Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование оксида азота в нейронах центральной нервной системы в норме и при алкогольной интоксикации

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Образование оксида азота в нейронах центральной нервной системы в норме и при алкогольной интоксикации"

На правах рукописи

РГБ ©Л ОгянВ 2004

КОНОВКО Ольга Олеговна

ОБРАЗОВАНИЕ ОКСИДА АЗОТА В НЕЙРОНАХ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ В НОРМЕ И ПРИ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

03. 00. 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Владивосток - 2003

Работа выполнена во Владивостокском государственном медицинском

университете

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович Официальные оппоненты.

доктор медицинских наук, профессор Красников Юрий Александрович доктор медицинских наук, профессор Тимошин Сергей Серафимович доктор биологических наук, профессор Кушнерова Наталья Федоровна

Ведущая организация: Российский кардиологический научно-

производственный комплекс МЗ РФ

Защита состоится «19» декабря 2003 года в «10» часов на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (690950, г. Владивосток, пр. Острякова, 2).

Авторефератразослан «_»_200_года.

Ученый секретарь диссертационного совета

РеваГ.В.

\ктуальность проблемы. Представление о том, что мозг является главным эрганом, определяющим формирование физической зависимости от »лкоголя, занимает центральное положение в концепции алкогольной гаркомании (Анохина и др., 2000; Ерышев и др., 2002; Fane л, Tipton, 1999; rabakoff, Hoffman, 2000; Soyka, Schütz, 2001; Weiss, Porrino, 2002). Эта доктрина, получила новые доказательства о том, что в развитие зависимости jt алкоголя и наркотических веществ вовлекаются механизмы, включающие пменения в нейромедиаторной, трансмиттеро-рецепторной, опиатной и шдорфинной системах мозга (Fadda, Rossetti, 1998; Lands, 1998; Goodwin, 1000; Heinz, Mann, 2001).

К основным неврологическим проявлениям, возникающим в центральной нервной системе вследствие алкоголизма относятся центральный миелинолиз структур моста, верхний геморрагический кшиэнцефалит Вернике, алкогольный тремор, поздняя атрофия мозжечка и <оры больших полушарий, синдром Маргиафаве-Бигнами, внутренний -еморрагический пахименингит, алкогольная эпилепсия, алкогольный целирий, алкогольные галлюцинации, бред ревности, алкогольная паранойя и :индром Корсакова (Арзуманов и др.. 1999; Бурдаков, 1999; Паркевич, 1999; Лиголкин и др., 2000; Rosse et al., 1997; Inoue et al., 2001; Vittadini et al., >001).

Хронический алкоголизм приводит к атрофии мозга (Daño, Le Guyader, 1988). У крысят (Pierce et al., 1989) этанол уменьшает массу целого мозга, мозжечка и мозгового ствола на 24%, 37% и 29%, соответственно. По данным Lewis, 1985) у эмбрионов, полученных при медицинских абортах от женщин 5ольных алкоголизмом, происходят нарушения развития и формирования цервной системы. На основании детального гистологического изучения ;резов эмбрионального мозга авторы сделали заключение, что этанол и щетальдегид снижают скорость пролиферации нервных клеток, нарушают 1роцессы миграции нейробластов и глиальных элементов на ранних этапах нстогенеза и вызывают замедление их созревания.

При алкоголизме у взрослого человека поражаются различные уровни i структуры нервной системы: неокортекс и гиппокамп, кора мозжечка и тодкорковые ядра, ядерные образования промежуточного мозга и мозгового :твола, а также периферические - чувствительные и вегетативные нервные центры. У больных алкогольной энцефалопатией при посмертном морфологическом исследовании выявляется выраженный хроматолиз в [ейроцитах ядер среднего мозга, моста и собственных ядер мозжечка (Flavas, 1986). Наиболее тяжелые специфические изменения, сопровождающиеся эастворением тигроида, обнаружены в мотонейронах передних рогов шинного мозга, ядер 111-XII пар черепномозговых нервов и в иейроцитах >етикулярной формации мозгового ствола (Havas, 1986).

Чрезвычайно токсичным для мозга, как органа с относительно шзкой этанолокисляющей способностью, является накопление ацет альдегида, соторое ведет к инактивации ферментов и выработке антител на модифицированные молекулы (Orrego, 1988).

На основании имеющихся данных этанол и ацетальдегид вызывают первичные дегенеративные изменения в сннаптнческих структурах ЦНС (Bonner, 2000; Goodwin, 2000).

В связи с открытием NO, его нейротоксического и нейропротективногс влияний, в последнее время интенсивно изучается вопрос о роли системь NOS/NADPHd и NMDA рецепторов в развитии алкогольной зг исимости и е генезе алкогольного поражения мозга (Chandler et al., 1997). В условия* хронического потребления этанол снижает активность NOS в различны* отделах головного могза животных: в мозжечке крыс (Fetaccioli et а!., 1997), [ полях СА-1 и СА-3 гиппокампа морских свинок (Kimura, Brien, 1998) приводит к снижению количества NADPH-d позитивных нейронов i стриатуме у крыс (Zima et al., 1998).

Наряду с нейрональной NOS этанол угнетает индуцибедьную NOS-¿ (NOS-11) в астроцитах коры мозжечка и других образованиях головного мозп животных (Syapin, 1998). Имеется прямая зависимость между активностьк NOS/NADPHd в процессах обучения, толерантности к этанолу и активность« NMDA рецепторов. Ингибиторы NOS/NADPHd - нитро-Ь-аргинин, N-нитро L-арпшин-метил эфира, Ы-монометил-Ь-арпшин, в свою очередь, блокирую: толерантность к этанолу, а также процесс поддержания длительной потенцш и ассоциативной памяти (Morato, Khanna, 1996). Ингибирование NOS i снижение активности синтеза NO повышает чувствительность гранулярны: клеток коры мозжечка крыс к этанолу и усиливает цитотоксическое действш последнего (Pantazis, Dai, 1997). Учитывая, что клетки Пуркинье корь мозжечка человека обладают видовой положительной активностьк NOS/NADPHd, мы на основании предварительных исследований считаем из удачно избранной гистохимической моделью для оценки, с одной стороны -токсического действия алкоголя, а с другой - NO-ергическоп нейропротективного и н»чродеструктивного влияний у людей, имеющих i анамнезе диагноз алкогольная болезнь.

Совершенно необходимыми, по нашему мнению, являютс. исследования в различных регионах мозга локализации активностей АДГ i АльДГ, - двух главных ферментных систем, которые не только осуществляю 75-90% окисления этанола в организме, но и рассматриваются в спектр биохимико-патогенетических факторов развития алкоголизма, как основны (Rout, Holmes, 1996). Диагностика нейронных с руктур, метаболизирующи: этанол и ацетальдегид, приведет к выяснению тончайших механизмо! возникающих при взаимодействии между синаптической медиацне; определенных нейроанатомических паттернов и метаболизмом в них этаноле что, вероятно, позволит вскрыть ключевые связи, которые складываются развиваются при формировании зависимости от алкоголя. Перепективност этого направления связана с выяснением роли различных структур мозп вовлеченных в развитие алкогольной наркомании.

1ель н задач» работы. Цель настоящей работы состояла в установлении акономерностей организации NO-ергических систем головного мозга [еловека и животных, обеспечивающих окисление этанола, в норме и на юделях острой и хронической алкогольной интоксикации.

В соответствии с избранным направлением были сформулированы адачи исследования:

. В возрастных группах человека (юношеском, зрелом и пожилом) изучить ктивность и локализацию АДГ, АльДГ и NADPH-диафоразы в:

- в холинергических ядрах мозгового ствола;

- в серотонинергических ядрах шва (п. raphe pontis, п. raphe dorsalis, п.

raphe pallidus, п. raphe medianus, п. raphe magnus, n. raphe obscurus), норадренергическом ядре locus coeruleus, дофаминергических структурах черной субстанции и вентрального тегментального поля.

- в коре мозжечка;

- в нейронах префронтальной (поле 46) и моторной (поле 4) области

неокортекса.

!. Изучить распределение и динамику активности NADPH-диафоразы в ядрах юзгового ствола, коре мозжечка и неокортексе при острой и хронической штоксикации этиловым алкоголем и дать качественную и количественную »ценку состояния фермента.

!. Изучить реактивность этанол-окисляющей и NO-ергической систем коры юзжечка в условиях хронической алкоголизации на ранних этапах юстнатального нейрогенеза.

к На основе полученных собственных и литературных данных обосновать (атогенетические механизмы токсического и нейропротективного действия 1ксида азота при остром и хроническом поступлении в мозг экзогенного танола и ацетальдегида.

1аучная новизна н теоретическое значение работы

Впервые на материале мозга человека проведена гисто- и [ммуноцитохимическая диагностика 1уЮ-ергических нейронов, [ринимающих участие в окислении этанола и ацетальдегида. На основании юлученных данных по распределению NADPH-диaфopaзы, МО-синтазы, ^ДГ и АльДГ в нейронах ЦНС создано представление об ЫО-ергической и танол-окисляющей системах головного мозга.

Впервые показано, что МО-ергические нейроны мозгового ствола, коры юзжечка и неокортекса остаются высокоустойчивыми в условиях лкогольной интоксикации, а наработка N0 снижает токсическое |ейротропное действие этанола и ацетальдегида.

Результаты исследования топографических взаимоотношений межд; локализацией этанол- и альдегидокисляющих ферментов в нейрона: различной медиаторной и Ж)-ергической специфичности необходимы дл1 выяснения роли нейротоксических и нейропротективных влияний N0 I алкоголя на различные структуры мозга. Эти данные также важны дл] обоснования закономерностей, лежащих в основе |юрмировани1 толерантности и физической зависимости к этанолу у человека.

