Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот у насекомых

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на метаболизм белков и нуклеиновых кислот у насекомых"

На правах рукописи

МИНЬКОВА Наталья Олеговна

ВЛИЯНИЕ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА И ЕГО СИНТЕТИЧЕСКОГО АНАЛОГА ДАЛАРГИНА НА МЕТАБОЛИЗМ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

У НАСЕКОМЫХ.

Специальность 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1999

Работа выполнена в Московском педагогическом государственном университете на кафедре органической и биологической химии.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Филиппович Ю.Б.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Лаптева Т.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Каменский А.А.

кандидат биологических наук Микодина Е.В.

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н. Баха

Защита состоится <»/2-1999 года в час ^^мин

на заседании Диссертационного Совета К 053.01.01 в Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129278, Москва, ул. Кибальчича, д.6, корп.5, ауд.506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МПГУ по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д.1

Автореферат разослан

г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ХОЛМОГОРОВА Н.В.

-ийская I

рственная I

лиЬтека

1999___I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. За последние 20 лет накоплен значительный объем данных о низкомолекулярных нейропептидах животных, в том числе и насекомых, выяснена первичная структура многих пептидов, а также молекул - предшественников, установлено место их синтеза, локализация в организме, выявлены физико-химические свойства и специфичность рецепторов, с которыми связываются эти пептиды и на какие клетки-мишени они воздействуют. Доказано, что низкомолекулярные регуляторные пептиды принимают участие в модуляции многих поведенческих и физиологических процессов. Однако в настоящее время практически полностью отсутствуют работы, посвященные изучению биохимических закономерностей воздействия этих пептидов на метаболизм клеток насекомых и, в частности, функциональной роли у них энкефалинов. Никем не ставилась задача установить конкретные биохимические реакции, являющиеся объектом регуляции у насекомых низкомолекулярными опиоидами.

Исходя из вышесказанного, изучение контроля регуляторными пептидами и их синтетическими аналогами некоторых сторон метаболизма у насекомых имеет не только большое теоретическое значение в плане сравнительной биохимии, но практически целесообразно для развития некоторых направлений прикладной энтомологии, в частности, поиска и использования экологически безопасных препаратов, в том числе нейропептидов, перспективных для применения в качестве регуляторов роста и численности насекомых. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе поставлен ряд задач, решение которых ведет к расшифровке некоторых механизмов регуляторного влияния энкефалинов и их аналогов на обмен веществ у насекомых. Намечено исследовать, во-первых, интенсивность включения 3Н-дезоксириботимидинмонофосфата в ДНК и изменение содержания ДНК под влиянием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина у восковой моли и мучного хрущака. Во-вторых, изучить воздействие лей-энкефалина и даларгина на содержание и интенсивность синтеза РНК с тем, чтобы на основании полученных данных оценить функциональную роль низкомолекулярных регуляторных пептидов в регуляции некоторых сторон обмена нуклеиновых кислот у различных насекомых. В-третьих, исследовать изменение активности ДНК-полимеразного комплекса ферментов при введении лей-энкефалина и даларгина в организм восковой моли с тем, чтобы высказать мнение о возможном механизме воздействия пептидных регуляторов на геном насекомых. В-четвертых, выяснить влияние лей-энкефалина и даларгина на содержание белков и интенсивность их синтеза у восковой моли, сопоставить степень воздействия эндогенного пептида и его синтетического аналога на процесс шелкообразования на заключительном этапе личиночного развития у этого насекомого. В-пятых, наконец, установить субклеточную локализацию 3Н-даларгина введенного личинкам восковой моли, что может служить основанием для рассмотрения вероятных путей действия низкомолекулярных регуляторных пептидов на метаболизм насекомых.

«

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

Впервые дана подробная характеристика влияния лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на некоторые стороны обмена белков и нуклеиновых кислот в организме животных. Проведено сравнительное исследование биогенных доз этих пептидов у высших и низших животных. Показано, что у насекомых оптимальные дозы действия лей-энкефапина и даларгина сопоставимы с таковыми у позвоночных. Установлено, что энкефапины оказывают мощное воздействие на геном насекомых, выражающееся в накоплении дополнительных количеств ДНК и существенном усилении их биосинтеза. Впервые показано, что 3Н-даларгин или его биологически активные фрагменты в значительном количестве накапливается в ядрах клеток, что не исключает его прямого влияния на функционирование генома. Полученные данные позволяют предположить, что синтетический аналог лей-энкефалина даларгин, по-видимому, обладает мутагенным действием, что открывает возможность его применения в качестве регулятора роста и численности насекомых. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты диссертационной работы докладывались на II Биохимическом съезде РАН (Мрсква,1997), на XI съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 1997) и ежегодно - на заседаниях семинара "Биохимия насекомых" кафедры органической и биологической химии МЛГУ им. В.И. Ленина (1993-1998г.) ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертационной работы опубликовано 3 статьи и 3 тезисов сообщений на биохимических и энтомологических конгрессах и съездах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о низкомолекулярных регуляторных пептидах у животных различных таксономических групп, в том числе и насекомых, описания материалов и методов исследования, трех глав, содержащих результаты собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 28 таблиц, 23 рисунка и список литературы, включающий 221 ссылку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для исследования служили имаго большого мучного хрущака Tenebrio molitor L. и личинки VII возраста восковой моли Gallería mellonella L.

Для работы использовали коммерческие препараты лей-энкефалина (НПО "Вектор") и его синтетического аналога даларгина- D-ала2-арг®-лей-энкефалина (Всесоюзный инженерный центр пептидных препаратов "Пептос"). Растворы пептидов готовили на основе физиологического раствора для насекомых с конечной концентрацией от Ю-15 до 10"® моль в 1 мкл. Инъекции пептидов и меченых препаратов проводили с помощью микрошприца ("Hamilton", Swetzerland).

Препараты меченых нуклеиновых кислот получали путем инъекции 3Н-дТТФ или Н-УТФ в гемолимфу насекомых.

Препараты меченых белков получали после введения в гемолимфу восковой моли 3Н-лейцина.

Содержание нуклеиновых кислот определяли по 1Увтоду Шмидта -Таннгаузера в модификации для насекомых (Филиппович и др., 1982).

Интенсивность биосинтеза нуклеиновых кислгг у подопытных и контрольных особей определяли по вклочению меченых предшественников 3Н-ТТФ и 3Н-УТФ (ВО "ИзотоГ). Радиоактивность образцов измеряли в гомогенной системе на жидкостном сцинтилляционном спектрометре "Ракбета" фирмы "LKB" (Швеция) (Микодина, Лаптева, 1990).

ДНК-полимеразную активность под влиянием пептидов у личинок восковой моли определяли по включению меченого дезоксириботимидинтрифосфата (3Н-ТТФ) в ДНК (Михайлов, 1987).

Интенсивность синтеза белков у контрольных и подопытных особей определяли по включению эН-лейцина в растворимую и нерастворимую фракции и коконы (Лаптева, 1981).

