Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование факторов, вызывающих повреждения нейронов при их культивировании IN VITRO

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование факторов, вызывающих повреждения нейронов при их культивировании IN VITRO"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК 612.822 +612.825

МАЛИНЧИК ВАЛЕРИЯ ИВАНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ.ВЫЗЫВАЮЩИХ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕЙРОНОВ ПРИ ИХ КУЛЬТИВОРОВАНШ IN. VITRO

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1992

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии Наук

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

доктор биологических наук,профессор М.Н.Кондрашова доктор биологических наук, О.В.Годухин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук,Д.А.Мошков кандидат биологических наук,А.К.Филиппов

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится " 19 " ноября 1992г.в час. на заседании Специализированного совета Д 200.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии Наук по адресу: 142292 Московская Область,Пущино-на Оке,ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики.

Автореферат разослан " " октября 1992 г.

Ученый секретарь

Специализированного совета _____

кандидат биологических наук

i

1 '

ÍÁ // / ,

ШС-Си -

-П.А.Нелипович

J

Актуальность темы. Исследование факторов, . приводящих к повреждению нервной ткани и гибели нейронов нозга, в настоящее вреня является одной из основных задач нейробиологии CSisJo В.К., 1981Э. Массовая гибель нейронов мозга происходит при различных нейропатологических расстройствах in vivo, в то же вреня эта ситуация характерна и для препаратов нозга in vitro, например, срезов мозга, культуры его нейронов. Массовая гибель нейронов наблюдается и в здоровой нозге при синаптической пластичности во время развития.

Причины гибели нейронов нозга остаются неясныни. Среди них наиболее часто рассматриваются ацидоз, нарушение ионного баланса, токсическое действие свободных жирных кислот, токсическое действие свободных радикалов, токсическое действие , возбуждающих анинокислот, ухудшение энергетического нетаболизма. При этом последние два фактора - токсическое действие возбуждающих аминокислот и ухудшение энергетического метаболизма - в настоящее время выдвигаются на первый план при исследовании причин нейрональной гибели С Choi D.W., 1990; Novel Ii А., 19883. Среди возбуждающих анинокислот, таких как глутамат, аспартат, гомоцистеат, наибольший интерес исследователей вызывает глутамат в связи с его высокой концентрацией в нозге, что, по-видимону, определяется его ключевой ролью в процессах метаболизма, и его значимостью в нозге как нейронедиатора. Существующая экзитотоксическая теория постулирует, что причиной гибели нейронов при целон ряде заболеваний, ведущих впоследствии к нейропатологическим расстройствам, таких как гипоксия, ишемия, гипогликемия. а также таких нейропатологиях как болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона, различные виды атаксий, является выброс глутамата во внеклеточное пространство из внутриклеточных хранилищ и усиленная стинуляция ин рецепторов возбуждающих анинокислот С Choi D.W., 1990Э.

Молекулярные и клеточные нехакизны гибели нейронов, связанные с активацией рецепторов возбуждающих аминокислот, in vivo и in vitro имеют общую природу и, следовательно, использование таких нодельных систем как срезы гиппокампа и культура нейронов мезэнцефалона и стриатума, имеющих высокую плотность рецепторов возбуждающих аминокислот, позволит приблизиться к пониманию сартины нейропатологии in vivo. В то же время полученные данные южно использовать для улучшения функционирования самих препаратов

- г -

ткани иозга in vitro, широко используемых для изучения таких биофизических процессов, как регуляция механизмов синаптической передачи, ионных процессов, лежащих в основе потенциала покоя и потенциала действия, электрофизиологических клеточных основ обучения и памяти, интегративной деятельности отдельных нейронов и микросистем нейронов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование факторов, вызывающих повреждения нейронов при их культивировании in vitro. Задачи исследования заключались в следующем:

1. Исследование переживания нейронов в среде, содержащей различные концентрации глутанина, в первичной культуре клеток мезэнцефалона и стриатума.

2. Исследование временного паттерна проявления активности NMDA-рецепторов глутамата в первичных культурах клеток мезэнцефалона и стриатума, инициированных в бессывороточных средах DMEM/ITS и DMEM/F-12/ITS.

3. Анализ причин гибели нейронов, опосредованной NMDA-рецепторами, при их длительном переживании в культуре клеток мезэнцефалона и стриатума.