Практическая ценность работы

Полученные данные по топографии МО-ергических нейронов I нейронов с различной медиаторной специфичностью, метаболкзирующи; этанол и ацетальдегид в мозге человека, могут быть использованы 1 нейрохимии, токсикологии, психофармакологии, психиатрии, наркологии I судебной медицине.

В клинической и экспериментальной неврологии и наркологии эт! результаты необходимы для выяснения патогенетических механизма алкоголизма и абстиненции, а также энцефалопатии Вернике и синдром; Корсакова. Данные о взаимосвязи алкогольного поражения нейронов и и; способностью синтезировать N0 могут быть использованы в разработке 1 оценке фармакологического действия препаратов направленного действия.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Нейроны сегментарных и корковых отделов головного мозг, характеризуются различным набором ЫО-ергических и этанол-окисляющи: ферментов, распределение которых коррелирует с медиаторно! специализацией нейронов.

2. Токсические эффекты этанола и продуктов его окисления н; центральные нейроны регулируются ЫО-ергическим компонентом.

3. Нейромодуляторное действие N0 связано с протективныи механизмом, защищающим нейроны от токсического влияния этанола I ацетальдегида.

4. Хроническая алкогольная интоксикация вызывает индукцию N0 синтазы в нервных центрах, наименее резистентных к токсическому влиянии этанола.

5. В основе толерантности и наркотической зависимости к этанол; лежат пластические изменения в синапсах, где N0 функционирует в качест в! орто- и ретроградного мессенджера.

Апробации работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены н, научно-практических конференциях БГМУ и ДВО РАН «Актуальны

роблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» Владивосток, 1988; 1990; 1993; 1994; 2002); 8-ом съезде Европейского ейрохимческого общества (Лейпциг, 23-28/06, 1990); 2-ом Международном !импозиуме Фонда Медицинского обмена Японии, России и стран Северо-1осточной Азии (Владивосток, 19-21/09, 1994); IV-ом Российско-Шведском импозиуме «Новые исследования в нейробиологии» (Москва, 20-22/05, 996); Международной конференции «Фундаментальные науки и прогресс линической медицины» (Москва, 1998); международном конгрессе Психосоматические нарушения на рубеже II-III тысячелетия» (Владивосток-омск, 2000); 4-ом Международном конгрессе по интегративной нтропологни (Санкт-Петербург, 23-25/05, 2002); Международной онференции, посвященной 150-летию со дня рождения A.C. Догеля (Томск, -4/04, 2002); международной научной конференции «Медико-биологические экологические проблемы здоровья человека на Севере (Сургут, 2002); IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии Колосовскне чтения - 2002» (Санкт-Петербург, 29-31/05,2002).

Публикация результатов работы. По теме диссертации публикованы монография, 19 статей в отечественных и международных сурналах и сборниках.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, бзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов библиографического указателя. Объём диссертации включает 201 страниц (ашинонисного текста, 9 таблиц, 11 схем, 76 микрофотографий и список итературы (436 источников). Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили в соответствии с правилами бережного вращения с лабораторными животными этического комитета ВГМУ. (лияние этанола на активность алкоголь-окисляющнх и NO-синтезирующих нзнмов исследовали в моноамин- и холинергических ядрах мозгового твола, моторной (поле 4) и префронтальной (поле 46) области коры ольшого мозга и коре мозжечка человека и крыс.

Основной раздел работы составили экспериментальные исследования, ыполненные на материале 40 нелинейных крыс-самцов массой 150-200 г, одержащихся в стандартных условиях вивария. Животных разделяли на две руппы, которым предъявляли этанол в условиях острой и хронической лкоголизации, соответственно (таблица 1). В первом случае его вводили сивотным однократно (через зонд в желудок, в дозе 5 г/кг в виде 30%-го одного раствора) и забивали спустя 15-20 минут. Вторая группа животных олучала 15%-ый этанол в качестве единственного источника жидкости в ечение 2-6 месяцев при свободном доступе к сухой стандартизованной пище

(Шабанов, Калишевич, 1997; Бушма и др., 2002). Контрольные крысч (табл. 1) получали соответственно эквиобъёмное количество воды. Опытны и контрольных животных забивали одновременно, декапитацией по, тиопенталовым наркозом в утренние часы (10-12 ч).

Таблица 1

Количество случаев, выполненных по сериям наблюдений различными

методами

Серии экспериментов Количество наблюдений

крысы контроль человек

Острая алкогольная интоксикация (ОАИ) 16 5 -

Хроническая алкогольная интоксикаци (ХАИ) 24 5 3

Метод на NADPH-d 18 - 7

Иммуноцитохимия ¡NOS 18 - 7

Метод на АДГ 15 - 8

Метод на АльДГ 6 - 1

Метод на катал азу 3 - -

Иммуноцитохимия GFAP 3 - - •

Количественные методы определения концентрации нитратов и NOS при эксперимент," 'ьном алкоголизме 12 10 : -

Образцы мозга человека получали при судебно-медицинских вскрытия: трупов лиц в возрасте 25-56 лет, погибших на месте происшествия 1 результате черепно-мозговой травмы и имевших в анамнезе диагно алкогольная болезнь (п = 3), а также при патологоанатомических вскрытия: трупов людей, умерших от заболеваний, не связанных с наркологической 1 неврологической патологией (п = 23). Материал исследовали не позднее 3-< часов после наступления смерти1.

Участки ствола мозга, коры мозжечка и неокортекса человека и крьи замораживали в криостате, готовили непрерывные серии срезов, которы< обрабатывали для выявления активности ЙАОРН-диафоразы ^АЭРН-с1) иммунореактивной МО-синтазы (¡N08; КФ 1.6.99.1), алкогольдегидрогеназь (АДГ; КФ 1.1.1.1), альдегиддегидрогеназы (АльДГ; КФ 1.2.1.3) и катала и (КФ 1.11.1.6). Реактивность глиального микроокружения нейронов яде]

' (.">.11>0Н1>-чед11Ш1Н1'кне исследования материала человека проведены совместно с научным сотрудник» Кчсийсцога центра судебно-медицинской экспертшы М> РФ, доктором медицинских на\к Ю.1: Мо^юным

озгового ствола при алкогольной интоксикации изучали по экспрессии мунореактивного глиального кислого фибриллярного белка (glial fibrillary cid protein, GFAP). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим по етоду Ниссля. Топографию нейронов, полученных на срезах, обработанных ястохимическими методами, сопоставляли с соответствующими рисунками схемами стереотаксических и цитоархитектонических атласов (Адрианов, 1еринг, 1959; Olszewski, Baxter, 1954; Mannen, 1988).

Гисто- и иммуноцитохнмическая идентификация NO-синтазы

Топофафию NO-синтазы изучали с помощью гистохимического метода î NADPH-диафоразу (Норе et al., 1991).

Локализацию активности индуцибельной формы NO-синтазы (iNOS) »■являли с использованием моноклональных антител (Sigma) и набора ¡активов для иммунопероксидазной реакции (lmmuno-detection kit, 1CN). усочки мозга крысы размером 0,5x1 см фиксировали в течение суток при 'С в 10%-ом нейтральном формалине. Из залитого в парафин и [мороженного в криостате материала, изготавливали срезы толщиной 10-20 км. Депарафинированные срезы промывали в течение 5 мин в трис-НС1-/фере (pH 7,6) и в течение 20 мин обрабатывали смесью 50% этанола и 0,3% :рекиси водорода для блокирования неспецифического фона эндогенной гроксидазы.

Инкубацию с первичной антисывороткой (Sigma), разведенной в гношении 1:500, проводили при комнатной температуре во влажной камере течение 30 мин. После промывки срезов трис-буфером (5 мин) наносили оричные антитела (lmmuno-detection kit) и инкубировали при комнатной •мпературе в течение 30 мин. Далее образцы повторно промывали трис-'фером и на 10 мин переносили в раствор следующего состава: 3 мл трис-'фера (pH 7,6), 50 мкл 3%-ной перекиси водорода и 1 мг 3,3-(аминобензидинатетрагидрохлорида.

Верификацию iNOS-иммунопозитивных астроцитов проводили с >мощью иммунореактивного глиального кислого фибриллярного белка liai fibrillary acid protein, GFAP). Срезы инкубировали в растворе юличьих поликлональных первичных антител против GFAP (Sigma), введенных в отношении 1:100, а затем обрабатывали в растворе ютинилнрованных вторичных антител против иммуноглобулина кролика, фаботаниых у козы, при разведении 1:100 (Vector Laboratories) и в растворе идин-пероксидазного комплекса (Vectastain ABS Kit, Vector Laboratories), эработку заканчивали выявлением пероксидазы ABC-комплекса с •мощью 0,03%-го раствора диаминобензидина и 0,001%-ой перекиси дорода в 50 мМ Трис-НС1-буфере (pH 7,4).

Биохимические методы определения активности NOS н ннтрат/нитритов при алкогольной интоксикации

Количественный анализ нитратов и нитритов в сыворотке крови крьк проводили по методу Cortas и Wakid (1990). Данные спектрофотометри» обрабатывали с помощью пакета программ «GrafPad» для анапчза уравненм простой линейной регрессии. В графиках на оси абсцисс отмечал! количество нитрат-иона (в мкмоль/л), а на оси ординат спектрофотометрические показания. Биохимическое определение активноеп NOS проводили с помощью радиометрического метода (Dawson et al., 1991) основанного на измерении количества радиомеченного цитрулина полученного после инкубации гомогенатов мозга в присутствии кофакторо! NO-синтазы. Радиоактивность [3Н]Ь-цитруллина в пробах определяли н: сцинтилляционном счетчике гамма-типа. Количество образующегося в ход( инкубации (3Н]Ь-цитруллина является показателем активности NO-синтазы i гомогенатах мозга, которые мы выражали в нмашЛмг белка\мин.

