Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фактора роста нервов на дифференцировку холинергических нейронов в культуре ткани

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние фактора роста нервов на дифференцировку холинергических нейронов в культуре ткани"

кшвдса ОРША ЛШШ, 0РД2НА ТРУЯОБОГО КРАСНОГО ¡ЖИЗНИ И ОРДЕНА ОКГПВРЬСКОЛ РЕШДШИ ГОСУДАРСТВЕННЫЕ УНИЕЗРОНТВТ еи:энн IIЕ ЯШЮООЫ шшсглчззш елшьтэт

Нз правах рукописи

1ШЗ 1ПШАЯ ГОШТАНТШШЧ

Ш1ПН1Ш РЛПТОРЛ РОСТА ¡ПРБСЗ ИЛ ЯПКЗРШШРОЕКУ

тшшрпюош шжгюв в ПУЛМУРЗ ТШП

Стощшапоо?» 03. СО. 11 - 0иярг»логия, {•"оточ'огт я шгтодзггл

о огаетдт

на сс:*о:г,:г') учэпоЯ отвпокп б:х>г0п:чзс!ся пая?

ггюггз - 1С92

Работа выполнена в ЮШ шага РАШ

Научный руководитель: кок-юр бкояогкчоских наук И. R Eimropos

0ф5?1шаяьида оппоненты:

- доктор бдаюгнческнх наук Т. А. Лйонтовнч

- кандидат биологических i:ajrx М. а Козлова

Шдусая организация - НИИ молекулярной генетики РАН

Зац^га диссертации сосгойтсй " н " ¿//•¿''УЖ 1092 г. в 42с в на васедшши специализированного ученого совета Д.

053. 05. SS ара Московской государственной университете ist

t£ В .йЬионосова. Адрес: 1117234, Мэсхва В-234, Ленинск*» гори, \TJ, Шологи-4Sстай факультет.

С диссертацкей шшо ояпшсош.ться в 0кЗ£:;отогса биохогк-чоского факультета Шсковского государственного yiiKBöpcKTefa им. М. В. Лошносова

Автореферат разослая" 3 " ^АЛЛ-Л 1992 г.

Ученый секретарь Спевдшзотровшшого совета кандидат биологических наук

Е. R Ка®гс?ратоЕа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной ив наиболее актуальных проблем современной нейробиологии является проблема развития нервной системы и составляющих ее клеточных элементов - нервных и гли-альных клеток. Среди различных аспектов этой проблемы важное место занимает исследование различных межклеточных взаимодействий, которые определяет процессы развития нейронов, и изучение опосредующих это взаимодействие гуморальных факторов. Особенно интенсивно исследуется в этом плане фактор роста нервов (ФРН), открытый ещэ в БО-х годах Леви-Мэнтальчини и Гамбургером и охарактеризованный ши как трофический фактор адренергических симпатических и некоторых сенсорных нейронов, способный интенсивно стимулироьмь рост и развитие этих нейронов [Lövl-Mantalohint R. , Hamburger V. , 1061; Levl-Montalohlnl R. , 1089h Позднее по аналогии с этими исследованиями начались поиски зависимых от ФРН адренергических нейронов в центральной нервной системе (ЦШ), и в 1982 году Крутчер tCrutcher H.A. and Collins F., 10821 обнаружил значительное содержание ФРН в гиппокампе. Было показано таю», что иньецированный в кору ФРН транспортируется в холинергические нейроны бавальных ядер переднего мозга [Sailor М. , Schwab М. Е.. 19841, и что на цитоплазматическнх шмбранах этих нейронов присутствуют рецепторы к ФРН [Tanluohi М. , Bahwelzer J.B. and Jonson E. M. , 19861. В этой связи рядом исследователей было высказано предполодание,- ФРН является трофическим фактором холинергических нейронов ЦНС, и что дефицит ФРН в ЦНС может лекать в OOHöfee патогенеза болезни Альцгеймера С Appel S. Н., 1982; Hs>rU F, .Wainer W. J. , 1086) . В дальнейшем многочисленные исследования, выполненные на моделях in vivo, действительно показали, что при разрушении структур мозга, слу-шцих мишенями иннервации холинергических нейронов Оазальных ядер переднего мозга, в которых осуществляется синтез ФРН, а также при нарушении аксонального транспорта этого нейротрофи-ческого фактора, в Оазальных ядрах переднего мозга развиваются нейродегенеративные процессы. Внутрижелудочковое введение ФРН предупреждает развитие таких нейродегенеративньи изменений.