Локализацию энкефапинов в клетках насекомых исследовали с помощью [3-3Н]-далзргина, синтезированного методом твердофазного каталитического синтеза в институте молекулярной генетики РАН (Zolotarev et al.,1S95). Субклеточное фракционирование осуществляли методом дифференциального центрифугирования в модификации для насекомых (Куранова и др., 1985). Чистоту полученных фракций контролировали методом световой микроскопии и измерением активности маркерных ферментов.

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976) и по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

РЕГУЛЯЦИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНОМ И ДАЛАРГИНОМ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ У НАСЕКОМЫХ.

Из анализа данных, приведенных в таблице 1, следует, что инъекции лей-энкефалина и даларгина в организм восковой моли в количестве от 10"® до 10'11 моль на особь приводят к дозозависимому увеличению содержания ДНК и РНК. Максимальное увеличение содержания ДНК (на 86-90% под действием лей-энкефалина и на 35% и 22% под влиянием даларгина) выявлено при введении Ю^-Ю^моль пегттида на особь. Инъекция 10"13 моль лей-энкефалина приводит к эффекту противоположного знака, вызывая уменьшение содержания ДНК в опыте по сравнению с контролем. Лей-энкефалин индуцирует увеличение содержания РНК во всем диапазоне инъецируемых доз с максимальными ответами (на 57% и 46%) через 24 часа после введения 10"8 и 10 10 моль пептида.

Даларгин индуцирует изменение содержания нуклеиновых кислот и у мучного хрущака (табл.2). Увеличение содержания ДНК под влияние даларгина по сравнению с контролем составляет 60-31% после введения 10^-10"'3 моль даларгина на особь. Отличие долговременного воздействия даларгина (3-е суток) состоит в том, что наиболее эффективной является доза 10"13 моль пептида на особь, под влиянием которой содержание ДНК у имаго мучного хрущака увеличивается на 90%. Сходная закономерность отмечена при исследовании сверхмалых

доз других биологически активных веществ: по мере увеличения времени максимальный эффект смещается в сторону меньших концентраций (Сазанов, Зайцев, 1992).

Менее ярко выражен эффект влияния даларгина на изменения содержания РНК у обоих исследованных видов насекомых: наибольшее увеличение содержания РНК в опыте по сравнению с контролем

составляет не более 25% при введении различных доз препарата (табл.1, 2>-

Таблица 1

СОДЕРЖАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ У ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ

Количество пептида (моль) Содержание ДНК (мкг/особь) Изменение содержания ДНК в опыте по сравнению с контролем (%) Содержание РНК (мкг/особь) Изменение содержания РНК в опыте по сравнению с контролем (%)

под влиянием лей-энкефалина '

контроль 26,35 ±1,70 0 495,56 + 43,51 0

10"8 49,00 ±2,23 85,9 777,10 ±27,04 56,8

10" 50,05 ±1,89 89,7 649,44 ±29,12 31,1

10ив 41,95x2,54 53,4 724,40 ±24,86 45,6

ю-11 31,99 ±1,65 21,3 654,36 ± 12,47 32,0

ю-12 27,27 ±2,03 3,5 526,30 ±13,98 6,5

ю-" 20,60 ±1,25 -21,8 511,81 ±13,42 3,2

под влиянием даларгина

контроль 26,74 ±1,55 0 598,65 ±49,48 0

10"3 35,51 ±2,09 34,9 750,71 ±46,97 25,4

10"9 31,98 ±2,98 21,7 704,61 ± 32,76 17,7

Ю"10 29,63 ±1,63 11,8 695,63 ±29,17 16,2

ю-11 28,63 ±1,84 7,1 693,24 ±17,86 15,8

10"" 25,73 ± 2,98 -3,7 401,40 ±12,68 -32,9

10"13 21,26 ±1,71 -20,5 584,16 ±17,50 -2,4

Таблица 2

СОДЕРЖАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ У ИМАГО МУЧНОГО ХРУЩАКА ЧЕРЕЗ 3 ЧАСА И ТРОЕ СУТОК ПОСЛЕ ИНЪЕКЦИИ ДАЛАРГИНА.

Количество вводимого пептида (моль) Время Содержание ДНК (мкг/особь) Изменение содержания ДНК (в % к контролю) Содержание РНК (мкг/особь) Изменение содержания РНК (в % к контролю)

контроль 3 часа 5,97± 0,22 0 151,9±6,83 0

10"" 7,84 ±0,39 31,3

10* 9,54 ± 0,44 59,8 147,6±7,39 -2,8

ю" 8,93 ±0,41 49,6

10"" 8,07 + 0,40 35,2 187,4±9,37 23,5

контроль 3 суток 6,61 ±0,33 0 297,2±12,8 0

10* 7,72 ±0,37 16,8 282,0±2,93 -5,1

10"13 12,64±0,63 90,8 286,9±12,3 -3,5

Сопоставление биохимического эффекта эндогенного пептида и его синтетического аналога показывает, что направление воздействия обоих пептидов одинаково, но количественно более выражено у лей-энкефалина, чем у даларгина. По-видимому, в данном случае вводимый нами лей-энкефалин действует в совокупности с эндогенным энкефалиноподобным пептидом, существование которого доказано для некоторых насекомых.

Для более точной оценки влияния лей-энкефалина и даларгина на ДНК насекомых мы использовали методический прием, заключающийся во введении меченого предшественника в гемолимфу насекомого и последующего обнаружения его в составе нуклеиновых кислот.

Исследования показали, что введение лей-энкефалина и даларгина личинкам восковой моли вызывает дозозависимое увеличение общей радиоактивности ДНК (рис.1), причем эта зависимость носит сложный полимодальный характер колоколообразного типа с максимальным ответом в диапазоне доз 10"'° - 10"14 моль при введении лей-энкефалина и 10"8 - 10"11 моль при инъекции даларгина, что выражается приростом радиоактивности в опыте по сравнению с контролем на 124-136% и на 42-68% соответственно. Следовательно, эффект воздействия лей-энкефалина на интенсивность синтеза ДНК у восковой моли значительно больше, чем даларгина.

Сходная, но не идентичная картина наблюдалась при исследовании влияния даларгина на интенсивность синтеза ДНК у имаго мучного хрущака; и в этом случае эффект воздействия даларгина зависит от дозы вводимого пэгттида (рис.1).

- изменение радиоактивности ДНК у восковой моли под влиянием лей-энкефалина 'изменение радиоактивности ДНК у восковой моли под влиянием даларгина "изменение радиоактивности ДНК у мучного хрущака под влиянием даларгина

Максимальный ответ на введение даларгина выражается в приросте радиоактивности ДНК на 162% в опыте по сравнению с контролем при инъекции 10"9 моль пептида на особь, что существенно превосходит таковой показатель у восковой моли. По-видимому, это связано с различной интенсивность метаболизма, определяемой фазой развития и видоспецифичностью насекомого.

Аналогичная дозовая зависимость является установленным фактом практически для всех регуляторных пептидов. Сложный характер дозовой зависимости можно объяснить существованием субпопуляций рецепторов, которые имеют различную аффинность к действующему веществу и дают различные суммарные эффекты (Сазанов, Зайцев, 1992, Brown, van Epps, 1985, Robertson, Grutsch, 1987).