4. Исследование влияния глюкозы и сукцината натрия на переживание нейронов в культуре клеток мозга и в срезах мозга.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе получены новые эксперементальные данные, касающиеся причин повреждения нейронов при их длительном культивировании in vitro, а также их устойчивости к повреждениям как в культуре клеток мозга, так и в его срезах.

Продолжительность жизни нейронов, имеющих функционирующие NMDA-рецепторы, в культуре ограничена из-за активации последних глутанатом, образующимся из компонентов питательной среды при ее замене свежей.

При культивировании нейронов в среде, не содержащей сыворотку, активность NMDA-рецепторов проявляется на 13-ый. 14-ый день жизни культуры in vitro.

При длительном культивировании нейронов в бессывороточной среде оптимальной концентрацией глутамина является 0.5 мМ для нейронов мезэнцефалона, и 1 иМ - для нейронов стриатума.

Введение сукцината натрия животным внутрибрюшинно в концентрации 50 мг/кг веса за 30 минут до декапитации

стабилизирует глутанатергическую синаптическую передачу в CAI зоне гиппокакла и увеличивает продолжительность длительной потенциации, вызванной тетанической стимуляцией.

Результаты работы ногут представлять интерес для специалистов, использующих препараты ткани мозга In vitro в качестве объектов исследования, для улучшения состояния этих объектов, для исследователей, занимающихся проблемами дифференци-ровки и гибели клеток мозга, а также найти применение в медицинской практике.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на межлабораторном семинаре в Национальном институте психического здоровья СБетесда, США, 19923, межлабораторном семинаре в Институте теоретической и эксперементальной биофизики СПущино, 19923.

Публикации. Основные положения диссертации отражены в центральных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания нетодов исследования, полученных экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация содержит 15 рисунков. Список цитированной литературы включает 160 наименований отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Все среды для культивирования клеток, а также пенициллин,

стрептомицин и глутамин были получены от Gibco Laboratories.

L-глутамат, NMDA, лейцин, сукцинат, D.L-APV, поли-1-лизин,

инсулин, трансферрин и селениум были получены от Cambridge 3 3

Btochemlcals. С НЗдофамин и С НЗГАМК были получены от MEN Research Products CUSA3. Платы для культивирования клеток были получены от $ирмы Falcon. В работе с первичной культурой клеток использованы эмбрионы крыс на 15,16 день эмбрионального развития, выделённые из Беременных самок линии Спрегью-Доули. В работе со срезами -иппоканпа использованы самцы крыс линии Wistar массой 150-200г.

Первичную культуру клеток получали по методу Дрискола IDriscoll В. et al., 19913.В качестве теста на физиологическое :остояние культуры клеток использовалось измерение уровня

3

)ысокоаффинного захвата С НЗдофамина нейронами в культуре клеток

3

1еззнцефалона и С НЗГАМК нейронами в культуре клеток стриатуиа Prochiantz A. et al. , 19793. Индукция нейротоксичности в

культуре, связанная с активацией NMDA-рецепторов, создавалась ЮОЯ-ой заненой питательной среды в ячейках с клетками на 20-ый день жизни культуры in vitro. Измерение концентрации глюкозы в среде проводилось с использованием глюкозного анализатора фирмы "Beckman". Анализ пула свободных анинокислот во внутриклеточной среде и в среде инкубации проводился с использованием аминокислотного анализатора фирмы "Beckman". Фазово-контрастная никроскопия с использованием инвертированного никроскопа служила визуальнын критерием состояния клеток на протяжении жизни культуры in vitro. Для гистохимической визуализации нейронов и глии использовался метод инмунофлуоресцентной микроскопии. Подготовка животных к эксперименту для выделения срезов мозга Свведение сукцината натрия внутрибрюшинно - опытной группе, или физиологического раствора - контрольной группе} проводилась по методу Кондрашовой М. Н. CKondrashova M.N. et al., 19913. Срезы гиппоканпа' выделяли как описано в работе Годухина с соавторами СГодухин О.В., 19893. Популяционный пик СППЭ отводили от пирамидных нейронов поля CAI в срезах гиппоканпа при электрической стимуляции • коллатералей Шаффера^комиссуральных волокон через каждые 20 нинут Спо пять реализаций) в течение 7 часов. Параметры тестирующей стимуляции были :следующими: 200 мкА, 0.1мс, 0.1/с. Тетаническое раздражение производилось 10 сериями, стимулов с частотой следования 2/с, частота стимулов в серии - 100/с, их число в серии - четыре, интенсивность тока - 200-250 мкА.