В пооледние годи были начаты интенсивные исследования действия ФРН на холинергические нейроны Оааальных ядер переднего юэга in vitro. В результате этих исследований было показано, что

ФРН влияет на выживание холинергических нейронов [Hartlkka j. >¡,1 Heft i F., 1988; Hatanaca H. , Tsukui H. , 1988.1 , оцоооо^твует ловышеншп в этих нейронах уровня активности ходина-цетилтрансфераэы (ХАТ) и ацетнлходинэстераэы ( АХЭ), а также ведет к увеличению длины и разветвленности холинергических волокон в диссоциированных культурах Septum pel lucidum (септум) [Hartlkka J. and Heftl F., 1988). Однако эти единичные исследования не носили систематического характера, и главный вопрос о роли ФРН в развитии холинергических нейронов оставался открытым. Исходя из этого и учитывая имеющиеся на момент начала иссле-доршшя (1987 год) данные, была сформулирована цель настоящей работы - исследовать влияние ФРН на «изнеспособность, дифферен-цкрсвку и регенерация холинергических нейронов Оазальных ядер переднего юз га в клеточных культурах. В соответствии с этой целью задачами исследования были:

- полу^чть диссоциированные клеточные культуры Оазальных »дер переднего шэга эыбрионов крыс, в которых возможна шрфо-логчь еская характеристика дендритной системы отдельных холи-вергкческих нейронов;

- изучить рост и развитие диссоциированных культур септума и Отчального крупноклеточногс ядра (¿ейнерта;

- исследовать влияние ФРН на жизнеспособность холинергических нейронов Назальных ядер переднего мозга;

- изучить влияние ФРН на уровень активности АХЭ в холинергических нейронах полученных клеточных культур;

- исследовать влияние ФРН на дифф^ренцировку холинергических нейронов Оазальных ядер переднего мозга.

В связи с тем, что появились данные свидетельствующие о tow, wo ганглиоэиды способны усиливать действие ФРН на уровень активности ХАТ в холинергических нейронах переднего мозга tCut-11 о A.C. , Gar af a lo L,Kenig-~berg R. L. , Mavsinger D. , 19891 была поставлена дополнительная задача: исследовать совместное действие ФИ1 и ганглиозида GM1 на жизнеспособность холинергических нейронов септума в клеточных культурах.

новизна результатов определяется рядом впервые полученных данных. Было обнаружено, что в диссоциированных клеточных культурам септуш, развивавшихся в присутствии ФРН. п;»оисхо-диг значительное возрастание рлямеров тел холинергических нейронов, применение мчтодз морФометрическпго одялияп-Ж'йронов о от-¡ю-'-тками на клеточных культурах, позволяло подать, что фактор

- з -

роста нерэов участвует в морфогенезе дендритной слствкы септаль-нш холинергичвских нейронов. Обнарукэно, что в клеточных культурах соптуиа, развивавшихся в присутствии ФРН, у холинергичвских нейронов возрастает количество первичных дендрнтов. С поющью количественной оценки числа АХЭ-пологительных нейронов в культурах сэптуыа и базального крупноклэточного ядра Мэйнерта было продемонстрировано, что действие ФРН на эти культуры реализуется в первую наделю развития in vitro.

Научно-практичеопая значимость исследования состоит в том, что результаты работы могут быть использованы а качестве экспе-ргаштаяькой ооновы для разработки возможного клинического при-ыэнения ffPH при нейродегенеративных заболеваниях.

Основные подотанкя диссертации вьшосимыэ на защиту:

1.ФРН вктивно участвует в трфогенеае холинергичвских нейронов соптуш.

2. В присутствии ФРН в клеточных культурах соптуыа зоэ рас тает количество нейронов с большим количеством первичных дендритов.

3. CFH увеличивает вьшваешсть септальных холинергичвских нейронов в условиях культивирования.

4. ФРН интенсивно влияет на уровень активности ацетилхолинэсте-раэы в холинергичвских нейронах септу\£а и базального крупноклэточиого ядра 1Мнерта.

Апробация работы: Основные положэния работы были представлены на научной конференции 1Ш шэга АШ СССР, яа 22-м 1{эдду-народном Дунайском онкпоэиуш нейрологичесюа наук.

Ш теш диссертации опубликовано семь печатных работ: дпоэ тезисов и пять статей.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах и содергят еледувдие разделы: введение, обзор литературы, материалы н катоды исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы, состоящий нэ 12 отечественных и 97 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 32 фотографиями, таблицами, рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основные экспериментальные данные этого наследования получены на тканевых и клеточных культура* спинальных ганглиев и холинергичвских ядер переднего мозга 1Б-19-дневних эмбрионов крыс линии "Вистар." Полученные методом микродиссекции фрагменты тка-

- л -

ни промывали в солевом растворе (СЬГ, f.bscona A.A., 1962; Moscona А. А. 1965], а затем инкубировали 16 минут при 37°С в смеси ферментов, приготовленных и& том га растворе.В состав смеси входили 0,06% трипсина, 0.02Х ЭДГА, 0,0004% ДНКаэы, б иг/мл глюкозы и 43 мг/мл бычьего сывороточного альбумина После ферментной обработки ткань промывали в трех сменах CNF к двух сменах солевого раствора Сишса, содержащего 10% сыворотки, а затем подвергали механической диссоциации повторный пилотированием в культуральной среде, состоящей из среды йгда - 90%, bvS-риональиой телячьей сыворотки - б%, планцентарной сьторотки человека - 6Х, глюкозы 8 иг/ия, глутамина 2 Uli, органического буфера HEPES ШиУ, pH среды 7,2-7,4, Клеточную суспензии центрифугировали 1 мин. (1000 оО/мин.), супернатант сливала, а осадок ресуспендировали в питательной среде того т состава.

Мокослойиш клеточные культуры выращивали на полмэтилешши-ковом клк коллаген-полн-Ь-диэиновом субстрате в 24-луночных плаоткковь, юи»рах иди на покровных стеклах ZZxZZ мм.

