Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Значение оксида азота в механизмах развития боли

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Значение оксида азота в механизмах развития боли"

На правах рукописи

Д Ю Й З Е Н Инесса Валерьевна

ЗНАЧЕНИЕ ОКСИДА АЗОТА В МЕХАНИЗМАХ РАЗВИТИЯ БОЛИ

03. 00. 25 -гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Владивосток - 2004

Работа выполнена во Владивостоском государственном медицинском университете и в Институте биологии моря ДВО РАН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Мотавкин Павел Александрович доктор биологических наук, профессор Хотимченко Юрий Степанович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Черток Виктор Михайлович доктор медицинских наук, профессор Исачкова Лариса Михайловна доктор медицинских наук, профессор Радивоз Михаил Иванович

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Защита состоится "_"_2004 года в "_" часов

на заседании диссертационного совета Д 208.007.01 при Владивостокском государственном медицинском университете (690905, г. Владивосток, пр.Острякова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского Государственного медицинского университета

Автореферат разослан "_"_2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета

fwff

Актуальность проблемы. Боль, как непременный спутник болезней человека, на протяжении всей истории борьбы за здоровье являлась и остается центральной проблемой теоретической и практической медицины. Представления о формировании болевых сигналов, их трансляции и превращении в ощущения в связи с достижениями нейрохимии и физиологии мозга существенно изменились. Новое направление в понимании боли стало формироваться благодаря открытию оксида азота, его участию в ноцицептивных восприятиях и взаимодействию этой молекулы с пептидами и медиаторами, традиционно рассматриваемыми как агенты, реализующие боль (Aley et al., 1998; Millan, 1999, 2002).

Ощущение, проведение и интеграция болевого сигнала обеспечивается системой пространственно распределенных центральных структур, имеющих многоуровневую организацию. Восходящие из спинного мозга болевые (ноцицептивные) импульсы активируют многочисленные мозговые центры, совокупная работа которых определяет целостную реакцию организма на боль. В этой системе оксид азота (N0) выступает в роли интегративного звена, модулирующего деятельность различных нейромедиаторных систем, и как посредник в регуляции мозговой гемодинамики (Дюйзен и соавт., 1998; Estrada, DeFelipe, 1998; Faraci, Brian 1994; Jones etal., 1999).

В последние десятилетия работы, посвященные исследованию роли N0 в регуляции боли, ведутся достаточно интенсивно во всем мире. Использование в эксперименте предшественников синтеза NO или активация глутаматной нейропередачи изменяет функциональное состояние болевого анализатора (Дюйзен, 2002; Aley et al., 1998; Coutinho et al., 2001), активирует защитные резервы, либо, напротив, провоцирует дисметаболические процессы в нервной ткани, приводя к гибели нейронов (Викторов, 2000; Раевский и соавт., 2000; Golde et al., 2002; Iravani et al., 2002). В то же время торможение NO-зависимых сигнальных путей создает наиболее оптимальные условия для проведения лекарственного обезболивания (Babey et al., 1994; Furst, 1999; Leza et al., 1996; Mao, 1999). Эти свойства нитроксидергической трансмиссии определили реальные предпосылки для изыскания новых методов фармакологической коррекции болевых синдромов (Elliot et al., 1995; Janero, '2000; Licinio et al., 1999; Trujillo, 2000). Несмотря на столь значительные успехи в расшифровке нейрохимических механизмов боли, картина NO-зависимой регуляции этого феномена остается неполной по нескольким причинам:

Во-первых, отсутствуют данные о динамике собственных, эндогенных систем синтеза NO в мозге при болевых реакциях. Большинство работ прсвящены NO-ергическим процессам, происходящим в спинном мозге и в периферических тканях, где за оксидом азота прочно закрепилась роль про-болевого фактора (Levy et al., 1999; Lin et al., 1999; Traub et al., 1994). В то же время известно, что в координационных центрах головного мозга NO во многом определяет эффективность ■..тт.лшт.чт-

когнитивных и антиболевых адаптации (Kolhekar et al., 1997; Masood et al., 2004; Morimoto et al., 2000; Prevot et al., 1998; Seo et al., 2002; Urban Gebhart, 1999). Поэтому интегративная оценка нейрохимических перестроек при боли возможна лишь с учетом особенностей системы эндогенного синтеза NO на всех уровнях ЦНС.

Во-вторых, используемые в мировой науке методы биохимической регистрации активности NO-синтазы (NOS) не всегда позволяют определить степень вовлеченности отдельных центров головного мозга, а также -установить тканевой источник избыточной либо недостаточной продукции NO при болевых воздействиях. Наиболее информативными методами анализа внутриклеточной активности NO-синтазы являются гисто- и иммуноцитохимическая диагностика (Kuo et al., 1994; Matsumoto et al., 1993). ЭТИ методы позволяют не только изучать морфо-химические параметры нейронов, но проследить особенности их связей и охарактеризовать их нейротрансмиттерный тип.

В-третьих, возможности применения уже полученных данных в клинической практике весьма ограничены без учета нитроксидергических событий, происходящих в мозге человека при болевом воздействии. К сожалению, усилия исследователей по данному вопросу ограничиваются лишь картированием NO-ергических нейронов мозга человека в норме (Egberongbe et al., 1994; Sangruichi, Cowall, 1991).

Цель настоящейработы -установить закономерности организации и функционирования NO-ергических систем головного мозга человека и животных, вовлеченных в модуляцию болевого сигнала.

Задачи исследования:

1. Изучить локализацию и активности NADPH-диафоразы и NO-синтазы в тех регионах головного мозга человека и животных, причастность которых к модуляции болевого сигнала является установленной.

2. С помощью гисто- и иммуноцитохимических методов охарактеризовать медиаторный тип NO-ергических нейронов в нервных центрах головного мозга человека и животных.

3. На модели тонической воспалительной боли изучить динамику активности NO-синтазы в ядерных и корковых формациях головного мозга крыс и оценить характер изменений нейронального, эндотелиального и индуцибельного компонентов синтеза NO.

4. Дать количественную оценку биохимической активности фермента в отделах головного мозга и определить содержание метаболитов NO (нитратов и нитритов) в периферической крови экспериментальных животных.

5. Провести комплексное исследование нитроксидергической активности в соответствующих структурах головного мозга людей, погибших в различные сроки после развития травматического болевого шока.

6. Изучить состояние нитроксидергических процессов в мозге экспериментальных животных при системном воздействии опиатов и у людей, погибших в результате опийной интоксикации.

7. На основе полученных результатов и при их соотнесении с литературными данными составить нейрохимическую и динамическую модель нитроксидергической модуляции системной болевой реакции.

Научная новизна работы. В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота в нервных центрах и корковых формациях головного мозга человека и животных, участвующих в формировании системной интегративной болевой реакции.

Впервые представлена количественная характеристика NO-ергических нейронов в отделах головного мозга человека и экспериментальных животных и выявлены межвидовые сходства и отличия.

Впервые изучена динамика активности NADPH-диафоразы, нейрональной и индуцибельной NO-синтазы в различных структурно-функциональных ансамблях болевого анализатора и проведен сравнительный анализ изменений, происходящих в мозге экспериментальных животных и у людей, погибших от травматического болевого шока.

Впервые показан дозо-зависимый эффект опиатных аналгетиков на состояние NO-ергического синтеза в серотонинергических ядрах у экспериментальных животных.

В коре головного мозга людей, погибших от опийной интоксикации, впервые идентифицированы аберрантные NO-ергические комплексы, формирующие морфологический субстрат для нейротоксического действия оксида азота.

Впервые установлена индукция NOS в норадренергических нейронах голубоватого пятна мозга наркоманов.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты

исследования топографических взаимоотношений между медиаторной специализацией нейрона и его NO-ергической функцией необходимы для выяснения роли нейромодуляторных влияний N0 при развитии болевых феноменов. Эти данные также важны для обоснования закономерностей, лежащих в основе аналгетического и аддиктивного действия используемых в клинике опиатных аналгетиков.

Предложенная в работе концепция NO-ергической модуляции центральных механизмов боли способствует пониманию нейрохимических основ патогенеза боли и открывает перспективы для более рациональной коррекции болевых синдромов при использовании специфических регуляторов активности NO-синтазы самостоятельно или в комбинации с другими препаратами.

Полученные данные о топографии NO-ергических нейронов головного мозга человекам животных и их динамических перестройках в условиях болевого стресса могут быть использованы в нейрохимии, токсикологии,

психофармакологии, психиатрии, клинической и экспериментальной неврологии, анестезиологии, наркологии и судебной медицине. Эти данные необходимы также для поиска и оценки фармакологических препаратов направленного действия.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В головном мозге стволовые и корковые отделы, участвующие в интеграции болевого сигнала, продуцируют оксид азота.

2. NO-ергические нейроны различных мозговых формаций человека и животных характеризуются медиаторной и нейрохимической гетерогенностью, которая определяет их неравнозначное участие в формировании болевой реакции.

3. В системной болевой реакции течение перцептуально-дискриминативного, эмоционально-когнитивного, вегетативного и антиболевого компонентов регулируется NO-ергическим механизмом.

4. В основе аналгетического и аддиктивного эффектов опиатных аналгетиков лежат изменения активности N0 в эндогенных антиболевых центрах: обезболивающее действие морфина связано с угнетением активности NO-ергических механизмов, а нарастание толерантности, и формирование зависимости сопровождается гипертонусом систем синтеза N0 в катехоламинергических ядрах и регионах коры.

Апробация работы: Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной конференции стран СНГ по функциональной морфологии, посвященной 100-летию со дня рождения Н.Г.Колосова (Санкт-Петербург, 1997); V Международном симпозиуме Японско-Российского медицинского обмена (Япония. Саппоро, 3-4\09. 1997); Международном симпозиуме «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (Минск, 17-21X02, 1998); VI Съезде анестезиологов и реаниматологов (Москва, 1998); V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000); I и III Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 4\05. 2000; 25\04. 2002); Центральном Европейском конгрессе по нейробиологии (Польша. Краков, 2001); Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 29-31\05, 2002); X Международном конгрессе нейрохимического общества Чехии и Словакии «Нейронауки в третьем тысячелетии» (Словакия. Каста, 1-5\06. 2002); IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2002» (Санкт-Петербург, 29-31\05, 2002); XIX конгрессе Международной академии судебной медицины (Италия. Милан, 3-6\09.2003); XX Конгрессе Международного общества судебных генетиков (Франция. Бордо, 9-13\09. 2003).

Публикациирезультатовработы. По теме диссертации опубликовано 30 статей в отечественных и международных журналах и сборниках.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 10 глав собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя.

Объем диссертации включает 322 страницы машинописного текста, 6 таблиц, 6 схем, 240 микрофотографий и список литературы из 461 источников.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе проведено комплексное исследование активности синтеза N0 в различных по морфо-физиологическим характеристикам, но функционально взаимосвязанных регионах головного мозга, совокупная работа которых определяет течение болевой реакции. К их числу относятся: ядра тонкого и клиновидного пучков, ядра ретикулярной формации продолговатого и среднего мозга, серотонинергические'ядра шва, дофаминергические структуры черной субстанции и вентрального тегментального поля, норадренергическое голубоватое место, центральное серое околоводопроводное вещество среднего мозга, холинергические ядра покрышки и базального переднего мозга, ядра таламуса и гипоталамуса, сомато-сенсорная и лимбическая области коры.

С помощью гистохимических, иммуноцитохимических и биохимических методов изучена динамика активности NO-синтазы в мозге человека и животных и продукция метаболитов N0 (нитратов и нитритов) в периферической крови экспериментальных животных в различные сроки после болевого воздействия.

Характеристика экспериментального материала. Работа выполнена на крысах-самцах линии Wistar со средним весом 250г. Для формирования воспалительного болевого процесса крысам в область подошвы задней правой лапы подкожно вводили 0,2 ml 4% раствора формалина. Животных разбивали на группы (по 10-12 в каждой) в зависимости от сроков и условий проведения эксперимента. Контролем служили крысы, которым вместо формалина в лапу вводилось аналогичное количество физиологического раствора. В большинстве случаев исследовались животные с "чистой" болью, то есть без дополнительных фармакологических воздействий. Другим крысам для изучения аналгетических эффектов некоторых фармакологических препаратов внутрибрюшинно вводили раствор морфина гидрохлорида (0,5 мг\кг) или раствор ингибитора >Ю-синтазы — Ы-монометил-Ь-аргинипа (Ь-NAME) из расчета 10 мг\кг. Эта серия включала две группы экспериментов - в первом случае аналгетик вводился за 30 минут до нанесения болевого повреждения, во втором - через некоторое время после развития болевого синдрома. Общая характеристика экспериментальных групп представлена в табл.1.

Табл. 1. Время болевой экспозиции, типы фармакологического антиболевого воздействия и количество исследованных животных.

№ группы тип воздействия количество наблюдений

б\х NOS б\х NOj/NOj rix, ицх

1 интактные 6 10 6

2 контроль 4 8 4

3 формалин - 5 минут 5 10 5

4 формалин - 30 минут 5 10 5

5 формалин -1 час 5 10 5

6 формалин - 3 часа 6 12 6

7 формалин - 6 часов 6 10 6

8 формалин - 24 часа 5 10 5

9 NMA 30 мин - формалин 6 часов 5 8 3

10 формалин 30 мин- NMA 6 часов 5 10 5

11 Морфин 30 мин -формалин 6 часов 6 10 6

12 формалин 30 мин -морфин 6 часов 6 12 6

Итого наблюдений 64 120 62

Животных 126

Сокращения: б\х - биохимическое исследование; г\х - гистохимическое исследование с помощью метода на NADPH-диафоразу; ицх - иммуноцитохимическое выявление индуцибелъной NOS

Объективизация болевого синдрома проводилась путем регистрации отдельных поведенческих реакций, характерных для этого состояния — полизывание поврежденной конечности, вокализация, характер двигательной активности, изменение положения тела, реакция вздрагивания и др.

В ряде случаев для сопоставления параметров нитроксидергического синтеза в условиях острой болевой реакции и при хронических болевых феноменах мы применяли модель хронической нейропатической боли после перерезки седалищного нерва. Для проведения этой операции в асептических условиях под общим (эфирным) наркозом производилось рассечение 1V3 -1\2 волокон седалищного нерва. Исследование производилось через 7-14 дней после операции.

В некоторых экспериментах мы анализировали взаимосвязь между локализацией периферического повреждения и топографией NO-ергической активности в ядрах тонкого и клиновидного пучков. Для этого мы использовали материал головного мозга 4 крыс через 3 часа после операции в области шеи. После каждого оперативного вмешательства животные содержались в отдельных клетках с более тщательным соблюдением режима чистоты и кормления.

Для изучения характера нитроксидергических процессов в головном мозге экспериментальных животных при однократном и длительном применении опиатных аналгетиков, мы провели отдельную серию экспериментов, где крысам внутривенно (в хвостовую вену) вводился раствор морфина

гидрохлорида в разных аналгетических дозировках. Животным 1 раз в сутки вводили раствор аналгетика, постепенно наращивая дозу препарата (животным из первой группы - от 0,5 до 1 мг/кг и из второй группы - от 5 до 10 мг/кг) в течение двух недель. Исследование проводили после однократного приема препарата, а также на 3,7 и 14 день хронического введения (по 5 крыс в каждой группе). Некоторым животным из обеих опытных групп (по 3 в каждой) после морфинизации производилась острая отмена морфина путем подкожного введения 0,1 мг/кг налоксона.

В нашей работе с помощью гистохимических, иммуноцитохимических и биохимических методов был исследован головной мозг 8 человек, погибших в результате тяжелых, не совместимых с жизнью травм через 1, 3 и 6 часов после начала развития болевого шока. Во всех случаях для анализа использовали материал головного мозга с минимальными проявлениями признаков черепно-мозговой травмы. Для оценки изменения гистохимической активности в мозге людей на фоне воздействия опиоидов мы исследовали головной мозг 5 человек, погибших от передозировки героина. Причина смерти в этом случае была подтверждена результатами биохимического исследования содержания опиатов в биологических жидкостях.