Данные экспериментов обрабатывались по Т-критерию Стьюдента. Значимость различий между двумя протоколами определялась двукратным анализон вариант. Все вычисления проводили, используя программный пакет "Statgraphics" версия 2.2 CStatistical Graphics Corporation, США}, на персональных ЭВМ типа РС-ХТ/АТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Исследование влияния различных концентраций глутамина в питательной среде на переживание нейронов в культуре DMEM/ITS С13

При сравнении между собой культур, выращиваемых при различной концентрации глутамина в среде, по таким параметрам как потребление глюкозы и концентрация белка в ячейках, выяснилось, что эти параметры значительно выше при 4мМ Gin в среде в культуре С1Э по сравнению с 0.5 нМ Gin в ней Сдля клеток мезэнцефалонаЗ, и 1-им мМ Gin в среде Сдля клеток стриатумаЭ, в первые дни жизни

- s -

культуры, что, по-видимому, указывает на более быстрое развитие культуры в первой случае; в то же время к 19-ому дню жизни культуры 'in vitro ситуация меняется на противоположную происходит значительное падение величины этих параметров при 4 мМ Gin и их подъем при 0.5 и 1 мМ в питательной среде Срис.1Э, что, по-видимому, говорит о гибели части клеточной популяции к этому сроку при концентрации глутаиина в среде, равной 4 мМ.

Результаты фазово-контрастной микроскопии при этон показали различие в скорости дифференцировки нейронов в культуре, при ведении ее в питательной среде с различным содержанием глутамина. Так, при ведении культуры клеток мозга в питательной среде, содержащей 4 мМ глутамина, появление отростков нейронов и их агрегация, указывающие на созревание и дифференцировку нейронов, происходят уже на 7-ой день жизни in vitro, в то вреня как в среде, содержащей 0.5 мМ глутамина, эти же процессы наблюдаются

100 90 80 70

«о

рис.1 Потребление глюкозы и концентрации белка в ячейках в культуре клеток мезэнцефалона. Черные столбики - глюкоза, потребленная клеткани Св мкг на ячейку}: CID - с 7 по 11 день. C2D с 11 по 15 день, С3D - с 15 по 19 день, где CID . С 2D, C3D - номера столбиков. Запггрихованые столбики - концентрация белка в ячейке в мкг в дни 11, 15, 19 жизни культуры in vitro.

На графиках 1, 2, 3, 4, и 5 представлены указанные выше паранетры, измеренные в культурах, инициированныхых в следующих средах: DMEM/F-12/1 TS, DMEM/ITS+0. 5мMGIn, DMEMXITS+1. OmMGIп, DMEM/ITS+2. OHMGln, DMEM/ITS+4. OmMGIп соответственно.

лишь к 11-ому дню.

Иммунофлуоресцентныи методом, с использованием ноноклональных антител к полипептидам нейрофиланентов с М.В. 68 кД и М. В. 160 кД, удалось установить, что в питательной среде, содержащей 4 мМ глутаиина, тела нейронов и их отростки определяются на 16-ый день жизни in vitro; с другой стороны уменьшение флуоресценции нейронов на 19-ый день жизни культуры in vitro указьюает на уменьшение количества антигенов, взаимодействующих с моноклональными антителани, связанными с флуоресцирующими группами, и, таким образом, по-видимому, говорит о деструктивных процессах, происходящих в цитоскелете нейронов к этому времени при ведении культуры клеток в среде, содержащей 4 мМ глутаиина. К тому же, наблюдающееся изменение формы астроцитов в среде, содержащей 4 нМ глутаиина к 19-ону дню жизни in vitro по сравнению с днем 16-ым -неконтролируемый рост их отростков, при одновременно имеющих место падении концентрации белка в ячейках с культурой клеток, и потребления глюкозы клетками, по-видимому, указывает на гибель определенной части нейронов к этому времени.

В то же время нейроны не определяются иммунофлуоресцентныи нетодом на 16-ый день жизни in vitro при концентрации глутаиина в среде инкубации, равной 0.5 мМ. Однако они четко определяются этим нетодон и дают значительную флуоресценцию на 19-ый день жизни in vitro при ведении культуры в этой же среде, что говорит о более позднем появлении антигенных детерминант - полипептидов нейрофиламентов с М. В. 68 кД и 160 кД, и, таким образом, по-видимому, указывает на более низкую скорость дифференцировки нейронов при содержании глутаиина в среде, равной 0.5 нМ, по сравнению о 4 ий глутаиина в ней.