Различия в динамике накопления дополнительных количеств ДНК и интенсивностью включения меченого предшественника, возможно, связаны с наличием в клеточных ядрах животных, и насекомых в том числе, свободных молекул ДНК, которые так же, как и хромосомные ДНК содержат уникальные и повторяющиеся последовательности и отличаются только скоростью включения 3Н-тимидина, что, вероятно, свидетельствует о разных путях их синтеза (Сухова и др., 1996, Видута, 1975). Показано, что специфическая фракция относительно быстро обменивающихся ДНК представлена экстракопиями наиболее активных генов (Ашмарин, Каразеева, 1996).

Учитывая тот факт, что под влиянием пептидов у восковой моли и мучного хрущака происходит мощное усиление биосинтеза ДНК, мы исследовали воздействие лей-энкефалина и даларгина на суммарную ДНК-полимеразную активность и установили, что под действием пептидов общая ДНК-полимеразная активность изменяется: под влиянием лзй-энкефалина активность ферментов увеличивается на 21 %, а под влиянием даларгина - на 30%.

Следовательно, под влиянием лей-знкефапина и даларгина происходит некоторое увеличение активности ДНК- синтезирующих ферментов, которое до определенной степени можно считать коррелирующим с увеличением интенсивности включения меченого предшественника в ДНК. Полученные данные дают основание полагать, что в регуляции обмена ДНК у насекомых исследуемыми пептидами задействованы разнообразные, в том числе и ферментативные механизмы.

При исследовании влияния лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на интенсивность синтеза РНК у исследуемых насекомых наблюдалось изменение включения меченого предшественника в РНК (рис.2).

При исследовании влияния лей-энкефалина на биосинтез РНК у восковой моли была получена полимодальная зависимость радиоактивности РНК от количества вводимого пептида с тремя четко выраженными максимумами в области 10"8, 10"1г и 10"15 моль, причем величина эффекта не превышает 98%.

Под влиянием даларгина наибольшее увеличение радиоактивности РНК у восковой моли на 111% наблюдалось при инъекции 10"1J моль пептида. Второй максимальный ответ обнаружен при введении 10"® моль даларгина, но количественно значительно ниже первого, радиоактивность РНК увеличивалась на 50% по сравнению с контролем. У мучного хрущака общая радиоактивность РНК возрастала на 78% при введении 10 моль и на 61% при инъекции 10"13 моль даларгина на особь.

Рис. 2. Изменение радиоактивности РНК у насекомых под влиянием пептидов.

-радиоактивность РНК у восковой моли под влиянием лей-энкефалина 'радиоактивность РНК у восковой моли под влиянием даларгина •радиоактивность РНК у мучного хрущака под влиянием даларгина |

Сравнение влияния лей-энкефалина и его аналога даларгина на интенсивность синтеза РНК у восковой моли показывает, что характер действия пептидов одинаков, но количественные характеристики эффектов в данном случае несколько выше у даларгина.

Следует отметить, что не наблюдается четкой корреляции между изменением содержания РНК (табл. 1) и уровнем включения меченого предшественника в РНК под влиянием исследуемых пептидов у восковой моли. После инъекции 10"9 и 10'12 моль лей-энкефалина содержание РНК изменяется незначительно, но в этих точках наблюдается значительное увеличение радиоактивности РНК. Аналогично, при инъекции 10"12-10"13 моль даларгина содержание РНК не увеличивается, тогда, как уровень радиоактивности резко поднимается вверх. Эти данные становятся понятными, если учесть, что у коконопрядущих насекомых перед зазивкой кокона обнаружена метаболически активная РНК, наиболее легко включающая меченые предшественники, стабильная, устойчивая к действию РНК-азы. Именно эта быстрометящаяся РНК по динамике накопления коррелирует с темпом биосинтеза фиброина и серицина и, по-видимому, представляет собой крупные молекулы предшественников рРНК (Смирнов и др., 1964,1_и е! а1., 1966) и, возможно, мРНК.

РЕГУЛЯЦИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНОМ ИДАЛАРГИНОМ ОБМЕНА БЕЛКОВ У НАСЕКОМЫХ.

В таблице 3 представлены данные, характеризующие изменение содержания растворимых белков через двое и трое суток после инъекции лей-энкефалина и даларгина. Из анализа этих данных следует, что во всем диапазоне инъецируемых доз и лей-энкефапин, и даларгин индуцируют изменения содержания белка как на стадии перед завивкой кокона (через 2 суток после инъекции), так и в первый день завивки кокона (через 3 суток после инъекции). Также, как и в случае с нуклеиновыми кислотами зависимость доза - эффект носит сложный полимодальный характер с четко выраженными двумя максимумами. При введении 10'9 и 10' 2-10 моля лей-энкефалина на стадии перед завивкой кокона максимальное увеличение содержания белка составляет 44% и

27% по сравнению с контролем соответственно, а при инъекции даларгина - 43% и 29% соответственно. В первый день завивки кокона эти же количества лей-энкефалина максимально увеличивают содержание белка на 60% и 53%, а даларгина на 68% и 42%. Малые дозы используемых пептидов не вызывают изменения содержания белка или вызывают эффект с обратным знаком.

Таблица 3

СОДЕРЖАНИЕ РАСТВОРИМОГО БЕЛКА У ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ _ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА И ДАЛАРГИНА._

Количество ВВОДИМОГО пептида, (моль) Перед завивкой кокона (через 2 суток после инъекции) 1-ый день завивки кокона (через 3 суток после инъекции) Прирост содержания в 3-ий день по сравнению со 2-ым днем (%)

Содержание белка (мг/особь) Изменение содержания (%к контролю) Содержание Белка (мг/особь) Изменение содержания (%к контролю)

под влиянием лей-энкефалина

контроль 8,36 0 15,12 0 81

10"8 12,02 44 18,85 25 57

10"ы 12,25 45 24,17 60 97

10"1и 9,51 14 18,19 26 91

10-" 10,94 31 20,41 35 87

ю-12 10,01 20 23,15 53 131

ю-13 10,63 27 16,72 11 57

ю-14 9,87 18 11,82 -20 20

под влиянием даларгина

контроль 9,46 0 15,12 0 60

10"* 10,70 13 18,91 25 77

10"* 13,52 43 25,34 68 87

10"1и 10,91 15 19,77 31 81

10-" 12,84 36 19,26 27 50

ю-" 9,25 -2 20,02 32 116

ю-13 12,20 29 21,45 42 76

ю-" 8,26 -13 15,79 4 91

ю-1* 6,53 -31 16,13 7 147

Таким образом, лей-энкефалин и даларгин индуцируют сходные изменения содержания белка, как по количественному выражению эффекта, так и по набору доз, вызывающих этот эффект.