В качестве "контроля" исследовали образцы мозга людей (4 человека), погибших от механической асфиксии, то есть тех, у которых в генезе смерти отсутствовало выраженное болевое повреждение.

Гистохимическое выявление активности NADPH-диафоразы. Метод на NADPH-диафоразу (КФ: 1.6.99.1) основан на образовании диформазана в присутствии эндогенного b-NADPH и солей тетразолия. Животных анестезировали внутривенным введением тиопентала натрия (60 мг/кг) и перфузировали через восходящий отдел аорты холодным 4% раствором параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4). Мозг извлекали на стекло, разрезали на кусочки размером 1x0,5 см и продолжали фиксировать в том же растворе в течение 2 часов при 4°С. Материал человека фиксировали без перфузии.. Кусочки ткани мозга погружали на 3 часа в холодный 4% параформальдегид, а затем в течение суток промывали в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4) с 7-8-кратной сменой раствора и в забуференном 30% растворе сахарозы до полного погружения. Серийные срезы толщиной 50 мкм (для проведения гистохимической реакции на NADPH-d) и 20 мкм (для проведения иммуногистохмической реакции) изготавливали во фронтальной плоскости на замораживающем микротоме.

Высушенные срезы помещали в инкубационную среду и термостатировали 1 час при 37 °С. Состав инкубационной среды был следующим: 50 мМ Трис-буфер, 0,2% Тритон Х-100, 0,8 мг/мл NADPH, 0,4 мг/ мл НСТ; рН 8,0 (Vincent, Kimura 1992). После инкубации срезы 3-х-кратно промывали в дистиллированной воде; обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам.

3

9

В качестве контроля в инкубационную среду вводили 1мМ нитро-L-аргинина, элективного ингибитора NADPH-диафоразы, при этом срезы оставались прозрачными, либо окрашивались в светло-розовый цвет за счет неспецифической адсорбции формазана.

Иммуноцитохимические методы исследования. В настоящей работе для оценки медиаторного профиля NADPH-d-реактивных нейронов и с целью идентификации типа NO-синтазы в отделах головного мозга человека и экспериментальных животных мы использовали иммуноцитохимические реакции. Поскольку параметры прединкубационной подготовки при этих исследованиях аналогичны тем, что применяются в гистохимии NADPH-диафоразы, для проведения иммуноцитохимического исследования мы использовали каждый пятый срез, получаемый при серийной нарезке материала. С помощью иммунофлуоресцентного и иммунопероксидазного методов была изучена локализация нейрональной NO-синтазы, индуцибельной NO-синтазы, серотонина и ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). В работе использованы первичные поликлональные кроличьи антитела против n-NOS, i-NOS, АПФ (Sigma) и серотонина (ICN), а также вторичные антитела козы против иммуноглобулинов кролика -биотинилированные (ICN), меченные пероксидазой хрена (Sigma), коньюгированные с TRITS (Mol. Probes) и Fap-фрагмент антител свиньи против иммуноглобулинов кролика, меченные FITS (Dako), набор стандартного ABC-комплекса (Vectastain Elite ABC kit, Vector Labs).

Техника гистохимического выявления ХАТ. Для гистохимического выявления эндогенной ХАТ срезы мозга инкубируют в присутствии экзогенных веществ: ацетил-КоА, холина и азотнокислого свинца (Burt, Silver 1973). Для проведения гистохимической реакции фиксировали кусочки мозга размером до 4-5 мм в 1% растворе формальдегида, приготовленном на 0,1 М какодилатном буфере с 0,32М сахарозой, рН 5,0, при 4 °С в течение 2 часов. Затем материал промывали в какодилатном буфере рН 5,2 с сахарозой в течение 18 часов с 7-кратной сменой раствора. Изготавливали криостатные срезы толщиной 12-15 мкм, монтировали их на покровные стекла 22x22 мм, высушивали при комнатной температуре в течение 1-2 мин и помещали в полипропиленовые кюветы с притертыми пробками для проведения реакции. Для прединкубации добавляли в кюветы с образцами 0,5 мл охлажденной до 4°С прединкубационной среды, рН 6,0, содержащей 2 мМ ДФФ, 10% сахарозы, 25 мМ какодилатного буфера и помещали кюветы в ледяную баню (0-4 °С) на 1 час. Для инкубация в кюветы добавляли 0,6 мл инкубационной среды рН 6,0 со следующей конечной концентрацией: 25 мМ какодилатного буфера, 1 мМ ДФФ, 4 мМ холинхлорида, 1 мМ азотнокислого свинца, 5% сахарозы, 0,3 мМ ацетил-КоА; затем, после легкого встряхивания в горизонтальном направлении, термостатировали при 37 °С в течение 2,5 часов. После промывки срезов в трех порциях дистиллированной воды их обрабатывали в 5% растворе сульфида аммония. Срезы постфиксировали в 5% растворе формальдегида, на 0,1 М какодилатном буфере, рН 5,2 с 0,32 М сахарозой в течение 5 мин, после чего обезвоживали и заключали в бальзам.

Общеморфологические методы. Определение общего количества нейронов в исследуемых ядрах производили при окрашивании по Нисслю. Для этого каждый шестой срез, получаемый при изготовлении серии для проведения гистохимической реакции, мы окрашивали в 1% растворе толлуидинового синего, после чего срезы обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам по традиционной прописи.

Биохимическое определение активности NO-синтазы. Биохимическое определения активности NO-синтазы осуществляли с помощью радиометрического метода, основанного на измерении количества цитруллина, образующегося в гомогенатах тканей при добавлении в среду меченого тритием субстрата реакции - L-аргинина (Bredt, Snyder, 1990).

После декапитации извлекали головной мозг и на льду, согласно топографическим и стереотаксическим координатам (Paxinos, Watson, 1982), разрезали его на кусочки, соответствующие различным отделам. Изучение активности NOS производили в продолговатом мозге, мосте, среднем мозге, гипоталамусе, таламусе, базальных ганглиях и коре.

Ткань гомогенизировали в течение 3 мин в 5 объемах буфера, содержащего 50 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA и 1 мМ дитиотрейтол (рН 7,4). Гомогенаты центрифугировали в течение 30 мин (11 000 g, 4°C) и в полученных супернатантах проводили определение активности NO-синтазы. Реакцию запускали добавлением супернатанта (50-100 мкг белка в 20 мкл) в реакционную смесь с конечным объемом 50 мкл, содержащую 20 мМ HEPES (рН 7,5), 0,45 мМ СаС12, 0,2 мМ NADPH, 50 мкМ тетрагидробиоптерина, 5 мкМ флавин-аденин-динуклеотида, 5мкМ флавин-мононуклеотид-фосфатаДмкМ L-аргинина и 0,5 мкКи/мл [3Н] L-аргинина. После 20 мин инкубации при 37°С образцы помещали на лед, добавляли 300 мкл охлажденной суспензии Dowex 50W-X8 (Na-форма) в 20 мМ HEPES (рН 5,5), содержащей 2 мМ ЭГТА, и инкубировали 60 мин для сорбции [3H]L-аргинина.

Радиоактивность [3Н^-цитруллина в пробах (80-100 мкл после осаждения смолы) определяли на сцинтилляционном счетчике. Количество образующегося в ходе инкубации [3Н^-цитруллина является показателем активности NO-синтазы в гомогенатах мозга, которые мы выражали в нмоль\мг белка\мин.

Спектрофотометрический метод определения нитрат- и нитрит-ионов в периферической крови. Используемый метод основан на способности металлического кадмия превращать нитраты биологических жидкостей в нитриты (Cortas, Wakid, 1990).Кровь центрифугировали (3000G; 10 мин.) не позже, чем через 1 час после декапитации и получаемую сыворотку повторно центрифугировали (5000G; 5 мин.) для избавления от нерастворимого остатка и депротеинизировали. Для этого к 0.5 мл сыворотки добавляли при перемешивании 2.0 мл 75мМ раствора ZnSO4 и 2.5 мл 55мМ NaOH. Конечная рН полученных образцов должна быть в пределах 7.0 - 7.5. После 10 минут инкубации при комнатной температуре сыворотку повторно

центрифугировали и в надосадочной порции определяли содержание нитрат-и нитрит-ионов.

Для измерения нитрат-ионов внутри каждого образца формировали "внутренний стандарт" путем добавления известных концентраций нитрата калия (табл. 2). Из пяти пробирок каждого образца, в которых проводилась реакция, 1-я являлась "пустой" (blank) и не содержала сыворотки, 2-я служила "чистым образцом" (sample) и не содержала дополнительных порций нитрат-иона, а в 3-ю, 4-ю и 5-ю вводились определенные количества 10 мкМ KNO3 (5, 10 и 15 нмоль, соответственно). В каждую из пробирок, кроме того, добавляли деионизированную бидистиллированную воду и глицин-NaOH-буфер (рН 9.7).

Табл.2. Приготовление "внутреннего стандарта" для исследования содержания нитрат-иона в сыворотке крови по методу N.Cortas, N.Wakid, 1990.

№№ 1 2 3 4 5

название blank sample 1 standart 2 standart 3 standart

глицин-NaOH 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml

сыворотка - 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml

KNO3 - - 0.5ml 1.0ml 1.5ml

деион. вода 3.0ml 2.0ml 1.5ml 1.0ml 0.5ml

Затем в каждую пробирку добавляли 2.5-3.0г. активированных медью кадмиевых гранул и после однократного встряхивания инкубировали 90 мин. при комнатной температуре. По окончании времени инкубации из каждой пробирки отбирали по 2.0 ml раствора, доводили объем деионизированной бидистиллированной водой до 2.5 ml и прибавляли 1.0 ml 1% сульфаниламида (приготовленного на ЗМ НС1), lml 0.2% N-нафтил-этилен-диамина (NEDA). После 20-60 мин. инкубации образцы спектрофотометрировали при длине волны 545 nm.

Количественную обработку полученных данных производили с помощью пакета программ "GrafPad" для анализа уравнений линейной регрессии. В графиках на оси абсцисс отмечали количество дополнительных порций нитраг-иона (в нМ), а на оси ординат - спектрофотометрические показания. Экстаполяция получаемой прямой на ось Y при коэффициенте линейной регрессии г > 0.98 является показателем количества нитрат-иона в исследуемом образце (Cortas, Wakid, 1990). Получаемое значение умножали на коэффициент разведения пробы и выражали содержание нитратов в мкмоль\л.

Нитриты определяли в депротеинизированных образцах, которые, не подвергая кадмиевой обработке, сразу же смешивали с сульфаниламидом и NEDA и после 20-60 мин. инкубации спектрофотометрировали. Содержание нитрит-ионов (в мкмоль\л) оценивали по калибровочной прямой, полученной при измерении спектра поглощения известных концентраций нитрита натрия.

Определением-РНКиндуцибельной NO-синтазы. Суммарную РНК в тканях головного мозга (20-100 мг) выделяли с использованием лизиса в буфере, содержащем гуанидинтиоцианат с последующей экстракцией смесью фенол-хлороформ на основе метода P.Chomczynski and N.Sacchi (1987). РНК осаждали тремя объемами этилового спирта и растворяли в деионизированной воде.

Качество РНК анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозе на буфере ТАЕ. Положение полос рибосомальной РНК сравнивали с «лестницей» фрагментов ДНК. Образцы РНК использовали для синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы) и специфических олигонуклеотидных праймеров для матричной РНК (полиА+). Затем кДНК амплифицировали для получения «библиотеки» кДНК (Shagin et al., 2002).

Качество полученной «библиотеки» кДНК оценивали с помощью амплицикации гена глицеральдегид-фосфатдегидрогеназы (ГДФГ) - гена «домашнего хозяйства». Специфические праймеры для ГДФГ получены от компании (Clontech, USA). Для амплификации i-NOS использованы следующие праймеры:

прямой 5'-CTGCAGACACGTGCGTTACTCCACC;

обратный 5'-CCAGGTCCCAGGCCAGCGCCTC.

После амплификации продукты реакции анализировали с помощью гель-электрофореза с последующей докраской этидием бромистым.

Количественная обработка данных. Подсчет числа нейронов и

элементов микроциркуляторного русла производили в 20-25 последовательных серийных срезах, включающих срединную порцию исследуемых ядер. В корковых формациях количественную оценку NADPH-d- и iNOS-, серотонин-, АПФ- и ХАТ-позитивных клеток и NADPH-d-позитивных капилляров проводили с помощью окуляр-морфометрической сетки на участках ткани площадью в 0,29 мм2 в 20-25 полях для каждого объекта. Учитывали абсолютное количество позитивных нейронов и высчитывали их долю из числа нервных клеток, окрашенных в сходных областях" по методу Ниссля. Данные распределения нейронов обрабатывали статистически с определением критерия достоверности по Стьюденту (PJ0,05). Линейные размеры нейрона определяли по наибольшему и наименьшему диаметру и классифицировали, как сверхмалые (5-10/5-10 мкм), малые (11-12/5-10 мкм), средние (13 -22,5/7,5-22,5 мкм) и крупные (23-30/7,5-30 мкм). Концентрацию NADPH-d-позитивных капилляров вычисляли по формуле для неравномерного распределения объектов в препарате (Блинков, Моисеев, 1961). Математическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ Statistica 5.0 и Microsoft Excel.

Автор выражает глубоую благодарность сотрудникам геномной лаборатории Краевого бюро судебно-медицинской экспертизы к.м.н. Г.ГДирлам, к.б.н. В.Б.Кожемяко и сотрудниками ТИБОХ ДВО РАН ГАНабережных и Р.В.Гладких за помощь в освоении биохимических методик и участие обсуждении результатов исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Воздействие болевого фактора на организм ведет к формированию определенного комплекса перцептивных, вегетативных и эмоциональных реакций, способствуя развитию краткосрочных и длительных адаптации. В конструкции целостного ответа организма на боль существует, кроме того, особый компонент, нацеленный на изменение интенсивности ноцицептивного сигнала и определяемый работой эндогенных анти- и проболевых систем.

В интегральную реакцию нервной системы на боль вовлекаются все известные нейромедиаторы. За каждым из них закреплена в мозге своя сфера влияния: отдельная трансмиттерная система формирует своеобразный стержень нейрофизиологического процесса, тонкая настройка которого осуществляется с помощью многочисленных модуляторных механизмов медиаторного, метаболического или генетического характера. Последовательный взаимообмен нервной информации имеет в мозге предпочтительные пути следования, за счет чего в центральной нервной системе организуются своеобразные морфо-функциональные ансамбли или компоненты целостного поведенческого акта. Перецептуально-дискриминативный анализ болевого сигнала связан с действием глутаматергического сигнала, траектория и интенсивность которого регулируется локальными тормозными (ГАМК-ергическими) и возбудительными механизмами. Неспецифическая "arousar-активация строится на конкурирующих взаимоотношениях между холинергической и моноаминергической неротрансмиссией; доминирование каждой из них предопределяет уровень и качество протекания основных нейрофизиологических процессов. Эмоционально-мотивационная окраска боли зависит от баланса катехоламинергических нейропередатчиков. Эти же нейромедиаторы выступают основными эффекторами эндогенного болевого контроля, поэтому развертывание антиболевой или про-ноцицептивной стратегии центральной нербной системы тесно коррелирует со специфическими эмоционально-мотивационными сдвигами. Опиоид-зависимые механизмы аналгезии выстраиваются на основе сложных дезингибиторных взаимодействий среди ГАМК- и моноаминергических интернейронов.

Если синоптический способ устройства нервных связей обеспечивает специфичность циркуляции импульса, организует строго упорядоченные тормозные и возбуждающие системы, то принципы работы объемного N0-ергического сигнального механизма отвечают принципиально иному, самостоятельному уровню межнейронных коммуникаций. Это определяется особыми качествами сигнала, передаваемого оксидом азота, высокой чувствительностью систем его регуляции, быстротой реагирования и динамическим характером действия в четырехмерном пространственно-временном континууме нервной активности (Kiss, Vizi, 2001).

Результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что N0-ергическая система головного мозга является неизменным участником

нейрональных процессов, протекающих на фоне действия болевого фактора. В различных нервных центрах выраженность и динамика NO-ергического ответа находится под влиянием индивидуальных регуляторных механизмов. В свою очередь, эффекты N0 на течение разнородных нейротрансмиттерных и метаболических процессов имеют селективный и гетерогенный характер. Плотность распределения NO-продуцирующих клеток в мозге относительно невелика, но даже незначительные сдвиги его локальной концентрации неизменно приводят к нейрохимическим перестройкам в широком объеме нервной ткани и в конченом итоге, мультиплицируются соответствующей системой нейромедиатора (Okhuma, Katsura, 2001; Prast, Philippu, 2001).

Особенности распределения Ш)-ергических систем в головном мозге человека и животных.

Как следует из результатов проведенного нами исследования, в головном мозге человека и животных имеется исходный, базисный уровень продукции оксида азота, определяющий наиболее благоприятные условия для протекания естественной деятельности. Сравнительная характеристика числа NO-ергических нейронов, показателей их гисто- и биохимической активности в отдельных регионах головного мозга человека и крысы представлена в таблице 3. В пределах центральной нервной системы NO-ергические клетки распределены достаточно негомогенно и их гистохимическая активность варьирует в широких пределах. Здесь есть ядра, где преобладающее большинство нейронов экспрессирует высокий уровень NO-синтазы (ножко-мостовое и дорсо-латеральное ядра покрышки, миндалина, стриатум). В нервной системе имеются участки, которые в физиологических условиях лишены собственных NO-ергических клеток (голубоватое пятно, двигательные ядра некоторых черепно-мозговых нервов, отдельные регионы ретикулярной формации). Между этими крайними типами существует большое количество переходных форм.

Можно заметить, что иерархической системе болевого анализатора распределение и количественное представительство NO-ергических клеток имеет определенный порядок. В цепи нейропередачи по лемнисковой системе связей, на всех ее уровнях N0 синтезируют, очевидно, только тормозные ГАМК-ергические элементы - они располагаются в поверхностных пластинах заднего рога спинного мозга, в релейных станциях тонкого и клиновидного пучков, в структурах таламуса и неокортекса. На каждом "этаже" плотность распределения NO-ергических интернейронов, их абсолютное и относительное содержание и параметры биохимической активности неидентичны и характеризуется межвидовыми особенностями. На уровне спинного мозга крыс NO-ергическими являются 20-25% клеток ЬП пластин, а у человека их число колеблется в пределах 30% (Охотин, Дюйзен., 1998). Ядра задних канатиков и у человека, и у животных содержат в своем составе небольшую популяцию нейронов, сконцентрированных на "непроекционных" территориях ядра (Дюйзен, 2003). Отделы вентро-базального комплекса

Табл. 3. Гистохимическая и биохимическая характеристика КО-ергических

систем в различных отделах головного мозга человека и крысы.

крыса человек

Область мозга количество активность количество активность

нейронов (ЕОП) нейронов (ЕОП)

(%) (%)

ПРОДОЛГОВАТЫЙ МОЗГ 28,1 пМ\мг\мин 7,8 пМ-мг\мин

Клиновидное ядро 8,5 32.1 13,8 34,8

Тонкое ядро 14.2 (кауд) 36,2 11.6 44,8

64,4(ростр) 31,1

Латеральное ретикулярное ядро - - - -

Гигантоклеточное ретикулярное ядро - - - -

а-часть парагигантоклеточнои

ретикулярной формации 56,4 71,6 13,2 83,3

Большое ядро шва 9,4 74,4 14,2 80,4

Бледное ядро шва ед 48,3 - -

Темное ядро шва 32.4 63,8 18,2 56,3

МОСТ 39,1 пМ\мг\мин 9,2пМ\мг\мин

Голубоватое пятно - - - -

Мостовое ядро шва 48.8 72,2 24,1 60,1

Дорсо-латерапьное ядро покрышки 88,3 118,7 72,6 114,1

Ножко-мостовое ядро покрышки 91,1 122,6 54,9 94,3

СРЕДНИЙ МОЗГ 13,4 пМ\мг\мин 8,2 пМ\мг\мин

цсов

-дорсо-латеральный сегмент 48,8 58,2 13,4 54,9

-вентро-латеральный сегмент ед 27,6

-дорсальный сегмент

Вентральное поле покрышки 22,4 38,1 - -

Черная субстанция

-латеральная часть 34,3 70,0 7,8 58.7

-компактная часть

-ретикулярная часть

Срединное ядро шва 7,2 26,5 16,2 72,3

Заднее ядро шва 76,7 87,2 63,1 59,4

ТАЛАМУС 9,6 пМ\мг\мин 3,1 пМ\мг\мин

Переднее-дорсальное я. ед 31,8 - -

Переднее вентральное я. - - - -

Переднее медиальное я. ед 32,3 49,6

Медио-дорсальное я. ед 28,3 - -

Центральное медиальное я. -

Вентральное задне-латеральное я. ед 28,5 32,4

Вентральное задне-медиальное я. - -

Реунеальное я. ед 31.4

Паратениальное я. ед 33,6 - -

Ромбовидное я. ед 29,6 - -

Интраламинарные я. - - 13,1 62,5

Ретикулярное я. 42,4 38,4 48,8

ГИПОТАЛАМУС 49,1 пМ\мг\мин 13,1 пМ\мг\мин

Медиальное преоптическое я. 73,2 38,6 -

Супрахиазматическое я. ед 44,8 - -

Супраоптическое я. 16,7 84,8 - -

Переднее гипоталамическое я. ед 28.8 - -

Паравентрикулярное я.

-мелкоклеточная часть

-крупноклеточная часть 17,5 42.2 32,4

Дугообразное я. - - - -

Заднее я. ед 30,1 - -

Вентро-медиальное я. ? 28,2 - -

Дорсо-медиальное я. - - - -

Латеральное ядро 31,8 63,3 - -

Заднее перивентрикулярное я. 32,4 38,1 - -

Супрамаммиллярное я. 54,1 22,6 29,2 48,9

Медиальное сосцевидное тело - - - -

Латеральное сосцевидное тело ? 21,4 ? 34,2

БАЗАЛЬНЫЙ ПЕРЕДНИЙ МОЗГ ? ?

Медиальное септальное я. 13.2 68,8 - -

Латеральное септальное я. ед - -

Ядро диагональной полоски Брока

-горизонтальный лимб 28,5 76,8 - -

-вертикальный лимб 21,1 65.5

Базальное крупноклеточное ядро 36,6 63.8 - -

СОМАТО-СЕНСОРНАЯ КОРА 48,2 пМ\мг\мин 7,6 пМ\мг\мин

Ч-М слой 43,4% 8 2%

-У-М слой 41,1% 38,1%

-белое вещество 15,5% 53,7%

ПОЯСНАЯ КОРА 42,4 пМ\мг\мин 8,1 пМ\мг\мин

Ч-М слой 53,6% 13,4%

-У-М слой 44,6 % 41,9%

-белое вещество 1,8% 44,7%

Примечание: в столбцах, посвященных анализу корковых формаций человека и животных, приводятся данные о послойном распределении МЛОРН-позитивных нейронов; ед - единично встречающиеся клетки; ? - параметр не изучался.

таламуса у животных лишены собственных МО-ергических элементов, а у человека они характеризуются достаточно умеренными показателями гисто-и биохимической активности. В различных отделах коры лишь 1,5-2% нервных клеток способны к синтезу оксида азота. Как показано в нашей работе, предпочтительной зоной их локализации в сомато-сенсорной зоне являются глубокие слои и подкорковое белое вещество. Эта тенденция еще более

отчетливо представлена в коре головного мозга человека, где около 80% N0-ергических клеток залегают в глубоких слоях и субкортикальной белой пластинке.

Складывается впечатление, что в ядрах с узко-специфической сенсорной функцией по мере центростремительного продвижения нервного сигнала относительное содержание NO-ергических нейронов уменьшается. Максимальная концентрация нейронов, продуцирующих N0, наблюдается в первичных центрах боли, а ноцицептивные структуры высшего порядка обладают более умеренной NO-ергической активностью. Другим важным принципом нейрохимического устройства специфических ядер болевого анализатора является отсутствие NO-ергической активности в эффекторных клетках (пирамидных клетках коры и проекционных нейронах переключательных станций) в условиях физиологической нормы.

В структурах с интегративными функциями распределение систем синтеза N0 более гетерогенно. Например, нервные центры, анатомически принадлежащие экстралемнисковой системе связей, практически не содержат NO-ергических нейронов на уровне первых переключательных станций - в ретикулярной формации продолговатого, среднего мозга и моста, парабрахиальном ядре, глубоких слоях верхних холмиков у интактных животных такие клетки практически отсутствуют. Относительная концентрация NO-позитивных элементов прогрессивно нарастает в ростральном направлении; ядра гипоталамуса, отделы центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга, миндалины, стриатума характеризуются, по нашим наблюдениям, высокой концентрацией клеток нитроксидергической природы.

Не йр ом ед и а торная характеристика NO-ергических нейронов головного мозга

Важным фактором, определяющим функцию нейрона, является его медиаторная специализация. Результаты проведенных нами исследований подтверждают существующее представление о нейрохимической гетерогенности NO-синтезирующих нервных клеток. В большинстве случаев оксид азота синтезирует определенная доля клеток определенного медиаторного типа. Так, холинергические ядра разных уровней центральной нервной системы имеют максимальную плотность NO-ергических нейронов с высоким уровнем гистохимической активности. В области покрышки мозга животных и человека все холинергические нейроны имеют высокие показатели активности синтеза N0. В медиальном ядре септума, горизонтальном ядре диагональной полоски Брока и в крупноклеточных ядрах ретикулярной формации NOS также является специфическим маркером холинергических клеток, хотя и формирует в мозге крыс лишь узкую группу и не содержится в холинергических нейронах у человека.

В серотонинергических нейронах шва NO-синтаза в большинстве случаев со-локализована с основным нейромедиатором. Напротив, дофамин-

и норадренергические нервные клетки NO-синтазу в норме не эксгтрессируют; гистохимическая реакция на NADPH-диафоразу маркирует в регионе голубоватого пятна и черной субстанции лишь интернейроны, расположенные на территории соответствующих центров.

В ядрах задних канатиков, центральном сером околоводопроводном веществе среднего мозга, таламусе и коре морфологические и топографические признаки NADPH-d\NOS-позитивных элементов позволяют причислить их к категории тормозных ГАМК-ергических нейронов.

Нейрохимическая партитура NO-продуцирующих элементов гипоталамуса чрезвычайно разнообразна (Yamada et al., 1996). Наряду с известным фактом о локализации NOS в клетках, секретирующих кортикотропин-релизинг-фактор (адренергические), окситоцин и вазопрессин (холинергические) и ряд нейропептидов (вещество Р, энкефалин и др.), мы установили, что некоторые NO-ергические нейроэндокриноциты гипоталамуса содержат ангиотензин-превращающий фермент.

Такое гетерогенное и селективное распределение, бесспорно, указывает на исключительную роль NO-ергических клеток в организации и управлении нейронными цепями. В пределах отдельного ядра или коркового поля эти различия обусловлены неодинаковой рабочей нагрузкой нервных клеток, что же касается разных мозговых центров, то различие активности между ними, преобладание определенных цитохимических типов нейронов находятся в зависимости от их генетической детерминированности. Как известно, нуклеотидная последовательность, ответственная, за трансляцию N0-синтазы, может быть обнаружена в любой нервной клетке, однако функционально активный фермент в физиологических условиях распределен в строго определенных клетках. Поэтому наличие энзима в "нетипичных" для него популяциях нейронов или других тканевых элементах нервной ткани неизменно трактуется исследователями, как проявление физиологической или патологической адаптации к действию внешних или внутренних раздражителей. В этом случае направление эффектов N0 зависит от типа синтезирующего его фермента (конститутивного или индуцибельного), локальной концентрации газа, медиаторной специализации окружающих клеток и характера афферентно-эффекторного устройства ядра, включенного в тот или иной компонент болевого интегративного ответа организма.

NO-ергические механизмы регуляции перцептуально-дискриминативного компонента болевой реакции

Возбуждающий глутаматергический поток на пути переключения через релейные станции лемнисковой и экстралемнисковой систем координируется мощным аппаратом ГАМК-ергических клеток, формирующих основу латерального, дискриминативного и возвратного торможения. Эти механизмы регулируют преемственность передачи болевого импульса, ограничивая латеральное распространение возбуждения. При этом вычленяются и последовательно усиливаются значимые параметры сигнала,

несущие информацию о его модальных, пространственных и временных качествах. Результаты настоящего исследования демонстрируют, что в пределах лемнисковой системы связей болевая стимуляция неизменно приводит к выраженным локальным перестройкам в характере N0-ергической медиации. Динамические и морфологические характеристики NO-ергического ответа в каждом передаточном звене индивидуальны (см. рис. 1).

К настоящему времени наиболее исследованным регионом является область болевых ворот заднего рога, где ноцицептивные стимулы разного качества, частоты и длительности сопровождаются быстрой и мощной активацией локальных и проекционных NO-синтезирующих клеток. Большинство их являются ГАМК-ергическими, но в функционировании системы "болевых ворот" с их деятельностью связывают как тормозные, так и возбудительные физиологические процессы (Mason, 1999; Levy et al., 1999).

На уровне ядер задних канатиков (ЯЗК) существуют аналогичные спинальным механизмы "воротного контроля", обеспечиваемые конвергентным характером прямых и полисинаптических афферентных систем и физиологической специализацией реципиентных нейронов (А1 Chaer et al., 1997). При анализе полученных результатов обращает на себя внимание сходство нитроксидергических перестроек в ядрах задних канатиков и в спинномозговых центрах боли, исследованных нами ранее (Охотин, Дюйзен, 1998; Шуматов и соавт., 1998; Дюйзен, 2003). Как и в спинном мозге, NO-ергический ответ тонкого и клиновидного ядер подчинен принципам сомато-топической иннервации и имеет динамический характер. Это означает, во-первых, что ядра задних канатиков вовлечены в трансляцию острого болевого сигнала; это позволяет пересмотреть классические концепции о причастности тонкого и клиновидного ядер, исключительно, к неболевым тактильным ощущениям. Во-вторых, NO-ергические процессы и связанные с ними нейрохимические модификации на уровне ЯЗК могут служить дополнительным инструментом нервной системы, позволяющим осуществлять более детальный анализ болевого стимула в условиях острой боли, а при трансформации болевого процесса в хронический (патологический) его вариант - содействовать развитию нейропластических перестроек (Willis et al., 1999).

Значение колебаний эндогенной продукции N0 и характер NO-зависимой модуляции болевого сигнала на супрасегментарных уровнях еще далеки от окончательной расшифровки. Вместе с тем, наши данные убедительно демонстрируют, что изменение активности NO-ергических систем является закономерной реакцией всех нервных центров, получающих ноцицептивный сигнал. Враженность и сроки изменений, происходящих на разных этажах лемнискового анализатора, свидетельствует о прогрессивной рострализации NO-ергического ответа по мере развития болевого процесса. Так, первично-чувствительные нейроны отвечают повышением синтеза N0 уже в первые минуты после возникновения боли, в нервных клетках заднего рога спинного мозга эти события запускаются с отсрочкой в несколько десятков минут. По

Рис. 1. Динамика активности NADPH-диафоразы в некоторых ядрах головного мозга крыс при болевом воздействии. По оси абсцисс - длительность болевой экспозиции. По оси ординат: в столбцах количество NO-ергических нейронов в средней порции ядра в серийный срезах толщиной 50мкм; в линиях - оптическая плотность преципитата гистохимической реакции на NADPH-диафоразу. В графиках, описывающих характер изменений в тонком ядре - заштрихованные столбцы - количество NO-ергических нейронов на стороне повреждения, светлые столбцы - на противоположной стороне.