Гистохимические методы выявления алкоголь-окнелаюших энзимов

Гистохимическую идентификацию АДГ проводили по пропио Hashimoto и Nanikawa (1977) в модификации Мотавкина и др. (1988), АльД1 выявляли по методу С.М. Зиматкина и др. (1985). В качестве дополнительно! диагностики нейронов, метаболизирующих этанол и ацетальдегид, но hi содержащих АДГ и/или АльДГ, исследовали топографию активноеп каталазы (Aragon et al., 1992)

Морфометрня и статистическая обработка данных

Для количественной оценки результатов исследования в каждое гистохимическом препарате выбирали срез стандартной толщины Препараты изучали с помощью светового микроскопа «Carl Zeiss», в окуля| которого была вставлена сетка с равновеликими квадратами, позволяющая подсчитать все клетки избранной структуры мозга, прореагировавшими < субстратами инкубационной среды в данном срезе. Содержание позитивн« окрашенных нейронов в ядрах мозгового ствола определяли как разност! между суммой нейронов, окрашенных по Ннсслю и суммой нейронов выявляемых при окрашивании срезов на АДГ, АльДГ, NADPH-d и NOS.

Визуализацию изображений всех микропрепаратов на компьютер получали с помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометр Vickers М-85. Цифровую обработку изображений проводили с помощь* программ Adobe Photoshop 5.0 и Microsort Hxcel 97. Активност нейронзльной формы NADPH-d определяли по плотности гистохимической преципитата и выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).

Данные исследования распределения АДГ-, АльДГ- и МОБ/ИАОРН-с!-гозитнвных неГфонов обрабатывали методом вариационной статистики с шределением ¿-критерия достоверности по Стыоденту (Р<0,05). Линейные размеры нейронов определяли по наибольшему и наименьшему диаметру Амунц, 1960) и классифицировали как сверхмалые (5-10/5-10 мкм), малые 11-12/5-10 мкм), средние (13-22,5/7,5-22,5 мкм) и крупные (23-30/7,5-30 мкм).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр действия этанола на обмен веществ и функции мозга весьма нирок и разнообразен по своим цитохимическим, физиологическим и морфологическим проявлениям, а также психическим последствиям Анохина и др., 2000). С легкостью проникая через гематоэнцефалический зарьер в мозг, этанол и его метаболиты затрагивают деятельность тодавляющего большинства известных биохимических процессов в нервных слетках. Взаимодействие «этанол - нейрон» ведет к формированию определенных мотивационных реакций организма в отношении алкоголя, а также к развитию процессов адаптации. Среди нейромедиаторных систем, формирующих феномен предпочтения этанола, значительная роль 1ринадлежит моноамин- и холинергическим нейронам мозгового ствола Чумакова и др., 2000).

Системное действие этанола связано с редукцией ГАМК-ергической 1ередачи и усилением возбуждающих глутамат- и холинергических механизмов (Fadda, Rosetti, 1998). Эти последствия стимулируют увеличение гроницаемости плазматических мембран, нарушают кальциевый гомеостаз, опускают механизмы окислительного стресса и, в конечном итоге, шзывают гибель нервных клеток от перевозбуждения (Faingold et al., 1998; Beaton et al., 2002; Li et al., 2002; Dahchour, DeWitte, 2003). Нарушение физиологических функций при алкоголизме связано также с влиянием >таиола на NO-ергическую систему мозга. Одно из действий этанола при )том потенцирует нейротоксические эффекты NO, а другое регулирует :интез и высвобождение серотонина, норадреналина, дофамина и щетилхолнна (Pelligrino et al., 1996; Ohkuma, Katsura, 2001). Оба действия »танола взаимодополнительны, определяются эффективностью этанол-жисляющих, NO-синтезирующих, аминергических и холинергических механизмов. В связи с неоднозначной локализацией и неодинаковой жтивностью NO-синтазы (NOS) и ферментов, окисляющих этанол, факторы i механизмы повреждения нейронов в различных ядерных образованиях мозга могут быть не идентичными.

!

Топография NADPH-d/NOS, АДГ и АльДГ в мозге человека

Распределение ЫАОРН-сШОБ коррелирует с медиаторной специализацией нейронов и их способностью метаболизировать алкоголь. ЫО-ергические клетки доминируют в холинергических АДГ/АльДГ-позитивных центрах и отсутствуют в ядрах, содержащих глутаматергические, преимущественно, АльДГ-негативные нейроны. Топохимическая неоднородность АДГ, АльДГ и ЫАБРЬМ позволяет разделить моноаминергические центры на три группы (таблица 2).

Таблица 2

Активность альдегнддегндрогеназы (АльДГ), алкогольдегндрогеназы (АДГ) и NADPH-диафоразы (NADPH-d) в моиоаминергических ядрах

ствола головного мозга человека (ЕОП, Р<0,05)

Группа Ядро АльДГ АДГ NADPH-d

I Substantia nigra (pars 76,3±2,4 80,3±1,2 68,7±3,6

reticularis)

N. raphe pontis 37,2±1,4 69,2±1,3 60,1±3,4

N. raphe dorsalis 4I,I±2,1 66,1±I,4 59,4±3,2

11 N. raphe pallidus 41,2±2,8 75,2±3,8 42,2±2,8

N. raphe mec.anus 40,4±1,1 70,1 ±2,4 72,3±2,2

N. raphe magnus 37,1±2,2 60,4±2,4 80,4±3,4

N. raphe obscurus 40,6±2,5 68,4±3,3 56,2±2,9

V entral tegmental area — 68Д±3,1 —

III Substantia nigra (pars 79,3±2,8

compacta)

Locus coeruleus - 72,1 ±4,2 -

К первой группе относятся дофаминергические ядра, в нейронах которых преобладает высокая степень активности АДГ, АльДГ и ЫАОРН-й. Цитоплазма клеток содержит значительной плотности интенсивно окрашенный преципитат формазана, равномерно заполняющий перикарион и переходящий в отростки. Активность ферментов в них варьирует от 67 до 80

ЮП и локализуется, главным образом, в нейронах ретикулярного ядра |ерной субстанции.

Вторую группу составляют серотонинергические нейроциты ядер шва, де имеется высокая активность АДГ, высокая или средняя активность 1АОРН-<1 и низкая активность АльДГ. При умеренной активности энзима 42-60 ЕОП) в нейронах осаждается гранулярный голубого цвета осадок, оторый сгущается в околоядерной зоне, образуя кольцо синего цвета, {итоплазма клеток с низкой активностью АльДГ (37-40 ЕОП) содержит ылевидный преципитат, окрашенный в однородно-голубой цвет.

К третьей группе относятся норадреналин- и дофаминергические центры, в которых содержится высокий уровень активности АДГ, но не ниявляется АльДГ и NADPH-d. Эти нейроны обнаруживаются в -олубоватом пятне, компактном ядре черной субстанции и вентральном гегментальном поле.

В отличие от аминергических центров холинергические нейроны сарактеризуются высоким уровнем активности АльДГ и АДГ и слабой 1КТИВНОСТЫО NADPH-диaфopaзы. Последняя выявляется только в (орсальном ядре блуждающего нерва, двойном ядре и магноцитах трамедианного ядра ретикулярной формации продолговатого мозга.

•Неоднородная локализация ЫАОР1М, АДГ и АльДГ (таблица 3) (етерминирует формирование различных регуляторных механизмов, зияющих на патогенез алкогольной зависимости.

Количественная оценка доли ЫЛОРЬМ-, АДГ- и АльДГ-позитивных [ейронов показывает, что при реакции с ЫАБРН, фурфуролом и цетальдегидом в двигательных ядрах черепно-мозговых нервов реагируют [е все нейроны. В ядре Вестфапя-Эдингер-Якубовича и заднем ядре луждающего нерва содержание АДГ- и АльДГ-позитивных нейронов аименынее; их значительно больше в моторном ядре тройничного нерва, .воином ядре и главном ядре глазодвигательного нерва (таблица 3). !ейроциты с низкой активностью АДГ и АльДГ превалируют в угообразном ядре. Умеренная активность ферментов идентифицирована в летках верхнего оливного ядра и ретикулярного латерального ядра, а ейроны с высокой активностью энзимов в преобладающем количестве зходятся в добавочном ядре глазодвигательного нерва, ядре Вестфаля-•дингер-Якубовича, ядре блокового, отводящего, лицевого, подъязычного и луждающего нервов, двойном ядре, латеральном вестибулярном ядре и игантоклеточных ядрах ретикулярной формации. Положительно еагирующие на ЫЛОР! Ы, АДГ и АльДГ нейроны отсутствуют в ядре [шнномозгового пути тройничного нерва, заднем улитковом ядре, ядре ежду нижними холмиками, клиновидном ядре, нижнем ядре, межножковом !фе, ядрах верхнего и нижнего холмиков и ретикулярном мелкоклеточном чре, где также имеются субпопуляции холинергических нейронов. В ядре естфаля-Эдннгер-Якубовича и заднем ядре блуждающего нерва удержание АДГ- и АльДГ-почитивных нейронов наименьшее; их

значительно больше в моторном ядре тройничного нерва и двойном ядр нейроны которых также реагируют на ИАОРЬМ.

