры гиппокампа // Медицинский альманах. Материалы Х-ой научной сессии молодых ученых и студентов "Современное решение актуальных научных проблем в медицине". Нижний Новгород. 2011. С. 112-113.
45. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Коротченко С.А., Мухина И.В. Изучение влияния BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) на спонтанную биоэлектрическую активность первичных диссоциированных культур гиппокампа на разных этапах развития in vitro II Медицинский академический журнал. Материалы Всероссийской молодежной конференции - школы «Нейробиология интегративных функций мозга». Санкт-Петербург. 2011. Т. 11. С. 49.
46. Vedunova M.V., Sakharnova Т.А., Korotchenko S.A., Mukhina I.V., Dityatev A.E. Hyaluronidase potentiation of epileptiform activities caused by 4-aminopiridine in cultured mice hippocampal neurons // Topical problems of biophotonics III International Symposium. St. Petersburg. 2011. P. 260-262.
47. Митрошина E.B., Ведунова M.B., Бобров М.Ю., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина на функционирование
нейронной сети первичной культуры гиппокампа при глюкозной депривации // Материалы IV Съезда биофизиков России. Н.Новгород. 2012. С. 100.
48. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Мухина И.В. Влияние BDNF (Brain-derived Neurotrophic Factor) на спонтанную биоэлектрическую активность первичных диссоциированных культур гиппокампа при моделировании гипоксии in vitro // Материалы IV Съезда биофизиков России. Н.Новгород. 2012. С. 128.
49. Широкова О.М., Ведунова М.В., Фрумкина JI.E., Мухина И.В. Структурное и функциональное развитие диссоциированных культур гиппокампа in vitro // Материалы IV Съезда биофизиков России. Н.Новгород. 2012. С. 160.
50. Vedunova М., Sakharnova Т., Mukhina I. BDNF Effect on the primary hippocampal culture neuron network in the glucose deprivation // International Brain Injury Association's Ninth World Congress on Brain Injury, Edinburgh, Scotland. BRAIN INJURY. 2012. V.26 (4-5). P. 540-540. Meeting Abstract: 0460.
51. Mukhina I., Mitroshina E., Vedunova M. Modeling and pharmacological modulation of neuronal network activity injury on a microelectrode array // International Brain Injury Association's Ninth World Congress on Brain Injury, Edinburgh, Scotland. BRAIN INJURY. V.26 (4-5). P. 785-786. Meeting Abstract: 0895.
52. Mukhina I., Trifonova A., Baskina O., Vedunova M. Polymeric material "Reperen" for neuronal culture transplantation after brain injury // International Brain Injury Association's Ninth World Congress on Brain Injury, Edinburgh, Scotland. BRAIN INJURY. V.26 (4-5). P.541-542. Meeting Abstract: 0463.
53. Vedunova M.V., Sakharnova T.A., Mukhina I.V. BDNF effect on the primary hippocampal culture neuron network in the glucose deprivation and hypoxia // 8th FENS Forum-2012. Barcelona, 2012. V. 6, p036.25. Number: A-471-0088-03072
54. Sakharnova T.A., Vedunova M.V., Mukhina I.V. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) as modulator of neural network activity in the developing hippocampal dissociated cultures // 8th FENS Forum-2012. Barcelona, 2012. V. 6, p036.25. Abstract Number: A-471-0031-03155.
55. Кокая A.A., Ведунова M.B., Митрошина E.B., Козяков В.П., Мухина И.В., Экспериментальная оценка защитных эффектов электромагнитного излучения при токсическом действии несимметричных диметилгидразинов // Сборник материалов всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, профилактики и лечения профессионально-обусловленных заболеваний». Сочи. 2013. С. 152-162.
56. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Мухина И.В. Нейропротекторное действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) при моделировании острой гипобарнческой гипоксии in vivo // Материалы XXII Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград. 2013. С. 467-468.
57. Митрошина Е.В.. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Мухина И.В. Влияние N-арахидоноилдофамнна на спонтанную кальциевую активность культур гиппокампа при моделировании гипоксии in vitro II Материалы XXII Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград. 2013. С. 354.
58. Мухина II.В., Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Пермннова М.И., Дптятев А.Э. Индуцированная гиалуронидазой синхронизация внутриклеточных кальциевых осцилляций в клетках диссоциированной культуры гиппокампа /7 Материалы XXII Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Волгоград. 2013. С. 371.
59. Широкова О.М., Корягина Е.А., Фрумкина Л.Е., Ведунова М.В., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В.. Динамика нейросетевой активности и морфологических закономерностей развития диссоциированной культуры гиппокампа in vitro II Материалы Форума молодых ученых. Нижний Новгород.
