Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе"

На правах рукописи

Стариков Юрий Витальевич

Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе

03 00 04 - биохимия 14 00 16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск-2008

003172721

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

Степовая Елена Алексеевна

доктор медицинских наук, Рязанцева Наталья Владимировна

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Колпаков Аркадий Ростиславович

профессор

доктор медицинских наук

Меньшикова Елена Брониславовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Росздрава

диссертационного совета Д 001 034 01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул Академика Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «_»_2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Русских Г С

Защита состоится «_»

2008 г в часов на заседании

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Окислительный стресс характеризуется избыточным накоплением в тканях активных форм кислорода (АФК), приводящих к повреждению нуклеиновых кислот, белков и липидов В физиологических условиях АФК участвуют в развитии «респираторного взрыва», синтезе юрмонов, процессах пролиферации клетки [Владимиров Ю А, 2000, Октябрьский О Н, Смирнова Г В, 2007] Наряду с этим АФК рассматриваются в качестве внутриклеточных мессенджеров, участвующих в регуляции метаболизма клетки Универсальным участником регуляторных процессов в клетке является оксид азота На организменном уровне основные эффекты оксида азота проявляют себя в поддержании тонуса сердечнососудистой системы, участии в синаптической передаче, регуляции воспалительного ответа и апоптоза клеток [Маеда X, Акаике Т, 1998, Меныцикова Е Б и соавт, 2000]

Апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточных популяций в многоклеточном организме [Кегг J F R, 1972] Активация программированной клеточной гибели напрямую связана с развитием окислительного стресса Активные формы кислорода вызывают открытие пор во внутренней митохондриалыюй мембране, набухание матрикса и разрыв внешней мембраны митохондрий с освобождением проапоптотических белков (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) из межмембранного пространства в цитозоль [Yi J et al, 2002, Лущак ВИ, 2007] Выход цитохрома с приводит к резкому повышению внутриклеточного содержания АФК и активации каспазпого каскада [Green D R, Reed J С , 1998, Gordon D M, 2000]

Важнейшим радикалом, участвующим в регуляции апоптоза, является радикал оксид азота (N0) Уникальная химическая природа и большое число внутриклеточных мишеней для N0 оставляют открытым вопрос, каким образом опосредуется регулирующее влияние оксида азота на апоптоз в условиях окислительного стресса [Choi В М et al, 2002, Меньшикова Е Б и соавт, 2006] С одной стороны, известно, что оксид азота способен подавлять синтез белка Вс1-2 и увеличивать экспрессию Вах в митохондриях, провоцируя повышение проницаемости митохондриальной мембраны и выход в цитоплазму клетки АФК [Hortelano S et al, 1997, Bruene В, 1999, Лущак ВИ, 2006, Кулинский В И, 2007] Сильный окислитель пероксинитрит, образующийся при взаимодействии оксида азота с супероксиданионом, индуцирует образование гидроксильных и липидных радикалов [Маеда X, Акаике Т, 1998], окисляет NH2- и SH-группы белков, что приводит к ингибированию супероксиддисмутазы и ДНК-лигазы

С другой стороны, в ряде работ описаны диаметрально противоположные эффекты оксида азота на развитие программированной клеточной гибели. Так, активация NO/цГМФ-зависимого пути отменяла развитие апоптоза моноцитов клеточной линии U937 [De Nadai С et al, 2000], гепатоцитов и В-лимфоцитов [Choi В -М et al, 2002] Кроме того, блокирование апоптоза может быть связано с нитрозилированием каспазы-3 [Bruene В, 1999, Mannick JB , 1999] Следует отметить, что имеются данные, указывающие на способность оксида азота |

индуцировать синтез белков семейства Вс1-2 [Зенков Н К и соавт, 2001, Choi В -М et al, 2002]