При сопоставлении прироста содержания растворимого белка перед завивкой кокона по сравнению с первым днем завивки в опыте и контроле наблюдаются существенные различия. Наибольшее накопление растворимых белков при переходе к завивке кокона происходит именно при введении тех доз пептидов, которые в большей мере увеличивают содержание белка. Накопление растворимых белков в первый день завивки кокона связано, прежде всего, с лизисом тканевых белков. Если учесть, что согласно литературным данным (Филиппович, 1953, Амбарцумова, 1968, Рикис!а е1 а!., 1959, 5Ыдета1зи, ТакеэМа, 1968, Лаптева, 1981) часть белков шелка формируется за счет тканей, то

можно предположить, что увеличение содержания растворимых белков в первый день завивки кокона в опыте (при введении 10"9, 10'12 и 10"13 моль пептидов на особь) по сравнению с контролем свидетельствует о большей степени участия тканей в процессе шелкообразования под влиянием пептидов.

Через двое суток после инъекции лей-энкефалина в гемолимфу восковой моли на стадии перед завивкой кокона не установлено увеличение удельной радиоактивности растворимых белков в опыте по сравнению с контролем (табл. 4). Совсем иная картина наблюдалась через 3 суток после инъекции лей-энкефалина, когда личинки уже формировали кокон (табл.4). Через 3 суток после инъекции лей-энкефалина происходит увеличение общей радиоактивности растворимых белков, причем дозозависимость также носит полимодальный характер с максимальными эффектами (на 69% и 68%) в тех же дозах (10"9 и 10"12 моль пептида на особь), что и при влиянии на содержание белка.

Таблица 4

РАДИОАКТИВНОСТЬ РАСТВОРИМОГО БЕЛКА У ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА.

Количество вводимого пептида (моль) Перед завиыой кокона (через 2 суток после инъешии) 1-ый день завивки кокона (через 3 суток после инъекции)

Удельная радиоактивность, (расп/мин/мг) Общая радиоактивность (расп/мин/особь) Удельная радиоактивность, (расг^мин/мг) Общая радиоактивность (расл/мин/оссбь) Изменение овщей радиоактивности (%)

контроль 12685 106047+3075 4222 63838±1385 0

10"3 10577 129320±3297 4888 88711+2616 39

10"а 5440 65398±1691 4458 107740±3517 69

10'1и 10353 98465±2358 5039 95689±2468 50

10й1 7535 82524±2294 4817 98311±2447 54

10'" 8520 85281+2581 4645 107523+2978 68

10"13 7670 81530+2019 5525 92386±2315 45

ю-14 8852 87389+2184 5900 69738±1799 9

Исследование влияния синтетического аналога даларгина на биосинтез белков у личинок восковой моли дает возможность сопоставить характер влияния этих пептидов. Даларгин индуцирует аналогичные изменения в содержании белков, интенсивности их синтеза и влияет на радиоактивность белков кокона. Даларгин через 2 суток после инъекции вызывает увеличение общей и удельной радиоактивности растворимых белков (табл. 5). Значительное повышение уровня включения меченого предшественника в белки происходило после введения 10"9 - Ю"10 моль и составляло 65-69%, а также после введения низких доз 10"13 и 10 м моль и составляло 89 и 75% соответственно. Удельная радиоактивность показывает, что концентрациями, при которых существенно увеличивается интенсивность синтеза белков, являются 10"'э и 10"'4 моль (изменение удельной радиоактивности составляет 165 и 100% по сравнению с контролем), и

10"9 моль (удельная радиоактивность повышается на 43%). Так как не наблюдается увеличение содержания белка под действием этих концентраций, но идет интенсивный синтез белков, можно предположить, что синтезируемые белки экскретируются для завивки кокона.

При исследовании влияния даларгина на общую и удельную радиоактивность через 3 суток после инъекции нами получена четкая полимодальная зависимость с 3 максимальными ответами в области 10"®, 10'" и 10"'4 моль, выражающимися в приросте радиоактивности по сравнению с контролем на 208, 111 и 276% соответственно.

Таблица 5

РАДИОАКТИВНОСТЬ РАСТВОРИМОГО БЕЛКА У ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ _ МОЛИ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ДАЛАРГИНА._

Количество вводимого пептида (моль) Перед завивкой кокона (через 2 суток после инъекции) 1-ый день завивки кокона (через 3 суток после инъекции)

Удельная радиоактивность (расл/мин/мг) Общая радиоактивность (расп/минЛяобь) Изменение общей радиоактивности (%) Удельная радиоактивность (расп/мин/ мг) Общая радиоактивность (расл/мин/особь) Измен« ниеоби радиоа тизнос (%)

контроль 9490 89779+2163 0 4222 63838+1385 0

10"8 12103 129498+3800 44 10381 196313±4639 208

10"" 13577 148128+3095 65 4919 124645+2962 95

ю-10 11239 151947±3585 69 5600 110718±2328 73

10"и 10634 136536+3008 52 6988 134689±2826 111

10"" 10097 93394±2101 4 5174 103579±2532 62

10"13 25199 170098±3311 89 6996 150055±3901 135

Ю-14 189947 156915+2217 75 15183 239740±5753 276

ю-1ь 13142 85820±2465 -4 5724 92355+2332 45

Сведение баланса учтенной радиоактивности (табл. 6) показывает, что лей-энкефалин только в количествах 10"9 и 10" моль увеличивает радиоактивность коконов на 47% и 56% соответственно, тогда как даларгин увеличивает радиоактивность коконов на 125-267% в опыте по сравнению с контролем при введении Ю'$ и 10"11-10"'3 моль пептида на особь. При этом суммарная радиоактивность растворимых и нерастворимых белков увеличивается максимально на 71% в случае лей-энкефалина и на 209% в случае даларгина. Приведенные данные совершенно определенно свидетельствуют о более мощном влиянии даларгина на обмен белков, чем лей-энкефалина. Кроме того, следует отметить, что некоторые дозы пептидов (10"®, 10'1,-10"14 моль лей-энкефалина на особь и 10"8, 10"14-10'15 моль даларгина на особь) вызывая значительное увеличение радиоактивности белков тела, уменьшают радиоактивность белков коконов в опыте по сравнению с контролем. Это может быть связано с тем, что именно эти количества пептидов способствуют сохранению в организме восковой моли протеинов, необходимых для формирования тканей куколки, имаго и яиц.

Таблица 6

РАДИОАКТИВНОСТЬ БЕЛКОВ ТЕЛА ВОСКОВОЙ МОЛИ И КОКОНОВ ЧЕРЕЗ 3 СУТОК ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА И ДАЛАРГИНА

(расп/мин на особь).