Такии образои, при длительном культивировании нейронов оптимальная концентрация глутаиина в питательной среде - 0.5мМ для нейронов меззнцефалона, и 1мМ - для нейронов стриатуиа. При концентрации глутаиина в среде, равной 4иМ, происходит ускоренное развитие культуры клеток, и, по-видиному, связанная с этим ускоренная гибель нейронов. Эта тенденция гораздо сильнее выражена в культуре клеток иеээнцефалона, чей в культуре клеток стриатума.

2. Исследование временного паттерна проявления активности NMDA-рецепторов глутаиата в первичных культурах клеток иеззн-цефалона и стриатуиа, инициированных в бессывороточных средах DMEK/ITS С1Э и DMEM/F-13X1TS С23 ■ Для выполнения поставленной задачи в дни 11, 12, 13 и 14 жизни культуры С1Э и С23 in vitro к

питательной среде в ячейках ны добавляли агонист этих рецепторов И-нетил-О-аспартат СЫМЛАЭ в концентрации 50 нкМ, который, в подобной концентрации, при длительном экспонировании с ним нейронов и наличии активных ИМОА-рецепторов должен приводить к гибели нейронов. Повреждения нейронов в культуре при 20-ти часовом экспонировании их с ММОА наблюдались, как правило, на 13-ый, 14-ый

рис.2 Созревание NMDA-рецепторов в культуре клеток мезэнцефалона и стриатума. Культура клеток инициировалась в Средах DMEM/F—12/1XS и DMEM/I TS+4mMG1 п . В дни 11, 12, 13, 14 жизни культуры in vitro измерялся захват дофамина Снейронами мезэнцефалона} и ГАМКСнейронани стриатумаЭ через 20 часов либо после замены питательной среды в ячейках, либо после добавления в среду культивирования APV или NMDA.

Обозначения кривых : о- среда в ячейках не заменяласьСЫО,■а состояние нейронов служило контролем для остальных ситуаций; в-замена свежей средой DMEM+4mMG1 п; V- замена средой DMEM+4mMG1 п +APV; T--NC+50MKM NMDA; Q-NC+50mkM NMDA+M>V.

Обозначения графиков: С1Э - захват С Н] дофамина нейронами в культуре клеток мезэнцефалона, выращенной в среде ДМЕМ+4мМС1п; С2Э

- то же, что и на предыдущем графике, но клетки инициированы в среде DMEM/F-12XITS; СЗЭ - захват t Н5ГАМК нейронами в культуре клеток стриатума, выращенной в среде DMEM+4mMG1п; С43 - то же, что и на предыдущем графике, но юлетки инициированы в среде D^EM/F-12/1TS. Обозначение осей: по оси ординат - захват С Юдофамина Сили С ЮГАМКЭ в распад/мин, по оси абсцисс - дни жизни культуры in vitro.

день жизни in vitro и были наибольшими в культуре DMEM/ITS клеток мезенцефалона. Антагонист NMDA-рецепторов APV полностью блокировал деструкцию нейронов, вызванную NMDA Срис.2).

3. Анализ причин гибели нейронов, опосредованной NMDA-рецепторани, при их длительном переживании в первичных культурах клеток меззнцефалона и стриатуна. Длительное культивирование нейронов приводит к необходимости обновления питательной среды в ячейках с клетками. При этом в культуре нейронов, имеющих функционирующие NMDA-рецепторы. замена питательной среды свежей вызывает кассовую гибель нейронов из-за активации NMDA-рецепторов. Антагонист NMDA-рецепторов APV блокирует эти повреждения. Мы протестировали динамику изменения концентрации внутри- и внеклеточного г-лутаната в культуре клеток меззнцефалона, выращиваемой в среде DMEM/ITS+4mMG1п, после замены питательной среды на день 20-ый жизни культуры in vitro и последующей 29-часовой инкубации этой культуры в средах DMEM/ITS, DMEM/ITS+4HMG1 n, DMEM/ITS+4MMG1 п+ APV, и обнаружили четкую корреляцию между концентрациями эндогенного и экзогенного глутамата в случае сред DMEM^ITS и DMEM/ITS+ 4mMG1п. В случае среды DMEM/ITS не наблюдалось увеличения концентрации глутамата как внутри клеток, так и в инкубационной среде. В то же время в среде инкубации DMEM^ITS+4HMGln рост концентрации глутамата во внутриклеточной среде сопровождался ростом концентрации глутамата в среде инкубации. Присутствие APV в среде DMEM/ITS+ 4мМв1п не препятствовало увеличению концентрации глутамата внутри клетки. Тем не менее изменение концентрации глутамата в среде инкубации было при этом незначительным: до 4.3мкМ к 8 часам инкубации Спротив 25мкМ без APV3 и 3.2мкМ к 29 часам инкубации Спротив 122икМ без APV3. Существовала также четкая корреляция между накоплением глутамата в среде выше внутриклеточного уровня, С~4.4мкмэ, наблюдающегося в состоянии динамического равновесия между клеткой и средой Свне ситуации метаболического стресса, связанной со сменой средьО, и процентом гибели нейронов.