Таблица 3

Относительное содержание и распределение нейронов с различной активностью АДГ, АльДГ и МАЭРН-й в ядрах ствола мозга человека

(Р<0,05)

Ядра Доля АДГ-позитивных нейронов, % Доля АльДГ-позитивных нейронов, % Доля NADPH-d-позитивных нейронов, %

N. ambiguus 75,6±5,0 69,8±6,7 11,8±1,6

Locus coeruleus 25,6±4,8 -

NWE 38,1 ±6,5 42,9±8,9

NlIIpr 80,6±7,9 70,1 ±7,2

NIV 82,0±7,5 63,0±6,6 -

NVmes 70,0±8,0 79,1±6.0 -

NVmot 72,4±5,9 65,0±6,7 -

NVI 43,0±7,3 55,2±7,9 -

NVII 48,5±6,3 67,5±5,3 -

NXd 42,3±9,0 47,9±5,6 11,0±2,9

NXII 52,8±4,1 63,2±4,0 -

sps 53,0±5,2 47,9±6.4 -

VI 84,1 ±8,3 80,0±7,1

Примечание: NVmes - ядро среднемозгового n/ги тройничного нерва; NVmot двигательное ядро тройничного нерва; NWE - ядро Вестфаля-Эдингера; NHlpr добавочное (главное) ядро глазодвигательного нерва; NIV - ядро блокового нерва; VL латеральное вестибулярное ядро; NXd - заднее ядро блуждающего нерва; NXII - яд] подъязычного нерва; NVI - ядро отводящего нерва; NVII - ядро лицевого нерва; sps супраспинальное ядро; «-» - активность фермента не определяется.

Корреляционный анализ показывает, что активность АДГ, АльДГ NOS не всегда имеют однородную локализацию в данном тиг холинергнчсских нейронов (таблица 4). Так, в ядре подъязычного nepi полная со-локализация определяется только в пгре АДГ/АльДГ, однаь активность NADPH-d здесь не выявляется.

Таблица 4

Результаты парного корреляционного анализа активности АДГ, АльДГ н NADPH-d в ядрах ствола головного мозга человека н крысы

Ядра Человек Крыса

АльДГ/ АДГ АльДГ/ NADPH-d АДГ/ NADPIId АльДГ/ АДГ АльДГ/ NADPIId АДГ/ NADPH-d

N. ambiguus -0,053 -0,096 -0,324 -0,034 -0,084 -0,020

N. dorsalis nervi vagi 0,417 0,533 0,471 -0,030 -0,003 -0,019

N. arcuatus -0,293 0,355 0,397 0,487 0,529 0,431

N. nervi hypoglossi 0,525 - - -0,029 - -

NVnies 0.382 - - -0,006 - -

NVmot -0,076 -0,017 -0,185 0.480 0,374 -0.156

N.rhaphae pontis -0,003 -0,117 -0,038 -0,223 0,429 -0,049

N. rhaphae dorsalis 0,513 -0,047 0,488 -0,033 0,355 0,102

N. rhaphae pallidus 0,460 -0,112 -0,091 0,389

N. rhaphae medianus 0,504 -0,200 -0,173 -0,067 0,454 -0,086

N. rhaphae magnus -0,147 -0,056 0,432 0,140 -0,062 0,518

N. pontis -0,002 -0,230 0,405 0,461 . 0,541 -0,120

NPRGC 0,505 0,365 -0,138 0.458 -0,188 -0,341

NRL 0,365 0,488

NRGC -0,013 -0,230

NWE -0,110 -0,034

Substantia nigra (pars reticularis) -0,006 -0,126 0,415 0,446

Примечание: ЫУтез - ядро среднемозгового пути тройничного нерва; ЫУшо1 -двигательное ядро тройничного нерва; N1*1, - ретикулярное латеральное ядро; ЫЯОС -ретикулярное гигантоклеточпое ядро; ОТ1ЮС - парагигантоклеточное ретикулярное ядро; NWE - ядро Вестфаля-Эдингера.

В заднем ядре блуждающего нерва и гигаитоклеточной ретикулярной формации присутствуют все исследованные энзимы, которые также со-локализуются, а в нейронах двойного ядра, напротив, со-локализация ферментов отсутствует. Отсюда следует, что локальная продукция монооксида азота, а значит его возможные цитотоксические и/или

нейропротективные эффекты, могут быть неидентичны. Топографическая и функциональная гетерогенность ферментов в нервных центрах с различной медиаторной специализацией определяет неодинаковую устойчивость структур ЦНС, в частности разных типов нейронов и их компонентов (цитоплазма, отростки, синаптические терминали) к этанолу и его токсическому метаболиту - ацетальдегиду.

Различия алкоголь- и альдегидокисляющей функции в ядрах мозгового ствола человека зависят от многих причин: от уровня толерантности нервных клеток к этанолу и продуктам его окисления, от концентрации в организме эндогенного этанола, от частоты и количества вводимого п организм экзогенного этанола, от наличия разных форм АДГ и АльДГ, обладающих неодинаковой субстратной специфичностью (Мотавкин и др., 1989). Значительную роль, надо полагать, Ифают особенности химической организации нейронов.

Следует отметить, что кроме нейронов, положительную реакцию на NADPH-d, АДГ и АльДГ дают капилляры всех исследуемых отделов мозга. Их сети при реакции на эти ферменты выявляются с большой полнотой. Наличие АДГ и АльДГ в эндотелиальных клетках имеет глубокий биологический смысл, заключающийся в том, что известная часть этанола и ацетальдегида может окисляться клеточными элементами капиллярной стенки. Однако при очень высоких концентрациях ацетальдегида в крови (основное количество которого образуется в печени) он способен проходить капиллярный барьер и на пути к нейронам частично окисляется с помощью АльДГ глии. Высокая активность АДГ и АльДГ установлена в астроцигах мозга, особенно коры больших полушарий. Её гематоэнцефалический барьер (капилляры и глия), содержат оба фермента с довольно высокой активностью. Тем не менее, этанол и ацетальдегид способны проникать к нейронам. Вероятно, NO расслабляя гладкие миоциты сосудистой стенки и вызывая расширение микрососудов, способствует реализации этого механизма.

NO-ергические, меднаторные и эганол-окисляюшие механизмы как фаюоры цитотоксичсского н нейропротеюивнога действия при острой и хроническом алкогольной шпоксикацнн

Из-за непродолжительности фазы активности в пределах от 5 до 30 секунд, радиус диффузии N0 невелик - около 100 мкм от места синтеза до реципиента (Snyder et al., 1998). Выделяемые в межклеточные пространства молекулы NO транспортируются к клеткам мишеням, проникают через мембраны в цитоплазму. Показано, что N0, благодаря активации гуанилилциклазы (Murad, 1994), стимулирует внутриклеточные ферменты, повышает уровень циклического ГМФ, что способствует длительной нейромодуляции (Реутов и др., 1997).

Согласно нашим наблюдениям, острая алкогольная интоксикация у крыс снижает активность NO-синтазы (NOS) в ядрах моста (рис. 1, табл. 5),

эднако в ядрах дофамннергической системы, обеспечивающих реакции тозитивного подкрепления при употреблении новых порций этанола (Koob et il., 1998), активность энзима увеличивается.

Реакция NO-ергической системы на хроническую алкоголизацию у срыс неодинакова в различных отделах мозга (рис. 1, табл. 5). Активность 40S увеличивается в ткани продолговатого мозга, варолиева моста, среднего лозга, новой коры и коры мозжечка, однако в промежуточном мозге и ¡триатуме обнаруживается снижение эктивности энзима. Вероятно, теоднородные эффекты этанола на экспрессию нейрональной изоформы N0-:интазы (nNOS) детерминированы нейрохимическим статусом нейронов, фовнем активности внутриклеточной протеинкиназы, циклического щенозинмонофосфата и G-белков. Нами установлено, что холинергические слетки покрышки моста и магноциты ретикулярной формации обладают максимальной активностью NADPH-d, которая еше более усиливается за счет шдукции энзимов при хронической алкогольной интоксикации. При уштельном потреблении алкоголя именно в этих нейронах развиваются (акономерные изменения ферментативной активности, определенно оказывающие на роль NADPH-d в избирательной гиперреактивностн клеток.

Следует отметить, что снижение степени продукции NO в ядрах мозгового ствола при острой алкогольной интоксикации коррелирует со снижением концентрации нитратов в сыворотке крови (рис. 2, табл. 6). Однако длительное поступление экзогенного этанола у «пьющих» животных, вызывающее индукцию nNOS, ведет к резкому подъему содержаения нитратов и нитритов в периферической крови (рис. 2, табл. 6), а, следовательно, потенцирует синтез азот-содержащих токсических анион-радикалов.

Индуцированное этанолом образование свободных радикалов активирует цитокины IL-2 и TNF-a, которые в свою очередь усиливают наработку NO (Faingold et al., 1998). В мозге больных алкоголизмом экспрессия nNOS увеличивается во фронтальной коре, поясной извилине, п. accumbens, энторинальнон коре и таламусе (Gerlach et al., 2001). Вызванное алкоголем повышение концентрации свободных ионов кальция в синаптосомах и микросомах ведет к альтерации функциональной активности нейронов и синапсов. Эти феномены обусловлены активностью различных изоформ NOS, уровнем наработки N0 и его окислительно-восстановительным статусом (Реутов, 2000; Colasanti, Suzuki, 2000),

Связь этих эффектов с NO предлагается рассматривать как потенциальную мишень для лекарственной терапии алкогольной швисимости (Lancaster, 1995; Calapai et al., 1996; Adams, Cicero, 1998). Например, ингибиторы NOS могут оптимизировать лечение и превентивную герагшю поражений ткани мозга, индуцированных алкоголем, а змешательство з NO-ергические пути влечет за собой снижение способности и желания потреблять этанол у больных алкоголизмом (Gerlach et al., 2001).