Количество пептида Суммарная радиоактивность Изменение в % к контролю Радиоактивность коконов Изменение в % к контролю

под влиянием лей-энкефалина

контроль 116217 0 446584±10614 0

ю* 179495 54,4 401750±10338 -10

10"» 198902 71,1 657735±15720 47,2

10"1и 190797 64,2 29276046762 -34,4

10'" 186831 60,8 204680+5076 -54,2

10"" 183299 57,7 226314+5771 -49,3

ю-13 175424 50,9 226935±5318 -49,1

10"" 137566 18,4 698110+16824 56,3

под влиянием даларгина

контроль 116217 0 446584±10614 0

10« 317376 173,1 1007395+24446 125,6

10"а 216422 86,2 316120+6375 -29,2

10"'° 209423 80,2 337528±8255 -24,4

10"" 213329 83,6 1640729+36260 267,4

10-™ 192856 65,9 1221095±30244 173,4

ю-13 276113 137,5 1346363±27959 201,5

10"'4 359701 209,5 374773+9294 -16,1

10'15 233399 100,8 338759+8299 -24,1

Согласно современным воззрениям, такие трудно интерпретируемые долговременные эффекты, как в нашем случае изменение радиоактивности ДНК через сутки, изменение интенсивности синтеза РНК и белков через двое и трое суток после введения пептидов, можно объяснить, лишь принимая во внимание возможность проникновения пептида в клетку и его взаимодействие с внутриклеточными рецепторами (Якубке, Ешкойт, 1985).

СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ 3Н-ДАЛАРГИНА В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ.

Исследование субклеточной локализации инъецируемых пептидов дает возможность подойти к выяснению их функциональной роли и в некоторой степени механизма их действия.

Используемая нами методика фракционирования позволила нам достичь разделения субклеточных структур, а также освободиться от основной массы пигментов, которые загрязняют субклеточные фракции. В результате нам удалось выделить чистые интакгные ядра, практически свободные от обломков клеточной оболочки, и достаточно чистые митохондриапьную и лизосомальную фракции.

При подкожном введении 3Н-дапаргина личинкам восковой моли уже через 1 час значительное его количество (31% от введенного количества) обнаружено в постлизосомальной фракции. Это свидетельствует о том, что опиоидные пептиды способны проникать через клеточные мембраны в клетки. Через 12 часов после введения количество меченого дапаргина в цитозоле уменьшается в 1,7 раз, а через 2 суток - в 3,2 раза. Это обусловлено несколькими процессами: часть меченого даларгина связывается с мембранами субклеточных структур (или проникает в них), а часть деградирует либо в лизосомах, либо в цитозоле, о чем свидетельствует уменьшение суммарной радиоактивности, учтенной во всех фракциях.

Сходная картина наблюдалась в лизосомальной и в митохондриальной фракции, где максимальный уровень радиоактивности был обнаружен через 1 час после введения пептида, а затем его количество заметно снижалось. Динамика проникновения 3Н-дапаргина в ядерную фракцию носила иной характер. В течение суток радиоактивность ядерной фракции увеличивалась в 1,4 раза, достигла максимума через сутки после введения пептида, а затем уменьшалась.

Расчет радиоактивности, учтенной в каждой фракции в процентах от суммарной (относительное содержание метки), показывает динамику проникновения 3Н-даларгина в субклеточные фракции (табл. 7).

Таблица 7

ИЗМЕНЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ 3Н-ДАЛАРГИНА В СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЯХ ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ В ТЕЧЕНИЕ ОПЫТА (относительная радиоактивность).

Время, ч Относительная радиоактивность фракций (%)

ядерная митохондриальная лизосомальная постлизосомальная

1 3,16 1,58 2,85 92,41

12 5,69 1,66 3,46 89,19

24 7,82 1,88 3,42 86,88

48 8,62 2,21 2,74 86,43

Прежде всего, следует отметить, что подавляющее количество метки находится в постлизосомальной фракции (цитозоль и микросомы) и ее относительной количество не изменяется в течение 48 часов, что свидетельствует о том, что исчерпания метки не происходит. Относительное содержание метки в митохондриальной и лизосомальной фракциях несколько увеличивается; это видимо, связано с тем, что 3Н-даларгин разрушается в цитозоле значительно быстрее, чем в митохондриях и лизосомах. Относительное содержание метки в ядерной фракции через 48 часов после введения увеличивается примерно в 3 раза. Динамика относительной радиоактивности ядер резко отличается

от таковой всех исследуемых фракций и свидетельствует о том, что даларгин не только проникает, но избирательно накапливается в ядрах.

Полученные данные подтверждают наши предположения о прямом или косвенном действии энкефалинов на геном на уровне ядра. Оказывая столь глубокое воздействие на метаболизм нуклеиновых кислот энкефалины, их синтетические аналоги и другие опиоидные пептиды в клетках, вероятно, действуют не только по классической схеме: связываются с рецепторами в клеточной оболочке, активируя протеинкиназы, в результате чего происходит фосфорилирование ряда белков, которые могут быть регуляторами репликации, транскрипции и трансляции. Следует учитывать и другой возможный механизм действия. Проникая в цитоплазму: энкефалины связываются с рецепторами, находящимися в ядерной оболочке, и перемещаются в ядро, где специфически связываются с хроматином и, в конечном счете, изменяют процессы репликации и транскрипции тех или иных генов. Главную роль в этом процессе играет открытое недавно явление интернализации рецептор - лигандных комплексов. Для преодоления мембраны гидрофильные молекулы регуляторных пептидов, связавшись с рецепторами, группируются. Вокруг возникшего комплекса формируется сетчатая оболочка с помощью белка - клатрина, и пептид-рецепторный комплекс проникает через мембрану посредством механизма близкого к пинсцитозу. Ранее интернализация рецептор-лигандных комплексов рассматривалась как одна из возможностей прекращения функций регуляторных пептидов. Однако сейчас есть все основания полагать, что в этом состоит один из путей передачи сигнала нейропептидов в геном клеток - мишеней (Ашмарин, Каразеева, 1996). Пока трудно отдать предпочтение какому-либо из описанных выше механизмов, но можно констатировать, что включение или повышение активности определенных генов под действием нейропептидов представляет собой либо обязательный, либо широко распространенный процесс, так как углубленное изучение эффектов регуляторных пептидов всегда приводило к выявлению действия на активность генома.

Биологические наблюдения за развитием восковой моли после инъекции личинкам VII возраста даларгина.

Биологические опыты не входили в задачу нашего исследования, но в ходе работы с восковой молью мы заметили ряд интересных особенностей, которые по-нашему мнению, являются фенотипическими проявлениями мощного воздействия определенных доз далартна на геном клеток этого насекомого.

Нами замечено, что в 28% случаев из личинок, которым инъецировали Ю-9 моль даларгина на особь, появляются бабочки с редуцированными крыльями, которые погибали вскоре после вылупления и не откладывали яиц. Остальные бабочки (72%), развившиеся из инъецированных даларгином личинок и не имеющие визуальных морфологических изменений откладывали ограниченное количество яиц (не более 25 в одной кладке, хотя в норме самка откладывает от 30 до 150 яиц в одной кладке (Загуляев, 1965)). В ходе развития личинок

второго поколения явных отклонений от нормы заметить не удалось. К концу VII возраста вес подопытных личинок II поколения был в среднем на 25% выше по сравнению с контрольными особями.