Мы исследовали также влияние астроглиальных клеток на устойчивость нейронов в культуре к повреждениям, вызываемым сиеной питательной среды Срис.3,43. Согласно общепринятой концепции астроциты играют поддерживающую роль в жизнедеятельности и функционировании нейронов CStevart R. М. , Rosenberg R. N. , 19793. Среди множества функций, выполняемых астроцитами in vivo и in vitro, немаловажную роль играет захват ими глутамата и аспартата

CBalcar V.J. et al. , 1977ЭБлагодаря этому захвату концентрация аминокислот может сохраняться на уровне ниже токсического для нейронов СHertz L. et al. , 1980D. Для исследования способности астроцитов защищать нейроны от повреждений в использованной нами модели - первичных культурах клеток мезэнцефалона и стриатума, помимо смешанной культуры нейронов и астроцитов, DMEM/F-12/ITS C2D , мы использовали культуру клеток, состоящую, практически, из одних нейронов. На 3-ий день жизни культуры DMEM/F-12/1TS in vitro в питательную среду добавлялся ингибитор пролиферации глиальных клеток Ara-С в концентрации ЮмкМ. Это позволяло получить культуру нейронов C3D, содержащую лишь незначительный процент астроцитов. Результаты наших экспериментов показали, что глиальные клетки защищают нейроны от повреждений: если в культуре С 2D массовая гибель нейронов присходит лишь в результате 100>{-ной замены среды свежей, содержащей в высокой концентрации глутамин и другие аминокислоты, то в культуре С 3D нейроны гибнут даже после замены среды буфером, содержащим лишь 2 мМ лейцина. Конкурентный антагонист NMDA-рецепторов APV защищает нейроны от повреждений в культуре С 2D, и не защищает - в культуре С 3D, в то вреня как неконкурентный антагонист, МК-801, защищает нейроны от повреждений в обеих культурах. Мы полагаем, что различие в способности антагонистов NMDA-рецепторов - МК-801 и APV - защищать нейроны от повреждений, вызываемых сменой среды, определяется разницей в механизмах их действия. Поскольку МК-801 является неконкурентным антагонистом NMDA-рецепторов глутамата, то его способность блокировать гиперактивность NMDA-рецепторов, и связанную с этим последующую гибель нейронов, не зависит от концентрации глутамата в среде инкубации. В то же время способность конкурентного антагониста APV блокировать NMDA-рецепторы зависит от концентрации глутамата в среде из-за существующей конкуренции между двумя этими лигандами за участок связывания на NMDA-рецепторе. Известно, что системы высокоаффинного захвата глутамата представлены, в основном, в астроцитах CHertz L., 1981Э, и, таким образом, возножно.что их незначительное количество в культуре C3D приводит к увеличению времени экспонирования высвобождающихся из клетки молекул глутамата, накоплению их в среде выше уровня, уже способного вытеснять APV с участков связьюания на NMDA-рецепторе.

Следовательно, в использованной нами нодели - первичной культуре клеток мозга, астроциты действительно защищают нейроны от

повреждений, вызываемых сненой питательной среды: замена среды приводит к значительно большим повреждениям нейронов в культуре клеток мезэнцефалона и стриатума, состоящей, практически, из одних нейронов, при наблюдающейся при этом значительно более высокой концентрации глутаната в среде инкубации по сравнению с таковой в смешанной культуре нейронов и астроцитов.

Нейроны мезэнцефалона и нейроны стриатума повреждаются, примерно, в одинаковой мере при занене питательной среды в культуре, состоящей, практически из одних нейронов, однако в смешанной культуре нейронов и астроцитов при замене питательной среды нейроны мезэнцефалона повреждаются в большей степени.