нашим наблюдениям, нейроны тонкого ядра включаются в NO-ергический ответ к концу 1 часа, а в структурах вентро-базального комплекса таламуса и в сомато-сенсорной коре наиболее значительные изменения регистрируются лишь через 6 часов болевой экспозиции.

Совокупный анализ наблюдаемых нейрохимических перестроек позволили нам сформулировать модель NO-ергической модуляции структур, обеспечивающих перцептуально-дискриминативный анализ болевого стимула (рис. 2). Активность NO-синтазы, как известно, чрезвычайно зависима от степени возбуждения NMDA-рецепторов, поэтому наработка N0 напрямую связана с работой глутаматергических афферентов (Willis, Westlund, 1997). Мы полагаем, что именно этот механизм имеет доминирующее влияние на NO-ергические нейроны каждого из звеньев лемнисковой цепи связей. Глутамат является медиатором прямых и полисинаптических афферентных волокон к ядрам задних канатиков (Day etal., 2001). На спинальном уровне, где формируются эти глутаматергические тракты, болевое воздействие неизменно сопровождается гипертонусом систем синтеза N0. Индукция фермента в мелких псвдоуниполярных нейронах (рис. 2-1) провоцирует аналогичные нейроперестройки в крупных нейронах, связанных с толстыми волокнами Ab-типа (рис. 2-2), которые в норме не причастными к ноцицептивной трансмиссии. Это провоцирует сенситизацию вставочных и проекционных нейронов заднего рога спинного мозга, среди которых NO-ергические клетки III-IV и X пластин имеют прямой выход на тонкое и клиновидное ядро (рис. 2-3).

На уровне ядер задних канатиков первичная фаза унилатеральной активации вставочных интернейронов, по мере нарастания болевого процесса дополняется нейроперестройками на противоположной стороне и, в конечном итоге, стимулирует экспрессию NO-синтазы в проекционных элементах ядра (рис. 2-4). Ими являются крупные округлые элементы, неизменно выявляемые при боли в nucleus gracilis человека и экспериментальных-животных.

В таламусе крыс максимальные изменения активности N0 регистрируются в специфическом вентро-базальном регионе на стороне, противоположной повреждению. Это подтверждает специфическую природу нейрохимических изменений, происходящих в соответствии с ходологией его специфических афферентных систем. На фоне болевого воздействия в сомато-сенсорной зоне таламуса возрастает концентрация нитроксидергических нервных проводников (рис. 2-5). По нашему мнению, к их формированию причастны не только проекционные клетки спинного мозга и тонкого ядра (которые при боли становятся NO-продуцирующими), но и (которые при боли становятся NO-продуцирующими), но и терминальные разветвления NO-ергических нейронов ретикулярного таламического ядра (рис. 2-6). Это - единственная зона в таламусе крыс, имеющая собственную популяцию NO-ергических нейронов

Рис. 2. Предполагаемая схема NO-ергической модуляции структур перцептуально-дискриминативного нализатора боли, выполненная по материалам собственныхисследований Объяснения в тексте

У человека, в отличие от мозга крысы, нейроны с положительной реакцией на NADPH-диафоразу могут быть обнаружены в большинстве ядер таламуса; на болевое воздействие они реагируют выраженной активацией фермента. Такие морфо-химические особенности NOXrAMK-ергических клеток таламуса человека позволяют сделать предположение о существовании NO-зависимого звена в патогенезе центральных (таламических) болей, где первостепенная роль отводится дисбалансулокальных тормозных механизмов (Крыжановский, 1980).

Изестно, что между специфическими сенсорными системами и неспецифическими модуляторными механизмами мозга происходит постоянный взаимо-модулирующий обмен, поэтому в индукции нейроперестроек, наблюдаемых на таламическом уровне, нельзя исключать влияний других нейротрасмиттерных путей, корректирующих качество N0-ергического ответа. Прямые NO-ергические проводники в таламус распространяются от ядер покрышки, оволоводопроводного вещества среднего мозга, ядер шва, гипоталамуса, парабрахиального ядра (рис. 2-7). Как установлено в нашей работе, большинство этих ядер в определенные периоды боли имеют кратковременный или более длительный период гиперпродукции N0. В этом случае постсинаптические эффекты газа могут влиять на свойства проекционных таламических нейронов, делая их более чувствительным к действию афферентных сигналов (Do et al., 1994; Раре, Magen, 1992).

Аналогичные события происходят и в регионах неокортекса (рис. 2-8), где N0 секретируют только тормозные ГАМК-егические клетки. По сравнению с ассоциативными зонами коры их концентрация в первичной сомато-сенсорной области значительно выше. У экспериментальных животных на боль "реагируют" нитроксидергические нейроны верхних корковых этажей, которые традиционно рассматриваются как конечные станции таламических афферентов (Herreho, 2002; Marino, Cudeiro, 2003). В лимбической коре нейроны, синтезирующие N0, концентрируются в супрагранулярных слоях; Следует отметить, что популяция NO-ергических нейронов подкоркового белого вещества остается на неизменном уровне в обеих корковых зонах.

Итак, в специфической картине NO-ергической реакции ядер, входящих в состав лемнисковой системы, существуют некоторые закономерности. На уровне спинного мозга, в ядрах задних канатиков, вентро-базальном регионе таламуса и в ^мато-сенсорной коре оксид азота синтезируется популяцией тормозных ГАМК-ергических клеток. Учитывая двойственную природу N0 -ергического сигнала, мы можем предполагать его влияние как на систему тормозной, так и возбудительной нейропередачи. На возможность существования обоих этих механизмов указывают современные исследования. В первом случае, за счет активации ГАМК-ергических тормозных процессов, N0 индуцирует латеральное торможение, обеспечивая функциональное разграничение популяций нейронов, заинтересованных в дальнейшей трансмиссии сигнала (Paul, Jayakumar, 2000). Параллельно действие нитроксида может диффузно распространяться на клетки возбудительной специализации и приходящие сюда афферентные волокна. Это

создает дополнительные возможности для мультипликации глутаматергического сигнала, обеспечивает концентрацию возбуждения и ограничивает его иррадиацию на обширные участки нервного центра, направляя афферентные импульсы в строго определенные нейронные сети. В результате NO-зависимого повышения чувствительности структур лемнисковой системы, создаются условия для усиления эффективности ноцицептивного нервного сигнала, что, совместно с NO-ергической активацией тормозных систем, способствует формированию целостного сенсорного образа (МШащ 1999). Доминирование тормозного или активирующего эффекта N0, очевидно, определяется качественными и количественными параметрами болевого стимула, локальной концентрацией нитроксида и характером сопутствующих изменений в иных медиаторных системах (Okhuma, Katsura, 2001).

NO-зависимая регуляция вегетативных адаптации при болевой стресс-реакции

В комплексной нейропатологии болевых расстройств процессу болевой перцепции неизменно сопутствуют изменения со стороны вегетативных функций. Это обеспечивается широкой дивергенцией специфических болевых импульсов к нервным центрам, обслуживающим вегетативную адаптацию (Benaroch, 2001). Исполнительные нейро-гуморальные механизмы находятся под влиянием контролирующих систем, распределенных на разных уровнях центральной нервной системы. Современные подходы к исследованию NO-ергического метаболизма в гипоталамусе, регионах центрального серого вещества среднего мозга и ядрах шва позволили уточнить и дополнить традиционную схему регуляции вегетативных реакций в условиях болевого стресса (Pacak, Palkovits, 2001).

В многокомпонентной стресс-активационной системе ключевой фигурой является гипоталамус, соединяющий взаимоотношения эмоциональной сферы, эндогенного обезболивания и настройки системного гомеостаза. Эти свойства во-многом диктуются морфо-химическими особенностями гипоталамических структур. Во-первых, супраоптическое и паравентрикулярные ядра, по сравнению с остальными отделами мозга, имеют наиболее мощную локальную капиллярную сеть. Здесь тесные взаимодействия клеток с кровеносным руслом позволяют им весьма чутко реагировать на малейшие сдвиги химического и динамического состояния системы циркуляции. По нашим наблюдениям, эта черта наиболее демонстративно представлена в крупноклеточных ядрах у человека, где при развитии болевого шока активность нейрональной и эндотелиальной NO-синтазы изменяется параллельно.

Во-вторых, за счет тесных связей с гипофизом, гипоталамус оказывает влияние на деятельность большинства эндокринных желез. В установлении этих взаимоотношений NO-ергический сигнал играет ведущую роль. Агонисты глутаматных рецепторов и метаболические предшественники NO, введенные в паравентрикулярный регион, стимулируют симпато-адреналовую активность, осуществляя кардиотропный, вазотонический и

симпато-стимулирукщий эффект (Rivier, 2001). Такое действие основано на способности газа усиливать синтез кортиколиберинов в паравентрикулярной зоне и облегчать его высвобождение в капилляры срединного возвышения (Seo et al., 2002). Материальный субстрат этих эффектов, по нашим данным, организуют многочисленные NO-продуцирующие нейроны в кортикотропной зоне паравентрикулярного ядра и нервные волокна, формирующие сплошной пласт в стенке срединного возхвышения. В этих структурах эффективность генерации N0 коррелирует с длительностью болевого процесса.

В-третьих, самостоятельным вегето-сосудистым эффектом обладают многие пептиды, высвобождаемые клетками гипоталамуса непосредственно в кровеносное русло. К их числу относится вазопрессин, солоколизованный с NO-синтазой в большинстве эндокриноцитов эндокриноцитов (Arevalo et al., 1992, Sanchez et al., 1994), и ангиотензин-превращающий фермент, аналогичная локализация которого была продемонстрирована в настоящей работе. Оба этих вазопрессорных нейропептида оказывают стимулирующее влияние на продукцию оксида азота, находясь при этом под тормозным контролем с его стороны (Lee, Patel, 2003; Prado et al., 2003). Иизменение эндогенных NO-ергических процессов в нейроэндокриноцитах гипоталамуса, по нашим данным, создает дополнительные возможности для адекватной коррекции гемодинамических слвигов, сопровождающих болевое воздействие.

В-четвертых, гипоталамическая область имеет обширные реципрокные связи со многими структурами мозга, вовлеченными в регуляцию автономных функций. В сфере гипоталамической регуляции находятся вегетативные аспекты работы центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга. Известно, например, что разные отделы ЦСОВ, обладающие противоположными кардио-васкулярными эффектами, регулируются отдельными ядрами гипоталамуса (Snowball et al., 2000). Паравентрикулярное и супраоптическое ядра иннервируют "вазо-прессорные" регионы ЦСОВ -дорсо-латеральные его сегменты. В этом случае вазомоторные эффекты гипоталамуса опосредованы некоторой местной популяцией NO-ергических клеток, поскольку оказываются весьма чувствительными к действию ингибиторов NO-синтазы (Hall, Behbehani, 1997), а локальные инъекции NO в дорсо-латеральный сегмент сопровождаются системными гипертензивными ответами (Kubo et al., 1999).

Вентральные отделы переднего гипоталамуса и латеральное поле синаптически связаны с вазо-депрессорными зонами ЦСОВ (вентро-медиальный сегмент). Аппликации доноров NO в эти регионы ЦСОВ на фоне их гипоталамической стимуляции облегчают развитие гипотонии, а ингибиторы NO-синтазы, напротив, увеличивают тонус периферических сосудов (Hall, Behbehani, 1997). Следует отметить при этом, что эффекторное "внимание" нейронов центрального вещества среднего мозга адресовано не симпатическим и парасимпатическим ядрам, а клеткам так называемой баро-рефлексорной зоны латеральной ретикулярной формации продолговатого мозга (Aicher et al., 1994). В нашем исследовании было показано, что нитроксидергические нейроны дорсо- и вентро-латерального сегментов ЦСОВ

в мозге человека и экспериментальных животных претерпевают биохимические изменения в соответствии с динамикой болевого процесса.

Существенный вклад в регуляцию вегетативных процессов вносит серотонинергическая система мозга (Inokuchi et al., 1990; Shimpo et al., 1997). Взаимосвязь большого ядра шва со спинальными и бульбарными симпатическими центрами (Izzo et al., 1993; Martin et al., 1985) определяет его значение в модуляции сердечно-сосудистых реакций. Серотонин нейронального и внутрисосудистого происхождения способствует сокращению гладкомышечных элементов сосудов, с чем связывают его патогенетическую роль при развитии мигрени (Fozard, 1996). Вазомоторные эффекты ядер шва могут иметь самостоятельное происхождение, либо подчиняются активирующему влиянию со стороны гипоталамуса и ЦСОВ (Li et al., 2001).

Идентификация МАВРН-диафоразы\КО-синтазы в нейронах всех перечисленных образований мозга и динамический характер активности фермента при болевом стрессе, очерчивает роль NO-ергического механизма в развитии кардио-васкулярных реакций на болевое воздействие.

Анализ литературных данных позволяет заключить, что наблюдаемая в нашей работе экспрессия NADPH-диафоразы происходит в тех регионах гипоталамуса и среднего мозга, которые получают прямые или полисинаптические глутаматергические проекции от спинальных нейронов (МШап, 1999) и в условиях болевого стресса экспрессируют маркер прямой нейронной активации - c-fos-ген (Pacak, Palkovits, 2001). Можно считать поэтому, что специфические черты вегетативных проявлений болевого стресса обусловлены, в первую очередь, характером афферентации и работой определенных восходящих трактов, где мультипликатором глутаматергического сигнала выступает система синтеза NO. Этот вывод, основанный на результатах собственных и литературных данных, является доказательством тому, что механизмы NO-ергической регуляции болевой чувствительности имеют свою избирательность и специфичность не только по отношению к виду действующего раздражителя, но и по отношению к тем нейрохимическим механизмам, которые активируются при этом виде болевого воздействия.

Интегративная оценка динамики NO-ергических процессов в вегето-регуляторных центрах головного мозга при болевом воздействии позволяет нам условно выделить два периода, где направление нитроксидергических процессов в соответствующих центрах наиболее благоприятно для формирования вазопрессорных и вазодепрессорных реакций (рис. 3).

Острый период боли характеризуется, по нашим данным, выраженной активацией NO-синтазы в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра, тканевых элементах срединного возвышения и дорсо-латеральном сегменте ЦСОВ. В эндокриноцитах супраоптического и паравентрикулярного ядра, а также - в серотонинергических ядра в эти сроки NO-ергическая активность снижена, о чем свидетельствуют гисто- и биохимические показатели.

Данные литературы о дифференцированном характере влияний N0 на соответствующие нейронные популяции (Fozard, 1996; Li et al., 2001; Pacak, Palkovits, 2001; Rivier, 2001; Shimpo et al., 1997), позволяют спрогнозировать течение некоторых NO-зависимых нейромедиаторных событий в условиях острой фазы боли. В мелкоклеточных нейронах паравентрикулярной зоны NO активирует синтез и высвобождение кортикотропин-релизинг-гормона (рис. 3-1). Напротив, мобилизация выброса вазопрессина и ангиотензин-превращающего фермента происходит на фоне гипофункция NO-синтазы в эндокринных элементах гипоталамуса (рис. 3-2). Эти нейрохимические сдвиги имеют самостоятельное влияние на уровень кровяного давления по эндокринному или внутрисосудистому пути регуляции (рис. 3-3), а таже могут изменять течение нейрональных процессов в дорсо-латеральной зоне ЦСОВ (рис. 3-4).