Рис. 1

Активность NOS в регионах мозга крыс в контроле, при острой и хронической алкогольной интоксикации (нмоль/мг белка/мин)

Диаграмма построена на основании данных, представленных в таблице 5 (стр. 19)

В контроль Q о. алк. интоке. Ш хр.алх. интокс.

Таблица S

Показатели активности NOS в регионах мозга крыс в контроле, при острой и хронической алкогольной интоксикации (нмоль/мг белка/мин)

Продолговатый м01г Моет Средний м01г Гипоталамус Таламус Гнпокамп Кора Мозжечок

Контроль <п=5) 0,28 ±0,0 Г 0,39±0,05 0,13±0,02 0,69±0,01 0,85±0,02 0,92±0,03 0,48±0,05 1,10±0,06

Острая алкогольная шпоксик'ация (п=6) 0,71 ±0,06 0,17±0,01 0,22±0,01 0,74±0,03 0,03±0,01 0,22±0,02 0,39±0,01 1,62±0,05

Хроническая 1.1icoi4i.i1.iuh интоксикация i (п=6) 1 0,56±0,03 0,45±0,03 0,48±0,04 0,32±0,05 0,09±0,04 0,87±0,03 0,76±0,03 1,87±0,04

"Достоверность при Р< 0,05 по сравнению с контролем

Рис.2

Уровень нитрат-ионов в сыворотке крови крыс в контроле, при острой и хронической алкогольной интоксикации (мкмоль/л)

Диаграмма построена на основании данных, представленных в таблице 6 (стр. 21)

контроль острая алкогольная интоксикация хроническая алкогольная интоксикация

□ контроль 0 острая алкогольная интоксикация О хроническая алздгогьная интоксикация

Таблица 6

Показатели уровня нитрат-ионов в.сыворотке крови крыс в контроле, при острой и хронической алкогольной интоксикации (мкмоль/л)

Контроль (п = 5) Острая алкогольная интоксикация(п = 6) Хроническая алкогольная интоксикация(п = 6)

28,75 ±0,05* 20,12 ±0,03 38,77 ±0,04

Достоверность при Р< 0,05 по сравнению с контролем

Исследования, проведенные на крысах, показывают, что торможение активности NOS предотвращает развитие алкогольной толерантности и способности употреблять алкоголь и животных, предпочитающих этанол (Beauge et al., 1994; Rezvani et al., 1995). Молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий, остаются не выясненными. Phung и Black (1999) показали, что этанол не влияет на степень экспрессии nNOS, однако последняя усиливается в присутствии фактора роста нервов.

Характерно, что аппликация ингибиторов NO-синтазы в эксперименте блокирует формирование толерантности и препятствует развитию алкогольного абстинентного синдрома (Pokk et al., 2001). Аналогичным усилением активности NADPH-d/NOS в ответ на хроническое поступление алкоголя реагируют ядра моноаминергической и холинергической синаптнческой передачи. Очевидно, длительная алкогольная интоксикация сенситизирует эти пути и влечет за собой развитие наркотической зависимости (Robinson, Berridge, 1993).

Известно (Hashimoto, et al., 1989), что сдвиги активности моноаминов, возникающие в мозге при острой алкогольной интоксикации, стимулируют развитие толерантности к этанолу. Наличие в аминергических нейронах высокой активности NADPH-d и АДГ при отсутствии АльДГ позволяет рассматривать N0 как метаболическое . звено, опосредующее цнтотоксическое действие ацетальдегида. Значение этого механизма особенно актуально в условиях хронической алкогольной интоксикации, когда уровень наработки N0 резко возрастает. При образовании эндогенного или при массивном поступлении в мозг экзогенного ацетальдегида эти нейроны лишаются ферментативной защиты и погибают (Zimatkin, Lindros, 1996). Хроническая алкоголизация блокирует синтез нейротрофинов и пресинаптических транспортеров моноаминов (Baily et ai., 1998). У крыс, предпочитающих этанол, отмечается снижение числа нейронов голубоватого места на 30%, а плотность синаптических окончаний в нейропиле ядра снижается на 22% (Lu Wei et al., 1997).

Согласно мультиметаболитной теории патогенеза алкогольной зависимости (Kuriyama et al., 1987; Collins, 1988; Maruyama et al., 2000; Toth et al., 2001; 2002), взаимодействие ферментов, окисляющих этанол и ацетальдегид, с моноаминами основываются на способности ацетальдегидг образовывать морфиноподобные алколоиды, которые начинают функционировать как ложные нейропередатчики. К этим веществаы относятся три группы метаболитов: тетрагидроизохинолины тетрагидропапаверолины и тетрагидро-Р-карболины. Первые два являют« естественными катаболитами дофамина (или норадреналина) i ацетальдегида; третья группа включает продукты конденсации ацетальдегидг с серотонином (или индоламином). При введении данных соединений в моз! у животных формируется стойкая зависимость к алкоголю (Myers, 1985) Присутствуя даже в ничтожных количествах в мозге крыс, они стимулируют интенсивное потребление этанола даже тогда, когда концентрацш последнего вызывают отвращение (Homicsko et al., 2003), чт<

рассматривается как главное доказательство их участия в формировании алкогольной наркомании. При этом триптолины обладают двойственным эффектом: при введении в мозг они вызывают пристрастие, а при внутрибрюшинном введении - отказ от алкоголя (Myers, 1985). Более того, при высокой активности АДГ в нейронах фермент может окислять моноамины, в частности, серотонин в индолацетальдегид, который совместно с ацетальдегидом конденсируется затем в ß-карболины (Consalvi et al., 1985).

Неспособность норадреналин-ергических клеток голубого пятна экспрессировать АльДГ объясняется, вероятно, тем, что альдегид-окисляющая и норадреналин-синтезирующая функции являются взаимоисключающими. Локальная наработка ацетальдегида здесь превышает скорость его элиминации и выступает ключевым фактором алкогольной интоксикации. У алкоголиков этанол и продукты его окисления вызывают усиленный распад норадреналина, что рассматривается как важное звено в сложной патогенетической цепи проявления острой и хронической алкогольной интоксикации (Анохина и др., 2000).

Ввиду низкой активности или отсутствия в норадренергических нейронах АльДГ, не исключена возможность инактивации экзогенного ацетальдегида с помощью каталазы.

При помощи цитохимического метода окрашивания нами установлено, что каталазу у человека и крыс экспрессируют исключительно моноаминергические нейроны. Высокая активность каталазы маркируется в слигодендроцитах, эпендимоцитах и астроцитах. Холинергические ядра на каталазу не реагируют. Экспериментальные данные указывают (Brown et al., 1980), что ацетальдегид способен потенцировать потребление этанола и непосредственно связан с формированием алкогольной эйфории. Поэтому восходящая катехоламинергическая система мозга рассматривается как важный компонент эмоционального вознаграждения и центра удовольствия. Однако этанол не только влияет на метаболизм биогенных аминов, что стимулирует потребление алкоголя, но также потенцирует вызванные им локомоторные расстройства (Ortiz et al., 1974; Hashimoto et al., 1989). Таким образом, избирательная продукция ацетальдегида в ядрах моноаминергической системы с помощью каталазы ведет к активации нейронов, усиливая поведенческие эффекты и степень потребления этанола.

Включение холинергического компонента в механизмы формирования алкогольной зависимости связано, главным образом, с обеспечением толерантности, которая определяется комплексом адаптивных изменений на разных уровнях: молекулярном, тканевом, клеточном и целого организма (Goodwin, 2000). В новой коре у высокотолерантных к этанолу животных регистрируется постоянное снижение активности ацетилхолшпстеразы и повышенное сродство ацетилхолиновых рецепторов к ли га илу, что свидетельствует об активации холинергических структур. Нарушение высших функций (памяти, обучения, сна, бодрствования) у хронических алкоголиков согласуется с данными о прямом влиянии ацетилхолипа на миестические и когнитивные процессы в гипнокампс и новой коре,

получающие холинергический вход от базальных ядер переднего мозга (Blokland, 1995; Everitt, Robbins, 1997).

Модуляторное действие этанола на холинергическую систему мозгового ствола потенцирует разнообразные физиологические эффекты; к ним, в частности, относятся: алкогольная гиперемия и гипотермия, нарушение дыхательного ритмогенеза и сна, увеличение порога этанолового наркоза и гибель от его передозировки. Важнейшим компонентом в патогенезе алкоголизма выступает влияние этанола на холинергическую трансмиссию в ретикулярной формации, ядрах среднего мозга и таламуса, участвующих в поддержании феноменов рабочей и пространственной памяти (Hallanger et al., 1987; Mitchell et al., 2002).

Если в перикарионах аминергических нейронов всех отделов мозга,, обнаруживается крайне низкая активность АльДГ и высокая активность NADPH-d, то в холинергических центрах наблюдается противоположное соотношение активностей ферментов. Это может обеспечивать избирательное накопление N0 и недоокисленного ацетальдегида в моноаминергических центрах, которые, как известно, опосредуют положительное подкрепляющее действие этанола, лежащее в основе влечения к алкоголю и формирования стойкой наркотической зависимости (Fadda, Rossetti, 1998; Lands, 1998; Goodwin, 2000).

Наряду с этим, АльДГ может принимать участие в функционировании холинергических пейсмекерных нейронов - системе запуска алкогольной мотивации и толерантности. Наличие в аминергических нейронах высокой активности NADPH-d и АДГ при отсутствии АльДГ позволяет рассматривать NO как метаболическое звено, опосредующее цитотоксическое действие ацетальдегида. Значение этого механизма особенно актуально в условиях хронической алкогольной интоксикации, когда уровень наработки NO резко возрастает. При образовании эндогенного или при массивном поступлении в мозг экзогенного ацетальдегида эти нейроны лишаются ферментативной защиты и погибают (Zimatkin, Lindros, 1996).