2013. Т. 1. С.43-46.
60. Шишкина Т.В., Ведунова М.В., Мухина И.В. Влияние глиального нейротрофического фактора на жизнеспособность и спонтанную биоэлектрическую активность нейронов гиппокампа при моделировании гипоксии in vitro II Материалы всероссийской молодёжной конференции "Нейробиология интегративных функций мозга". Санкт-Петербург. 2013.
61. E.V. Mitroshina, M.V. Vedunova, Т.A. Sakharnova, M.Yu. Bobrov, V.V. Bezuglov, L.G. Khaspekov, I.V. Mukhina Neuroprotective properties of cannabinoid N-arachidonoyl dopamine in hippocampal neural network cultured on multielectrode arrays // Материалы IV международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics -2013". Нижний Новгород. 2013. С. 233-234
62. I.V. Mukhina, M.V. Vedunova, E.V. Mitroshina, T.A. Sakharnova, Ya.I. Kalintseva, Yu.N. Zakharov, A.S. Pimashkin, and V.B. Kazantsev Microelectrode arrays and Ca2+ imaging in combination with in vitro model of stroke as a tool to investigate pathological changes in network activity // Материалы международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics - 2013". Нижний Новгород. 2013. С. 245-247.
63. T.A. Sakharnova, M.V. Vedunova, I.V. Mukhina The effect of the Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and k252a on the spontaneous neural network activity of primary dissociated hippocampal cultures during hypoxia in vitro // Материалы IV международного симпозиума "Topical Problems of Biophotonics -2013". Нижний Новгород. 2013. С. 249-251.
64. Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Sakharnova T.A., Bobrov M.Yu., Khaspeckov L.G., Mukhina I.V. Mechanisms of N-arachydonoildopamine neuroprotective and antihypoxic effects in acute normobaric hypoxia in vitro: role of CB1, CB2 and TRPV1 receptors // 8th International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair. Magdeburg. 2014.
65. Sakharnova T.A., Vedunova M.V., Mitroshina E.V., Mukhina I.V. Realisation of neuroprotective and antihypoxic properties of Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) through TrkB signaling mechanisms during acute normobaric hypoxia in vitro // 8th International Symposium on Neuroprotection and Neurorepair. Magdeburg. 2014. Abstract number: 192.
66. T.A. Сахарнова, M.B. Ведунова, E.B. Митрошина, И.В. Мухина исследование биосовместимости полимерных матриксов для нейротрансплантации // Материалы VI Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине». Троицк. 2014. С. 615.
67. Шишкина Т.В., Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Мухина И.В. Антигипоксическое и нейротропное действие глиального нейротрофического фактора (GDNF) при моделировании гипоксии // Материалы VI Троицкой конференции «Медицинская физика и инновации в медицине». Троицк. 2014. С. 432.
68. Sakharnova Т.А., Vedunova M.V., Mitroshina E.V., Mukhina I.V. Changes of BDNF-mediated signaling mechanisms during normobaric hypoxia in vitro II International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience». Nizhny Novgorod.
2014. P. 32-33.
69. Shishkina T.V., Vedunova M.V., Sakharnova T.A., Mukhina I.V. Antihypoxic and neuroprotective properties of Glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) during acute hypoxia // International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience». Nizhny Novgorod. 2014. P. 36-37.
70. E.V. Mitroshina, M.V. Vedunova, T.A. Sakharnova, M.Yu. Bobrov, L.G. Khaspekov, Mukhina I.V. The role of N-arachidonoyldopamin (N-ADA) in maintaining of neural network functional homeostasis in normal conditions and hypoxia // International Scientific School «Frontiers in modern neuroscience». Nizhny Novgorod. 2014. P. 24-25.
71. Sakharnova T.A.. Vedunova M.V., Mitroshina E.V., Mukhina I.V. TrkB signaling mechanism as a basis for implementation of antihypoxic and neuroprotective action of Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) during normobaric hypoxia in vitro //Материалы Международного конгресса по нейронаукам. Красноярск. 2014. С. 83.
72. Vedunova M.V., Sakharnova Т.А., Mitroshina E.V., Mukhina I.V. RNA-probe using for the investigation of the neuroprotective action mechanisms of Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the modeling of normobaric hypoxia in vitro // Материалы Международного конгресса по нейронаукам. Красноярск. 2014. С. 110.