Экспрессия NADPH-диафоразы в нейронах этого региона (рис. 3-5), сопутствующая мобилизация его ГАМК-ергических систем и опосредованное растормаживание баро-рецепторных нейронов продолговатого мозга (рис. 3-6) создает дополнительные возможности для развития гипертензивных реакций. Этому также содействует вызванное серотонином усиление тонуса мозговых и периферических сосудов, которое обусловлено ингибированием NOS и сопрояженной активацией синтеза серотонина в ядрах шва (рис. 3-7). Учитывая тот факт, что NADPH-диафораза маркирует здесь только серотонинергические клетки, можно предполагать, что обнаруженные нами нейро-вазальные контакты в области ядер шва сформированы именно серотонинергическими волокнами. При болевых реакциях их активность и плотность распределения на поверхности капилляров заметно возрастает. Следует отметить, что даже на периферическом уровне серотонин и оксид азота находятся в антагонистических взаимодействиях. Кардио-васкулярные эффекты серотонина опосредуются 5-НТ1 и 5-НТ2 типами рецепторов, расположенными в стенке кровеносных сосудов (Frishman et al., 1995). Их активация угнетает синтез NO эндотелиальными элементами сосудов и блокирует дилататорные реакции (Shimpo et al., 1997).

Изменение активности NADPH-диафоразы в нейронах сочетается с NO-ергической реакцией микрососудов в некоторых отделах головного мозга. Так, по нашим данным, в первые часы боли активность NO-синтетических процессов в микрокапиллярах коры имеет выраженную тенденцию к угнетению, а низкий периферический уровень нитратов еще более демонстративно свидетельствует о несостоятельности эндотелиальных систем NO-ергической вазодилатации (рис. 3-8).

Вторая фaзa NO-epгичecкиx сдвигов в указанных отделах головного мозга регистрируется примерно через 3 часа после начала болевого воздействия. Для нее характерна реверсия NO-ергического ответа в мелко- и крупноклеточных ядрах гипоталамуса, активация NADPH-диафоразы в вентро-латеральном сегменте ЦСОВ и индукция NO-синтазы в серотонинергических центрах. Основываясь на данных фармакологического . анализа нейромодуляторных свойств NO (Go et al., 1999; Kadekaro et al., 1997; Prado,

]ЧО-ергическая регуляция вегетативных адаптации при

Рис. 3. Предполагаемая схема ИО-ергической модуляции вегетативных адаптации при болевом срессе. Объяснения в тексте.

2003; Rivier, 2001), мы считаем, что эти сдвиги в совокупности формируют наиболее благоприятный фон для развития системных гипотонических реакций. В условиях сниженной продукции N0 в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра устраняется активирующее влияние критикотропного гормона (рис. 3-9), а экспрессия фермента в эндокринных нейроцитах гипоталамуса способствует блокаде синтеза вазопрессина, окситоцина и АПФ (рис. 3-10). В эти сроки активируется система синтеза оксида азота, и соответственно - активность глутаматергической нейропередачи в вентро-медиальном и латеральном гипоталамических ядрах, иннервирующих вентро-медиальный ("гипотензивный") сегмент ЦСОВ (рис. 3-11). Стимулирующее действие нисходящих и восходящих глутаматергических трактов приводит к тому, что в нервных клетках этого сегмента серого вещества происходит экспрессия NADPH-диафоразы в клетках, не обладавших ранее NO-ергической активностью (рис. 3-12). Указанные перестройки во взаимосвязанных отделах гипоталамуса и ЦСОВ обуславливают выраженный тормозной эффект на сосудодвигательные нейроны ретикулярной формации (рис. 3-13). Эти клетки одновременно иннервируются нейронами всех регионов ЦСОВ, но отвечают на их сигналы противоположным образом. Отчасти это связано с действием оксида азота, синаптические эффекты которого в вентро-латеральном сегменте стимулируют эфферентную активность его проекционных нейронов и в конечном итоге приводят к снижению кровяного давления (Wang, et al., 2001). В норме этот регион не имеет в своем составе нитроксидергических элементов; экспрессия NADPH-диафоразы (NO-синтазы) наблюдается здесь через 6 часов после начала болевого воздействия. Нельзя отрицать, что при при формировании хронических нейропатических болевых расстройств синтез NO может осуществляется с участием индуцибельной формы фермента, однако в течение первых суток мы не идентифицировали иммунореактивной i-NOS ни в одном из регионов центрального серого вещества среднего мозга.

NO-зависимые вегетативные процессы, протекающие с участием гипоталамуса и ЦСОВ, дополняются мощным ингибированием серотонинергической медиации, обусловленным в этот период боли индукцией NOS в клетках шва (рис. 3-14).

Изменение активности NADPH-диафоразы в нейронах вегето-модулирующих центров сочетается во вторую фазу боли с двигательной реакцией сосудов. Общепризнанным является тот факт, что ответы гладких миоцитов артериол находятся в прямом соответствии с активностью NO-синтазы (Dirnaglet al., 1993; Lauer et al., 2001; Vallance, Hingorani, 1999). Действительно, результаты наших исследований соответствуют этому правилу. На поздних стадиях болевого ответа плотность и гистохимическая активность капиллярных сетей в сомато-сенсорной и лимбической коре, а также уровень нитратов в периферической крови достоверно превышают контрольные показатели (рис. 3-15). В совокупности все эти нейрохимические сдвиги могут благоприятствовать формированию гипотонических вегетативных реакций.

Предложенная нами схема NO-ергической модуляции кардио-васкулярных сдвигов находится в согласии с данными эелектрофизиологических и реовазографических наблюдений других авторов (Вальдман, Игнатов, 1976; Erdos et al., 2003; Farad, Brian, 1994). По их данным острая фаза соматической боли, связанная с работой эпикритической нервной системы, сопровождается чаще всего гипертоническими системными сдвигами. В свою очередь, нейрональные пути, несущие информацию о протопатической боли (висцеральной и отсроченной соматической) прицельно активируют те мозговые центры, которые регулируют центральные и периферические вазодепрессорные механизмы, что в конечном итоге приводит к снижению уровня сердечно-сосудистой активности (Snowball et al., 2000). Совокупный анализ данных, полученных гистохимическими (плотность распределения NO-ергических капилляров в коре головного мозга, NO-ергическая активность клеток вегето-регуляторных центров) и биохимическими методами (уровень, стабильных метаболитов NO в крови) позволяет предполагать, что NO-ергические системы головного мозга в условиях болевого воздействия выступают не только участником специфических нейронных взаимоотношений, но и организуют метаболические адаптации за счет регуляции локального и системного кровотока.

NO-ергические механизмы регуляции эндогенной антиболевой системы

Выраженность болевого синдрома является совокупным эффектом ноцицептивного раздражения и активности эндогенной антиноцицептивной системы. Нейронные взаимодействия между входящими в ее состав нервными центрами, специфика их трансмиттерно-рецепторного оснащения и индивидуальные уровни порога активации определяют динамический характер антиболевой защиты, реализуемой как при эндогенной и стимуляционной аналгезии, так и в условиях морфинного обезболивания (Bodnar, 2000; Millan, 2002). Ядро антиноцицептивной системы образуют связи между миндалиной, гипоталамусом, околоводопроводным серым веществом среднего мозга и серотонинергическими нейронами каудальной группы шва. Последние рассматриваются в качестве конечного, эфферентного звена этой системы, так как образуют прямые связи с клетками. спинальных болевых ворот. Самостоятельные, серотонин-независимые пути, модулирующие на уровне спинного мозга пропускную способность болевых ворот, образуют норадренергические и холинергические ядра ствола, а также некоторые отделы гипоталамуса (Millan, 2002). Поведенческие, нейрофизиологические и нейрохимические исследования указывают на интенсивный, но, вместе с тем - избирательный и динамический характер эндогенной антиболевой защиты.

Интенсивное изучение NO-зависимых механизмов боли, проводимые в последнее время, поставили под сомнение однозначную, антиболевую направленность влияний эндогенных систем. Этому способствовала идентификация двойственных эффектов NO, вводимого в отдельные регионы

мозга. Оказалось, что в зависимости от стадии болевого процесса, локальные аппликации доноров нитроксида или агонистов NMDA-рецепторов в серотонинергическую область могут вызывать как угнетение болевых реакций, так и их облегчение (Kolesnikov et al., 1997; Sousa, Prado, 2002). Ha основе этих наблюдений была создана и активно развивается концепция о существовании эндогенной про-болевой системы (Coutincho et al., 2001; McNally, 1999; Millan, 2002; Urban, Gebhart, 1999).

Результаты нашего исследования позволяют охарактеризовать нейрохимические предпосылки, лежащие в основе динамической функциональной реорганизации систем эндогенного контроля боли. Было установлено, что основные ядра мозгового ствола, причастные к работе аналгетических систем, являются NO-ергическими. В составе дорсо-латерального сегмента ЦСОВ, латерального гипоталамического ядра и в каудальных ядрах шва доминирующая популяция нервных клеток способна синтезировать оксид азота. Особенностью их реакции на боль является отчетливая двух-фазная динамика; при этом на острые и тонические ноцицептивные влияния NO-ергические клетки разных участков антиболевой системы реагируют по-разному.

Анализируя полученные результаты и сопоставляя их с литературными данными, мы сформулировали модель динамической NO-зависимой регуляции эндогенной антиболевой системы (рис. 4). Здесь, как и в любой нейротрансмиттерной системе, изменение синтеза NO является, с одной стороны, следствием специфических событий, протекающих на самом нейроне и его рецепторной поверхности. С другой стороны, сдвиг NO-ергической продукции, даже в небольшом диапазоне концентраций, изменяет пространственную информацию в окружающей нервной ткани, поэтому может рассматриваться как причина последующих трансмиттерных и метаболических изменений.

Решающее влияние на характер NO-ергической реакции отдельных ядер ствола имеет направление и интенсивность восходящего глутаматергического сигнала. Поэтому в острую фазу боли, связанную с работой Ad-афферентных волокон (рис. 4-1) и их ГАМК-ергических мишеней в продолговатом мозге (рис. 4-2), заметно угнетается нитроксидергическая активность большинства нейронов шва (рис. 4-3). В этот период угнетение NO-синтетических процессов в серотонинергических клетках шва благоприятно влияет на активность триптофан-гидроксилазы и способствует наработке трансмиттерного серотонина (Fossier et al., 1999). Параллельно с этим отмечается постепенное нарастание активности NO-синтазы в нейронах дорсо-латерального сегмента околоводопроводного серого вещества (рис. 4-4) и латерального гипоталамического ядра (рис. 4-5). Подобный порядок событий, по нашему мнению, является определяющим для эффективной реализации нисходящего серотонин-опосредованного анлгетического механизма (рис. 4-6).

Рис. 4. Предполагаемая схема NO-ергической модуляции эндогенных механизмов антиболевой защиты. Объяснения в тексту

В отсроченный период болевого ответа (с 1 по 6 час) ситуация принимает иной оборот. Здесь на первый план выступают процессы активации синтеза N0 в серотонинергической зоне мозга (рис. 4-9). В основе реверсии биохимического ответа нейронов шва лежат процессы нейропластических модификаций их афферентных систем. Известно, что происходящая в этот период сенситизация спинальных ноцицептивных систем значительно увеличивает пропускную способность "болевых ворот" (рис. 4-7), что ведет к перераспределению возбудительных и тормознх влияний в структуре афферентных потоков к нейронам шва (рис. 4-8). За счет прогрессивного увеличесния NO-ергической активности в каудальных ядрах шва и появления здесь клеток с индуцибельным типом фермента, создаются оптимальные условия для трансформации серотонинергических нисходящих влияний. Это связано, с одной стороны, с сопряженным угнетением синтеза серотонина (Fossier et al., 1999) и снижением его ингибиторных влияний на уровне задних рогов спинного мозга. С другой стороны, NO-зависимые нейропластические перестройки в системе глутаматергической нейропередачи могут обеспечивать бесперебойную взаимо-усиливающую циркуляцию возбуждающего сигнала в спино-бульбо-спинальной системе. Такие изменения в эффекторном серотонинергическом звене аналгетической системы мозга определяют новое качественное состояние эндогенных защитных систем, формируя морфо-химический базис для реализации про-болевой стратегии (рис. 4-10). Это вытекает из функциональных свойств нейронов каудальных ядер шва, нитроксидергическая модуляция которых подтверждена эффектами доноров NO (Urban et al., 1999) и ингибиторов NOS (Countinho et al., 1998).

Наблюдаемое в ядрах шва возрастание активности NO-синтазы, тем не менее, не отрицает полностью возможности реализации эндогенной аналгетической стратегии, развитие которой привлекает иные сигнальные механизмы и нейрональные сети. Эти альтернативные защитные механизмы основаны на активности норадренергических, ГАМК- и холинергических центров продолговатого и среднего мозга, которые формируют одноименные медиаторные компонентны эндогенной аналгезии (Millan, 2002).

Экспрессия NADPH-d\NOS в вентро- и дорсо-латеральных зонах ЦСОВ (рис. 4-11) является свидетельством активации его антиболевых механизмов, выраженность которых напрямую зависит от локальной концентрации оксида азота (Hall, Behbehani, 1998; Wang et al., 2001).

В фазу тонической боли в регионе голубоватого пятна заметно возрастет плотность NADPH-d-позитивных волокон (рис. 4-12). Норадренергические нейроны, не обладая собственной системой синтеза NO, весьма чувствительны к действию NO-ергических агентов (Sinner et a., 2001; Xu et al., 1998). Нельзя исключать, что активность норадренергических нейронов locus coeruleus возрастает под влиянием оксида азота нейропильного происхождения. NO-содержащие транзитные или конвергентные волокна приходят сюда от каудальных и ростральных ядер шва, ЦСОВ, гипоталамуса и от соседних

тегментальных ядер, экспрессирующих в этот период высокий уровень гисто-и биохимической активности фермента.

Гипоталамическая модуляция аналгетической системы задействует множество нейротрансмиттерных, нейропептидных и гормональных путей (Ярушкина, Богданов, 1998; Burlet et al., 2002; Lariviere, Melzak, 2000; Lopez et al., 1991). NO-зависимые механизмы их реализации связывают с латеральным, вентро-медиальным, паравентрикулярным ядрами и медиальным преоптическим регионом, где в отсроченный период боли мы наблюдали заметную активацию NO-синтазы (рис. 4-13).

Изменение NO-ергической активности в структурах гипоталамуса, ЦСОВ и голубоватого пятна обуславливает развитие самостоятельных, серотонин-независимых форм эндогенной аналгезии (рис. 4-14), которая в при действии длительных болевых факторов развивается параллельно с про-ноцицептивными серотонинергическими влияниями из ядер каудальной группы шва (рис. 4-10).

За счет работы мультимедиаторных защитных механизмов болевая чувствительность превращается в динамический процесс, адаптивно меняющийся в зависимости от факторов внешней и внутренней среды (Bodnar, 2000; Millan, 2002). Результаты проведенного нами исследования позволяют сделать вывод, что в структуре антиболевой системы NO-ергический сигнал выполняет интегрирующую роль, обеспечивая гетерогенное влияние на активность анти- и про-ноцицептивных систем.

Значение NO-ергического феномена широко обсуждается в связи с изучением свойств принципиально новой и мало изученной группы фармакологических препаратов - так называемых биполярных аналгетиков, целенаправленно влияющих на уровень эндогенной продукции N0 (Janero, 2000; Sousa, Prado, 2001; Su et al., 2003). Эти вещества, с одной стороны, уменьшают выраженность болевого синдрома и связанных с ним вегетативных расстройств, приводящих к развитию болевого шока. С другой стороны, препараты этого ряда способны потенцировать болеутоляющий эффект опиатных аналгетиков, препятствовать нарастанию наркотической зависимости и купировать проявления синдрома отмены. Эти данные очерчивают значение NO-ергического сигнала для оптимальной реализации морфинной аналгезии, хотя молекулярные механизмы, лежащие в основе этих событий, остаются невыясненными.