Приведенные выше наблюдения носят предварительный характер, они, безусловно, нуждаются в уточнениях и дополнениях на большем объеме биологического материала, но, несмотря на это, позволяют сделать вывод, что даларгин, введенный в количестве 10"9 моль на особь личинкам VII возраста восковой моли, индуцирует морфологические изменения имаго, снижает их плодовитость, изменяет развитие особей второго поколения, что косвенно подтверждает его воздействие на ядерный аппарат клеток. По-видимому, целесообразно в дальнейшем изучить действие этого пептида и перспективы его применения в качестве регулятора роста и численности насекомых.

ВЫВОДЫ:

1. Лей-энкефалин и даларгин вызывают дозозависимое изменение содержания нуклеиновых кислот у двух исследованных видов насекомых (СаПепа теНопеНа I.. и ТепеЬпо тоМог I..). Оба пептида проявляют наибольшую активность при введении 10"8 -Ю'10 моля на особь и в большей мере изменяют содержание ДНК, чем РНК, причем максимальный эффект лей-энкефалина выше, чем дапаргина.

2. Лей-энкефалин и даларгин вызывают дозозависимое изменение интенсивности синтеза ДНК у обоих исследованных видов насекомых. Для всех исследуемых доз влияние лей-энкефалина на изменение радиоактивности ДНК выражено сильнее, чем даларгина. Количественное выражение влияния пептидов зависит от вида насекомого и интенсивности метаболизма у него.

3. Под влиянием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина у личинок восковой моли происходит увеличение активности ДНК-синтезирующих ферментов

4. Дозозависимое влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на биосинтез РНК у личинок восковой моли и мучного хрущака выражается в накоплении дополнительных количеств РНК и усилении биосинтеза РНК. На стадии перед завивкой кокона у восковой моли лей-энкефалин и даларгин в количестве Ю-9 и 10'13 моль на особь значительно усиливают включение 3Н-уридин-монофосфата в одну из фракций РНК, по-видимому, метаболически активную, быстрометящуюся РНК. Полученные нами, а также имеющиеся литературные данные, позволяют предположить, что лей-энкефалин и даларгин контролируют экспрессию генов на уровне транскрипции.

5. Лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин индуцируют сходные изменения содержания белков у личинок восковой моли на заключительном этапе личиночного развития, как по количественному выражению эффекта, так и по набору доз, вызывающих этот эффект.

6. Лей-энкефалин и даларгин в зависимости от дозы и стадии развития насекомого модулируют биосинтез белков у личинок восковой

моли перед завивкой и в период завивки кокона, регулируя процессы шелкообразования.

7. Доказано проникновение значительного количества 3Н-даларгина в ядра клеток личинок Gallería meí'onella, что, вероятно, свидетельствует о возможности прямого воздействия опиоидных пептидов на геном насекомых.

8. Определенные количества дапаргича модулируют развитие восковой моли, что позволяет обсуждать перспективы его применения в качестве регулятора роста и численности насзкомых.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Лаптева Т.И., Минькова Н.О., Филиппович Ю.Б. Влияние синтетического аналога лей-энкефашна на интенсивность синтеза ДНК у насекомых. И Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1997. №4. С.417-419.

2. Минькова Н.О., Филиппович Ю.Б., Лаптева Т.Н. Лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин модулируют биосинтез нуклеиновых кислот у восковой моли Gallería Tiellonella.// Тезисы II Биохимического съезда РАН, Пущино, 1997. Т.1. С.215-216.

3. Минькова НО., Филиппович Ю.Б. Сравнение воздействия лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на биосинтез ДНК у Gallería mellonella.// Научные труды МПГУ. Серия "Естественные науки". 1998. С.240-241.

4. Минькова Н.О., Лаптева Т.И., Фипиппович Ю.Б. Влияние лей-энкефалина на биосинтез нуклеиновых кислот у восковой моли Gallería mellonella.// Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т.35. №1. С.109-111.

5. Минькова Н.О., Лаптева Т.И., Филиппович Ю.Б. Лей-энкефалин и его синтетический аналог даларгин (0-ала2-аргв-лей-знкефалин) индуцируют увеличение содержания и интенсивность синтеза нуклеиновых кислот у насекомых./ГПроблемы энтомологии в России". Сборник научных трудов. Санкт-Петербург. 1998. Т.2. С.30-31.

6. Minkova NO., LaptevaT.I., Filippovich Yu.B. Leu-enkephalín and synthetic analog dalargín (D-a!aJ-args-leu-enkephalin) as regulators of synthesis of nucleic acids in the insect.// Abstract of the VIth European Congress of Entomology. Ceske Budejovice. 1998. P.106.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минькова, Наталья Олеговна, Москва



- О

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО

знамени педагогический государственный университет

ВЛИЯНИЕ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИНА И ЕГО СИНТЕТИЧЕСКОГО АНАЛОГА ДАЛАРГИНА НА МЕТАБОЛИЗМ БЕЛКОВ И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

У НАСЕКОМЫХ

Специальность 03.00.04.- биологическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители доктор биологических наук, профессор

ФилипповичЮ.Б.

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Лаптева Т.И.

На правах рукописи

МИНЬКОВА Наталья Олеговна

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение..................................................4

Глава I. Низкомолекулярные регуляторные пептиды у животных

различных филогенетических групп (обзор литературы). .... 7

1.1. Филогенез регуляторных пептидов......................... . 7

1.2. Регуляторные пептиды животных и некоторых других таксономических групп. . ................................. . 9

1.3. Регуляторные пептиды насекомых...........................14

1.3.1. Миотропные пептиды насекомых........................15

1.3.2. Семейство РРМР- амидов.............................22

1.3.3. Кардиоактивные пептиды..............................24

1.3.4. АКН/РРСН семейство.................................24

1.3.5. Меланоцитостимулирующие гормоны у насекомых.........26

1.3.6. Опиоидные пептиды насекомых.........................27

1.3.7. Диуретические пептиды............................. . . .29

1.3 8. Аллатотропины и аллатостатины........................30

1.3.9. Феромонтропные пептиды..............................32

1.4. Энкефалины и их синтетические аналоги - как регуляторы

роста и возможные фармакологические агенты................34

1.4.1. Открытие, структура и функциональная роль

опиоидных пептидов..................................34

1.4.2. Тканевая локализация и содержание энкефалинов..........36

1.4.3. Распад и биосинтез энкефалинов.........................37

1.4.4. Рецепторы энкефалинов................................39

1.4.5. Синтетические аналоги энкефалинов.......................41

I 4.6. Физиологический эффект даларгина......................44

1.4.7. Фармакологическая активность даларгина.................45

Глава II. Материалы и методы. ................................50

11.1. Биологический материал..................................50

11.2. Введение радиоактивных предшественников и пептидов

в гемолимфу насекомых...................................51

И З. Получение препаратов меченых нуклеиновых кислот...........51

11.4. Определение содержания нуклеиновых кислот по методу

Шмидта - Таннгаузера.....................................52

11.5. Получение препаратов меченых белков и определение содержания белка........................................53