¡окочиая плотность клеток на суОстрате составляла 00-130 тыс. клеток на см . Культивирование проивводили в С02 инкубаторе (б% 00г . 06% В08духа) при температуре 35,6°С и относительной влажности S8X.

В экспериментах использовали культуры септуыа и ядра Шй-иврта 16-16 н 18-10-дневных эьярионов крыс. Культивирование производили 7 или 14 дней, с полной с к» но0 питательной сроды каядые 3-4 суток для удаления эндогенных ростовых факторов. Продолет-тельность культивирования определялась конкретной задачей эксперимента.

Для получения тканевых культур, выделенную из шэга 16-18-дневных эмЭрионов крыс ткань септума рассекали скальпелем на 4-6 частей в солевом растворе (СМ7). Далее фрагменты каждого септума помещали в отдельную ячейку Z4-луночной пластиковой камеры на кшлаген-полм-Ь-лиэкновый субстрат в 0,4 мл питательной средн. Культивирование производили в СО, инкубаторе при 36,6° С и относительной влажности 98% в течении пяти суток.

йивые культуры исследовали при помощи инвертированного микроскопа "Reichert" (Австрия) при освещении по методу светлого поля и фазового контраста. Для идентификации -холинергических нейронов использовали гистохимический метод окраски на АХЭ по Карновскоыу-Ругсу í El-badavl A., Setene Е. А. , 1067] . Для более-

- Б -

полного выявления отростков холннергичосюя нейронов, применяли модифицированный метод серэОрянного контрастирования пигмента Отчета СНо<Згвэп 1.С. , Ваооп 5. I. , РПоо 0. Ь , 1986] , окрашва-ггдзго нейроны при гистохимической реакции на кУЗ по Карновскю-му-Рутсу. Полученные препараты заключали в канадский бальзам или глицерин.

Подсчет холинергичэсиих нейронов после реакции на АХЭ производили тотально на всем препарате. Для определения выживаемости холкнвргичаских нейронов подсчитывали все АХЭ положительные клетки независимо от интенсивности их окрашивания. Для сравнения культур по уровню активности в них АХЭ, в этих культурах подсчитывали количество интенсивно окрашенных нейронов. В каждом экспе-Р'.акште подсчет ходинергических нейронов производили не менее чем на 7 культурах.

В экспериментах по влиянии ФРН на изменение популяционного состава холияергических нейронов в клеточных культурах, на препаратах, окрашенных на АХЭ раздельно подсчитывали количество двух-, трех- и четырехдендритных АХЭ-положительных нейронов. В ходе эксперимента было просчитано 910 нейронов; результаты подсчета выраиаля в процентном ооотновэнии двух-, трех- и четы-рехдендритных нейронов, от количества клеток, просчитанных на одном препарате.

Количественную оценку влияния ФРН на рост волокон в тканевых культурах септуыа проводили 1этодом раздельного подсчета эксплантатов о выраяэнныу нейритныы ростом н эксплантатов, в зоне роста которых нейриты отсутствовали.

Результаты подсчетов обрабатывали статистически с применением критерия Стыодента при уровне эначтюети <0,05.

В 7-дневных культурах, полученных ко септуыа и базалького крупноклоточного ядра ййнерта 18-19-дневных эизрмоноэ крш и окрзшэнных гистохшлгчэски на АХЭ, производили визуальный анализ плотности нейропиля АЯ&-содершцих нейронов. С этой целью на препаратах сравнивали поля зрений с одинаковым числом ходинергических кэйронов в контрольных и опытных культурах .

Для исследования морфологических изменений холинергических нейронов в диоооциированньа клеточных культурах Оааалъних ядер переднего мозга использовали морфометрический катод анализа нейронов с отростками по Т.А. Леонтович СЛэонтович Т.Д. , 1987] по четырем параметрам:

1. Площадь профильного поля тола нейрона (площадь тела нейрона).

2. Общая длина деидритоо иэйроиа.

3. Число своОодшх окончаний у sees дондрцтов ивйропа (раа-звтвяенность нейрона).

4. Паощадь дендритной территории нейрона.

Достоверность различий контроля и опыта определяли по катоду стьвданта или по непараметрическому критерию Билкоксона-Шине-Уитнн , при уровне зпачшэстн <0,06. Всего Ото проанализировано 199 нейронов в двр серияк эксперимента.

Ют изучения включений предшественников синтезе Оодка в культивируеюй ткани септума был применен радиоиэотопний изгоя. Результаты издарэниа актнвкоотн включенного изотопа вырашли с количестве импульсов на 1 мг сырого веса ткани в минуту.

©актор роста нервов С ©PID пршэненный нами в исследованиях, получэн из подчэдзостных жалее самцов шшэй в институте фггакодо-гия АН ЕООР (7S ®РЙ, удельная активность 1 биол. «д. /10 нг. бал-га).

Г5гог. биологической активности ФРН производили на орга-иотшшзекнх культурах спинаяьньк ганглиев 16 и 10-дневных эй$-рионо; крглс.

Гаягдиозид Ш произведен фирмой "Фидия" (Италия).

В проведенных зкеперкшнтше ФРН использовался в концентрациях го, 60 и 200 е. е./мл, а гангляоэид (ЗШ о,1 и i ней.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ П ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Диссоциированные клеточныэ культуры Septum pelluoidum.