Одним из морфо-химических субстратов, на уровне которого осуществляется взаимодействие опиатной и NO-ергической систем, является серотонинергическая зона мозга. На это указывают следующие наши наблюдения: 1. Однократное введение морфина интактным животным угнетает NO-ергическую активность большинства нейронов шва; 2. Инактивация NO-синтазы неодинаково выражена в различных ядрах шва, что коррелирует с данными о неравномерном распределении т-опиатных рецепторов (Ding et al., 1995); 3. Нитроксидергические сдвиги в нейронах шва зависят от дозы вводимого препарата, а применение антагониста опиатов

налоксона восстанавливает NO-ергическую функцию нейронов шва; 4. На фоне действия болевого фактора влияние ингибиторов NOS (N-монометил-L-аргинина; L-NAME) и морфина синергично - оба препарата снижают активность NOS в серотонинергических нейронах. Полученные данные указывают, что аналгетики опиоидного ряда, прямо или опосредованно, изменяют характер NO-синтетических процессов в серотонинергических нейронах и формируют в них специфические перестройки, корректирующие конечный антиболевой эффект опиатов. При этом в регионе шва L-NAME и морфин воздействуют на одну и ту же мишень—уменьшают активность NOS в нейронах шва -, что позволяет включить серотонинергический компонент в известные механизмы потенцирующего влияния ингибиторов NOS на течение опиатной аналгезии (Bhargava et al., 1995, 1998).

Формирование толерантности к аналгетическому эффекту морфина становление наркотической зависимости также определяется N0-синтетической активностью серотонинергических нейронов, поскольку хроническое введение опиатов в нарастающих дозировках и развитие спонтанной и налоксон-вызванной отмены сопровождается у экспериментальных животных значительной экспрессией нейрональной NOS и, соответственно, снижением аналгетических свойств серотониновой медиации.

Наряду со специфическим влиянием на соответствующие типы опиатных рецепторов, морфин активно включается в партитуру других медиаторных систем, что ведет к перераспределению возбудительных и тормозных потоков в мозге. Наиболее "уязвимыми" из них оказываются норадренергические нейроны голубоватого пятна и интернейроны корковых формаций. Основные вегето-эмоциональные и когнитивные проявления синдрома отмены связывают с патохимической реорганизацией внутриклеточных сигнальных каскадов именно в этих центрах (Nestler, Aghajanian, 1997).

Наблюдая изменения нейрохимических свойств норадренергических нейронов locus coeruleus, мы обнаружили в них индуцибельную форму N0-синтазы и высокую активность NADPH-диафоразы как у животных, длительно получающих морфин, так и у людей, погибших вследствие интоксикации опиатами. Причины, ведущие к столь значительным внутриклеточным перестройкам, в доступной нам литературе не находят объяснения. Однако ключевая роль норадренергической медиации в формировании вегетативного дисбаланса при наркомании (Мао, 1999; Singewald, Philippu, 1998) и выраженная зависимость этих процессов от воздействия ингибиторов NO-синтазы (Janero, 2000, Lanier et al., 2002) позволяют нам считать индукцию NOS в норадренергических клетках важным патогенетическим фактором развития опийной зависимости.

Наркотическая зависимость представляет собой мультимодальный феномен с повреждением на уровне метаболических процессов, реорганизацией трансмиттерно-рецепторных взаимоотношений и грубыми

морфологическими изменениями нервной ткани (Babey et ah, 1994; Bhargava et al., 1995; Cuella et al., 2000; Leza et al., 1996). Сопутствующие наркомании патоморфологические перестройки наиболее демонстративно представлены в коре головного мозга людей, погибших от интоксикации опиатами. Здесь с помощью гистохимического метода на NADPH-диафоразу выявляются высокоактивные нейропильные структуры нетипичной формы и локализации. Они формируют компактные, варикозные, корзинчатые сплетения вокруг NO-негативных интернейронов верхних слоев коры. В зависимости от своей структуры, гистохимической активности и морфологического состояния "погруженных" в них клеток, эти аберрантные волокна были подразделены нами на три типа, отражающие последовательные этапы NO-зависимого нейродегенеративного процесса. Чрезмерная продукция N0 является существенным фактором в процессах повреждения и гибели нейронов, что связано с повышением освобождения возбуждающих аминокислот и высокотоксичных перекисных соединений, химической модификацией белков, угнетением клеточного метаболизма и повреждением ДНК (Викторов, 2000; Раевский и соавт., 2000; Ammon et al., 2003). В большинстве случаев в сферу влияния NO-ергических нервных сплетений попадают непирамидные интернейроны поясной и гиппокампальной коры, чем, по-видимому, объясняется недостаток торможения, наблюдаемый на высоте развития абстинентного синдрома (Курбат, Лелевич, 2002; Williams et al., 2001).

Токсическое действие опиатов распространяется и на клетки пирамидной природы, которые в мозге наркоманов обладают отчетливыми признаками индукции NO-синтазы. Об этом свидетельствуют результаты гисто- и иммуноцитохимического картирования, а также данные, полученные методом ПЦР-диагностики м-РНК индуцибельной NOS. Биологический смысл такого типа внутриклеточной адаптации принципальных нейронов коры может расцениваться двояко. Можно полагать, что этот процесс является следствием предшествующих компенсаторных сдвигов, которые сформировались в период нарастания толерантности к опиатам и были спровоцированы мощным угнетением глутаматергической нейротрансмиссии в коре (Yang et al., 2004).

Не исключено также, что экспрессия фермента в пирамидных нейронах является своеобразным механизмом их защиты от токсического действия возбуждающей нейротрансмиссии, активность которой в условиях редуцированного торможения значительно возрастает. Известно, например, что в условиях длительной гипоксии, дегенерации и токсических влияний NO-ергические элементы мозга остаются наиболее резистентными (Bonthius et al., 2003).

Таким образом, цитотоксические и нейропротективные эффекты NO можно рассматривать как взаимосвязанные элементы одного действия. Хотя предельная концентрация оксида азота, определяющая границу смещения его эффекторного действия, остается неизвестной, токсическое влияние газа

всегда сопутствуют развитию NO-опосредованных механизмов защиты (Охотин и соавт., 2003). Разбалансировка этих процессов имеет патофизиологическое значение в ЦНС при нарастании опийной толерантности и развитии синдрома отмены. Нерегулируемая гиперпродукция N0 в этой ситуации может выступать в качестве индуктора патологических форм нейропластичности, нарушать равновесие между тормозными и возбуждающими механизмами и в итоге приводить к формированию стойких очагов перевозбуждения (Nestler, Aghajanian, 1997; Williams et al., 2001). Баланс физиологических и патологических эффектов NO в мозге определяется предшествующей или сопутствующей пространственной информацией, поэтому NO-ергические нейроны могут служить эффективной моделью для исследования обезболивающего,

аддиктивного и нейродегенеративного эффекта опиатных аналгетиков.

* * *

Настоящее исследование посвящено изучению супраспинальных NO-ергических механизмов формирования боли и обезболивания у животных и человека. Результаты и выводы работы указывают на прямую связь между уровнем активности NO-синтазы в различных центрах головного мозга и стадией болевого процесса. В каждом из отделов центральной нервной системы нитроксидергические события разворачиваются по собственному сценарию, что имеет особый биологический смысл для общей интегральной реакции организма на болевое воздействие. Динамический характер реакции NO-ергической системы отражают ее адаптивный характер, позволяя организму, испытывающему боль, максимально приспосабливаться к этому состоянию, координируя нейротрансмиттерные процессы в различных компонентах болевой реакции. Значение NO-ергического фактора в регуляции вегетативных, антиболевых, поведенческих и эмоциональных проявлений боли еще предстоит выяснить, однако нельзя отрицать, что изменения синтеза NO в подкорковых и корковых центрах обеспечивает биохимическую основу комплексного и дифференцированного защитного ответа, адекватного болевой ситуации.

Вполне возможно, что представленные в нашей работе обобщающие схемы динамической NO-ергической модуляции отдельных компонентов болевой реакции, в некоторой мере являются неполными и при дальнейшей детальной их разработке могут быть скорректированы значительным числом новых и неожиданных деталей. Мы согласны также с тем, что NO-ергическая нейротрансмиссия является лишь одним из звеньев сложной мультимедиаторной стратегии целостной реакции организма на боль. Вместе с тем, полученные в нашем исследовании данные позволяют заключить, что NO-ергический путь сигнализации, будучи мощным механизмом, обеспечивающим согласование нейротрансмиттерных и метаболических процессов в норме и при развитии патологических состояний, может считаться удобной и эффективной мишенью для борьбы с различными вариантами боли.

выводы

1. В головном мозге NADPH-диафораза (NO-синтаза) локализуется в нейронах ядер шва, тонкого и клиновидного ядер, центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга, черной субстанции, вентрального тегментального поля, ядрах покрышки мозга (дорсо-латеральном и ножко-мостовом), ядер гипоталамуса, таламуса и базального переднего мозга, сомато-сенсорной и лимбической коры.

2. NO-продуцирующие клетки головного мозга химически гетерогенны: в ядрах шва NO-синтаза со-локализована с серотонином; на уровне покрышковых ядер и в области базального переднего мозга N0 синтезируют холинергические нейроны; NO-ергические эндокриноциты супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса экспрессируют ангиотензин-превращающий фермент; топографические и морфологические характеристики NADPH-d-позитивных клеток в ядрах задних канатиков, центральном сером веществе среднего мозга, черной субстанции и вентральном тегментальном поле, таламусе и коре позволяют причислить их к категории тормозных ГАМК-ергических интернейронов. Оксид азота не синтезируется в норадренергических и дофаминергических нейронах.

3. В исследованных отделах головного мозга экспериментальных животных и человека характер NO-ергической активности коррелирует со степенью вовлеченности нервного центра в процессы модуляции болевого сигнала, зависит от длительности болевой экспозиции и обусловлен характером афферентно-эфферентного устройства его нервных связей. В разных нейротрансмиттерных и функциональных системах NO-ергическая активность имеет индивидуальный динамический рисунок.

4. У крыс в ядрах, осуществляющих перцептуально-дискриминативный анализ болевого импульса, регистрируются однонаправленные нейрохимические перестройки:

• в тонком ядре при болевом воздействии происходит отсроченный, билатеральный и непродолжительный (4-5 часов) всплеск нитроксидергической активности. Последовательная активация N0-ергических структур ипси- и контралатеральной стороны определяется характером двойственной иннервации ядра;

• в вентро-базальных отделах таламуса регистрируется уплотнение NO-ергического нейропильного компонента на стороне, противоположной повреждению. Активация нейронного пула NADРН-диафоразы наблюдается в ретикулярном таламическом ядре;

• в корковых регионах мозга крыс изменения наиболее выражены через 6 часов болевой экспозиции и связаны с увеличением числа МО-позитивных нейронов и длины МО-ергического капиллярного русла.

5. Интегративная оценка динамики МО-ергических процессов в ядрах, участвующих в регуляции вегетативных адаптации, позволяет условно выделить два периода.

• Первая фаза болевого ответа характеризуется гиперактивностью N 0 -синтазы в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра гипоталамуса и тканевых элементах срединного возвышения, заметным угнетением показателей гистохимической реакции в эндокриноцитах супраоптического и паравентрикулярного ядер и умеренной активацией нейронов дорсо-латерального сегмента центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга;

• Вторая фаза МО-ергических сдвигов регистрируется через 3 часа после начала болевого воздействия - для нее характерна реверсия N0-ергического ответа в мелко- и крупноклеточных ядрах гипоталамуса и выраженная экспрессия фермента в дорсо- и вентро-латеральных сегментах центрального серого вещества среднего мозга.

6. В аналгетических центрах головного мозга крыс изменение синтеза N0 имеет динамическое развитие:

• острый период боли связан со снижением уровня МЛОРИ-диафоразы серотонинергических ядрах шва крыс, умеренной активацией синтеза N0 в центральных структурах среднего мозга, латеральном ядре гипоталамуса и может формировать благоприятные внутриклеточные условия для запуска нисходящей серотонинергической аналгезии;

• в отсроченный период нарастание N0-ергической активности в нейронах шва является механизмом, лимитирующим синтез серотонина, что определяет про-ноцицептивный этап нисходящей серотонинергической модуляции боли;

• заметная активация NADPH-диафоразы в нейронах вентро-медиального, латерального гипоталамических ядер, дорсо- и вентро-латерального сегментов околоводопроводного вещества среднего мозга, а также - экспрессия фермента в афферентных системах голубоватого пятна обуславливает в фазу тонической боли серотонин-независимые аналгетические механизмы.'

7. У крыс регуляция "агошаГ-систем протекает без участия N0-ергического механизма - болевое воздействие приводит к значительному снижению числа и активности N0-продуцирующих элементов в

холинергических зонах мозга (дорсо-латеральном и ножко-мостовом ядрах покрышки, структурах базального переднего мозга).

8. В большинстве исследованных образований мозга человека и экспериментальных животных топография, морфологические характеристики и показатели гистохимической активности КАОРН-ё-позитивных нейронов совпадают, однако характер связанных с болью нитроксидергических перестроек в мозге человека имеет ряд особенностей:

• в тонком ядре доминирующим типом нейрохимического ответа на болевое повреждение является изменение КО-ергической активности волокон и нейроглиальных элементов заднего канатика;

• в таламусе формируются нейроперестройки двоякого рода: в неспецифических отделах и в ретикулярном ядре более выражены изменения со стороны КО-ергических нейронов, а в вентро-базальных ядрах изменения затрагивают их нейропильный компонент;

• в сомато-сенсорной и лимбической коре на первый план выступают изменения КО-ергической активности нейроглиоцитов; количество и активность КАОРН-ё-позитивных нейронов достоверно не изменяются;

• развитие болевого шока у человека сопровождается экспрессией КАБРН-диафоразы в нейронах мелкоклеточной и эндокринной зоны паравентрикулярного ядра, в локальных микрососудах и волокнах гипоталамо-гипофизарного тракта;

• у людей, погибших в результате травматического шока экспрессия КАОРН-диафоразы происходит только в дорсо-латеральном сегменте ЦСОВ;

• во всех ядрах шва регистрируется стойкое угнетение активности К 0 -синтазы.

9. В большинстве исследованных ядер человека и крыс изменение активности КО-синтазы связано с нейрональным типом фермента: исключение составляет а-часть парагигантоклеточной ретикулярной формации, где на фоне болевого воспаления регистрируется индуцибельная КО-синтаза.

10. Течение болевого процесса изменяет биохимическую активность КО-синтазы в регионах головного мозга человека и животных и сопровождается параллельными сдвигами концентрации нитратов и нитритов в периферической крови.

11. Антиболевой эффект опиатных аналгетиков связан с активностью КО-ергических систем мозга:

• однократное воздействие препарата на фоне болевого синдрома или у интактных животных угнетает NO-синтетические процессы в серотонинергических ядрах шва крыс;

• эти влияния зависят от дозы вводимого препарата, коррелируют с уровнем опиатных рецепторов и чувствительны к действию антагонистов опиатов - налоксона.

12. Аддиктивные и нейротоксические эффекты опиатов реализуются при содействии NO-ергической системы:

• нарастание толерантности и развитие спонтанного или вызванного налоксоном синдрома отмены сопровождаются экспрессией NADPH-диафоразы в серотонинергических ядрах крыс;

• при интоксикации опиатами происходит индукция NO-синтазы в норадренергических нейронах голубоватого пятна у человека;

• в коре головного мозга наркоманов формируются высоко-активные аберрантные сплетения NO-ергических волокон, которые предопределяют развитие нейродеструктивных изменений. Избыточное образование оксида азота за счет активности индуцибельной NO-синтазы в пирамидных нейронах коры головного мозга наркоманов подтверждается иммуноцитохимическими и генетическими методами.

13.На основании полученных данных сформировано представление о том, что в реализации системной болевой реакции у животных и человека участвуют NO-ергические механизмы подкорковых и корковых центров головного мозга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Охотин В.Е., Калиниченко СП, Дюйзен И.В., Сулимов Г.Ю. ГАМК-ергические корзинчато-пирамидная и корзинчато-гранулярная системы гиппокампальной формации кошки // Бюллетень экспер. биол. мед. 1995. N 4. с 116-117.

2. Дюйзен И.В., Охотин В.Е., Калиниченко С.Г., Мотавктн П.А. Нейрохимическая характеристика нейронов гиппокампальной формации человека//Морфология. 1996. ТЛЮ. № 6, с. 49-54.