Известно, что продукция АФК наиболее значима в нейтрофильных лейкоцитах по сравнению с другими клетками организма Индукция окислительного стресса при воспалении инициирует развитие программированной гибели нейтрофилов В связи с тем, что нейтрофилы быстро вступают на путь спонтанно развивающегося апотоза, не требующего какого-либо внешнего сигнала смерти [Edwards S W et al, 2003], состояние внутриклеточных сигнальных систем (Са2+, цАМФ и цГМФ), баланс анти- и проапоптотических белков семейства Вс1-2 являются' важными регуляторными факторами продолжительности жизни клеток

Несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза, роль оксида азота в механизмах реализации программированной гибели нейтрофилов в полной мере до конца не ясна Установление молекулярных механизмов регуляции продолжительности жизни нейтрофильных лейкоцитов позволит создать селективные технологии управления воспалительным процессом

Цель исследования изучить роль оксида азота в механизмах регуляции апоптоза иейтрофилов при окислительном стрессе

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1 Изучить особенности продукции нейтрофилами оксида азота при экспериментальном окислительном стрессе и у больных острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит)

2 Оценить количество апоптотически измененных нейтрофилов при окислительном стрессе т vitro в условиях влияния индуктора и ингибитора NO-синтазы

3 Оценить содержание белков-регуляторов с про- (Вах) и антиапоптотической (Вс1-2) активностью при индукции синтеза NO и ингибировании NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса

4 Определить роль внутриклеточных сигнальных молекул (Са2+, цАМФ и цГМФ) в регуляции апоптоза нейтрофилов в условиях окислительного стресса т vitro при индукции синтеза NO и ингибировании NO-синтазы

5 Установить особенности влияния NO на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней

Научная новизна. Использование современных молекулярно-биологических и биохимических методов показало, что при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалительном процессе в клинике внутренних болезней (внебольничная пневмония, острый аппендицит) происходит увеличение продукции оксида азота нейтрофильными лейкоцитами

Показано, что молекулярные механизмы влияния молекул оксида азота на апоптоз иейтрофилов при окислительном стрессе и остром воспалительном процессе сопряжены с участием ионов кальция, цАМФ и цГМФ Установлено, что влияние оксида азота на реализацию программированной гибели нейтрофилов не связано с влиянием на баланс про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков

Теоретическая и практическая значимость Разработана экспериментальная модечь окислительного стресса, позволяющего прогнозировать развитие программированной клеточной гибели нейтрофилов при использовании индукторов и ингибиторов NO-синтаз при острых воспалительных заболеваниях Полученные в результате проведенного исследования данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы развития программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов, опосредованные молекулами оксида азота, в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней Установленные закономерности реализации апоптотической программы нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительною стресса при воспалении могут быть положены в основу разработки селективных молекулярных технологий управления развитием воспалительного процесса, влияя на продолжительность жизни нейтрофильных лейкоцитов

Положения, выносимые на защиту:

1 Молекулы оксида азота оказывают протективный эффект на реализацию апоптотической гибели нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированным 5 мМ Н202. и остром воспалительном процессе

2 Нарушение реализации программированной гибели нейтрофилов при культивировании с индуетором синтеза оксида азота в условиях окислительного стресса in vitio и при остром воспалении сопряжено с изменением внутриклеточного содержания ионов кальция, цАМФ и цГМФ, не зависит от содержания белков Вах и Вс1-2

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VII международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2007), на Всероссийской конференции «Национальные дни лабораторной медицины России 2007» (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества имени И П Пирогова (Санкт-Петербург, 2007), II конгрессе терапевтов «Новый курс консолидация усилий по охране здоровья нации» (Москва, 2007)

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, по проблеме «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153 2006 7),

РФФИ «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150 -ориентированные фундаментальные исследования 2007-2008), а так же проекта «Разработка способов коррекции нарушений регуляции апоптоза клеток при патологических процессах в условиях окислительного стресса» (г ос контракт № 02 442 11 7276 от 20 02 2006), реализованного в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006»

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы (135 страниц машинописного текста), включающего 180 источников (из них - 62 отечественных и 118 зарубежных) Работа иллюстрирована 9 таблицами и 6 рисунками