11.6. Определение ДНК-полимеразной активности.................54

11.6.1. Приготовление активированной ДНК...................54

11.6.2. Получение экстрактов, содержащих ДНК-полимеразу......54

11.6.3. Определение общей ДНК-полимеразной активности. ...... 55

II.7 Выделение субклеточных фракций из гомогенатов личинок

восковой моли..........................................55

11.8. Определение радиоактивности коконов восковой моли..........58

11.9. Статистическая обработка экспериментальных данных..........58

Глава III. Регуляция лей-энкефалином и даларгином обмена

нуклеиновых кислот..................................59

II!.1. Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога

даларгина на содержание нуклеиновых кислот у насекомых.....59

111.2. Влияние лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина на биосинтез ДНК у насекомых....................68

111.3. Влияние пептидов на ДНК-полимеразную активность

у восковой моли.........................................79

111.4. Влияние лей-энкефалина и его аналога даларгина на биосинтез РНК......................................... 83

Глава IV. Регуляция лей-энкефалином и даларгином обмена

белков у личинок восковой моли...................... 92

Глава V. Субклеточная локализация 3Н-даларгина у восковой моли. 109

Заключение. ...............................................118

Выводы................................................... 125

Приложение. Биологические наблюдения за развитием восковой

моли после инъекции даларгина личинкам VII возраста. . 127 Список литературы.......................................... 130

ВВЕДЕНИЕ.

В настоящее время большое внимание уделяется сопоставлению нейроэндокринных систем насекомых и позвоночных. Доказано, что сложность эндокринной регуляции у насекомых одного порядка с таковой у беспозвоночных. Это подтверждается хотя бы тем, что около 50 различных антисывороток, полученных к пептидному материалу позвоночных, дают положительную иммунную реакцию при испытании на клетках беспозвоночных (De Loof et al., 1987). Присутствие у насекомых пептидов, сходных с пептидами позвоночных, подтверждается данными, полученными с помощью иммуноцитохимического и радиоиммунологического методов, а также по результатам биопроб (Thorpe, Duve, 1984). Хотя содержание опиоидных пептидов и плотность опиатных рецепторов у насекомых в сотни раз ниже, чем у позвоночных, их рецепторная пептидная система столь же сложна, как у последних.

Сравнительные исследования показывают, что основные принципы организации работы эндокринной системы сложились уже перед дивергенцией первичноротых и вторичноротых. Они также оказались достаточно стабильными в ходе дальнейшей эволюции животных.

Сейчас число выделенных и идентифицированных природных регуляторных пептидов приближается к сотне, а число синтезированных аналогов измеряется тысячами. Однако, внедрение регуляторных пептидов и их аналогов в практику идет далеко не столь быстро, как этого можно было ожидать. Лишь несколько десятков аналогов регуляторных пептидов проходят клинические испытания. Ежегодно в мире выявляются и идентифицируются новые и новые природные пептиды, кроме того, у ранее открытых регуляторных пептидов выявляются принципиально новые биологически активные потенции, позволяющие расширить и пересмотреть перспективные оценки их практического использования.

Наряду с выявлением функциональной роли эндогенных пептидов, изучается действие на организм их синтетических аналогов. Одним из таких

аналогов регуляторных пептидов является даларгин - синтетический аналог лей-энкефалина. синтезированный в ВКНЦ АМН России. Он обладает рядом перспективных интересных фармакологических свойств. Учитывая применение даларгина в медицине в качестве фармакологического препарата (Чазов и др., 1984) и в рыбоводстве как биорегулятора роста рыб (Седова, 1991), изучение биохимических аспектов различных путей метаболизма, затрагиваемых даларгином, представляют несомненный научный и практический интерес.

Использование модельных систем для выявления основных закономерностей влияния пептидов . на обменные процессы имеет длительную историю, в течение которой число биологических объектов в основном было ограничено несколькими видами млекопитающих. Сейчас внимание сфокусировано на низших формах ввиду их относительной простоты, большей доступности и пригодности для осуществления определенных экспериментальных процедур. Но, прежде всего, важность информации, полученной при использовании таких моделей, была установлена путем демонстрации замечательного структурного и функционального параллелизма между высшими и низшими животными. Эти аналогии прослеживаются от молекулярного до организменного уровня организации. Более того, функциональная значимость экспериментов с более низкоорганизованными животными, включая одноклеточных, позволяет использовать их для моделирования в биомедицинских исследованиях; широкие сравнительные работы в таком контексте уже принесли информацию об эволюционной истории основных биологических понятий и ведут к открытию принципов, которые трудно выявить, изучая лишь млекопитающих.

Нейроэндокринный аппарат осуществляет интегративный контроль над функциями тела. Этот регуляторный механизм столь же важен для насекомых, как и для млекопитающих, включая человека, и его функционирование у первых, вероятно, не менее сложно, чем у вторых. Поэтому параллелизм, существующий в механизме действия регуляторных пептидов у млекопитающих и у насекомых, дает основание считать последних перспективной экспериментальной моделью.

Учитывая сказанное, а также огромную экономическую важность насекомых и особенности их развития, характеризующиеся достаточно быстрой сменой морфологических форм, этот биологический объект незаменим для проведения нейроэндокринных исследований в плане сравнительной биохимии.

Исходя из вышеизложенного, мы поставили перед собой задачу исследовать, во-первых, интенсивность включения меченого предшественника 3Н-дТТФ в ДНК и изменение содержания ДНК под влиянием лей-энкефалина и его синтетического аналога даларгина у восковой моли и мучного хрущака. Во-вторых, изучить воздействие лей-энкефалина и даларгина на содержание и интенсивность синтеза РНК с тем, чтобы на основании полученных данных оценить функциональную роль низкомолекулярных регуляторных пептидов в регуляции некоторых сторон обмена нуклеиновых кислот у различных насекомых. В-третьих, исследовать изменение активности ДНК-полимеразного комплекса ферментов при введении лей-энкефалина и даларгина в организм восковой моли с тем, чтобы высказать мнение о возможном механизме воздействия пептидных регуляторов на геном насекомых. В-четвертых, выяснить влияние лей-энкефалина и даларгина на содержание белков и интенсивность их синтеза у восковой моли, сопоставить степень воздействия эндогенного пептида и его синтетического аналога на процесс шелкообразования на заключительном этапе личиночного развития у этого насекомого. В-пятых, установить субклеточную локализацию 3Н-даларгина введенного личинкам восковой моли, что может служить основанием для рассмотрения вероятных путей действия низкомолекулярных регуляторных пептидов на метаболизм насекомых.

ГЛАВА I. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ У

животных различных филогенетических групп (обзор литературы).

1.1 Филогенез регуляторных пептидов.

Обобщение результатов исследования низкомолекулярных регуляторных пептидов у одноклеточных организмов и животных различных таксономических групп осуществлено в ряде обзоров (Ашмарин, 1986, 1988, Карамян, Соллертинская, 1964, 1987, Le Roith d., Roith J., 1984, Holman et al., 1990, O'Shea M., Adams M., 1986, Penzlin,1989, Hassel, 1993). Согласно этим авторам, большое число нейропептидов или близких им пептидов обнаружено не только у высших организмов, но и у организмов, не обладающих нервной системой, и даже у одноклеточных.