Таким образом, в спектре своего регуляторного действия NO выступает как двуликий Янус, оказывая подчас диаметрально противоположные эффекты на физиологические процессы. Базапьный синтез NO связан с активностью конститутивной NOS (нейрональной и эндотелиальной). Однако при патологических состояниях в результате экспрессии индуцибельного изофермента NOS, уровень наработки NO резко повышается, достигая критических параметров, при которых его нейродеструктивные эффекты становятся преобладающими. Они реализуются посредством вторичного образования токсических анион-радикалов и пероксинитритов (Pelligrino et al., 1996; Lipton, 1999).

Хотя предельная концентрация NO, определяющая границу смещения его эффекторного действия, остается неизвестной, токсическое влияние газа всегда стимулирует протективные механизмы, снижающие продукцию пероксинитритов (Реутов и др., ¡997; Dawson, 1995; Bídmon et al., 2001). Они включают ферменты оксидативной защиты, утилизирующие избыток анион-

радикалов, а также систему ауторегуляции синтеза N0 и ингибирования активности индуцибельной NOS.

Значение NO-ергическпх нейронов в алкогольном поражении коры мозжечка и неокортекса

NO-ергические нейроны могут служить эффективной моделью для исследования нейродегенеративной патологии, вызванной интоксикацией этиловым алкоголем. Так, клетки Пуркинье человека в условиях физиологической нормы экспрессируют конститутивную NOS, которую также содержат корзинчатые нейроны и клетки-зерна. Наши наблюдения, проведенные на материале лиц, имевших в анамнезе диагноз алкогольная болезнь и декомпенсированный деструктивный уровень алкоголемии (3,0 -5,0 %0), показали резкий подъем уровня валовой активности NADPH-d в этих нейронах и сосудах микроциркуляторного русла (таблица 7). Очевидно, этот феномен обусловлен индукцией дополнительных порций NOS, которую стимулируют хроническое поступление аддуктов этанола и потенциированная ими повышенная эффективность глутаматергической нейрэпередачи в афферентных волокнах мозжечка. Не исключается вариант индукции эндотелиальной NOS в ответ на возрастание метаболической потребности нейронов, вовлеченных в генерацию высокочастотных разрядов (Bonthius et al., 2001).

Таблица 7

Активность NADPH-d в коре мозжечка человека при декомпенсированнон алкогольной интоксикации, (ЕОП, Р<0,05) ■

Клеточные элементы коры мозжечка Активность NADPH-d при хронической алкогольной интоксикации Активность NADPH-d в норме

Корзинчатые нейроны 71,4±4,1 65,4±2,3

Клетки Пуркинье 84,4±2,8 58,7±3,3

Клетки-зерна 41,4±2,3 38,2±1,2

Эндотелий микрососудов 78,4±2,7 46,4±6,3

Вызывает интерес тот факт, что мы не отметили подобных изменений активности NOS в коре мозжечка крыс, где, видимо, формируется иной механизм ферментативной зашиты. На первый план зцесь выступает динамика соотношения активностей АДГ/АльДГ. У интактных животных клетки Пуркинье характеризуются высокой активностью АДГ, они не содержат АльДГ, либо экспрессируют очень низкий уровень активности энзима. В условиях хронической алкоголизации ситуация принимает другой

оборот. У потомства крыс, получавших этанол в дозе 4 г/кг, на 15-е сутки после рождения в нейронах Пуркинье избирательно увеличивается активность АльДГ, которая затем по мере созревания мозга постепенно снижается и достигает физиологической нормы на 30-й день постнатальной жизни. Важно подчеркнуть, что этот период совпадает с прорастанием в кору мозжечка основной массы афферентных волокон и характеризуется наиболее заметными дегенеративными последствиями со стороны нейронов Пуркинье. Включение апьдегид-окисляющей системы в критическую фазу нейрогенеза, представляет, несомненно, адаптивную реакцию развивающихся нейронов, защищающую их от токсических последствий недоокисленного ацетальдегида. Введение пиразола - ингибитора АльДГ - на этой стадии усиливает некроз и апоптоз нейронов Пуркинье, ведет к прогрессивному сокращению численности их популяции в дефинитивном мозге (Thomas et а!., 1998; Light et al., 2002). Отметим, кстати, что массивная наработка NO in vivo на фоне продолжительного воздействия этанола также блокирует активность АльДГ в нейронах (De Master et al., 1997). При этом нейродеструктивные эффекты ацетальдегида и оксида азота многократно усиливаются.

У мышей (Tabbaa et al., 1997) хроническое воздействие этанола приводит к снижению развития аксонов клеток Пуркинье и уменьшению длины их первичных и вторичных дендритов. M. Tavares et al. (1985) выдвинули гипотезу о наличии прямой связи между хроническим потреблением алкоголя и процессами старения нервной ткани. Авторы показали, что у крыс, получающих в течение 1-18 месяцев в качестве единственного источника питья 20%-нын раствор этанола, начиная с 6-го месяца потребления алкоголя, обнаруживается накопление липофусцина в клетках Пуркинье, а также в корзинчатых клетках, клетках Гольджи и звездчатых клетках коры мозжечка. У этих животных после 6-ти месячного эксперимента был также установлен факт значительного снижения плотности синапсов параллельных волокон на отростках клеток Пуркинье (Pierce et al., 1993). При этом средний диаметр и площадь поверхности синапсов прогрессивно возрастают (Tavares et al., 1986).

Отметим, кстати, что наличие аналогичных морфологических изменений было продемонстрировано в зубчатой фасции и гнппокампе у крыс, хронически употреблявших этанол в течение 18 месяцев (Cadete-Leitc et al., 1989; Fifkova et al., 1994; Lang et al., 1997). Количественный электронно-микроскопический анализ показал, что в перйод от 6 до 12 месяцев эксперимента возникает значительное снижение численности пирамид и гранулярных клеток. Волокна гранулярных клеток, вероятно претерпевают наряду с дегенеративными, пластические компенсаторньк изменения, что выражается в увеличении части их плазмолсммы, занято? синапсами. Снижение доли гранулярных и пирамидных клеток гиппокампа i результате их гибели при отсутствии изменений в количестве синапсов которые устанавливают мшистые волокна, указывает на образование новы? контактов на теле пирамид. Предполагается (Webb et al., 1997), что t условиях длительной алкогольной интоксикации пластические изменеши

синапсов не в состоянии компенсировать их количественного снижения, вызванного этанолом.

Поступление значительных доз этанола на пренатальной стадии, особенно в период активного развития головного мозга (3-й триместр беременности), связано с риском возникновения алкогольного синдрома плода. Его становление сопровождается массивной дегенерацией нейронов, гипоплазией мозжечка, мозолистого тела и подкорковых ядер большого мозга (Коннор, Стрейссгус, 1999).

Последствия алкогольной интоксикации зависят от функциональной зрелости нейронов и синапсов: чем они моложе и, соответственно, менее дифференцированы, тем более выражен нейродеструктивный эффект этанола. Так, у крыс к моменту рождения количество клеток Пуркинье составляет около 450.000. В результате алкоголизации (6,6 г/кг) на 8-ой и 9-ый день постнатального периода их численность снижается до 400.000, на 4-ый и 5-ый день эта величина составляет уже 270.000, а при ежедневном введении этанола с 4-го по 9-ый день - 250.000 (Thomas et al., 1998). Характерно, что степень снижения популяции клеток Пуркинье коррелирует с выраженностью последующих нарушений в двигательной активности животных. Гибель нейронов на ранних этапах дифференцировки вследствие токсического действия этанола и его метаболитов связывают со стимулирующим влиянием последних на активность апоптотических ферментов (Light et al., 2002).

Элементом, защищающим нейроны от цитотоксического действия этанола, выступают рецепторы возбуждающих аминокислот - аспартата и глутамата. Pantazis et al. (1995) впервые продемонстрировали протективное влияние №-метил-0-аспартата (агониста глутаматных рецепторов) на нейроны мозжечка, которые культивировали в условиях длительной экспозиции этанола. Спустя несколько лет Bonthius et al (2003) показали, что тгн эффекты опосредует оксид азота, который начинает «работать» здесь как элемент оксидативной защиты.

NO регулирует уровень Са2+ в цитоплазме нервной клетки посредством увеличения внутриклеточной концентрации cGMP и активации через систему G-киназ Са2 "-насосов эндоплазматического ретикулума. Аппликация нитроаргинина (ингибитора NOS) или ингибиторов гуанилат-циклазы в ходе продолжительной алкоголизации животных блокирует нейропротективные эффекты NMDA (Pentazis et al.,1995). В условиях антенатальной экспозиции этанола апоптоз клеток-зерен и нейронов Пуркинье более выражен у мышей с генетически обусловленным дефицитом nNOS (Bonthius et al., 2002).

Имеются все основания полагать, что протективные эффекты NO тесно ассоциированы с продукцией трофических молекул (Panta/is et al., 1998). По данным D.J. Bonthius и др. (2002) на первый план здесь выступают нейротрофины, фактор роста фибробластов, инсулиноподооный фактор роста и нейроростковый фактор. Если в плодном !» раннем постнатальном периодах функционирует BDNF-зависимый механизм защиты, то NO-ергичеекий путь

ретроградной сигнализации формируется на поздних постнатальных стадиях нейрогенеза (Heaton et al., 2002).

Многофакторный механизм протективного влияния NO очевидно объясняется неодинаковым его участием в модификации глутамагных (NMDA и не-NMDA типов) рецепторов. Эта регуляция является первостепенной особенно при формировании алкогольного абстинентного синдрома, когда перевозбуждение NMDA-рецепторов потенцирует развитие судорожных припадков (Gonzalez et al., 2001 ; Li et al., 2001a).