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для реализации предпринятого нами исследования были выделены экспериментальный и клинический блоки, включавшие манипулирование m vitro нейтрофильными лейкоцитами, полученными у здоровых доноров и у больных острыми воспалительными заболеваниями

В исследование были включены 32 здоровых донора (18 мужчин и 14 женщин) в возрасте от 18 до 40 лет (25,0±5,4 лет) Обследовали 54 пациента (30 мужчин и 24 женщины) в возрасте от 18 до 50 лег (32,0±3,0 лет) с острыми воспалительными заболеваниями Из них 29 человек с внебольничной пневмонией (13 мужчин и 16 женщин) и 25 больных острым аппендицитом (17 мужчин и 8 женщин) Все пациенты поступали в стационар в порядке скорой медицинской помощи, обследование проводилось до назначения терапии

Для верификации диагноза использовали данные анамнеза, инструментальных (УЗИ, рентгенологическое исследование органов брюшной и грудной полости и др ) и лабораторных (общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови и др ) методов исследования

Критериями исключения являлись возраст (менее 18 и более 50 лет), период обострения хронических воспалительных заболеваний, аутоиммунные, наследственные и психические болезни, алкогольная и наркотическая зависимости

Набор клинического материала осуществлялся на базе и при участии сотрудников кафедры терапии усовершенствования врачей (зав кафедрой -канд мед наук, доцент Т С Агеева) Томского военно-медицинского института, терапевтического отделения (зав отдечением - канд мед наук А В Дубоделова) и хирургического отделения (зав отделением - канд мед наук В Я Митасов) ММЛПУ «Городская больница №1» (главный врач - С M Киоютенко) (г Томск), кафедры госпитальной хирургии (зав кафедрой - член-

корреспондент РАМН, проф Г.Ц Дамбаев) ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г Томск)

Материалом исследования служила венозная кровь, взятая из локтевой вены утром натощак с помощью стандартных вакуумных систем "BD VACUTAINERTM" («Greiner-bio-one», Австрия) с гепарином (25 Ед/мл)

В соответствии с поставленными целью и задачами исследования был предложен дизайн, предполагающий разделение работы на два последовательных этапа

На первом этапе исследования проводили оценку выраженности апоптоза нейтрофильпых лейкоцитов крови в условиях экспериментального окислительного стресса и при остром воспалении в клинике внутренних болезней Окислительный стресс in vitro воспроизведен с использованием пероксида водорода [Yamamoto К et al, 2003, Akishita М et al, 2005] (табл 1)

Таблица 1

Распредечение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями в соответствии с использованными методами регистрации апоптоза и АФКв нейтрофилах

Методы исследования Группы обследованных

Здоровые доноры Экспериментальный блок исследования (культивирование клеток т vitro с 1, 5, 10 и 50 мМ Н2О2) Клинический блок исследования (внебольпичная пневмония и острый аппендицит)

Оценка апоптоза нейтрофилов в аннексиновом тесте с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии 32 32 54

Определение уровня АФК в клетках с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии 32 32 54

Оценка количества некротизированных клеток, с использованием окраски трепановым синим 32 32 54

На втором этапе исследования для проверки гипотезы участия оксида азота в регуляции программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса клетки были культивированы в присутствии 5 мМ перекиси водорода и 500 мкМ Ь-аргинина («МР», США) (субстрата фермента Ш-синтазы [N111 X -Р е1 а1, 1996]) или 500 мкМ Ь-ЫАМЕ (№-нитро-Ь-аргинин метиловый эфир) («Р1ика» США) (селективного ингибитора МО-синтазы) [ВеИгап В й а1, 2002]) Далее оценивалось влияние оксида азота на содержание

про- (Вах) и антиапоптотических белков (Вс1-2), концентрацию внутриклеточных мессенджеров в нейтрофилах (Са21. цАМФ и цГМФ) (табл 2) Исследование проводилось в Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав лабораторией - д-р мед наук Л С Литвинова)