Размеры малых пептидов или триггерных участков средних и больших нейропептидов - 4-11 аминокислотных остатков, находятся в замечательном соответствии с размерами "узнающих" последовательностей в полипептидах антител или рецепторов (Ружицин, 1991). Контактные участки этих белковых молекул состоят из 5-6 доменов, содержащих отдельные пента- и декапептидные фрагменты. Ранее был установлен и минимальный размер антигенной детерминанты - 4-7 остатков. Пептиды-регуляторы представляются как бы подвижным "узнающим" фрагментом белковых молекул.

Как и у высших животных, регуляторные пептиды беспозвоночных образуются путем протеолитической фрагментации высокомолекулярных предшественников. При этом сначала отщепляются сигнальные пептиды, способствующие выведению гормонов из железистых клеток, а потом -пептидные фрагменты прогормонов (Wang, 1988; Rayne, O Shea, 1996). Часть регуляторных пептидов (для нейропептидов такие случаи не описаны) образуются у высших организмов не из специализированных больших пептидов - предшественников, а из белков, выполняющих другие функции, как, например, тафцин из иммуноглобулина. Вероятно, это отражает начальные этапы филогенеза регуляторных пептидов. В свою очередь, это

дает основание полагать, что регуляторные пептиды (и нейропептиды) являются наиболее древними регуляторами обменных процессов (Ашмарин, 1987,1988; Карамян, 1956; Муратов и др., 1988; Шейман и др., 1985).

Формирование в процессе эволюции все новых и новых нейропептидов может быть значительно более быстрым и гибким процессом, нежели образование новых мономолекулярных медиаторов. У лишенных нервной системы организмов обнаружены многообразные регуляторные пептиды, близкие к таковым высших организмов, поэтому достаточно обоснованной является гипотеза об особой эволюционной древности пептидных медиаторов и о преимуществах их быстрой эволюции. Установленным фактом является и обилие нейромодуляторных и нейромедиаторных пептидов, обнаруживаемых у беспозвоночных с примитивной нервной системой (Камкин, 1984; Муратов и др., 1988; Шейман и др., 1985).

Наличие у многоклеточных организмов такого пути быстрой эволюции системы пептидной регуляции открывает возможности широкого использования на всех ступенях филогенеза эволюционно древних регуляторных пептидов, которые благодаря изменениям в топографии рецепторов и мест синтеза самих регуляторных пептидов, обретают принципиально новые сферы действия. Если изложенные выше соображения правильны, то значительная часть регуляторных пептидов высших животных должна быть идентична или очень близка к регуляторным пептидам, обнаруживаемым у низших многоклеточных систем, причем в относительно филогенетически молодых системах организмов. Многие авторы уже осуществили такие сопоставления, показав близость ряда регуляторных пептидов нервной системы и пищеварительных органов практически на всех ступенях филогенеза (Holman et al., 1990). Важно далее проследить участие регуляторных пептидов не вообще в функциях нервной и других относительно филогенетически молодых систем, а оценить их вовлеченность в наиболее сложные новейшие функции мозга, такие как обучение, память и другие, а также в новейшие функции иммунной системы -модуляцию специфического иммунитета (Такси, Ласкар, 1986; Ашмарин, 1987, 1989).

Опубликовано немало сообщений о выявлении регуляторных пептидов у наиболее просто организованных многоклеточных и одноклеточных. Заметим, однако, что, как правило, объектом таких поисков являются регуляторные пептиды, идентичные или подобные тем, которые обнаружены ранее у высших позвоночных, Высокочувствительные радиоиммунные методы, отработанные в процессе изучения регуляторных пептидов позвоночных, используются для обнаружения и идентификации пептидов низших организмов.

Согласно И. П. Ашмарину (1988) неправомерен вывод о том, что все регуляторные пептиды высших позвоночных представлены в числе регуляторных пептидов низших существ в виде идентичных или очень близких соединений. К тому же немало регуляторных пептидов, эволюция которых, будучи прослежена в пределах позвоночных, демонстрирует возникновение новых пептидов-регуляторов. Следовательно, тезис о широком участии пептидов в регуляции филогенетически новых функций у высших позвоночных, будучи сам по себе правилен, не дает права на предположение о том, что эволюционно древними являются все "высшие" регуляторные пептиды. Более того, учитывая преобладание иммунохимических и функциональных подходов к сравнению регуляторных пептидов низших и высших животных, следует избегать утверждений о полной их идентичности до полного раскрытия первичных структур тех и других.

1.2. Регуляторные пептиды животных и некоторых других таксономических групп.

В таблице 1 представлен список практически всех обнаруженных к настоящему времени регуляторных пептидов у различных групп бактерий, одноклеточных, грибов и животных, составленный нами исходя из литературных данных (Ашмарин, 1986, 1987, 1988, 1989, Муратов и др., 1988, Такси, Ласкар, 1986, !_е Ро№, 1Чо№, 1984, е1 а!., 1985, Но1тап е! а!., 1990, РепгПп, 1990, Ыавэе!, 1993). Следует отметить, что список приведенных пептидов ограничивается только теми, для которых установлено иммуноподобие к соответствующим пептидам высших

животных. Крупные таксоны, приведенные в таблице, выбраны с соответствии с филогенетическим древом (Висктапп, 1984).

Таблица 1

РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ БАКТЕРИЙ, ГРИБОВ, ОДНОКЛЕТОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ИММУНОРЕАКТИВНЫЕ ПЕПТИДАМ

ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ, (по Ашмарину 1986, 1987, 1988, 1989, Муратову и др., 1988, Такси, Ласкар, 1986, !_е РоЛИ, РоКИ, 1984, 1ЧоШ1 е* а!,, 1985, Но!тап е* а!., 1990, РегаИп,

1990. Nassei, 1993)

Таксон Название Название пептида, к которому

организма обнаружена иммунореактивность

Прокариоты Е. co!i инсулин кальцитонин соматостатин

Одноклеточные Protozoa холецистокинин

эукариоты аргинин8-вазотоцин

Tetrachymena инсулин адренокортикотропный гормон

Грибы Fungia кальцитонин

Тип Aurelia aurita инсулин

Кишечнополостные

Hydra arrenyata инсулин

Metridium инсулин

Тип Моллюски Buccinium инсулин

Helix pomatia инсулин

Lymnaea stagnalis соматостатин

Mya arenflia инсулин

Ostrea инсулин

Тип Моллюски Pecten maximus инсулин

Phs»sp. соматостатин

Тип Членистоногие Acheta вазопрессин

Класс Насекомые Aeschna вещество Р

Apis инсулин

Blaberus вазопрессин

Bombyx инсулин р-эндорфин панкреатический полипептид лей-энкефалин

Calliphora инсулин р-эндорфин мет-энкефалин панкреатический полипептид

Clitumnis вазопрессин вазотоцин

Продолжение таблицы 1

ОгоэорИйа мет-энкефалин лей-энкефалин

Ег^аУэ инсулин лей-энкефалин мет-энкефалин соматостатин секретин р-эндорфин

1_ерйпо1агза инсулин сомато