Таким образом, учитывая всю совокупность описанных выше данных, мы предполагаем, что накопление глутамата в среде выше токсического уровня связано со значительным увеличением его концентрации внутри клетки и последующей утечкой в среду

рис.3 Переживание нейронов в культуре клеток мезэнцефалона через 20 часов после ЮОХ-ной замены питательной среды в ячейках. Состав сред инкубации: 13 КС - без сиены среды, контроль. 23 N0+61 п

33 вР/П^ 43 СРУ1Т2+С1 п 53 СЗР/П-З+ап+АРУ 63 ТЗ+ЫМЛА С20 часовЗ

73 (ЗР/1ТЭ+НМОАС пульс 30 *3 83 ОР/ХТЗ+вШ С20чЗ аз бР/1тз+е1и с пульс зо*з у Обозначения графиков: среде ЕЗМЕМ/Р-12/1ТЗ; 33

103 100Х СРЭ

113 100* СРЭ+01п

123 ЮО* СРЭ+Ьеи

133 1 00* СРЭ+в1п+1.еи

143 10ОУ. СРЭ+Ип+Ьеи+АРУ

153 100* СРЭ+Э1п С пульс 30'3

163 100* СРЭ+в1п+Ьеи+МК-801

173 ЮО* СРЭ+ЫМОА С пульс 30'3

23 - культура клеток инициировалась в - то же в среде ОМЕМ/Г-12/1Т5 -Ага-ССдень 33. По оси абсцисс - номера столбиков, обозначающих уровень захвата дофамина при инкубации в различных средах. По оси ординат - уровень захвата дофамина.

по градиенту концентрации на фоне недостаточности энергозависимых систем высокоаффинного захвата глутэиата из-за метаболического стресса и возможного ухудшения энергетического статуса клетки при смене питательной среды.

4. Зависимость выживания нейронов в культуре клеток мезэнцефалона после 100Я-Ной замены среды от присутствия в среде глюкозы и сукцината натрия. 20-часовая инкубация клеток в бикарбо-натнон буфере с 20нМ глюкозы, также как и в бикарбонатном буфере с 20мМ глюкозы и 4мМ глутамина, не вызывала повреждений нейронов. В то же время инкубация культуры клеток в бикарбонатнон буфере без глюкозы, но с 4мМ глутамина, приводила к повреждению нейронов; добавление в эту среду 6мМ сукцината натрия не защищало клетки от повреждений, в то время как использование антагониста ИМОА-рецептора АРУ в среде без глюкозы, но с 4мМ глутамина.

рис. 4 Изнерение содержания глутамата в среде инкубации через 20 часов после 100%-ной замены питательной среды в ячейках в культуре клеток мезэнцефалона Собозначения графиков такие же как на рис.33. В культуре клеток мезэнцефалона содержание глутамата измерялось в ячейках, содержащих следующие инкубационные растворы Спорядок . перечисления соответствует номерам столбиков на графиках}:

13 N0 63 100% СРЭ

23 МС+С1п 73 100% СРЭ+Э1п

33 83 100% СРЭ+Ьеи

43 ЗК/1ТЗ+е1п 93 100% СРЭ+С1п+Ьеи

53 *П>+01 п +АРV 103 100% СРЭ+С1п+Цеи+МК-801

113 100% СРЭ+Ип+Ьеи+АРУ По оси ординат концентрация глутамата в мкм.

блокировало нейрональную гибель.

Результаты проведенных экспериментов показывают, что нейроны повреждаются при длительной инкубации в среде без глюкозы в присутствии потенциального источника глутамата - глутамина, что, по-видимому, связано с их ухудшенным энергетическим статусом в этих условиях. Блок повреждения и гибели нейронов антагонистом NMDA-рецепторов APV говорит об участии NMDA-рецепторов в этом процессе. Сукцинат натрия не защищает нейроны от повреждений, что, возможно, связано с тем, что астроциты не могут использовать его в качестве энергетического субстрата Сглиальные клетки содержат незначительное количество митохондрий: в них, практически, отсутствует маркерный нитохондриальный фермент - цитохромоксидаза, и на долю окислительного метаболизма приходится лишь 5Х образующейся АТФЗ.