Обнаруженная нами индукция NO-синтазы и АльДГ в цитоплазме нейронов и эндотелии микрососудов представляет собой две стороны одного процесса, связанного с формированием механизма, предохраняющего клетки от токсического действия ацетальдегида, и модуляторной NO-ергической компоненты.

Пожалуй, наиболее дискуссионными в нейробиологии алкоголизма остаются причины и механизмы становления толерантности, которая по праву рассматривается как связующее звено между патологическим влечением к алкоголю и возникновением физической зависимости от него (Валентик, 1998; Анохина, 2000; Koob et al., 1998; Goodwin, 2000). Несмотря на столь яркое разнообразие нейротропного действия этанола и его метаболитов на структуры ЦНС, большинство исследователей сходятся во мнении, что психоэмоциональный аспект алкогольной болезни связан, прежде всего, с токсическим влиянием алкоголя на нейроны новой коры (Cadete-Leite et al., 1990; Chandler et al., 1997; Kril et al., 1997; Farren, Tipton, 1999). В этом контексте особый интерес представляет фронтальная доля, которая специфически ассоциирована у человека с функциями памяти и когнитивного обучения (Moselhy et al., 2001 ; Tarkka et al., 2001 ).

Мы исследовали префронтальную (поле 46) и первичную двигательную область (поле 4) неокортекса человека. Большинство пирамидных нейронов слоев II, III,- V и VI характеризуются высоким уровнем активности АльДГ, при низком содержании АДГ и полном отсутствии активности NADPH-d/NOS. Непирамидные клетки, напротив, имеют высокую активность NADPH-d. Относительное количество NO-ергических интернейронов в коре головного мозга человека составляет приблизительно 0,5-2% (Gabbott, Bacon, 1996).

Общепризнанно, что медиатором пирамидных нейронов выступает, главным образом, глутамат и/или аспартат (Conti et al., 1987; Don et al., 1992), a корковых интернейронов - у-аминомасляная кислота (Somogyi et al., 1998). Гигантские пирамидные нейроны Беца у человека являются, очевидно, холинергическими (Мотавкин и др., 19906). Однако клетки Беца в отличие от холинергических двигательных клеток сегментарных центров имеют очень низкую активность АДГ. Поэтому механизм их повреждения может быть связан, во-первых, с прямым повреждающим действием этанола и, во-вторых, с наличием в межклеточной среде (интерстициальном пространстве мозга) ацетальдегида, фильтруемого из крови сосудистыми сплетениями (Allali-Hassani et al., 1997; Nishiguchi et al., 2002; Tampier, Quintanilla, 2002).

Полученные нами данные о высокой активности АльДГ в новой коре человека совпадают с результатами её биохимического анализа (Сатановская, 1988); установлено высокое содержание энзима с низкой и высокой константой Михаэлиса, причем степень активности АльДГ не уступает таковой, показанной для ядер мозгового ствола. Высокая активность АльДГ является показателем интенсивности метаболизма ацетальдегида в клетке. Ввиду низкой активности АДГ, как фактора локальной наработки ацетальдегида, не исключена возможность его образования в корковом нейроне с помощью микросомальной этанол-окисляющей системы.

При исследовании материала лиц с хронической алкогольной интоксикацией установлена значительная редукция численности пирамидных нейронов в префронтальной коре, однако в поле 4 подобных изменений выявлено не было. Возможно, наиболее важным в этой серии исследований явилось следующее наблюдение: оказалось, что NADPH-d-позитивные NO-ергические интернейроны неокортекса становятся уникально резистентными к токсическим эффектам этанола и нейродегенеративным расстройствам при алкоголизме. Можно полагать, что сохранение популяции этих нейронов обусловлено защитным действием оксида азота. Пирамидные клетки, не синтезирующие этот фактор, лишаются трофической поддержки и погибают в 15-20%.

Аномалии популяции пирамидных клеток хорошо согласуются с данными о снижении объема белого вещества у больных с энцефалопатией Верника и синдромом Корсакова (Kril, Homewood, 1993; Sullivan et al., 1995; Pfefferbaum et al., 1996). Причины, ведущие к редукции белого вещества фронтальной области большого мозга, могут быть связаны с демиелинизацией волокон и дегенерацией аксонов пирамидных нейронов (Kril et al., 1997; Moselhy et al., 2001 ).

Мальформация белого вещества и декомпозиция межнейронных связей вызывает патологическую реорганизацию трансмиттеро-рецепторных систем коры, что, в свою очередь, обусловливает дальнейшее формирование морфофункциональных дефектов при алкоголизме. Предполагается [Maezawa et al., 1996), что эти изменения детерминированы наличием у алкоголиков аллели ADH21 алкогольдегидрогеназы, активация которой лтецифически связана с атрофией мозга. Вероятно, локализация этого гена и гена, кодирующего NOS, в данном типе нейронов, является »заимоисключающей, что обусловливает отсутствие протективного N0-фгического механизма в пирамидных клетках коры.

Некоторые авторы (Tarkka et al., 2001) связывают развитие толерантности к этанолу с модификацией клеточных механизмов памяти и обучения. Последние формируются как феномены синаптической гпастичности и выражаются в длительном усилении эффективности лутаматергической неаропередачи между неГфонами коры (Скребицкий, 4епкова, 1999; Bliss, Collingridge, 1993; Bi, Poo, 2001). Этот процесс получил тзвание длительной потенциации (ДП). NO как ретроградный мессенджер, шдуцирует и пролонгирует ДП (Schuman, Madison, 1991; Zhuo et al., 1993).

в-Б. МогаЮ и 1.М. КЬаппа (1996) показали, что антагонисты рецепторов, нарушающие процесс обучения, ингибируют развитие толерантности к алкоголю, а Ы\ША-агонисты, стимулирующие консолидацию памятного следа, напротив, усиливают толерантность. Аппликация ингибитора ИО-синтазы нитроаргинина в данном эксперименте блокировала развитие толерантности и одновременно - устраняла ДП в нейроцитах повой коры. Авторы заключают, что нарушение памяти и способности к обучению при хроническом алкоголизме может быть связано с вовлечением этанола и его аддуктов в процессы ЫО-ергической синапсомодификации, которые реализуются на фоне гипервозбуждения нейронов и непременно влияют на эффективность глутаматергической трансмиссии.

Итак, токсическое влияние экзогенного этанола распространяется на различные звенья нейротрансмиссии. В неокортексе к ним относятся глутаматергические пирамидные клетки и ГАМК/ТМО-ергические тормозные интернейроны (рис. 3). При острой алкогольной интоксикации этанол блокирует ЫМБА-рецепторы и усиливает нейропередачу ГАМК. Этот процесс вызывает компенсаторную сенситизацию ЫМОА-рецепторов, которые при отмене этанола освобождаются от тормозного блока и становятся более чувствительными к даже минимальным концентрациям трансмиттерного глутамата. Формирующееся в результате перевозбуждение пирамидных клеток, дополняется дезингибицией тормозных ГАМК-ергических интернейронов. В свою очередь, усиление возбуждающих механизмов стимулирует активность ЫО-синтазы в интернейронах, которые переходят на гиперпродукцию оксида азота, оказывающего токсическое влияние на пирамидные нейроны. Смещение физиологического действия N0 зависит от дозы и длительности экспозиции этанола и ацетальдегида, степени гипервозбудимости нейронов и вторичной по отношению к ней продукции супероксидов и пероксинитритов.

Данные биохимических исследований показывают (Пакта е1 а1., 2002), что представленный механизм нейромодуляторного действия этанола и оксида азота сходным образом функционирует и в других образованиях центральной нервной системы вне зависимости от их медиаторной специализации.

Результаты и выводы настоящей работы позволяют заключить, что взаимодействие этанол-окисляющей и ЙО-ергической системы головного мозга коррелирует с медиаторной специализацией нейронов. Активность N0-синтазы и алкоголь-метаболизирующих энзимов является значимым фактором, который определяет повышенный метаболизм экзогенного этанола и ацетальдегида, низкий уровень метаболизма эндогенного этанола и ацетальдегида н регуляторное влияние оксида азота на специфичность нейротропного действия этилового алкоголя.

Рис. 3. Взаимодействие N0-, ГАМК- и глутаматергических нейронов неокортекса при интоксикации этиловым алкоголем. Пирамидные клетки и интернейроны нейрохимически неоднородны, экспрессируют различные паттерны этанол-окисляющих ферментов. Алкогольная интоксикация повышает возбуждающий фон коры и потенцирует функцию ЫМЭА-рецепторов, сцепленных с активностью Ж)-синтазы. Гиперпродукция N0 в цитоплазме ГАМК-ергических интернейронов усиливает токсическое действие этанола на пирамидные клетки. ГАМК - у-аминомасляная кислота; ГЛУ - Глутамат; ИМОА - глутаматные рецепторы; АльДГ -альдёгйддегидрогеназа; АДГ - алкогольдегидрогеназа.

Принципиальные и основополагающие моменты наших знаний об алкогольных наркоманиях, которые в настоящее время кажутся штономными, в будущем, сольются в единую картину понимания о гшркоманиях в целом. Быть может, некоторые из теорий, которые сегодня тредставляются парадоксальными, послужат отправной точкой для анализа 5олее скрытых, интимных механизмов, лежащих в основе возникновения физической зависимости от этанола.

ВЫВОДЫ

1. В стволе головною мозга человека ЫАОРН-диафораза (ЫАОРНч!) установлена в нейронах супраоливарного комплекса, дорсального ядра блуждающего нерва, двойного ядра, ядра подъязычного нерва, ядер шва, ядра лицевого нерва, двигательного и мезэнцефалического ядра тройничного нерва, собственных ядер моста, медиального вестибулярного ядра и ретикулярного ядра черной субстанции.

2. NADPH-d солокализована с альдегиддегидрогеназой (АльДГ) в дорсальном ядре блуждающего нерва, двойном ядре, ядре подъязычного нерва, ядрах шва, ядре лицевого нерва, двигательном ядре тройничного нерва, собственных ядрах моста и медиальном вестибулярном ядре.

3. NADPH-d солокализована с алкогольдегидрогеназой (АДГ) в ядрах моноамингргической системы, а также в дорсальном ядре блуждающего нерва, двойном ядре, ядре подъязычного нерва, мезэнцефалическом ядре тройничного нерва и собственных ядрах моста.

4. ^ОРЬМ, АДГ и АльДГ экспрессируют нейроны дорсального ядра блуждающего нерва, двойного ядра, ядра подъязычного нерва, ядра лицевого нерва, двигательного ядра тройничного нерва, собственных ядер моста и медиального вестибулярного ядра.

5. Локализация и уровни активности АДГ и АльДГ в ядрах мозгового ствола человека и крыс совпадают, однако распределение активности КАЕ)РЬМ характеризуется видовой и внутривидовой специфичностью.

6. АДГ у человека и крыс локализуется во всех центрах моноамин- и холинергической нейропередачи, где преобладает высокий уровень активности энзима. Холинергические нейроны характеризуются высоко!" активностью АльДГ, а " моноаминергические (особенно катехоламинергические) - низкой.

7. В аминергических нейронах существует каталаза-зависимьн! механизм окисления этанола до ацетальдегида, который разрушается бе: участия АльДГ. Локальное накопление ацетальдегида в аминергическт нейронах усиливает токсический эффект этанола на эти структуры.

8. Наличие в аминергических нейронах высокой активности NADPH-t и АДГ при отсутствии АльДГ позволяет рассматривать N0 ка( метаболическое звено, опосредующее цитотоксическое деист ши ацетальдегида. Значение этого механизма усиливается в условия) хроническом алкогольной интоксикации, когда уровень наработки N0 резм

юзрастает за счет индукции NOS в серотонинергических ядрах шва и юрадренергическом ядре locus coeruleus.

9. Острая алкогольная интоксикация у крыс снижает активность NOS в 1драх моста, таламусе, гиппокампе и неокортексе, и усиливает активность жзима в ядрах продолговатого и среднего мозга, гипоталамусе и коре лозжечка.

10. При хронической алкогольной интоксикации у крыс возникает шдукция NADPH-d/NOS в астроцитах моноаминергических ядер и в солинергических нейронах гигантоклеточной ретикулярной формации фодолговатого мозга. Дополнительное образование N0 за счет активности 1Строцитарной и нейрональной ¡NOS коррелирует с повышением сонцентрации сывороточных нитрат-ионов и валовой биохимической iîcî hbhocth NOS ткани мозга.

11. Клетки ГТуркинье коры мозжечка человека характеризуются ibicoKHM уровнем активности АДГ и NADPH-d. На АльДГ они не реагируют, шбо имеют низкий уровень активности энзима. При декомпенсированной шкогольнон интоксикации наблюдается индукция нейрональной и шдотелиальной NOS в клетках Пуркинье и сосудах микроциркуляторного эусла.

12. В пирамидных нейронах моторной (поле 4) и префронтальной (поле 16) коры человека установлена высокая активность АльДГ, активность АДГ >тсутствует или имеет низкий уровень.

13. В неокортексе человека и крыс N0 синтезируют исключительно ормозные ГАМК-ергические интернейроны. В условиях хронической шкоголнзацли NADPH-d-позитивные интернейроны префронтальной >бластн коры остаются высокоустойчивыми к токсическому действию >танола, в отличие от пирамидных нейронов, количество которых снижается и 15-20%.

14. На основании полученных данных по распределению АДГ, АльДГ, "JADPH-d и NOS в нейронах сегментарных и координационных центров юздано представление об этанол-окисляющей и NO-ергической системе •оловного мозга. Активность исследованных энзимов является значимым фактором, который определяет повышенный метаболизм экзогенного гганола и ацетальдегида, низкий уровень метаболизма эндогенного этанола и щетальдегида и регуляторное влияние оксида азота на специфичность «ейротропного действия этилового алкоголя.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коновко О.О. NO-ергические механизмы алкогольной зависимости Владивосток, Тип. ОАО «Дальприбор», 2003.149 с.

2. Мотавкин П.А., Охотин В.Е., Коновко О.О., Зиматкин С.М. Локализацш алкоголь- и альдегиддегидрогеназы в спинном и головном мозге человек:; // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1988, t.XCV, №11.-е. 32-36.

3. Мотавкин П.А., Охотин В.Е., Коновко О.О., Зиматкин С.М. Локализаци? альдегиддегидрогеназы в центральной нервной системе человека // Бюл эксперим. биологии и медицины. 1989, № 12, с. 24.

4. Motavkin P.A., Okhotin V.Ye., Konovko O.O., Zimatkin S.M. Distribution ó alcohol- and aldegyde dehydrogenase activités in the human brain stem I, European Society for Neurochemistry.8th general meeting Leipzig, July 23 28,1990 Abstracts. - Leipzig, 1990, p. 132.

5. Motavkin P.A., Okhotin V.Ye., Konovko O.O., Zimatkin S.M. Localizations о alcohol- and aldegyde dehydrogenase in the spinal and brain of the human I, Neurosci. Behav. Physiol. 1990, N 5. P. 323-329.

6. Охотин B.E., Александрова Е.П., Матвеев А.Г., Коновко О.О. Калиниченко С.Г. Современные представления о роли и значенш алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в метаболизме этанола i ацетальдегида. Обзор // Деп. ВИНИТИ № 292-В91,1991,46 с.

7. Охотин В.Е., Коновко О.О., Матвеев А.Г., Нестеров Ю.П., Калиниченк« С.Г. Нейротоксическое, нейрометаболическое и нейромодуляторнси действие этанола на ЦНС. Обзор // Деп. в ВИНИТИ. 1993. № 1995-В93. 2' с.

8. Охотин В.Е., Коновко О.О. Цитохимическая характеристика алкоголь- i альдегиддегидрогеназы нейронов мозга человека // В кн. Тезисы 1 научно! конференции молодых ученых. Владивосток: ВГМИ, 1988, с. 125-127.

9. Охотин В.Е., Коновко О.О., Матвеев А.Г., Александрова Е.П. Локализаци: альдегиддегидрогеназы в головном мозге человека // В кн.: Материаль научной конференции ВГМИ и ДВО АН СССР. Владивосток, 1990, с. 58 60.

Ю.Охотин В.Е., Коновко О.О., Александрова Е.П. Топохимия алкоголь- i альдегиддегидрогеназы в холинергических и моноаминергически: нейронах головного мозга человека // В кн. Материалы научно! конференции ВГМИ и ДВО АН СССР. Владивосток, 1990, с. 60-62.

11.Охотин В.Е.. Сулимов Г.Ю., Коновко О.О., Матвеев А.Г. Локализаци алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в холинергически: нейронах головного мозга человека // В кн.: "Региональные аспекп психического здоровья". Томск-Владивосток, 1993. с. 272-274.

12,Охотин В.Е., Сулимов Г.Ю., Матвеев А.Г., Калиниченко С.Г., Коновк О.О., Дюйзен И.В. Нейротоксическое действие этанола на грушевидны нейроны коры мозжечка крысы // В кн.: «Региональные аспекп психического здоровья». Томск-Владивосгок, 1993. с. 274-276.

13.Мотавкин П.А., Охотин В.Е., Коновко О.О. Энзимологические барьеры мозга для этанола и механизмы алкогольной абстиненции // В кн.: «Охрана психического здоровья». Владивосток, 1994, с. 83-87.

14.Мотавкин П.А., Охотин В.Е., Коновко О.О. Механизмы алкогольной абстиненции // В кн.: «Психосоматические нарушения на рубеже II-III тысячелетия». Владивосток-Томск, 2000. с. 104-109.

15.Морозов Ю.Е., Охотин В.Е., Коновко О.О., Калиниченко С.Г. Половозрелые различия активности алкоголь- и альдегиддегидрогеназы головного мозга человека // В Сб. Международный конгресс по интегративной антропологии. Санкт- Петербург, 2002. С. 65-78.

16.Коновко О.О., Морозов Ю.Е. Топохимия NO-синтазы, алкоголь- и альдегиддегидрогеназы в моноаминергических и холннергических нейронах головного мозга человека // В кн.: «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии». - Томск: Сибирский государственный медицинский университет. 2002, С. 41-42.

17.Коновко О.О., Охотин В.Е., Калиниченко С.Г. Сравнительное гистохимическое исследование локализации алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в головном мозге человека и крыс // В сб. материалов международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере».-Сургут: Изд-во СурГУ, 2002, с. 260-262.

18.Коновко О.О. Гистохимическое исследование локализации алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы в головном мозге человека // В сб. тез. докладов III Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины».-Владивосток, 2002.- с. 18.

19.Морозов Ю.Е., Охотин В.Е., Коновко О.О., Калиниченко С.Г. Окисляющие этанол и ацетальдегид ферменты мозга при отравлении алкоголем // Вопр. наркологии. 2003. № 2. С. 62-73.

20.Ксновко О.О., Дюйзеи И.В., Мотавкин П.А. Этанол-окисляющие и NO-синтезирующие ферменты моноаминергических ядер мозга человека // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2003. Т. 136, № 8. С. 231-234.