3. Shumayov V, Selyuk Т., Kalinichenko S., Dyuizen I., Balashova Т., Bogdanov S. Nitrinergic function of pseudounipolar neurons and their role in the maintenance ofthe antinociceptive effect // The IV International symposium of medical exchange. Japan. Sapporo. 1997. p. 180.

4. Shumayov V., Balashova Т., Dyuizen I. Aspartataminotrasferase of the must cells during morphine epidural anaesthesia // The V International symposium of medical exchange. Japan. Sapporo. 1998. p. 179.

5. Охотин В.Е., Дюйзен И.В. Взаимодействие ноцицептивной и N0-ергической систем: концептуальные аспекты // "Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности". Минск. 1998. с. 57-60.

6. Dyuizen, V. Okhotin, S.Kalinichenko, P. Motavkin. Neurochemical characteristics of neurons of the human hippocampal formation // Neuroscience and Behavioral Physiology 1998. Vol. 23, № 1. pp. 94-99.

7. Шуматов В.Б., Балашова Т.Ю., Дюйзен И.В. Реактивность N0-ергических нейронов спинномозговых узлов при травме // Морфология 1998 Т. 113,№3с. 135.

8. Шуматов В.Б., Балашова Т.Ю., Дюйзен И.В. Влияние боли и эпидуральной аналгезии морфином на некоторые показатели гомеостаза // Дальневост. мед. журнал 1998, № 3. с. 47-48.

9. Шуматов В.Б.,- Балашова Т.Ю., Дюйзен И.В. Реактивность N0-ергических нейронов спинномозговых узлов в условиях аналгезии морфином // VI съезд анестезиологов, реаниматологов. Москва. 1998. с. 52.

10. Дюйзен И.В., Калиниченко С.Г., Охотин В.Е., Мотавкин П.А. Нитроксидергические нейроны белого вещества гиппокампальной формации человека//Морфология. 1998. Т.113. № 1. с. 47-50.

11. Шерстюк Б.В., Гарцман Т.Ю., Курбаций Р.А., Дюйзен И.В. Патоморфология нитроксидергической системы мозга при интоксикации опиатами //11 всесоюзный съезд судебных медиков. Москва-Астрахань. 2000. с. 341-342.

12. Гарцман Т.Ю., Дюйзен И.В., Шерстюк Б.В. Изменение активности N0-ергической системы мозга при интоксикации героином // I Тихоокеанская научно-пракстическая конференция с международным участием "Актуальные проблемы экспериментально, профилактической и клинической медицины" Владивосток. 2000. с. 42.

13. Гарцман Т.Ю., Шерстюк Б.В., Дюйзен И.В. Изменение баланса N0-ергической системы мозга при некоторых патологических состояниях // Тихоокеанский медицинский журнал. 2000. № 4 с. 87.

14. Dyuizen I.V., Shorin V.V. Time course ofthe changes in NADPH-diaphorase activity in rat dorsal raphe nucleus following chronic morphine administration and withdrawal // Central European congress of neurobiology, Krakow, Poland. 2001. p. 102.

15. Дюйзен И.В., Мотавкин П.А., Шорин В.В. Динамика активности NADPH-диафоразы в нейронах шва при хроническом введении опиатов // Бюллетень экспер. биол. мед. 2001. Т.9. с. 334-337.

16. Гарцман Т.Ю., Дюйзен И.В. Нитроксидергические нейроны ядра солитарного тракта человека // "Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере". Сургут. 2002. Т.2. с. 48-52.

17. Дюйзен И.В. NO-ергическая функция нейронов околоводопроводного серого вещества при боли и системном введении опиатов // "Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере". Сургут. 2002. Т.2. с. 267-270.

18. Дюйзен И.В., Деридович И.И., Курбацкий Р.А., Шорин В.В. N0-ергические нейроны ядер шва мозга крысы в норме и при системном введении опиатов // Морфология 2003. Т. 123, №2. стр. 24-29.

19. Дюйзен И.В., Дирлам Г.Г., Жилков Д.М., Дордус Л.Д. NADPH-диафораза в головном мозге человека при острой алкогольной интоксикации // "овременные вопросы судебной медицины". Владивосток. 2001. стр. 227-231.

20. Дюйзен И.В. Нитроксидергические нейроны тонкого ядра мозга крысы при боли // Бюллетень экспер. биол. мед. 2003. Т. 135, №2. стр.215-218.

21. Дюйзен И.В. NO-ергическая функция некоторых регионов мозга при боли и введении опиатов //IV Международная конференция по функциональной нейроморфологии "Колосовские чтения" . Санкт-

' Петербург. 2002. с. 103.

22.' Dyuizen I. Effect of single and chronic morphine administration on NADPH-diaphorase activity in some rat brain regions. X International congress of the Czech and Slovak neurochemical society. Slovakia, Casta, 2002. p. 29.

23. Дюйзен И.В., Мотавкин П.А. Нитроксидергические механизмы формирования боли // Дальневосточный медицинский журнал. 2003. №2, с. 11-16.

24. Коновко О.О., Дюйзен И.В., Мотавкин П.А Этанол-окисляющие и NO-синтезирующие ферменты в моноаминергических ядрах мозга человека // Бюллетень экспер. биол. мед. 2003. Т. 136. № 8, стр.231-234.

25. Kozhemyako V.B., Dirlam G.G., Smolina I.V., Dyuizen I., Shkryl Y., Rasskazov VA Inducible NOS mRNA in postmortem brain // XX Congress Int. Soc. Forensic Genetics. 2003. Bodreaux-Arcachon. France. E-18.

26. Kozhemyako V.B., Dirlam G.G., Smolina I.V., Dyuizen I., Shkryl Y., Rasskazov VA Features of expression of iNOS mRNA in postmortem brain // XIX Congress Int. Acad. Legal Medicine. 2003. Milan. Italy, p. 243.

27. Коновко О.О., Морозов Ю.Е., Калиниченко СП, Дюйзен И.В., Мотавкин П.А. Индукция NO-синтазы и ацедпльдегид-дегидрогеназы в нейронах коры мозжечка человека при хронической алкогольной интоксикации // Бюллетень экспер. биол. мед. 2004. Т. 137. №2, стр. 338-341.

28. Калиниченко СП, Дудина Ю.В., Дюйзен И.В., Мотавкин П.А. Индукция NO-синтазы и глиального кислого фибриллярного белка в астроцитах височной коры крыс с аудиогенной эпилептиформной реакцией // Морфология. 2004. Т. 125. №3. с. 165-173.

29. Пущина Е.В., Дюйзен И.В. Структура и нейрохимические особенности ядер шва костистых рыб // Морфология. 2004. Т. 124. №2. с. 32-37.

30. Хрулев СВ., Дюйзен И.В. Солокализация серотонина и NO-синтазы в нейронах подкоркового белого вещества мозга человека // Дальневосточный медицинский журнал. 2004. N 2. с.23-26

ДЮЙЗЕН Инесса Валерьевна

ЗНАЧЕНИЕ ОКСИДА АЗОТА В МЕХАНИЗМАХ РАЗВИТИЯ БОЛИ

Автореферат

Лицензия ПЛД № 63-19 от 02.12.1999 г. Зак. № 50и. Формат 60x84 '/„. Усл. и.л. 1,0. Тираж 100 экз. Подписано в печать 9.09.2004 г. Печать офсетная с оригинала заказчика.

Отпечатано в типографии ОАО "ДАЛЬПРИБОР" 690105, г. Владивосток, ул. Бородинская, 46/50, тел. 32-70-49 (32-44)

m 77 2 1

PHB PyCCKHÎÎ (j)OHA

2005-4 14841

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Дюйзен, Инесса Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. боль как интегративная реакция нервной системы. основные классификации и современные теории боли.

1.2. Общая характеристика компонентов болевой реакции.

1.2.1. Системы перцептуалъно-дискриминативного анализа боли.

1.2.2. Модуляция ноцицептивных процессов нисходящими тормозными и облегчающими влияниями.

1.2.3. Значение "arousal" в интегративной болевой реакции организма.

1.2.4. Роль гипоталамуса в регуляции болевого стресса.

1.3. Объемная NO-ергическая нейропередача как способ организации межнейронных связей.

1.4. Нитроксидергические механизмы и болевая нейропередача.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Характеристика экспериментального материала.

Гистохимическое выявление активности NADPH-диафоразы.

Иммуноцитохимические методы исследования.

Техника гистохимического выявления ХАТ.

Общеморфологические методы.

Биохимическое определение активности NO-синтазы.

Спектрофотометрический метод определения нитрат- и нитрит-ионов в периферической крови.

Определение м-РНК индуцибельной NO-синтазы.

Количественная обработка данных.

ГЛАВА 3. АКТИВНОСТЬ NO-СИНТАЗЫ В СТРУКТУРАХ ПЕРЦЕПТУАЛЬНО-ДИСКРИМИНАТИВНОГО АНАЛИЗА БОЛИ.

3.1. Ядра задних канатиков.

3.2. Таламус.

ГЛАВА 4. NO В МОНОАМИНЕРГИЧЕСКИХ ЯДРАХ МОЗГА В НОРМЕ И ПРИ БОЛЕВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ.

4.1. Серотонинергические ядра шва.

4.2. Норадренергические структуры.

4.3. дофаминергические центры мозга.

ГЛАВА 5. NO В ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ НЕЙРОНАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА В НОРМЕ И ПРИ БОЛИ.

ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА NO-ЕРГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ГИПОТАЛАМУСА В НОРМЕ И ПРИ БОЛЕВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ.

6.1. перивентрикулярный регион гипоталамуса и NO-зависимая регуляция стресс-реализующих механизмов.

6.2. Срединное возвышение и значение его NO-ергических систем в ] регуляции болевой стресс-реакции.

6.3. NO-ергическая функция эндокринных ядер гипоталамуса в условиях болевого стресса.

6.4. NO-ергические перестройки в "аналгетических" зонах гипоталамуса

ГЛАВА 7. ЦЕНТРАЛЬНОЕ СЕРОЕ ОКОЛОВОДОПРОВОДНОЕ ВЕЩЕСТВО СРЕДНЕГО МОЗГА КАК ИНТЕГРАТОР ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ БОЛЕВОЙ РЕАКЦИИ.

ГЛАВА 8. NO-ЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ КОРЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА В НОРМЕ И ПРИ БОЛЕВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ.

ГЛАВА 9. БИОХИМИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ NO-СИНТАЗЫ И NO-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕМОЦИРКУЛЯЦИИ В НОРМЕ И ПРИ БОЛЕВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.

Активность NOS в регионах головного мозга крыс при экспериментальных болевых воздействиях.

Уровень метаболитов оксида в периферической крови как отралсение NOергической активности эндотелиальных клеток.

NO-синтаза внутргшозговых сосудов в норме и при болевых реакциях.

ГЛАВА 10. ВЛИЯНИЕ ОПИАТОВ НА СИНТЕЗ ОКСИДА АЗОТА В НЕКОТОРЫХ СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА.

9.1. Ядра шва.

9.2. Голубоватое пятно.

9.3. Кора.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Значение оксида азота в механизмах развития боли"

Актуальность проблемы. Боль, как непременный спутник болезней человека, на протяжении всей истории борьбы за здоровье являлась и остается центральной проблемой теоретической и практической медицины. Представления о формировании болевых сигналов, их трансляции и превращении в ощущения в связи с достижениями нейрохимии и физиологии мозга существенно изменились. Новое направление в понимании боли стало формироваться благодаря открытию оксида азота, его участию в ноцицептивных восприятиях и взаимодействию этой молекулы с пептидами и медиаторами, традиционно рассматриваемыми как агенты, реализующие боль (Aley et al., 1998; Millan, 1999, 2002).

Ощущение, проведение и интеграция болевого сигнала обеспечивается системой пространственно распределенных центральных структур, имеющих многоуровневую организацию. Восходящие из спинного мозга болевые (ноцицептивные) импульсы активируют многочисленные мозговые центры, совокупная работа которых определяет целостную реакцию организма на боль. В этой системе оксид азота (N0) выступает в роли интегративного звена, модулирующего деятельность различных нейромедиаторных систем, и как посредник в регуляции мозговой гемодинамики (Дюйзен и соавт., 1998; Estrada, DeFelipe, 1998; Faraci, Brian 1994; Jones et al., 1999).

В последние десятилетия работы, посвященные исследованию роли N0 в регуляции боли, ведутся достаточно интенсивно во всем мире. Использование в эксперименте предшественников синтеза N0 или активация глутаматной нейропередачи изменяет функциональное состояние болевого анализатора (Дюйзен, 2002; Aley et al., 1998; Coutinho et al., 2001), активирует защитные резервы, либо, напротив, провоцирует дисметаболические процессы в нервной ткани, приводя к гибели нейронов (Викторов, 2000; Раевский и соавт., 2000; Golde et al., 2002; Iravani et al., 2002). В то же время торможение NO-зависимых сигнальных путей создает наиболее оптимальные условия для проведения лекарственного обезболивания (Babey et al., 1994; Furst, 1999; Leza et al., 1996;

Мао, 1999). Эти свойства нитроксидергической трансмиссии определили реальные предпосылки для изыскания новых методов фармакологической коррекции болевых синдромов (Elliot et al., 1995; Janero, 2000; Licinio et al., 1999; Trujillo, 2000). Несмотря на столь значительные успехи в расшифровке нейрохимических механизмов боли, картина NO-зависимой регуляции этого феномена остается неполной по нескольким причинам:

Во-первых, отсутствуют данные о динамике собственных, эндогенных систем синтеза NO в мозге при болевых реакциях. Большинство работ посвящены NO-ергическим процессам, происходящим в спинном мозге и в периферических тканях, где за оксидом азота прочно закрепилась роль про-болевого фактора (Levy et al., 1999; Lin et al., 1999; Traub et al., 1994). В то же время известно, что в координационных центрах головного мозга NO во многом определяет эффективность вегетативных, эмоционально-когнитивных и антиболевых адаптаций (Kolhekar et al., 1997; Masood et al., 2004; Morimoto et al, 2000; Prevot et al., 1998; Seo et al., 2002; Urban Gebhart, 1999). Поэтому интегративная оценка нейрохимических перестроек при боли возможна лишь с учетом особенностей системы эндогенного синтеза NO на всех уровнях ЦНС.

Во-вторых, используемые в мировой науке методы биохимической регистрации активности NO-синтазы (NOS) не всегда позволяют определить степень вовлеченности отдельных центров головного мозга, а также -установить тканевой источник избыточной либо недостаточной продукции NO при болевых воздействиях. Наиболее информативными методами анализа внутриклеточной активности NO-синтазы являются гисто- и иммуноцитохимическая диагностика (Kuo et al., 1994; Matsumoto et al., 1993). Эти методы позволяют не только изучать морфо-химические параметры нейронов, но проследить особенности их связей и охарактеризовать их нейротрансмиттерный тип.

В-третьих, возможности применения уже полученных данных в клинической практике весьма ограничены без учета нитроксидергических событий, происходящих в мозге человека при болевом воздействии. К сожалению, усилия исследователей по данному вопросу ограничиваются лишь картированием NO-ергических нейронов мозга человека в норме (Egberongbe et al., 1994; Sangruichi, Cowall, 1991).

Цель настоящей работы - установить закономерности организации и функционирования NO-ергических систем головного мозга человека и животных, вовлеченных в модуляцию болевого сигнала.

Задачи исследования:

1. Изучить локализацию и активности NADPH-диафоразы и NO-синтазы в тех регионах головного мозга человека и животных, причастность которых к модуляции болевого сигнала является установленной.

2. С помощью гисто- и иммуноцитохимических методов охарактеризовать медиаторный тип NO-ергических нейронов в нервных центрах головного мозга человека и животных.

3. На модели тонической воспалительной боли изучить динамику активности NO-синтазы в ядерных и корковых формациях головного мозга крыс и оценить характер изменений нейронального, эндотелиального и индуцибельного компонентов синтеза NO.