S. Влияние сукцината натрия на переживание нейронов в срезах гиппокампа. Как известно, плотность NMDA-рецепторов в CAI зоне гиппокампа одна из самых высоких в мозге и эти нейроны наиболее уязвимы в условиях ухудшенного энергетического статуса клетки — гипоксии, ишемии и гипогликемии CPulsinelli W. АЗ. Мы использовали короткоживущую культуру клеток мозга, срезы гиппокампа, в качестве второго объекта наших исследований. На наш взгляд использование двух моделей, первичной культуры клеток мозга и срезов мозга, оправдано их взаимодополняющими качествами. На первой модели, благодаря большей ее прдолжительности жизни, легкой имитации условий повреждения нейронов, связанных с нейротоксичностью возбуждающих аминокислот, ны могли исследовать биохимические механизмы и условия, которые длительно на протяжении всей жизни культуры формируют восприимчивость к токсическому действию возбуждающих аминокислот. Во втором случае, при работе на срезах мозга, мы могли исследовать переживание нейронов в ткани мозга с сохраненной норфофункциональной организацией, и использовать в качестве теста на их состояние такие специфические функции нейрона, как проведение нервного импульса, возбуждение, торможение.

В срезах гиппокампа, после выделения их из мозга животных, наблюдается падение уровня высокоэнергетических фосфатов, по-видимому, связанное с декапитационной ишемией. Мы попытались улучшить функциональное состояние срезов мозга, внеся коррекцию в их энергетический метаболизм. Ранее было обосновано представление.

согласно которону устойчивость к гипоксии обеспечивается переключением тканевого дыхания на флавинзависиное окисление янтарной кислоты, образующейся в обход НАД-зависимых этапов цикла Кребса СКондрашова М. Н. ,19893. Мы предположили, что усиление данного пути за счет экзогенного введения сукцината приведет к коррекции энергетического метаболизма, и, таким образом, улучшению функционального статуса нейронов.

Сукцинат в среде суперфузии как в концентрации 2.5 ммоль/л, так и в концентрации 0.35 нмоль/л при отсутствии глюкозы в среде, не приводил к восстановлению функциональной активности срезов после начала суперфузии. Сукцинат натрия, введенный в среду суперфузии срезов гиппокампа в концентрации 0.35 и 2.5 мМ на фоне присутствия в ней глюкозы, вызывал некоторое увеличение импульсной активности нейронов и не влиял на амплитуду вызванного ответа.

При сравнении срезов гиппокампа, выделенных из животных,

О Н-.-1-1-----1---1-1-г-,-,-1-,-1-,-г-1-,-.-

12 3 4 5 6 7 ВРЕМЯ

(ЧАСЫ)

Рис.3 Изменение амплитуды популяционного пика после высокочастотной стинуляции коллатералей Шаффера. Стрелкой отмечен нонент стимуляции.

1 - в срезах гиппокампа контрольных животных, 2 - в срезах гиппокампа животных, которым вводился сукцинат натрия внутрибрюшинно в концентрации С50мг/кг весаЭ за 30 минут до декапитации.

По оси абсцисс - время от начала суперфузии срезов, ч; по оси ординат-относительная амплитуда ПП, X Сза 100/4 принята амплитуда ПП, регистрируемого через 3 часа после начала суперфузииЭ. Каждое значение амплитуды ПП представляет собой среднее из пяти значений, полученных в разных опытах.

который внутрибрюшинно вводился 0.9v. NaCl, с таковыми, выделенными из животных, которым внутрибрюшинно вводился сукцинат натрия С50мг/кгЭ, наблюдалась значительная разница в функциональной активности срезов. В срезах гиппокампа, выделенных из животных контрольной группы, амплитуда популяционного пика СПГО значительно варьировала без четко выраженного плато во временной динамике. В срезах же гиппокампа, выделенных из мозга обработанных сукцинатом животных, динамика амплитуды ПП в процессе регистрации носила более стабильный характер с четко выраженным плато. Длительность поддержания потенциированного состояния глутаматергических синапсов в срезах гиппокампа таких животных была значительно выше, чем в срезах гиппокампа контрольных крыс Срис.5Э. Увеличенные по амплитуде ПП после тетанической стимуляции в первом случае отмечались в течение всего времени наблюдения, тогда как в контроле их амплитуда возвращалась к норме через 100 мин. после тетанической стимуляции. Амплитуда ПП у сравниваемых групп животных через 120, 140 и 160 мин. после тетанической стимуляции различалась достоверно С р<0.05Э.