Для приготовления клеточных культур использовали Septum pelluoidum (септум) 16-10 н 18-19-дневных эмбрионов крыс. В процессе форшнтативной и механической обработки септальной ткани большинство диссоциированных клеток утрачиваэт отростки, округляется, н в клеточной суспензии, помещэнный на полиэтиленимино-ьую шш коллагвн-поли-Ь-лиэйновую подложку, можно видеть лишь тела клеток с крупным ядром и узким оботкоы цитоплазмы. Только у отдельных клеток могут сохранятся начальные сегменты отростков. В течении первого часа культивирования большая часть жиэнеопособ-

них клеток прикрепляется к субстрату изолировано или небольшими группами. в состав которых мэгат входить раеличное число шток, Шмшю спонтанной ре-агрегации, протошэдрй в сусповзии меток после прикрепления к субстрату, шпю наблюдать процосси иторнч-ноя агрегации клеток, происходя®? й а результате их ммградзии, Рост нейритов в клоточных культурах сепгуиз наблюдши уггзэ через 2-4 часа культнвкроаания. К третьему дню культивирования с этих культурах г/лт начинает формировать клеточный подслой , ооршзущий в дальивйпзм как на коллаген- поли-1- лиаиновои, так и на полиэтиле-ш-шовои субстрате сливающийся пласт, на котором к 14-м суткам 1(1 у^гб 1ЯЯЮ отчетливо видеть отдельные крупные нейроны,

Ьтойои гистохимической окраски на Ш в «юточш« культура* септукэ упэ на седьмые сутки культивирования выявляются нейроны 0 округзш, веретеновндным или треугольна толом, от второго отходят 2-4, редко 5 слабо ветвящихся отростков , площадь тела таких нейронов составляет 167±6 мкм\ При Содое длительном культивировании (14 суток), раэшр тела холшергнчеоких нейронов еаметно увеличивается, в среднем до 233+10 №Шг, при этом их деНдрити становились солее длинными, толстими и раоветвленнши . Продукт гистохишческоП реакции на АХЗ - пип'.энт Капота, окра-швад ходинергн^ескке нейроны в коричневиа шзот различной интенсивности. В Оодызннстве случаев наиболое интенсивно одаривалось тело 1«0Т!Ш и несколько бледнее отходярю от мго отростки.

Вйсоциированныз клеточные культуры (Засольного круп-

иокдеточного ядра Шйнерта, Обгаать баеадьиого ¡срупноклэточиого ядра ВоМшрта 18-1й-диешш змЗрионов криз, солоршт готорогонну» популяцию йейроаоз, находящихся на разных стадах развития, т.к. период tiiismaibiton кнтотичоской астшооти клеток-продсосгвеншщ яоли-пэргкчзеш нолроноэ отоя структуры лосолыю длителен.

Развнтнэ культур Саэшпого кругшоклеточного ядра йзйнерта проиохошгг оходно о оошшиь&ш культураш, однако в порвет «эк-йо нвашйп ¡фугато нейроны о Хорога развитыми дендритами уга па седыа» оуткл in vitro . Штодоы гистохимической окраски на Ш в клеточш куатурах ядра ШПнерта выявляются крупные отдельно легадко ноПрогш о округ лш, веретеновидньги или полигональным телом И отходящими от него З-б отростками. Рае мэр тела этих нейронов 9 одеднем составлял 312tii ыгоЛ

Продукт гистохимической реакции на ш - пигмент Хэтчета,

наиболее интенсивно окрашивает гсарикарионы шйронов и несколько шнее интенсивно их отросткк, в которых он формирует отдельна гранулы.

Влияние ФРН на разшр клеточного тела и отроете;

АЮ-содеряащих нейронов в 7-дневных клеточные культурах Septum pelluoidum.

В ходе этих экспериментов было показано, что в клеточкых культурах септума, развивавшихся в присутствии ©РН (200 б. е. /мл), раэьир холинергичвских нейронов был значительно боль-вэ, чоы в культурах в питательную среду которых ФРН не вносили. На 7-е сутки in vitro в контрольных культурах площадь тела Ш-содердацик нейронов в среднем достигала 167±б 'мкм, при шссикальном значения этого параметра 344 mí1, и минимальном 84 ис/. В культурах, развивавшихся в присутствии ФРН^ площадь тела МЭ-содергащнк нейронов быяа в среднем 230±í0 мкм , лишь у отдельных îk? >01юв эта величина достигала 667 то/ . разшр саыш ¡¿эякгос АХ^-содвркащих нейронов в опытных культурах был приблизительно такой же, как и в контрольных. Такая гетерогенность АХЭ-содержавдх нейронов септуш как в контрольных культурах, так и в культурах, росших в присутствии ФРН, а такие наличие мелких форм этих нейронов и в контроле в опыте позволяет предположить, что разные типы холннергических нейронов септуш могут различно реагировать на ФРН в процессе своего развития.