4. Дать количественную оценку биохимической активности фермента в отделах головного мозга и определить содержание метаболитов NO (нитратов и нитритов) в периферической крови экспериментальных животных.

5. Провести комплексное исследование нитроксидергической активности в соответствующих структурах головного мозга людей, погибших в различные сроки после развития травматического болевого шока.

6. Изучить состояние нитроксидергических процессов в мозге экспериментальных животных при системном воздействии опиатов и у людей, погибших в результате опийной интоксикации.

7. На основе полученных результатов и при их соотнесении с литературными данными составить нейрохимическую и динамическую модель нитроксидергической модуляции системной болевой реакции.

Научная новизна работы. В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота в нервных центрах и корковых формациях головного мозга человека и животных, участвующих в формировании системной интегративной болевой реакции.

Впервые представлена количественная характеристика NO-ергических нейронов в отделах головного мозга человека и экспериментальных животных и выявлены межвидовые сходства и отличия.

Впервые изучена динамика активности NADPH-диафоразы, нейрональной и индуцибельной NO-синтазы в различных структурно-функциональных ансамблях болевого анализатора и проведен сравнительный анализ изменений, происходящих в мозге экспериментальных животных и у людей, погибших от травматического болевого шока.

Впервые показан дозо-зависимый эффект опиатных аналгетиков на состояние NO-ергического синтеза в серотонинергических ядрах у экспериментальных животных.

В коре головного мозга людей, погибших от опийной интоксикации, впервые идентифицированы аберрантные NO-ергические комплексы, формирующие морфологический субстрат для нейротоксического действия оксида азота.

Впервые установлена индукция NOS в норадренергических нейронах голубоватого пятна мозга наркоманов.

Впервые создана нейрохимическая и динамическая модель нитроксидергической модуляции различных компонентов системной болевой реакции.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты исследования топографических взаимоотношений между медиаторной специализацией нейрона и его NO-ергической функцией необходимы для выяснения роли нейромодуляторных влияний N0 при развитии болевых феноменов. Эти данные также важны для обоснования закономерностей, лежащих в основе аналитического и аддиктивного действия используемых в клинике опиатных аналгетиков.

Предложенная в работе концепция NO-ергической модуляции центральных механизмов боли способствует пониманию нейрохимических основ патогенеза боли и открывает перспективы для более рациональной коррекции болевых синдромов при использовании специфических регуляторов активности NO-синтазы самостоятельно или в комбинации с другими препаратами.

Полученные данные о топографии NO-ергических нейронов головного мозга человека и животных и их динамических перестройках в условиях болевого стресса могут быть использованы в нейрохимии, токсикологии, психофармакологии, психиатрии, клинической и экспериментальной неврологии, анестезиологии, наркологии и судебной медицине. Эти данные необходимы также для поиска и оценки фармакологических препаратов направленного действия.

На защиту выносятся следующие положения:

1. В головном мозге стволовые и корковые отделы, участвующие в интеграции болевого сигнала, продуцируют оксид азота.

2. NO-ергические нейроны различных мозговых формаций человека и животных характеризуются медиаторной и нейрохимической гетерогенностью, которая определяет их неравнозначное участие в формировании болевой реакции.

3. В системной болевой реакции течение перцептуально-дискриминативного, эмоционально-когнитивного, вегетативного и антиболевого компонентов регулируется NO-ергическим механизмом.

4. В основе аналитического и аддиктивного эффектов опиатных аналгетиков лежат изменения активности N0 в эндогенных антиболевых центрах.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной конференции стран СНГ по функциональной морфологии, посвященной 100-летию со дня рождения Н.Г.Колосова (Санкт-Петербург, 1997); V Международном симпозиуме Японско-Российского медицинского обмена (Япония. Саппоро, 3-4\09. 1997); Международном симпозиуме «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (Минск, 17-21X02, 1998); VI Съезде анестезиологов и реаниматологов (Москва, 1998); V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000); I и III Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 4\05. 2000; 25\04. 2002); Центральном Европейском конгрессе по нейробиологии (Польша. Краков, 2001); Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 29-31\05, 2002); X Международном конгрессе нейрохимического общества Чехии и Словакии «Нейронауки в третьем тысячелетии» (Словакия. Каста, 1-5X06. 2002); IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2002» (Санкт-Петербург, 29-31X05, 2002); XIX конгрессе Международной академии судебной медицины (Италия. Милан, 3-6\09. 2003); XX Конгрессе Международного общества судебных генетиков (Франция. Бордо, 9-13\09. 2003).

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Дюйзен, Инесса Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. В головном мозге NADPH-диафораза (NO-синтаза) локализуется в нейронах ядер шва, тонкого и клиновидного ядер, центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга, черной субстанции, вентрального тегментального поля, ядрах покрышки мозга (дорсо-латеральном и ножко-мостовом), ядер гипоталамуса, таламуса и базального переднего мозга, сомато-сенсорной и лимбической коры.

2. NO-продуцирующие клетки головного мозга химически гетерогенны: в ядрах шва NO-синтаза со-локализована с серотонином; на уровне покрышковых ядер и в области базального переднего мозга NO синтезируют холинергические нейроны; NO-ергические эндокриноциты супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса экспрессируют ангиотензин-превращающий фермент; топографические и морфологические характеристики NADPH-d-позитивных клеток в ядрах задних канатиков, центральном сером веществе среднего мозга, черной субстанции и вентральном тегментальном поле, таламусе и коре позволяют причислить их к категории тормозных ГАМК-ергических интернейронов. Оксид азота не синтезируется в норадренергических и дофаминергических нейронах.

3. В исследованных отделах головного мозга экспериментальных животных и человека характер NO-ергической активности коррелирует со степенью вовлеченности нервного центра в процессы модуляции болевого сигнала, зависит от длительности болевой экспозиции и обусловлен характером афферентно-эфферентного устройства его нервных связей. В разных нейротрансмиттерных и функциональных системах NO-ергическая активность имеет индивидуальный динамический рисунок.

4. У крыс в ядрах, осуществляющих перцептуально-дискриминативный анализ болевого импульса, регистрируются однонаправленные нейрохимические перестройки:

• в тонком ядре при болевом воздействии происходит отсроченный, билатеральный и непродолжительный (4-5 часов) всплеск нитроксидергической активности. Последовательная активация NO-ергических структур ипси- и контралатеральной стороны определяется характером двойственной иннервации ядра;

• в вентро-базальных отделах таламуса регистрируется уплотнение NO-ергического нейропильного компонента на стороне, противоположной повреждению. Активация нейронного пула NADPH-диафоразы наблюдается в ретикулярном таламическом ядре;

• в корковых регионах мозга крыс изменения наиболее выражены через 6 часов болевой экспозиции и связаны с увеличением числа N0-позитивных нейронов и длины NO-ергического капиллярного русла.

5. Интегративная оценка динамики NO-ергических процессов в ядрах, участвующих в регуляции вегетативных адаптаций, позволяет условно выделить два периода.

• Первая фаза болевого ответа характеризуется гиперактивностью NO-синтазы в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра гипоталамуса и тканевых элементах срединного возвышения, заметным угнетением показателей гистохимической реакции в эндокриноцитах супраоптического и паравентрикулярного ядер и умеренной активацией нейронов дорсо-латерального сегмента центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга;

• Вторая фаза NO-ергических сдвигов регистрируется через 3 часа после начала болевого воздействия - для нее характерна реверсия NO-ергического ответа в мелко- и крупноклеточных ядрах гипоталамуса и выраженная экспрессия фермента в дорсо- и вентро-латеральных сегментах центрального серого вещества среднего мозга.

6. В аналитических центрах головного мозга крыс изменение синтеза N0 имеет динамическое развитие:

• острый период боли связан со снижением уровня NADPH-диафоразы в серотонинергических ядрах шва крыс, умеренной активацией синтеза NO в центральных структурах среднего мозга, латеральном ядре гипоталамуса и может формировать благоприятные внутриклеточные условия для запуска нисходящей серотонинергической аналгезии;

• в отсроченный период нарастание NO-ергической активности в нейронах шва является механизмом, лимитирующим синтез серотонина, что определяет про-ноцицептивный этап нисходящей серотонинергической модуляции боли;

• заметная активация NADPH-диафоразы в нейронах вентро-медиального, латерального гипоталамических ядер, дорсо- и вентро-латерального сегментов околоводопроводного вещества среднего мозга, а также -экспрессия фермента в афферентных системах голубоватого пятна обусловливает в фазу тонической боли серотонин-независимые аналитические механизмы.

7. У крыс регуляция "arousaP'-систем протекает без участия NO-ергического механизма - болевое воздействие приводит к значительному снижению числа и активности NO-продуцирующих элементов в холинергических зонах мозга (дорсо-латеральном и ножко-мостовом ядрах покрышки, структурах базального переднего мозга).

8. В большинстве исследованных образований мозга человека и экспериментальных животных топография, морфологические характеристики и показатели гистохимической активности NADPH-d-позитивных нейронов совпадают, однако характер связанных с болью нитроксидергических перестроек в мозге человека имеет ряд особенностей:

• в тонком ядре доминирующим типом нейрохимического ответа на болевое повреждение является изменение NO-ергической активности волокон и нейроглиальных элементов заднего канатика;

• в таламусе формируются нейроперестройки двоякого рода: в неспецифических отделах и в ретикулярном ядре более выражены изменения со стороны NO-ергических нейронов, а в вентро-базальных ядрах изменения затрагивают их нейропильный компонент;

• в сомато-сенсорной и лимбической коре на первый план выступают изменения NO-ергической активности нейроглиоцитов; количество и активность NADPH-d-позитивных нейронов достоверно не изменяются;

• развитие болевого шока у человека сопровождается экспрессией NADPH-диафоразы в нейронах мелкоклеточной и эндокринной зоны паравентрикулярного ядра, в локальных микрососудах и волокнах гипоталамо-гипофизарного тракта;

• у людей, погибших в результате травматического шока экспрессия NADPH-диафоразы происходит только в дорсо-латеральном сегменте ЦСОВ;

• во всех ядрах шва регистрируется стойкое угнетение активности NO-синтазы.

9. В большинстве исследованных ядер человека и крыс изменение активности NO-синтазы связано с нейрональным типом фермента: исключение составляет а-часть парагигантоклеточной ретикулярной формации, где на фоне болевого воспаления регистрируется индуцибельная форма NOS.

10. Течение болевого процесса изменяет биохимическую активность NO-синтазы в регионах головного мозга человека и животных и сопровождается параллельными сдвигами концентрации нитратов и нитритов в периферической крови.

11. Антиболевой эффект опиатных аналгетиков связан с активностью NO-ергических систем мозга:

• однократное воздействие препарата на фоне болевого синдрома или у интактных животных угнетает NO-синтетические процессы в серотонинергических ядрах шва крыс;

• эти влияния зависят от дозы вводимого препарата, коррелируют с уровнем опиатных рецепторов и чувствительны к действию антагониста опиатов - налоксона.

12. Аддиктивные и нейротоксические эффекты опиатов реализуются при содействии NO-ергической системы:

• нарастание толерантности и развитие спонтанного или вызванного налоксоном синдрома отмены сопровождаются экспрессией NADPH-диафоразы в серотонинергических ядрах крыс;

• при интоксикации опиатами происходит индукция NO-синтазы в норадренергических нейронах голубоватого пятна у человека;

• в коре головного мозга наркоманов формируются высоко-активные аберрантные сплетения NO-ергических волокон, которые предопределяют развитие нейродеструктивных изменений. Избыточное образование оксида азота за счет активности индуцибельной NO-синтазы в пирамидных нейронах коры головного мозга наркоманов подтверждается иммуноцитохимическими и генетическими методами.

13. На основании полученных данных сформировано представление о том, что в реализации системной болевой реакции у животных и человека участвуют NO-ергические механизмы подкорковых и корковых центров головного мозга.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Дюйзен, Инесса Валерьевна, Владивосток

1. Аринова А.А, Богданов Е.Г, Зайцев А.А, Игнатов Ю.Д. Болеутоляющее действие серотонинергических средств // Анестезиол. реаниматол.- 1994.Т. 2.- с. 9-12.

2. Акмаев И.Г, Волкова О.В, Гриневич В.В, Мишарин А.В, Поскребышева Е.А, Ресненко А.Б, Савелов Н.А. Вазопрессин и воспаление // Морфология.- 2001.- Т. 120, N5.- с.7-18.

3. Баклаваджан О.Г, Дарбинян А.Г, Татурян И.К, Ипекчан Н.М. Нейрональные и нейрохимические механизмы гипоталамического торможения болевого рефлекса // Физиол Ж. им Сеченова.- 1987.- Т. 73, N 9 .- с.1160-1169.

4. Башкатова В.Г, Раевский К.С. Оксид азота в механизмах повреждения мозга, обусловленных нейротоксическим действием глутамата // Биохимия.- 1998.- Т. 63,- с.1020-1028.

5. Богданов А.И, Ярушкина Н.И. Эффект АКТГ на болевую чувствительность крыс // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 2001.Т. 131, N3.- с.216-218.

6. Боголепов Н.Н. Изменение ультраструктуры межнейрональных связей при экспериментальной хронической морфинной интоксикации.- Вестник РАМН.- 1998,- Т. 8, N 16.- с. 16-19.

7. Брагин Е.О. Нейрохимические механизмы регуляции болевой чувствительности // М. Изд-во Университета дружбы народов. 1991. 248с.

8. Ванин А.Ф. оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестник РАМН.- Т.2000.- N4.- с. 3-5.

9. Вальдман А.В, Ингатов Ю.Д. Центральные механизмы боли // Л. Наука. 1976.

10. Викторов И.В. Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга // Вестник РАМН.- 2000. Т4.- с. 5-10.

11. Виноградова О.С. Гиппокамп и память // М. Наука.- 1971.- 322с.

12. Гарцман Т.Ю., Шерстюк Б.В., Дюйзен И.В. Изменение баланса NO-ергической системы мозга при некоторых патологических состояниях // Тихоок. медиц. журн.- 2000.- № 4.- с. 87.

13. Дикенсон Э. О локализации и механизмах действия опиоидов // Эксперим. клин, фармакол.- 1994.- Т. 57.- с. 3-12.

14. Дуринян Р.А. Корковый контроль неспецифических систем мозга // М. Медицина.- 1975.

15. Дюйзен И.В. NO-ергическая функция нейронов околоводопроводного серого вещества при боли и системном введении опиатов // В: "Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере". Сургут.- 2002.- Т. 2.- с. 267-270.

16. Дюйзен И.В. Нитроксидергические нейроны тонкого ядра мозга крысы при боли // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.- 2003.- Т. 135, N 2.- с. 215-218.

17. Дюйзен И.В., Мотавкин П. А. Нитроксидергические механизмы формирования боли. Дальневост. Медиц. Журн.- 2003.- № 2.- с. 11-16.

18. Дюйзен ИВ., Калиниченко С.Г., Охотин В.Е., Мотавкин П.А. Нитроксидергические нейроны белого вещества гиппокампальной формации человека//Морфология.- 1998.- Т. 113.- с. 47-51.

19. Дюйзен И.В., Деридович И.И., Курбацкий Р.А., Шорин В.В. NO-ергические нейроны ядер шва мозга крысы в норме и при введении опиатов // Морфология.- 2003.- Т. 123.- с. 24-29.

20. Звартау Э.Э., Кузьмин А.В. Новые аспекты изучения аддиктивных эффектов наркотических аналгетиков // Анестезиол. реаниматол.- 1996.Т. 4.-с. 13-16.

21. Калюжный JI.B. Физиологические механизмы регуляции болевой чувствительности // М. Медицина. 1984.- 215 с.

22. Кассиль Г.Н. Наука о боли // М. Медицина. 1975.- 399с.

23. Коновко О.О., Дюйзен И.В., Мотавкин П.А. Этанол-окисляющие и NO-синтезирующие ферменты моноаминергических ядер мозга человека // Бюлл. эсперим. биологии и медицины.- 2003.- Т. 136.- с. 231-234.24