Таким образом, проведенный анализ показал, что сукцинат натрия, введенный животным внутрибрюшинно за 30 минут до декапитации в концентрации 50 мг/кг веса стабилизирует глутаматергическую синаптическую передачу в CAI зоне гиппокампа и увеличивает продолжительность длительной потенциации, вызванной тетанической стимуляцией. В то же время сукцинат натрия, введенный в среду суперфузии срезов гиппокампа в концентрации 0.35 и 2. 5 мМ, не влияет на амплитуду вызванного ответа.

Помимо прямого использования нейронами в качестве субстрата сукцината, введенного внутрибрюшинно, нельзя исключить его опосредованного воздействия на них через кортикоадреналовую систему. что, как показано, также может иметь место, и рассматривается как антистрессорное действие этого метаболита CKondrashova M.N. et al., 1S91D.

- 15 -ВЫВОДЫ.

1. Гибель нейронов при их длительном культивировании in vitro, связанная со сненой питательной среды, опосредованна активацией NMDA-рецепторов, поскольку блокируется антагонистом HMDA-рецепторов APV.

2. Активность NMDA-рецепторов в первичных культурах клеток неззнцефалона и стриатума, инициированных в бессывороточных средах DMEM/I.TS и DMEM/F-12/ITS, проявляется на 13-ый, 14-ый день жизни культуры in vitro.

3. Гибель нейронов после смены питательной среды в ячейках с культурой клеток вызывается глутаматом, высвобождающийся из внутриклеточных депо в результате его диффузии по градиенту концентрации.

а.3 в смешанной культуре нейронов и астроцитов замена питательной среды свежей, содержащей 4 мМ .глутамина, ведет к повышению концентрации как эндогенного, так и экзогенного глутаната; антагонист NMDA-рецепторов APV блокирует повышение концентрации глутаиата в среде, не влияя на динамику его изменения внутри клетки;

б.3 замена питательной среды свежей, не содержащей глутамин, не приводит к заметному повышению концентрации глутамата внутри клетки и в среде инкубации.

4. Глиальные клетки защищают нейроны от повреждений, вызываемых заменой среды свежей; нейроны гораздо более устойчивы к такин повреждениям в снешанной культуре нейронов и астроцитов, чен при, практически, отсутствии последних.

5. При длительном культивировании нейронов в среде DMEM/ITS оптимальной концентрацией глутамина в среде является 0.5мМ - для нейронов мезэнцефалона, и 1мМ - для нейронов стриатума. При концентрации глутамина в питательной среде, равной 4 мМ, происходит ускоренное развитие нейронов, и, по-видимому, связанная с этим, их ускоренная гибель.

е. Сукцинат натрия, введенный животным внутрибрюшинно за 30 минут до декапитации в концентрации 50 мг/кг веса стабилизирует глутаматергическую синаптическую передачу в CAI зоне гиппокампа и увеличивает продолжительность длительной потенциации, вызванной тетанической стимуляцией.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Малахова СМалинчикЭ В. И. , Годухин О. В., Кондрашова М. Н Влияние сукцината на эффективность глутаматергической синаптической передачи в переживающих срезах гиппокампа крыс. Нейрофизиология, 1992, т.24, N1, с.106-108.

2. Годухин 0.В., Малахова СМалинчикЭ В. И. , Калеменев С. В. Динаника функционального состояния переживающего среза мозга и факторы, вызывающие его нарушение. - Успехи Физиологических Наук, 1992, N1, с.40-57.

3. Driscoll В. , Malinchik V. The effect of glutamine on the development of neurons in mesencephalic culture from rat embryous. - Neurochem Res. , 1S92, in press. .

Список использованных сокращений. APV - 2~анино-5-фосфоновалериат; Ara-C - цитозинарабинозид С; DMEM - среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM/F-12 - среда, состоящая из 3-х объемов среды DMEM и 1-го объема среды Хема-F-12; ein - глутамин; ITS - инсулин, трансферрин, селениум; Leu -лейцин; МК-801 - дибензоциклогептенимин; мМ - милиноль; мкМ -микромоль; NMDA - N-метил-Д-аспартат; СРЭ - сбалансированный раствор Эрла; ЮОйСРЭ - СРЭ, содержащий 20мМ глюкозы; ФСБ -фосфатно-солевой буфер

Зак.бОЗЭР 29.07.92 г. Т»ц. 125 экз.

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН