Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Алкогольный синдром плода и его фармакологическая коррекция при помощи синтетического нейропептида даларгина (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Алкогольный синдром плода и его фармакологическая коррекция при помощи синтетического нейропептида даларгина (экспериментальное исследование)"

Р Г Б ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

ФУТЕР Ольга Леонидовна

АЛКОГОЛЬНЫЙ СИНДРОМ ПЛОДА И ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ КОРРЕКЦИЯ ПРИ ПОМОЩИ СИНТЕТИЧЕСКОГО НЕЙРОПЕПТИДА ДАЛАРГИНА (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1<Э<Э4

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной патологии и терапии высшей нервной деятельности (зав. лабораторией - докт. мед. наук, профессор МГ.Айрапетянц) Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор - академик РАН, профессор ПВ.Симонов).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

М.Г. Айрапетянц

Официальные оппоненты; доктор медицинских наук,

доктор философских наук, профессор Р.И. Крутиков

доктор медицинских наук, профессор ЮВ. Буров

Ведущее учреждение: кафедра высшей нервной деятельности

МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится ' ШишЬЦ 1094 г. вс/_часов на заседании Специализированного УченогоГСовета Д-003.10.01 Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул. Бутлерова, д5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАК

Автореферат разослан " <394 г.

Ученый секретарь Специализированного совета (, // У О.Х.Коштоянц

(Кг

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Данная диссертация посвящена изучению экспериментальной модели алкогольного синдрома плода и поиску фармакологических средств для его лечения. Комплексное исследование поведенческих, нейрофизиологических, метаболических и структурных нарушений у животны:;, перенесших алкогольную интоксикацию во внутриутробном периоде развития, позволило углубить понимание механизмов повреждающего действия алкоголя. Продемонстрированы результаты экспериментальной фармакотерапии указанных нарушений с помощью нейропептида даларгина

Актуальность_исследования. Злоупотребление алкоголем и

его клиническая форма - алкоголизм - широко распространены во эсем мире. В связи с тем, что алкоголь и его метаболиты являются сильными тератогенами, в семьях алкоголиков часто рождаются дети с весьма характерной врожденной патологией. Комплекс нарушений, вызванных антенатальной алкогольной интоксикацией, впервые был описан Johnes и соавторами (1973) и получил название "фетальный алкогольный синдром", или "алкогольный синрдром плода" (АСП). Характерным признаком АСП является так называемая "триада" -отставание в росте, нарушения со стороны центральной нервной системы и лицевые дисморфизмы. В дальнейшем представления о тератогенном действии алкоголя были расширены, см. обзоры (Бадалян, Мастюкова, 1986, Colangelo and Jones, 1982, Streissguth, 1992, Larroque, 1992, Osborn et al., 1993, Weinberg 1993). было показано, что последствия антенатальной алкогольной интоксикации могут иметь разную выраженность от самых незначительных изменений до тяжелых уродств (Smith, 1980, Streissguth, 1985)

Исследованию механизмов эмбриотоксического действия алкоголя уделяется большое внимание в литературе (Анохина, 1981, Мастюкова, 1987, Fisher. 1985). было доказано, что тератогеном является как сам алкоголь, так и его метаболит - ацетальдегид (Буров. Ведерникова, 1985). Повреждающий эффект алкоголя на плод проявляется в нарушении синтеза нейромедиаторов и гормонов, нарушении миграции нервных клеток, нарушении процесса

образования синапсов (Pratt, 1984, Volk, 1981). Однако, вследствие сложности и многоплановости проблемы, до сих пор остаются нерешенными многие вопросы связанные как с механизмами тератогенного действия алкоголя, так и с отдаленными последствиями антенатальной алкогольной интоксикации для взрослого потомства. Исследование структурной организации мозга потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности, а также активности окислительного фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы - имеет принципиальное значение для понимания патогенетических механизмов фетального алкогольного синдрома.

Известно, что сон является одним из основных механизмов защиты нервной системы от перегрузок, и его компенсаторная и восстановительная роль крайне важны для нормального функционирования организма. С другой стороны, сон очень раним и чувствителен к различным воздействиям внешней среды (Айрапетянц, Вейн, 1982). В этой связи представляется важным и актуальным изучение состояния системы бодрствование-сон антенатально алкоголизированных крыс.

Малоизученным является вопрос о том, какой прогноз ожидает тех детей родителей-алкоголиков, у которых при рождении не наблюдается морфологических нарушений, а в раннем детстве -отставания психического развития. Насколько они приспособлены к нагрузкам постоянно меняющейся внешней среды? Не являются ли патологические изменения скрытыми до определенного возраста? Пытаясь ответить на эти вопросы, мы провели серию экспериментов, в которой исследовали чувствительность потомства крыс, потреблявших алкоголь, к хроническому эмоционально-болевому стрессу.

Терапия фетального алкогольного синдрома разработана не достаточно. В клинической практике применяется в основном симптоматическое лечение, в то время как этиологический подход к лечению и профилактике АСП практически полностью отсутствует (Osborn, et. al., 1993). Первые экспериментальные работы в этом направлении появились лишь в недавнее время (Чеботарь, 1987,

Майзелис, 1989, Коломейцева, 1989). Необходимость разработки новых методов лечения фетального алкогольного синдрома придает особую актуальность нашим исследованиям, в которых был успешно использован синтетический нейропептид даларгин.

Цель и_задачи исследования. Целью настоящей работы

было исследование поведенческих, нейрофизиологических и структурно-метаболических нарушений у взрослых животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию, и поиск средств фармакологической коррекции этих нарушений. Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние антенатальной алкогольной интоксикации на следующие показатели у взрослых крыс:

а) поведение в тестах "открытого поля", "неизбегаемого плавания" и "эмоционального резонанса";

б) высшую нервную деятельность (процессы выработки и сохранения условных рефлексов активного и пассивного избегания);

в) состояние вегетативных функций (артериальное давление в фоне и при функциональной нагрузке);

г) биоэлектрическую активность мозга в цикле бодрствование-сон;

д) структурные (световая и электронная микроскопия) и метаболические (активность окислительного фермента сукцинатдегидрогеназы) изменения в мозге в процессе онтогенеза.

2. Изучить влияние хронического (1 месяц) эмоционально-болевого стресса на .поведение, условно-рефлекторную деятельность, артериальное давление и биоэлектрическую активность мозга потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности.

3. Оценить фармакологические свойства синтетического нейропептида даларгина как средства для лечения последствий антенатальной алкогольной интоксикации. Исследовать влияние препарата на вызываемые алкогольной интоксикацией нарушения выработки и сохранности условных рефлексов, нарушения сна и структурно-метаболические изменения 8 мозге.

Научная_новизна_исследований. Впервые при исследовании

последствий антенатальной алкогольной интоксикации у взрослых

животных обнаружены устойчивые нарушения структуры сна, подобные наблюдаемым при экспериментальном неврозе.

Впервые продемонстрировано, что вследствие эмбриотоксического действия алкоголя повышается чувствительность потомства к стрессу. Хронический эмоционально-болевой стресс впервые позволил продемонстрировать "скрытый" характер нарушений высшей нервной деятельности, наблюдаемый у части потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности.

Впервые установлен положительный коррегирующий эффект даларгина на показатели условно-рефлекторной деятельности, структуру сна и окислительные процессы в мозге животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты расширили и углубили знания о повреждающем действии алкоголя на плод. Обнаруженная в нашем исследовании повышенная чувствительность антенатально алкоголизированных животных к стрессу может быть использована в клинике алкогольных эмбриопатий для оценки факторов риска развития невротических расстройств. Учитывая практические трудности и ограничения клинических исследований использованный нами метод экспериментального моделирования фетального алкогольного синдрома является единственно возможным для поиска средств рациональной терапии и профилактики этого заболевания. Обнаруженный положительный эффект даларгина может служить основанием для рекомендации этого препарата к внедрению в клиническую практику, что отражено в заявке на изобретение (приоритетная справка # 4.221430/14, 1087).

Представленные в работе данные о структурно-метаболических нарушениях, возникающих вследствие антенатальной алкогольной интоксикации, и их коррекции при помощи даларгина имеют принципиальное значение для понимания патогенетических механизмов фетального алкогольного синдрома и возможных механизмов коррегирующего действия нейропептида. Эти результаты

могут быть рекомендованы для включения в учебный курс ВУЗов по курсам "патофизиология" и "акушерство и гинекология".

Положения, выносимые на защиту.

1. Антенатальная алкогольная интоксикация оказывает влияние на врожденные формы поведения - усиливает пассивно-оборонительные реакции и реакции страха, повышает склонность к развитию депрессивно-подобного состояния

2. Антенатальная алкогольная интоксикация разрушительно действует на функции центральной и вегетативной нервной системы, вызывая нарушение условно-рефлекторной деятельности, нарушение механизмов саморегуляции вегетативных функций, нарушение структуры цикла бодрствование-сон.

3. В основе механизма патогенного действия алкоголя на нервную систему лежит нарушение тканевого дыхания. Развивающееся при этом гипоксическое состояние мозга приводит к необратимым изменениям на структурном и ультраструктурном уровне, а также к функциональным нарушениям.

4. Антенатальная алкогольная интоксикация повышает чувствительность потомства к стрессовым факторам внешней среды

5. Этиологический подход к лечению и профилактике фетального алкогольного синдрома является принципиально возможным. Инъекции синтетического нейропептида даларгина частично компенсируют нарушения, вызванные антенатальной алкогольной интоксикацией. & основе лечебных эффектов препарата лежат его антигипоксические и нейроростовые свойства.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых ИВНД и НФ АН СССР (Москва, 1985. 1986). на конференции молодых ученых НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина АМН СССР (Москва, 1986), на международном симпозиуме "Алкоголизм и наследственность" (Ленинград. 1986), на конференции "Алкоголизм и стресс" (Пущино, 1987), на международной школе молодых ученых "Обучающийся мозг" (Репино., 1987), на Всероссийской конференции "Перспективы клинического применения препаратов пептидной природы" (Москва, 1987). Диссертация апробировалась на совместном заседании

группы экспериментальной патологии и терапии высшей нервной деятельности и лаборатории нейрохимических механизмов условного рефлекса ИВНД НФ РАН 2 июня 1994.

Публикации. Материалы диссертации отражены в 1 1 печатных работах и одной заявке на изобретение.

Структура и объем_диссертации. Диссертация состоит из

введения, обзора литературы, описания методики, изложения результатов исследования и их обсуждения (5 глав), заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работд изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков и ^ таблиц. Библиографический указатель содержит ш работ, из которых £ отечественных и иностранных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проведены на 450 беспородных крысах-самцах. Контрольные животные были получены от самок, потреблявших воду, подопытные - от самок, потреблявших добровольно в течение всей беременности в качестве единственного источника жидкости 15%-ный раствор спирта.

Поведение в "открытом поле" изучали дважды - в возрасте 1 -1,5 и в 4 - 4,5 месяцев. В течение 5 мин у крыс регистрировали горизонтальную и вертикальную двигательную активность, число выходов в центр поля, количество умываний и дефекаций. По показателям двигательной активности животных подразделяли на высоко- и низкоактивных.

Для оценки склонности крыс к развитию депрессивно-подобного состояния животных помещали на 10 мин в бассейн с водой и регистрировали время нахождения животных в позе иммобилизации (пассивное плавание) (Роной е: а1., 1978, Кампов-Полевой, 1982).

По методике "эмоционального резонанса" по П.В. Симонову (1976) у животных вырабатывали в течение 8 дней условную реакцию избегания малого пространства, переход в которое сопровождался электро-раздражениеп крысы-"жертвы", находящейся в другом

отсеке камеры. Регистрировали суммарное время нахождения животного в малом отсеке и количество переходов из одного отсека в другой за 5 мин наблюдения.

Изучение условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) проводили в камере, разделенной на два отсека - освещенный и затемненный. Крысу помещали в светлый отсек, при переходе в более комфортный - затемненный - животное получало удар током пороговой силы. После однократного избавления от боли (возврата в светлый отсек) крысу удаляли из камеры. Проверку выработки и сохранения УРПИ проводили на следующий день и через один месяц.

Условный рефлекс активного двустороннего избегания (УРАИ) вырабатывали в челночной камере с электродным полом, где удару тока пороговой силы предшествовали вспышки света частотой 1 Гц, длящиеся 5 сек изолированно и 5 сек на фоне электрического раздражения лап животного. Выработку УР проводили в течение 2-х дней, а через 1 месяц проверяли сохранность выработанной временной связи.

Артериальное давление (АД) определяли бескровным способом при- помощи светодатчика по появлению пульсовых волн после пережатия корня хвоста животного специальной манжеткой. Регистрацию проводили до (фоновое значение) и после 2 час. иммобилизации.

Биоэлектрическую активность мозга регистрировали в свободном поведении в течение 5 дней по 2 часа ежедневно. Для записи ЭЭГ использовали 16-канальный энцефалограф фирмы "Медикор" (Венгрия). ЭЭГ зрительной коры регистрировали монополярно при помощи серебряных электродов, вживленных эпидурально. ЭЭГ дорзального гиппокампа регистрировали с помощью нихромового электрода, вживленного по координатам: АР-4,0; 1-2,5; Н-3,5. Запись электрокардиограммы осуществляли биполярно от серебряных электродов, вживленных в мышцы шеи. Операцию по вживлению электродов проводили под нембуталовым наркозом (40 мг/кг, внутрибрюшинно). Дыхание регистрировали при помощи угольного датчика, укрепленного на груди животного.

При анализе ЭЭГ выделяли следующие фазы цикла бодрстаование-сон: активное бодрствование (б)), пассивное бодрствование (52). поверхностный медленный сон (МС]), глубокий медленный сон (МС2) и парадоксальный сон (ПС). Структуру сна оценивали по продолжительности отдельных эпизодов, времени их наступления, частоте встречаемости той или иной фазы сна, количеству пробуждений.

На 2, 14, 60 и 180-й день жизни часть животных забивали и а срезах зрительной и сенсопоторной коры определяли активность сукцинатдегидрогенезы (С ДГ). Для этого использовали количественный гистохимический метод Р.П. Нарциссова (1970), позволяющий определить активность фермента в единицах удельной активности (мкмоль формазана на 1 мг ткани). Локализацию СДГ в ткани определяли в срезах мозга по методу Нахласа (1958).

У животных тех же возрастных групп проводили морфологическое исследование мозга методами световой и электронной микроскопии. Использовали методы Ниссля, Кахаля и Миагава-Александровской. Электронно-микроскопическое исследование коры больших полушарий проводили по препаратам, фиксированным в 5%-ном глютаровом альдегиде, содержащем 1 % параформа, а затем в 2% СЮд, после чего препараты обезвоживали в спирте и заливали в аралдит. Срезы контрастировали азотнокислым свинцом и исследовали на электронном микроскопе jEM-100-B.

Для исследования чувствительности к стрессу потомство контрольных и алкоголизированных самок было разделено каждое на две подгруппы, одну из которых подвергали действию эмоционально-болевого стресса в течение одного месяца. Стрессирующее воздействие создавали сочетанием прерывистого белого шума и электроболевого раздражения.

В качестве средства для лечения последствий антенатальной алкогольной интоксикации использовали синтетический нейропептид даларгин. Препарат вводили подкожно курсами по пять дней либо самкам с 16-го по 20-й день беременности в дозе 15мкг/кг, либо крысятам с 7-го по 11-й день жизни в дозе 10мкг/кг.

Результаты обрабатывали статистически по критериям Стьюдента и Билкоксона-Манна-Уитни (Гублер, Генкин, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние антенатальной алкогольной интоксикации_

выживаемость потомства. Потомство самок, потреблявших алкоголь во время беременности, отставало от контрольного по физическому развитию. Средний вес новорожденных крысят, перенесших антенатальную интоксикацию алкоголем, был достоверно ниже, чем в контроле, в среднем соответственно 5,7 и 6,4 г (р< 0,01). В половине подопытных пометов были обнаружены мертворожденные крысята (8,3% от общего числа родившихся), а 8 контрольных пометах мертворожденных крысят не было. В результате антенатальной алкогольной интоксикации аозрасла также смертность а раннем возрасте: в подопытной группе з первые две недели жизни погибло (включая мертворожденных) 39% крысят, в контрольной группе

-16,3%(р < 0,01).

Особенности поведения и условно-рефлекторной деятельности животных, пепрняппих антенатальную алкогольную интоксикацию. При исследовании поведения крыс в тесте "открытое поле" было обнаружено, что в возрасте 1,5 мес. большинство животных подопытной группы, подвергавшихся антенатальной алкогольной интоксикации, были высокоактивны. Только 4,2% крыс этой группы имели низкую горизонтальную активность, тогда как в контрольной группе таких животных было 25,4% (р < 0,001). Горизонтальную активность 4-месячных крыс считали высокой, если животное за время наблюдения пересекало более 40 квадратов, и низкой - если менее 20. К этому возрасту двигательная активность подопытных животных резко снижалась. Среди них было больше крыс с низкой горизонтальной активностью (59,1% по сравнению с 33,3% в контрольной группе) и меньше с высокой (36,4% и 47,6% соответственно). Крысы подопытной группы реже выходили в центр открытого поля, в 4-месячном возрасте разница по этому показателю между контрольной и подопытной группой достигла критерия

достоверности (57,2% и 27,3% , р < 0,025). Число дефекаций, свидетельствующее о выраженности реакции страха в открытой поле, у 4-месячных животных подопытной группы было в среднем примерно в 1,5 раза больше.

6 условиях неизбегаемого плавания подопытные животные, как правило, раньше, чем контрольные, прекращали активное плавание, отказывались от борьбы и зависали в воде неподвижно. У 82% антенатально алкоголизированных животных время нахождения в позе иммобилизации было более 200 сек. В литературе (Рогсок ее а1„ 1978, Кампов-Полевой, 1982) это рассматривается как проявление депрессивно-подобного состояния.

По характеру поведения в условиях выработки реакции избегания малого затемненного простраства на крик "жертвы" (методика "эмоционального резонанса" по П.В. Симонову) контрольных животных можно было разделить на три подгруппы: крысы, вырабатывающие реакцию избегания; крысы, не вырабатывающие реакции избегания; и амбивалентные животные, не вырабатывающие предпочтения затемненного или освещенного пространства. Распределение крыс между подгруппами было примерно равномерным, что согласуется с описанным ранее в литературе (Симонов, 1976, Хоничева, Данчев, 1985). У животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию кроме трех описанных типов поведения наблюдался еще один, к которому можно было отнести более 40% крыс подопытной группы. Эти крысы отличались ярко выраженными реакциями замирания, оцепенения и не вырабатывали реакцию избегания крика "жертвы" из-за явного преобладния у них реакции страха.

Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) вырабатывается, как правило, с одного сочетания. Через один месяц у всех контрольных животных УРПИ оставался прочным (побежка в темный отсек отсутствовала), в то время как у 6 из 10 антенатально алкоголизированых крыс рефлекс не сохранился - они заходили в темную часть камеры со средним латентным периодом перехода 112,5 сек. Поведение в экспериментальной камере трех подопытных крыс (30%) заметно отличалось от остальной группы - из-за

повышенной реакции страха в 1-ый день опыта средний латентный период перехода э темный отсек у этих крыс составлял 240 сек (в контрольной группе - 7 сек., р <0,001). Несмотря на то, что эти крысы не заходили в темный отсек в последующих опытах, вряд ли можно говорить о сохранности у них выработанного рефлекса, т.к. отсутствие побежки в течение всего времени наблюдения связано скорее всего не с обучением, а с проявлением реакции страха.

Антенатально алкоголизированные животные заметно отставали от контрольных по скорости выработки условного рефлекса активного двустороннего избегания (УРАИ). Им требовалось достоверно большее число сочетаний как для появления (23 и 40 соответственно, р < 0,005), так и для закрепления рефлекса (52 и более 60 соответственно, р < 0,05). На 2-й день и через месяц у контрольных животных сроки появления и закрепления УРАИ сокращались (появление - на 12-ом и 4-ом, закрепление - на 31-ом и 7-ом сочетании соответственно) тогда как у животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию, рефлекс приходилось вырабатывать практически заново (первые правильные побежки появлялись на второй день в среднем на 42-ом сочетании, а через масяц на - 52-ом), что свидетельствует о нарушении у них долгосрочной памяти.

Таким образом, все использованные методики исследования поведения животных позволили обнаружить сходный эффект: в группе крыс, перенесших антенатальную интоксикацию алкоголем, усиливаются пассивно-оборонительные формы поведения. В ситуации неизбегаемого плавания 82% животных находились в позе иммобилизации более 200 сек. При выработке реакции избегания малого пространства в условиях крика партнера пассивный тип поведения проявлялся у 42%, а при выработке УРПИ - у 30 % крыс, перенесших интоксикацию алкоголем во время внутриутробного развития.

Можно утверждать, что в результате алкогольной интоксикации, действующей во время беременности, рождается потомство, характеризующееся изменением врожденных форм поведения, преобладанием пассивно-оборонительных реакций, высокой

I

ия . и

_I °

5 • ! I

4 /г яс, «5 ® ^ ^ ж, мс, пс

I I

4

Л „

¡0 -

за

х I пс~мс.

I

П

ЙС-МС.

ПС—5.4,

ПС

к

Рис. 1. Структура цикла бодрствование-сон

А - средняя длительность каждой фазы цикла, (%); Б - латентный период наступления фаз сна, (мин); 6 - среднее число эпизодов каждой фазы цикла; Г - средняя длительность одного эпизода, (миа); Д - число эпизодов ПС, (%), заканчивающихся разным типом пробуждения: переходом в МСг (ПС - МСг), а МС1 (ПС - ПС\) и в 61, 62 (ПС - Б1+62). I, II - номера групп. * - р < 0,05, ** - р < 0,005, *** -р < 0,001.

12

склонностью к развитию депрессивно-подобного состояния, нарушением способности к выработке условных рефлексов.

Структура сна антенатально злкоголизированных животных. У крыс подопытной группы наблюдалось увеличение продолжительности бодрствования (суммарная длительность Б1 и 62 составляла 40%, в контроле - 21%.Р <0,001) и сокращение времени сна, преимущественно его глубоких фаз. Например, МС2 составлял только 30% всего времени сна, тогда как в контроле - 49%, (р < 0,05) (рис. 1, А). У антенатально алкоголизированных крыс было также отмечено увеличение латентных периодов наступления всех фаз сна (рис. 1, Б). Кроме снижения суммарной длительности отдельных фаз сна, у подопытных животных была нарушена структура цикла: время бодрствования увеличивалось как за счет увеличения продолжительности отдельных эпизодов 51 и 62, так и в результате увеличения их числа; длительность эпизодов МС2 и ПС уменьшалась по сравнению с контролем; снижалось также количество эпизодов парадоксального сна (рис. 1, В,Г).

Нарушение структуры сна сопровождалось ухудшением качества отдельных фаз. В частности, в ПС подопытных животных наблюдалась диссоциация между вегетативными и электроэнцефалографическими показателями - замедление сердечного ритма и снижение тонуса шейных мышц, обычно возникающие на фоне этой фазы сна, не всегда сопровождались развитием четкого тета-ритма в гиппокампе и в коре. В ряде других случаев при развитии ПС не было отмечено полного мышечного расслабления. Кроме того, у животных подопытной группы чаще, чем в контроле, наблюдался скачкообразный переход, минуя ряд фаз, из ПС в Б1 (рис. 1, Д). Переход от ПС сразу к поведенческому пробуждению свидетельствует о недостаточной глубине этой фазы сна (Ониани, 1974). Иногда парадоксальный сон у подопытных животных внезапно прерывался кратковременными эпизодами медленного поверхностного сна с изменением мышечного тонуса и затем 8новь возбновлялся ПС. Такой сон наблюдается у человека при невротических расстройствах и считается качественно

неполноценным (Вейн, 1974). Очевидно, он не может выполнять свою восстановительную роль при возникновении стрессовых ситуаций.

Кроме того, в ЭЭГ крыс, перенесших внутриутробную алкогольную интоксикацию, была обнаружена элилептиформная активность в виде одиночных и групповых пик-волн, развивающихся на фоне различных фаз сна. Это наблюдение свидетельствует о снижении порогов судорожной активности, так называемой эпилептоидной готовности животных, родившихся от самок, потреблявших алкоголь во время беременности.

Гистохимические и морфологические исследования мозга. Определение активности СДГ в сенсомоторной и зрительной коре крыс было проведено в различные возрастные периоды. Антенатальная алкогольная интоксикация приводила к достоверному снижению активности фермента в обоих отделах мозга у подопытных животных всех возрастных групп, что свидетельствует о нарушении тканевого дыхания. Так, например, в возрасте 2-х месяцев в контрольной группе уровень активности СДГ в сенсомоторной коре составлял 130 единиц, а в зрительной - 90, в то время как в подопытной группе эти показатели равнялись 60-ти и 50-ти соответственно (в обоих случаях разница достоверна при р< 0,001). Различия в активности СДГ в зрительной и сенсомоторной коре контрольных животных могут быть связаны с особенностями структурно-функциональной организации двух структур мозга.

Изучение послойной локализации СДГ в сенсомоторной и зрительной коре позволило обнаружить неравномерное распределение этого фермента у крыс, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию. У них наблюдалось появление в отдельных участках коры полей с резко сниженной и нормальной активностью фермента. Такую особенность распределения СДГ наблюдали в сенсомоторной коре во П и 1П слоях, а 8 зрительной - во П, Ш и V слоях.

Морфологическое исследование мозга контрольных и подопытных животных выявило корреляцию между структурным развитием коры и активностью СДГ. В 2-х месячном возрасте у подопытных животных снижение активности СДГ сочеталось с

обнаруженным электронно-микроскопическим методом нарушением митохондриального аппарата нервных и глиальных элементов. Снижение содержения в нервных клетках ядерного вещества, а в цитоплазме - каналов гранулярного ретикулума и свободных рибосомальных элементов указывает на нарушение функции аппарата синтеза белков. В части клеток обращала на себя внимание структурная дезорганизация органоидов цитоплазмы, что не характерно для нервных клеток нормальных животных.

Поражение кровеносных сосудов мозга потомства животных, потреблявших алкоголь, проявлялось в виде набухания клеток эндотелия, расширения базального слоя в капиллярах, перекапиллярных отеков прилежащих к ним отростков астроцитарной глии. Все эти изменения свидетельствуют о нарушении мозгового кровообращения и развитии тканевой гипоксии в головном мозге антенатально алкоголизированных крыс.

Чувствительность_К_стрессу взрослых крыс._перенесших

антенатальную интоксикацию алкоголем. Хронический эмоционально-болевой стресс в течение одного месяца приводил к нарушению условнорефлекторной деятельности у всех животных. Однако, у контрольных животных стресс вызывал лишь замедление процесса восстановления условного рефлекса активного избегания, выработанного до начала стрессирующего воздействия. Большинство животных (80%) вновь достигли критерия выработки УРАИ на второй день опыта. У крыс, перенесших антенатальную интоксикацию алкоголем, хроничесий эмоционально-болевой стресс привел к полному выпадению условного рефлекса - критерия выработки УРАИ не достигло ни одно животное этой группы.

Эмоционально-болевой стресс вызывал стойкое повышение артериального давления у всех животных. Так, в контрольной группе АД до начала стрессирующего воздействия составляло 120 мм рт.ст., а после месяца невротизации - 135 мм рт.ст. (р < 0,01). У крыс, перенесших интоксикацию алкоголем во внутриутробный прериод развития, повышение АД вследствие хронического эмоционально-болевого стресса было более значительным - до 145 мм рт.ст. (р < 0,001).

Изменения в структуре сна, вызванные антенатальной алкогольной интоксикацией и хроническим эмоционально-болевым стрессом, были схожи. В обоих случаях наблюдалось сокращение длительности сна, ухудшалось его качество. Однако, стресс усугублял инсомнические расстройства, вызванные антенатальной алкогольной интоксикацией. У крыс, подвергавшихся токсическому действию алкоголя во внутриутробный период и хроническому стрессу во взрослом возрасте, наблюдалось дальнейшее сокращение доли МС2 и ПС в структуре сна и укорочение их эпизодов. Кроме того, количество поведенческих пробуждений из фазы ПС в Б1 и 62 У этих животных было максимальным по сравнению со всеми остальными группами (38,5%, р < 0.001), что свидетельствует о снижении глубины ПС и. следовательно, качества сна (Коридзе, 1985, Латаш, 1971).

Таким образом, у антенатально алкоголизированных крыс хронический эмоционально-болевой стресс вызывал более серьезные нарушения как со стороны высшей нервной деятельности, так и со стороны регуляции вегетативных функций и сна. Полученное результаты указывают на то. что животные, подвергавшиеся эмбриотоксическому действию алкоголя, в большей степени подвержены развитию невротических расстройств.

экспериментальная_терапия_Фатального , алкогольного

синлпома. Контрольные животные, получавшие даларгин в конце эмбриогенеза или в раннем онтогенезе не отличались достоверно от интактных животных ни по одному из исследованных нами показателей физического развития, условнорефлекторной деятельности, биоэлектрической активности мозга и тканевого дыхания. Следовательно, сам по себе даларгин не оказывает влияния на рост и развитие животных.

У животных, родившихся от алкоголизированных самок, получавших даларгин в третьем триместре беременности, наблюдалось значительное улучшение способности к выработке УРАИ. Этим крысам требовалось достоверно меньшее число сочетаний для достижения критерия закрепления УРАИ, чем потомству самок, потреблявших алкоголь и не получавших лечения.

хотя и несколько больше, чем контрольным животным (в среднем 45. более 60 и 20 соответственно, р < 0,01). Несмотря на отставание в темпах выработки рефлекса, критерия закрепления достигло 85,7% животных этой группы, что достоверно не отличается от контроля.

Аналогичные результаты были получены при введении даларгина антенатально алкоголизированным животным в раннем онтогенезе (с 7-го по 11-й день жизни), большинство антенатально алкоголизированных крыс, получавших даларгин (66,7%), достигли критерия закрепления УРАИ на 2-ой день опыта. По этому показателю они не отличались достоверно от контрольной группы

Как уже было показано ранее, антенатальная алкогольная интоксикация приводила к значительному нарушению структуры цикла бодрствование-сон - достоверному сокращению продолжительности глубоких фаз сна (МС2 и ПС) и увеличению латентных периодов их наступления. Лечение даларгином в третьем триместре беременности полностью компенсировало нарушения структуры сна. вызванные антенатальной интоксикацией алкоголем: у потомства самок, получавших даларгин, продолжительность и латентные периоды наступления МС2 и ПС достоверно не отличались от контроля. Лечение даларгином в раннем онтогенезе также восстанавливало структуру сна взрослых крыс.

У животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию уровень СДГ в сенсомоторной коре был достоверно ниже, чем в котрольной группе во все исследованные возрастные периоды (например, в возрасте 2-х месяцев, 60 и 120 уел ед. соответственно, р< 0,001). Введение даларгина беременным самкам на фоне потребления алкоголя приводило к достоверному повышению активности СДГ в коре мозга потомства в среднем до 80 усл. ед. (р < 0,001). Этот эффект был отмечен не только в сенсомоторной, но и в зрительной коре (активность СДГ без лечения - 50, с лечением - 70, в контроле - 90 усл. ед., р< 0,001). Введение даларгина крысятам также частично компенсировало вызванные интоксикацией нарушения тканевого дыхания в мозге. У животных, получавших даларгин, уровень СДГ в зрительной и сенсомоторной

коре был достоверно выше, чем у не получавших его антенатально алкоголизированных крыс (р < 0,001).

Изучение послойной локализации СДГ позволило обнаружить у крыс, подвергавшихся антенатальному действию алкоголя, неравномерность распределения фермента в отдельных слоях коры мозга. Введение даларгина не только частично компенсировало вызванное интоксикацией количественное снижение уровня активности СДГ, но и способствовало более равномерному распределению фермента в ткани, что в совокупности нормализовало окислительные процессы в митохондриях. Нормализация распределения СДГ наблюдалась при обоих режимах лечения - как при ведении даларгина беременным самкам, так и крысятам.

Таким образом, короткие 5-дневные курсы лечения даларгином в позднем эмбриогенезе или раннем онтогенезе полностью восстанавливали вызванные антенатальной алкогольной интоксикацией инсомнические расстройства, способствавали улучшению условнорефлекторной деятельности, а также приводили к повышению активности СДГ и более равномерному распределению фермента в отдельных слоях коры, что свидетельствует о нормализации тканевого дыхания и улучшении энергообеспечения в мозге.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нами было установлено, что в результате антенатальной алкогольной интоксикации рождается потомство, характеризующееся изменением врожденных форм поведения, снижением скорости выработки условных рефлексов, вегетативными сдвигами, инсомническими расстройствами, структурно-метаболическими нарушениями.

Сравнение поведения подопытных животных в тестах "открытое поле", "неизбегаемое плавание", "эмоциональный резонанс" и при выработке оборонительных условных рефлексов, позволило выявить определенную закономерность. Во всех случаях была отмечена тенденция к усилению пассивно-оборонительных черт поведения и

эмоций страха. Не исключено, что эта особенность поведения животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию, является одной из причин ухудшения условно-рефлекторной деятельности. Естественно предположить, что резкое превалирование у них мотивации страха в ситуации неизбегаемого болевого раздражения при выработке УРАИ тормозило проявление ориентировочно-поисковых реакций и препятствовало быстрой смене площадки. Такое подавление мотивации в результате действия обстановочных раздражителей отмечено а литературе (Хоничева, Данчев, 1985) и рассматривается как проявление неврозоподобного поведения. Таким образом, можно с уверенностью утверждать, что алкогольная интоксикация плода влияет на врожденные формы поведения. Наши результаты подтверждают высказывания ряда авторов о возможности возникновения под влиянием алкоголя поведенческого тератогенеза (Fisher, 1985 ; Лильин, Лукашева, 1987).

Исследование биоэлектрической активности мозга потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности, позволило обнаружить значительные нарушения в структуре цикла бодрствование-сон: сокращение длительности сна, нарушение засыпания, снижение качества сна с преобладанием более поверхностных фаз. Сокращение продолжительности глубоких фаз сна происходило как за счет уменьшения числа эпизодов каждой из фаз (что может быть связано с дефектностью триггерных механизмов (Schmidek et al., 1974), так и за- счет укорочения длительности каждого эпизода. Последнее свидетельствует об истощении энергетических ресурсов мозга, обеспечивающих развитие медленного и парадоксального сна (Druker-Colin, Espejel, 1980). В целом, обнаруженные у антенатально алкоголизированного потомства инсомнические расстройства напоминали описанные ранее нарушения сна при экспериментальном неврозе (Коломейцева, 1982).

Тот факт, что у подопытных животных наблюдалось нарушение механизмов запуска и MC и ПС, существенно различающихся по своему метаболическому и анатомическому обеспечению, позволяет предположить, что антенатальная алкогольная интоксикация оказывает неспецифическое астенизирующее воздействие на ЦНС

потомства. Весьма возможно, что снижение качества ПС у подопытных животных явилось одной из причин ухудшения способности к запоминанию при выработке оборонительных условных рефлексов, так как именно с ПС связывают процессы консолидации следов памяти (Реаг1тап, СгееепЬегг, 1973). Кроме того, ПС играет важную роль в адаптационно-приспособительных реакциях организма (Ротенберг. 1977).

Структурно-метаболические исследования мозга крыс, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию, продемонстрировали следующее:

- достоверное снижение активности центрального окислительного фермента митохондрий - сукцинатдегидрогеназы,

- ультраструктурные изменения митохондрий в телах и отростках нервных клеток, а также в глиальных клетках - астроцитах и олигодендроцитах,

- изменения структуры кровеносных сосудов - перикапилярные отеки астроцитарных отростков, набухание клеток эндотелия, расширение базального слоя в калилярных стенках.

Все эти изменения свидетельствуют о нарушении мозгового кровообращения и тканевого дыхания и, как следствие, о развитии гипоксии в коре мозга потомства, алкоголизированного в антенатальном периоде развития. Вышесказанное подтверждается также тем, что наблюдаемые у антенатально алкоголизированных крыс нарушения ультраструктуры зрительной и сенсомоторной коры напоминали деструктивные изменения нервных элементов при гипоксии (Боголепов, 1979, Попова, 1984). Далее, было показано, что нарушение процессов обучения и синтеза белка в церебральных структурах у потомства самок, перенесших гипоксию и алкоголизацию во время беременности, имеет сходную картину (Майзелис и др.,1987). Очевидно, общим компонентом в действии этих факторов является гипоксия эмбриона.

На основании многолетнего исследования экспериментальных неврозов в лаборатории экспериментальной патологии и терапии высшей нервной деятельности ИВНД и НФ АН России была высказана гипотеза о роли церебральной гипоксии в патогенезе невроза

(Айрапетянц, 1992). Можно предположить, что у животных, перенесших антенатальную алкогольную интоксикацию, гипоксическое состояние мозга создает предпосылку для появления невротических черт поведения. Причем определенные элементы неврозоподобного состояния, такие как пассивно-оборонительное поведение и торможение ориентировочно-исследовательской активности, нарушение электроэнцефало-графической структуры сна, нарушение механизма саморегуляции вегетативных функций наблюдаются у антенатально алкоголизированных животных в обычных условиях внешней среды без действия дополнительных надпороговых стимулов. В этом состоит их основное отличие от контрольных животных для которых наличие сильного психоэмоционального стресса является необходимой предпосылкой для развития невроза.

Нами было показано, что хронический эмоционально-болевой стресс, применяемый для создания неврозоподобного состояния у крыс, вызывая у антенатально алкоголизированных животных более глубокие вегетативные сдвиги, полное выпадение ранее выработанных условных рефлексов, дальнейшее сокращение доли ПС в структуре сна. Наши результаты доказывают, что предрасположенность потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности, к развитию неврозоподобного состояния связана с вызванной антенатальной алкогольной интоксикацией церебральной гипоксией.

Анализируя результатыл фармакотерапии, можно предположить, что положительное действие даларгина на функцию и структуру коры больших полушарий, вероятно, прежде всего связано с восстановлением метаболических процессов в мозге, в частности тканевого дыхания, (на что указывает наблюдаемое нами повышение активности СДГ), и белкового синтеза (Майзелис, 1989). Важная роль в этом процессе принадлежит, по-видимому, активации глиальных клеток, улучшающих трофику мозга и способствующих восстановлению кровообращения. Восстановление же энергообеспечения в нервных клетках повышает активность белоксинтезирующего аппарата и приводит к новообразованию рибосомальных элементов в цитоплазме.

В связи с этим весьма вероятно, что в основе лечебных эффектов даларгина лежат, с одной стороны, его антигипоксические свойства (Иноземцева. Павленко, 1985), а с другой - нейроростовые свойства препарата и его способность как опиоидного пептида активировать рост ткани в местах ее повреждения и недоразвития (Ильинский, Козлова и др., 1985, Ильинский, Спевак и др., 1985). Эффективность лечения даларгином, возможно, обуславливалась и временем введения пептида в конце эмбриогенеза и в раннем онтогенезе, когда у крыс интенсивно идет развитие и дифференцировка корковых нейронов. В период, когда созревание мозга еще не завершилось, препарат типа даларгина может служить триггером для активного включения компенсаторных возможностей организма.

Механизмы центрального действия нейропептидов, в частности даларгина, при периферическом введении изучены еще недостаточно. Учитывая быструю скорость распада пептидов в крови (период полужизни составляет около 2-х минут), а также высокую резистентность гематоэнцефалического барьера к энкефалинам, можно предполагать, что даларгин поступал только в прилежащие к "безбарьерным зонам" структуры мозга. Имеются основания думать, что действие энкефалинов, включая даларгин, осуществляется опосредованно через вовлечение нейромедиаторных систем и циклических нуклеотидов (Майзелис и др.. 1989). На это указывают полученные ранее данные об изменениях содержания АМФ и ГМФ в коре полушарий и гиппокампе под влиянием энкефалина (Майзелис, 1982).

Важной особенностью даларгина являются его антисудорожные свойства (Майзелис, 1989). Этот эффект препарата приобретает особую значимость, если учесть, что мы наблюдали у потомства алкоголизированных крыс эпизоды эпилептиформной активности в коре и гиппокампе во время сна. свидетельствующие о повышении судорожной готовности.

Резюмируя сказанное, можно заключить, что обнаруженные у потомства алкоголизированных крыс нарушение тканевого дыхания и структурные изменения в мозге указывают на наличие церебральной

гипоксии. Поэтому применение даларгина дало положительной эффект, т.к. этот препарат известен своим антигипоксическим и нейроростовым действием.

Таким образом, наши исследования доказывают принципиальную возможность этиологического подхода к лечению и профилактике алкогольного синдрома плода Положительные эффекты даларгина позволяют надеяться, что он найдет применение в клинической практике.

ВЫВОДЫ

1. В работе была использована адекватная модель фетального алкогольного синдрома, которая позволила выявить целый ряд нарушений, вызванных антенатальной алкогольной интоксикацией.

2. Антенатальная алкогольная интоксикация вызывает отставание физического развития, повышает смертность в раннем возрасте.

3. Антенатальная алкогольная интоксикация оказывает влияние на врожденные формы поведения - усиливает пассивно-оборонительные реакции и реакции страха, повышает склонность к развитию депрессивно-подобного состояния.

4. Антенатальная алкогольная интоксикация разрушительно действует на функции центральной и вегетативной нервной системы. У потомства крыс, потреблявших алкоголь во время беременности обнаружено:

- нарушение краткосрочной и долгосрочной памяти,

- нарушение механизмов саморегуляции вегетативных функций,

- нарушение структуры цикла бодрствование-сон.

5. В основе механизма патогенного действия алкоголя на нервную систему лежит нарушение тканевого дыхания. Развивающееся при этом гипоксическое состояние мозга приводит к необратимым изменениям на структурном и ультраструктурном уровне, а также/ функциональным нарушениям.

6. Антенатальная алкогольная интоксикация повышает чувствительность потомства к стрессовым факторам внешней среды

7. Введение даларгина в поздний пренатальный и ранний постнатальный периоды позволяет частично компенсировать нарушения вызванные антенатальной алкогольной интоксикацией. Терапевтический эффект даларгина сохраняется в течение всей жизни животного. У взрослых крыс, подвергавшихся действию алкоголя в течение эмбриогенеза и получавших даларгин, обнаружено (по сравнению с животными, не получавшими лечения):

- улучшение способности к выработке условных рефлексов,

- нормализация структуры цикла бодрствование-сон,

- повышение активности сукцинатдегидрогеназы в отделах

мозга.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОЛ.Футер (Левиной)

1. Коломейцева И.А., Левина ОЛ. Электрографическая картина сна у взрослых крыс при антенатальной алкогольной интоксикации. Актуальные'вопросы физиологии и патологии сна. М., 1985, стр. 3335.

2. Коломейцева И.А, Левина О.Л. Стрессоустойчивость взрослых крыс, перенесших антенатальную интоксикацию алкоголем. Алкоголизм и наследственность. М„ 1987, стр. 83-87.

3. Айрапетянц М.Г., Артюхина Н.И., Коломейцева И.А., Левина О.Л., Ноздрачева Л.В. Нарушения развития нервной системы при антенатальной алкогольной интоксикации и их фармакологическая коррекция. Развивающийся мозг. Вып. 16. М„ 1987, стр. 118-121.

4. Левина О.Л., Коломейцева И.А., Ноздрачева Л.В. Коррегирующий эффект синтетического гексапептида - даларгина при нарушениях, вызванных антенатальной алкогольной интоксикацией. Перспективы применения препаратов пептидной природы. М., 1987, стр. 28-31.

5. Коломейцева И.А., Левина О.Л., Кампов-Полевой А.б. Влияние алкогольной интоксикации в период внутриутробного развития на поведение взрослого потомства. Журн. высшей нервной деятельности 1988, 4, стр. 773-776.

6. Коломейцева И.А. Левина О.Л., Ноздрачева Л.В., Айрапетянц М.Г. Фармакологическая коррекция экспериментальной алкогольной эмбриопатии. 5юлл. экспериментальной биологии и медицины. 1988,

7, стр. 178-180.

7. Коломейцева И.А. Левина ОЛ. Влияние алкогольной интоксикации в период внутриутробного развития на функции центральной нервной системы потомства Акушерство и гинекология. 1988. 1, стр. 46-50.

8. Коломейцева И.А. Левина О.Л., Вармут Р., Айрапетянц М.Г,. Гехт К., Оеме П. Потомство при экспериментальном алкоголизме и субстанция Р. Intern. Symp. "Experimentelle und Klinische neurosen". Berlin, 1988.

9. Коломейцева И.А., Левина О.Л., Гехт К, Оеме П. Последствия антенатальной алкогольной интоксикации у взрослых крыс. Intern. Symp. "Experimentelle und Klinische neurosen". Berlin, 1988.

10. Коломейцева И.А., Левина О.Л. Влияние антенатальной алкогольной интоксикации на функции ЦНС потомства. В кн.: Последствия алкогольной интоксикации для потомства. М., Наука, 1989, стр. 5-23.

11. Ноздрачева Л.В.. Артюхина Н.И., Коломейцева И.А., Левина О.Л. Коррегирующее действие даларгина на ЦНС крыс при антенатальной алкогольной интоксикации. В кн.: Последствия алкогольной интоксикации для потомства. М., Наука, 1989, стр. 105-110.

12. Заявка на изобретение- Коломейцева И.А., Левина О.Л., Ноздрачева Л.В., Айрапетянц М.Г. Применение даларгина в качестве средства для лечения фетального алкогольного синдрома. Приоритетная справка #4.221430/14. М, 1987.