После окраски на АХЭ клеточных культур септуш с последующим серебряным контрастированием на препаратах выявлялась сеть отростков холинергичвских нейронов, которая в культурах, росших в присутствии фактора роста нервов была более плотной, чем в контроле. Однако, методом визуального анализа препаратов невозможно было определять, что лежит в основе увеличения плотности нейритной сети в диссоциированных культурах септума в присутствии ФРН - увеличение рааветвленности и длины дендритов или стимуляция акеонального роста. Однако возрастание размеров тел А)©-содертащих нейронов с прогрессивным увеличением плотности отростков этих нейронов при действии ФРН, позволяет сделать вывод, что ФРН активно включается в процессы регенерации и корфогенеэа этих нейронов в клеточных культурах.

Влияние ФРН на размер клеточного тела холинергичвских нейронов в диссоциированных 7-дневных культу-

- g -

pax оаэалыгого крутшо!слеточного ядра Нэйнерта В 7-дневиых клеточных ¡сультурах области локализации базалъ-ного крутюгслеточного ядра Шйнерта 18-19-дневных эмбрионов крыс но было обнаружено зависимости размеров тела АХЭ-содержащих нейронов от присутствия ФРН в питательной среде исследованных культур. В контрольных культурах площадь сомы таких нейронов была около 312±11 ьасм2, а а культурах^ развивавшихся в присутствии Sajwopa роста нервов, - 30Stll

Количество АХЭ-содерглдих нейронов в диссоциированных культурах ядра Шйнврга было заначнтольно мовьш, чем в. септалышх культурах, поэтому большинство этих нейронов располагалось изолировано, и плотная пейритная сеть, характерная для культур сеп-тую, не обраэоввывалась. Так как холинергичесиие нейроны различных базальных ядер переднего шага различаются по срокам созревания и представлены несколькими морфологическими подтипами, то но исключена воэшгность дифференцированного эффекта ФРН на эти нейроны.

Влияние фактора роста нервов на морфологическую диффе-ренцировку холииоргичоских нейронов в 14-дневных диссоциированных культурах Septum pelluoldun Изкболев детальное исследование действия ®РН на диффереици-ровку холинергических нейронов в диссоциированных культурах ба-оаяьшя ядер переднего мозга было выполнено на>.ш на клеточных культурах септуш 18-19-дневных крыс на 14-е сутки развития in vitro. К этому врэюни дендриты холшергичэских нейронов в клеточных культурах септукэ достигает значительного развития и интенсивность их окраски достаточна для выполнения точных зарисовок клеток, требуешх для выполнения количественного анализа всей дендритной системы этих нейронов.

Концентрация фзктора роста нервов в питательной среде опытных культур составляла БО б. о. /ил.

Результаты анализа показали, что плосздь тела (Sn) хо-дкнергичэского нейрона в клеточных культурах септука, в питательной среде которых присутствовал экзогенный ФРН, была достоверно больше, чем в контрольных культурах, не содержат?« ФРН. В первом эксперименте Sn АХЭ-содеряавих нейронов в контрольных культурах равнялась 219±10 мкмг, а в опытных - 311±1б мкut во втором эксперименте l?liQ мкм* и Z45±10 ыкмгсоответственно. Как в

первом, так и so мороы эксперименте отличия были очень достоверны, т.к. йшмялшоь при очень низком уровне значимости (Р<0,0Ш), Катодом шрфоштрйчгсдого анализа было поназано так-м, что в ййоеоцййровйшьй клеточных культурах септума у холи-нергичеекйх нейронов при действии ФРН достоверно увеличивается обора длина девдштов (Ui). В первом эксперименте в контроле среднее вййч&ние Ld длй АКЭ-содерванщх нейронов составляло 071 ¿at «км, в В enure - 784¿42 шш. Во втором эксперименте Б27±21 мки i KfiHípOJ» и 63б±29 ьш в опыте. При действии ФРН происходило не только увеличение Длины декдритов, но и их разветвленности (ао).й первом аксшфИЫбнте Аа АХЭ содержащих нейронов составляла 0,8710,36 6 контроле, а й опыте достоверно больше - 8,4Б±0,47. Во втором екопбримзитв 6 Контроле ко зтнн нейронов была около 6.20*0,3, ts опыте 7, Q6¿0,2й, Обличив как в первом, так и во втором случае достоверно. Было показало такле, что в присутствии ФРН достоверно увеанчйбаетсй площадь дендритной территории (Sd) голинергическмх нейронов в диссоциированных культурах септума. В первой а:г еришкте в контрольных культурах Sd АХЭ-содерианих нейрозгэ« составляла 2487О±1071 мкмг, в опытных - была около 32010±гггег икиг. Во втором эксперименте этот показатель равнялся - 22E60¿1604 мм/и 2800011Б16 ыкм? соответственно.

Ttuonj сОрааок, из выш приведенных данных следует, что фактор роста нервов интенсивно влияет на развитие и регенерацию дендритной СИОТ0Ш холинергичвских нейронов в диссоциированных клеточных культурах еепгума эмбрионов крыс и активно участвует в шрфогенезе этих нейронов,

Изменение состава популяции холинергичвских нейронов в клеточных культурах эыбрионов крыс при действии экзогенного фактора роста нервов. В этом вксперишйте использовали н-дневные клеточные культуры септуш lB-10-дневнш эмбрионов крыс. Полученные данные показали, что в культурах, развивавшихся в присутствии ФРН. достоверно больше трехдеедритных АХЭ-положительных нейронов и меньше дпухдендритю«, чем в контроле, а таю» наблюдается тенденция увеличения процентного содержания в популяции четырехдендритпых нейронов при Действии ФРН С рис. 1) ■ Таким обраеом, при действии фактора fr.eta, нервов в клеточных культурах септуш изменяется поиумциомкий ¡госта» АХЭ-положительных нейронов'В. сторону уьели-

А

В

Рис.1 ийы9н9ни0 процрнтого соотноэ9ния (А) двух, (В) трек, и (С) четырвхдандрятных нейронов при действии ФРН (200 0.е./мл) в диссоциированных культурах септума 18-19-дневных эмбрионов крысы.

За 100% принято оОвде количество просчитанных нейронов а культур«.

* - досторерног- от/ичио вт контроля, Р<0,01.

чения более разветвленных форм, что ыовэт происходить в реэула-тате- возрастания числа первичных дендритов у холинергическнх нейронов или вследствие лучвэй вкапзаошсти трех- и четырехденд-ритнш нейронов в присутствии экзогенного Ш, как более ФРН еа-вкскшх.

ВЛНШ» ®РН ка К0ЛИЧ9СТ80 Ш-СОЕОРШЕК нейронов в

клеточных культурах Бер^ш 1ио1йиш, В отои эксперименте ка всем протяшнш периода культквяро-вання культуры наблюдеиш в фазохш контрасте при пошазз инвертированного микроскопа Значительных отличия в развит®! контрольных культур и культур, раовивавшихся в присутствии экзогенного с?Н не было обнаружено,

В 7-дневных культурах септуш гистохимическим штодоы окраски на Ш были выявлены нейроны о различной интенсивностью окраски. ворт тела зтих нейронов была округлой или веретеновид-иоа. они имели 2-4 слабо ветвящихся отростка.

При подочете Ш-содержащих нейронов было обнаружено, что в опытных культурах количество этих нейронов больше на 45-105%, чем в культурах, в питательную ерэду которых зкеогенный £РК но »нооили. Вариабельность этого показателя обусловлена разницей количества холинергическия НОПРОИОЕ В ИСХОДНОЙ клеточной СУСПеПШ! отдельных опытов, различной степень» повреккения и гибели кдеток при днеооцнацш!» что иекзоегщо приводит к отяшш культур по числу вышних нейронов, а степень выраженности эффекта Ш в ового очередь штат зависеть от клеточной плотности СНагикка , апб НеШ Р. 10833, Было показало что действие £?Н в концентрациях '¿00, Ш и 20 б. е. /т на количество нейрошв содор;.'ас:х АКЗ было гграктес:аг одиншювьи. Повышение выгзшазшети нейронов содержала АХЭ, при действии фактора роста нервов отмечено в клеточных культурах септуш, полученных как из 16-16, так и 18-19-дневных эмбрионов фыз (рис.2).Однако, в культурах септуш 18-19-дневных эмбрионов, развивавшосся в присутствии ФРН било обнаружено значительное количество крупных нейронов, которые при гистохимической реакции на АХЭ окрашивались более интенсивно, что свидетельствует о высоком уровне активности етого фермента. В контрольных культурах Ш-оодершо» нейроны были окрашены значительно юнее интенсивно и имели меньшие рае меры. Кодичеотво кн-

- 1о -

- КОНТРОЛЬ

ШШ

<ЭРН

300

200

100 -

О

/л "

////л

А

В

Рис» 2. Действие ЗРН на количество ЛХЭ-содержащих нейронов в диссоциированных культурах септума (А) 15-16-дневних и (В) 1В-1У-ДН0ШШХ ямбрионов крысы, семь дней культивирования..

* - достоверное отличие от контроля, яри Н< 0,001)1. По оси ординат отложено количество АХЗ-содержащих нейронов в культуре, выраженное в процентах.

Т9НСИВН0 окрашенных нейронов в присутствии различных Кбицонтраций ФРН: 200, БО, 20 б. е. /мл, Сшю приблизительно одинаковым, поскольку, и идиш, уже 20 б. е. ФРН в одном шшшдмфрг» плтвтояь-ной среды достаточно для повышения уровня активности АХЭ в холинергических нейронах , В то т время нельзя исключить того, что в полученных нами культурах присутствовали небольшие количества ФРН или.сходных с ним иейротрофичееких факторов, сокретируеьак глнальньши клетками и фибробластами, поскольку в и-днеишя культурах септу*» интенсивно окрашенные АХЭ-содергаане нейроны были обнаружены и в опытных, и в контрольных культурах, хотя б последнем случае количество этих нейронов было вяачительно ыэмь-ш.

Полученные результаты показывают, что QPH значительно увеличивает жизнеспособность холинергических селтаяьных нейронов И активно влияет на уровень активности ключевых ферментов сш»®аа ацетилхолина, что подтверждается данными других работ CHartlkka J, end Hertl F. 1888).

Влияние ФРН на количество АХЭ-содержащих нейронов в клеточных культурах бавалького крупноклеточного ядра Шйнерта.

Доя исследования влияния ФРН на холинергичоокио иэйрош ба-еального крупноклвточкого ядра Иейнерта иопольаоьагш фит>р роста нервов в концентрации zoo б. е. /ид. Диссощщрошшиа культу* ры получали из области ядра ШЯнерта 18-Ю-дневных крыо. ■ Ш ?-о сутки культивирования в этих культурах ''ксгохииичоекиы кгэтодоы окраски на АХЭ выявлялись крупные АЗЭ-содеркапзш нейроны о 4-6 отростками, Интенсивно окрашеннш нейроны присутствовали как в опытных, так и в контрольных культурах, но в последних таких нейронов было меньше на 80*. ООщэо количество АХЭ-содержшцих нейронов различной интенсивности окраски не зависело от присутствия ФРН в питательной среде. Возможно, что для выживания и дифферен-цировки нейронов Саэального крупноклеточного ядра Шйиорта ФРН необходим только на каком-то определенном этапе их развития и что в дадьнойюм фактор роста нервов способствует лкш> поддержанию определенного уровня активности ХАТ и АХЭ в нейронах этого ядра Подобно« сю давление вавиоимооти от вкаогениого ФРН наблюдается и у септмьных холинергических нейронов по .маре их рвавитий. В наотояцэм исследовании и работе Хартикки с соавторами

- 1Б -

nínrttkka J. and lisrtl F., 19881 било продемонстрировано что в ¡«сточных культурах, полученных из 0овальных ядер переднего коз-га прзнатгшных крыс ФРН вызывает аиачнтольное увеличение коли-чоотэа хогшнергическия нейронов, тогда как а подобных культурах, полученных яа постнатальных крыс ФРН ив злиял аа количество ю-.зпгсргических нейронов [Hetanaoa Н. , Tsukut Н., Nlohormtsu I,, 1907].

Совместное действие ©РН и гояглноэида GM1 на количест-so холмнергических нейронов в клеточных ¡культурах Septum pslluoldura и уровень активности АКЭ, Исследование совкэстного действия фаетора рсота .чоргов и ганглиоэнда Gí.ü яа холинергические пзйропн сеэадьяьи ядер перэд-пэго мое га проводили на клеточных культурах'саптума 15-16 и 18-10-дневных эмбрионов крив. 3 »кодом эюмюримвнм культуры разделяли на четыре группы. Переел группа являлась контрольной, з сряду культивирования второй группы вносили ФРН, третьей - 0PH и Ш. четвертой - только гаяглкозид GM1, Культивирование производили в течении сок? суток.

Оценку биологической активности й>РН ;! Ш производили по обкому количеству АХЭ-содортагск нейронов, независимо от :ш-тонс1Шносг:1 окраски и по количеству интенсивно окравэнных ¡слеток на препаратах культур, окрвдоиных гисгохимкчески на АХЗ.

Нервна эксперимент был выполнен на культурах евптуиа 18-19-диевшя э!.йрионов крыс. Концентрация ФРН в питательной среде составляла - ZOO о. е./мл, а Ш 1 Во втором эксперименте т нспольоовали более низкие концентрации ФРН 20 0. е. /мл и С?Л 0,1 ккМ. в третьем эксперименте использовали культуры диссоциированных клеток септума 1Б-1б-дкззяых эмбрионов. Концентрация ФРН в питательной среде таких культур составляла 200 б. е. /мл, ганг-ллоеида Ш 1 мкМ. Во всех трех экспериментах гангддазид Ш достоверно не наменял влияния ФРН на количество как интенсивно окраяенных АХЭ-пояожятельных, нейронов тек и яа общее число АЯЭ-содержащих нейронов.

Таким образом, исходя из имеющихся на данный ¡¿окон? литературных данных и полученных накш результатов, можно заключить, что гангляоаид GM1 в испольйоешшнх надо концентрациях не ¡модулирует действия ФРИ на жизнеспособность холинергичоских нейронов.

Действие ФРН на рост и развитие нейритов в органоти-пичэских культурах Septum pel lucidum.

Дэйстви® ФРН из рост нейритов было исследовано нами не только на клеточных, но и на тканевых оргаяотшгачэских культурах септума, полученных не 15-18-дневных эмбрионов крыс. В тканевых культурах эксплантаты - септвльнш фрагменты, покэернныо в питательную среду в течении первых суток прикреплялись к колда-ген-поли-Ь-лиэиновоыу субстрату, а на вторые сутки культивирования у части эксплантатов начинался рост нейритов и наблюдалась активная миграция глиальных клеток, образующих еоиу роста вксллаитата. Для определения влияния ФРН на рост рвгбкерирувдх отростков в культурах подсчитывали количество эксплантатов с нвйрктным ростом и бее него на вторые сутки культивирования, в ходе статистической обработки данных эксперимента была обнаружена лишь тенденция влияния ФРН на нейритный рост культивируемых эксплантатов. Ток в контрольных культурах на вторые оутки in vitro нейритный рост наблюдали у 41 ДО эксплантатов, в то вреьзз как присутствие ФРН в питательной среде в концентрата* 60 б. е. /мл вызывало увеличение количества фрагментов сепгуш с ной-ритным ростом до 62111t. К пятым суткам культивирования количество аксплантатов с отрооткаш возрастало как в контрольных культурах (69tlOX), так и в культурах, развивавшихоя в присутствии ФРН (80±8Х), при этом степень выраженности тенденции снижалась. Шжно предположить, что на ранних сроках культивирования тканевых фрагментов септума ФРН способствует Аолее быстрой адаптации екоплантатов к условиям культивирования ы способен стимулировать начальный регенераторный рост нейритов ходииергичоских нейронов.

Влияние ФРН на включение предшественников синтеза белка культивируемыми фрагментами Soptum pölluoiduin

Культивирование производили в течении двух суток. В питательную среду опытных культур вносили ФРН в конечной концентрации 60 б. е. /мл. Выло выполнено три эксперимента, в каждом иэ которых определяли включение меченного мэтнонина в культивируемые фрагменты свптуыа, выделенных иэ мозга шести крыс (см. методы). Во всех трек экспериментах в опытных культурах интенсивность включения меченного метнонина была не выше, чем в контрольных культурах, в шггательную среду которых экзогенный ФРН не вноси-

ЛЯ.

Исходя по получении1.: данных следует продполо.-хить, что ®РН да 'усиливает синтез бояка s культ ивируемня клетках, что одиоире-ьзяно с нами было показано Хэфти с соавтора.».«* n<nusel В. , Michel P.P., Hefti F. 19903 на диссоциированных культурах септума фотометрическим методом.

ШЮДЫ

1. Показано, что в днесоцетроввитс: ;су.»ьтурах септука \i öa-еального крупиоклоточного ядра Уэйиерта присутствуют различные морфологические разновидности яожгаергкчс-ских нейронов, коториэ различаются размером и количеством порзячных доидрнтоа.

2. Iii ранник cposcax paamra куяьтур, полученных из моэга 18-19-днешнй süßpHOHOB крь'с соятольш» холинергическкэ пейроны (.:зиоэ дифференцировали, чем яолинергическив нейроны а культурах бааалыюго крупнокдеточного ядра '¿эЛнерта, ¡сак по степени развития дендритной системы, так я по уровни активности оцетидхолн-яэетораэы.

а В жпольооваяяой систеиз культивирования диссоциированных клоток происходит pas а и но н дифферонцнровка холинергичвских нейронов (Юз влияния экзогенного ФРЯ

4. в результате трофического влияния экзогенного ФРИ в диссоциировании» культурах септума и оаэадьного крупноклеточного ядра Иэйнерта значительно возрастает количество нейронов с вьгео-ким уровнем активности ацетилхолинэствраэн.

6. Показано, что в септальных меточных культурах экзогенный Ф?Н вьэьгаеет увеличение оСп^эго количества нейронов, содеркащнх ацетнлхолинзетеразу, независимо от уровня активности этого фер-кэнта в нейронах. В диссоциированных культурах бовального круп-поклеточного ядра Мвйиерта ФРН не вызывал увеличения этого пока-вателя.

5. Показано, что присутствие экзогенного ФРН в питательной среде клеточных культур септума вызывает активную регенерацию и прогрессивную дифференцировку новооОраэовавгоэйоя дендритной системы холинергических нейронов, что внралается в увеличении длины и раэветвденности дендритов, а таю» площади их распространения.

7. ФРН-эависимая дифференцировка дендритной системы холинер-

гическкх нейронов в клеточных культурах септут, сопровохзштся значительные увеличением размеров тел этих нейронов,

е. В кудьттаируешх клеточных популящшх септут, развивавшихся в присутствии экзогенного ФРН, увеличивается процентное содержание холинергических нейронов с 3-4 деидриташ, тогда как процентное содергшке двухдендргоных ходинергических нейронов в популяции понизится.

СПИСОК РАБОТ, ОЛШШЮВАНШХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.К. Исаев. Зависимость раэмеров соки холидаргичешзх нейронов базальных ядер переднего шага siíQphohob крш от оОедй плотностн клеток в диссоциированной культуре, В оберни» //Шщяткчность нервной система// Ы. 1989 г,, с. 19-го.

г. ¡,V. Victorov, LO. Ctespekov, N. К. Isaav. Cholinergic neurons of septum and basal fore bra in nuclei in vitro: influence of neurotrophic feotors end nourccytotoxlns. In; 22nd Danubo Ьда. for Neurological Sciences, Insbruck, November 9th-llth, 1989«. Abstr. 8.

3. H. K. Исаев, Развитие холинергических нейронов баэальных ганглиев переднего юега крыс в диссоциированных культурах. //1йтериалы 2-го Всесоюзного симпозиума : ВоаСудише клетки в культуре ткани. 1990 г.. с. 99-100,

4. к, К. Исаев, Е. Е Орлова. Динамика ükíííbhoctk ховжацэ-тиягрансфвразы и адатклхолннэстераэы в онтогенезе септуш кризы. В сборнике //Макро- и макроуровне организации мозга. U 1990 г,

Б. й, Ь Викторов, Н. А. Андреева, Е F Исаев, Иопольвованиа полиэтиленишнового субстрата для культивирования диссоциированию клеток центральной нервной системы. Цитология 1990 г., т. 32. N2, с. 81-84.

6, а К. Исаев, И, а Викторов. Влияние Фактора роста нервов на холикергические нейроны в диссоциированных культурах прозрачной перегородки (SEPTUM PEILUCIDUM). Бюллетень экспериментальной биологии и-медицины 1991 г., т. 0X1, КЗ, с. 305-306.

7. И К. Исаев. Действие фактора роста нервов на холинерги-ческие нейроны в клеточных культурах септут крыс. // Тевисы Всесоюзной молодежной конференции; йгогоуровневая организация церебральных функций. Москва 1991 г,