73. Mitroshina E.V., Vedunova M.V., Sakharnova Т.А., Bobrov M.Yu., Khaspeckov L.G., Mukhina I.V. Antihypoxic effects of N- arachydonoildopamine in hippocampal cultures by activating both cannabinoid and vanilloid receptors // 9th FENS Forum of Neuroscience. Milan. 2014. FENS-3045.
74. Vedunova M.V., Sakharnova T.A., Mitroshina E.V.. Shishkina T.V., Mukhina I.V. Neurotrophic factors (BDNF, GDNF) modify the functional neural activity and synthesis of the protein p50 during hypoxia in vitro II 9th FENS Forum of Neuroscience. Milan. 2014. Abstract Number: FENS-2921.
75. Mukhina I., Mitrosina E., Sakharnova Т., Socolov R., Vedunova M., A. Dityatev. Hyaluronidase indused Ca2+ superoscillations in dissotiatcd hippocampal cultures // 9th FENS Forum of Neuroscience. 2014, July 5-9, Milan. Italy. Abstract Number: FENS-2920.
76. Мнтрошнна E.B., Ведунова M.B., Сахарнова T.A., Хаспеков JI.Г., Мухина И.В. Влияние N-арахидоноилдофамнна на распределение каннабиноидных рецепторов 1 и 2 типа в первичных культурах гнппокампа при моделировании острой гипоксии in vitro И Материалы Десятого международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2014. С. 236-237.
77. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Мухина И.В. Антигипоксическое н нейропротекторное действие нейротрофических факторов BDNF и GDNF в условиях острой гипобарнческой гипоксии in vivo // Материалы Десятого международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2014. С. 288-289.
78. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Митрошина Е.В., Мухина И.В. Изучение роли тирозинкиназного рецептора (TrkB) в реализации нейропротективного и антигнпоксического действия нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) при моделировании нормобарнческой гипоксии in vitro II Материалы Десятого международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак. 2014. С. 99.
79. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Митрошина Е.В., Мухина И.В. Использование методов прижизненной детекции мРНК для изучения
молекулярных механизмов нейропротектнвного действия нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vitro II Материалы Первого всероссийского симпозиума «Новейшие методы клеточных технологий в медицине». Новосибирск. 2014. С. 52.
80. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Шишкина Т.В., Мухина И.В. Антигипоксические свойства нейротрофических факторов (BDNF, GDNF) при моделировании острой гипоксии in vivo и in vitro // Материалы Первого всероссийского симпозиума «Новейшне методы клеточных технологий в медицине». Новосибирск. 2014. С. 79.
81. Сахарнова Т.А., Ведунова М.В., Митрошина Е.В., Шишкина Т.В., Мухина И.В. Влияние нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) на восстановление функциональной нейросетевой активности первичных диссоциированных культур гиппокампа после гибели части нейронов // Материалы IV международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» С.128-131.
82. Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Митрошина Е.В., Астраханова Т.А., Мухина И.В. TrkB-опосредованное антигипосическое и нейропротективное действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) // Материалы IV международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» С. 164-168.
83. Митрошина Е.В., Ведунова М.В., Сахарнова Т.А., Бобров М.Ю., Хаспеков Л.Г., Мухина И.В. Антигипоксическое и нейропротекторное действие эндоканнабиноида N-арихидоноилдофамина при моделировании острой нормобарической гипоксии // Материалы IV международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» С. 154-156
Список сокращений
ВКМ - внеклеточный матрикс мозга
ГД - глюкозная депрвацня
Кз - коэффициент защиты
ОГБГ - острая гипобарическая гипоксия
оКс - отсроченный коэффициент сохранения долговременной памяти
Тж - время жизни на «высоте»
Тпп - время потери позы
Твп - время восстановления позы
BDNF (Brain-derived neurotrophic factor) - нейротрофический фактор головного мозга
DIV (Day in vitro) - день развития in vitro
GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor) - глиальный нейротрофический фактор
iPS - индуцированные плюрипотентные клетки
N-ADA - N-арахидоноилдофамин
TrkB - тирозинкиназный рецептор В типа
Подписано в печать 16.02.2015 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2. Заказ № 75. Тираж 100 экз.
Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37
-
Ведунова, Мария Валерьевна
-
доктора биологических наук
-
Пущино, 2015
-
ВАК 03.03.01
- Исследование факторов, вызывающих повреждения нейронов при их культивировании IN VITRO
- Нейротропное и антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) in vivo и in vitro
- Реакция микроглии и астроцитов мозга грызунов на хронический стресс различной модальности
- Функциональная регуляция и онтогенез медиатор-специфичных систем нейронов беспозвоночных
- Антигипоксическое и нейропротекторное действие N-арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии in vivo и in vitro