Таблица 2

Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями в соответствии с использованными методами исследования влияния NО на реализацию апоптоза нейтрофилов в условиях окислительного стресса

Методы исследования Группы обследованных

Экспериментальный блок исследования Клинический блок исследования

Интактные нейтрофилы Нейтрофилы, инкубированные т \itro с 5 мМ Н2О2 Нейтрофилы, инкубированные т Vиго с 5 чМ Н2О2 и Ь-аргинином Нейтрофилы, инкубированные т уиго с 5 мМ Н2О2 и Ь-апгинином Интактные нейтрофилы Нейтрофичы, инкубированные с Ь-аргинином Нейтрофилы, инкубированные с Ь^АМЕ

Лазерная проточная цитофлуориметрия

Нейтрофилы в стадии раннего апоптоза 32 32 22 22 54 54 54

Уровень АФК в клетке 32 32 22 22 54 54 54

Концентрация Са"" в клетке 22 22 22 22 54 54 54

Спектрофотометрический анализ

Концентрация метаболитов N0 22 22 22 22 54 54 54

Радиоимуннный анализ

Концентрация цАМФ в клетке 7 7 6 7 14 15 17

Концентрация цГМФ в клетке 7 7 8 9 14 16 14

Вестерн-блоттинг

Содержание Вах в клетке 3 3 3 3 3 Не определяли Не определяли

Содержание Вс1-2 в клетке 3 3 3 3 3 Не определяли Не определяли

Нентрофилы выделяли из гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в двойном градиенте плотности Ficoll-Paque (р=1,077 г/см3) («GE Healthcare», Швеция) и Ficoll-урографина (р=1,095 г/см3) (урографин -«Schering», Россия) Клетки культивировали в полной питательной среде [Гольдберг Е Д и соавт, 1992] в стерильных пенициллиновых флаконах (для определения концентрации конечных метаболитов оксида азота, содержания белков Вс1-2, Вах, концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах) и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах (для определения числа аннсксин-положительных клеток, концентрации внутриклеточных АФК и цитоплазматического кальция методом проточной лазерной цитометрии) в течение 18 ч при температуре 37° С и 5 % С02

Методом лазерной проточной цитометрии с использованием цитометра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали число аниексин-положительных клеток в культуре, содержание АФК и Са2+ в нейтрофилах Оценка реализации программированной гибели нейтрофилов крови осуществляли с помощью набора реагентов «ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция) методом, основанным на способности аннексина V, меченною флуорссцеин изотиоцианатом, связываться с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клею к при запуске программы апоптоза [Van Engeland М et al, 1998] Концентрация внутриклеточных АФК определялась с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией - дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma», США) [Bass DA et al, 1983] Оценка концентрации ионов кальция в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов проводилась методом, основанным на определении интенсивности флуоресценции липофильного зонда Fluo 3 AM («MP Biomedicals ™», США), проникающего в клетку и связывающего ионы кальция [Merritt JE et al ,1990]

Спектрофотометрический метод определения содержания нитритов в супернатантах был основан на цветной реакции с реактивом Грисса (1 % сульфаниламид («МР», США), 0,1 % нафтилендиамин («МР», США), разведенные в 12 % уксусной кислоте) [Green L С et al, 1982]

Определение содержания циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ в нейтрофилах крови проводили с использованием метода конкурентного твердофазного радиоиммупного анализа [Yallow R S , Berson S А , 1970], при помощи наборов «RIA АМРс/сАМР» и «RIA cGMP» («Immunotech», Франция) Методические детали проведения радиоконкуреитного анализа описаны в протоколах фирмы-изготовителя для каждого радиоиммунного комплекта

С помощью метода вестерн-блоттинга в нейтрофилах определяли содержание белков Вс!-2 и Вах [Towbin Н et al, 1979] Клеточные экстракты получены путем лизиса клеток в фосфатно-солевом буфере, содержащем 50 мМ трис-HCI буфер (рН=6,5), ЮОмМ дитиотреитол, 2% SDS, 0,1% бромфеноловый синий, 15% глицерол («Helikon», США), смесь протеазных ингибиторов («Sigma», США) Белки разделяли по молекулярной массе иод действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении поля 120 В Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) Перенос белков осуществлялся электрофоретичееки в течение 90 мин при силе тока 60 мА В качестве

стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогсназу (антитела фирмы «Chemicon», США), выражая содержание белка Вах как отношение сигнала определяемого белка к сигналу белка глицеро-3-фосфат-дегидрогеназы в исследуемых образцах

При оценке полученных данных были использованы методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин ГФ, 1980] Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин осуществляли с использованием t-критерия Стьюдснта В случае отсутствия coi ласия данных с нормальным распределением для оценки различии между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона С помощью рангового критерия Манна-Уитни оценивали достоверность различий независимых выборок Наличие связи между изучаемыми показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Особенности программированной гибели нейтрофилов крови при окислительном стрессе т vitro и остром воспалении

Отсутствие в научной литературе данных, свидетельствующих об изменениях метаболизма нейтрофилов в зависимости от концентрации перекиси водорода т vitro, наличие различных способов индикации фенотипических проявлений апотоза и некроза определили задачу экспериментального подбора оптимальной концентрации Н202, способной эффективно индуцировать как развитие окислительного стресса (ОС), так и программированную гибель нейтрофильных лейкоцитов

Для моделирования окислительного стресса in vitro нейтрофилы, полученные у здоровых доноров, инкубировали с перекисью водорода в конечной концентрации 1, 5,10 и 50 мМ

В ходе проведенного нами исследования было установлено, что оптимальной конечной концентрацией Н2О2, вызывающей нарастание внутриклеточной продукции АФК и индуцирующей апоптоз наибольшего числа нейтрофильных лейкоцитов, но не стимулирующей развитие некротических изменений нейтрофилов, является 5 мМ (рис 1) В ходе дальнейших исследований именно эта концентрация была использована для моделирования ОС in vitro

В ходе выполненною нами исследования для подтверждения адекватности выбранной модели окислительного стресса было проведено сравнение внутриклеточного содержания АФК в условиях экспериментальной модели окислительного стресса (5 мМ Нг02) и при остром воспалении. Было выявлено,

что содержание АФК в нейтрофильных леикоцитах, полученных у больных внебольничной пневмонией (0,653(0,574-0,728) уел ед) и острым аппендицитом (0,673(0,561-0,690) услед)) значимо превышало контрольные величины (р<0,05) и статистически не отличалось от значений в экспериментальной модели (р>0,05) Этот факт, на наш взгляд, свидетельствует об адекватности использованной в работе модели ОС и подобранной концентрации Н202 для имитации поведения нейтрофилов при развитии острого воспаления Отсутствие различий содержания внутриклеточных АФК в нейтрофилах у больных острым аппендицитом и внебольничнои пневмонией позволило нам объединить пациентов в одну клиническую группу с острым воспалительным процессом

Концентрация Н2О2

-Апоптоз, %--Некроз, % -АФК, у е

Рис. 1 Содержание внутриклеточных АФК, количество аннексин-положительных и некроппированных клеток в культуре нейтрофильных лейкоцитов при инкубации с разными концентрациями перекиси водорода

Сходная ситуация отмечалась при сравнении количества аннексин-положительных клеток в экспериментальной и клинических группах, что указывает на близкий механизм активации апоптоза нейтрофилов, культивируемых в присутствии 5 мМ перекиси водорода т \ntro, и нейтрофилов, полученных у больных с острым воспалением Число апоптотически измененных клеток в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с внебольничной пневмонией (62,37(54,25-69,20)%) и у больных острым аппендицитом (57,40(51,37-62,37)%), достоверно превышало контрольную величину (р<0,05) и не отличалось от его значения при экспериментальном ОС (р>0,05) Количес1во клеток с пермеабилизированной мембраной в культуре нейтрофилов, полученных у больных внебольничной пневмонией (5,50(4,30-6,50) %), статистически превышало (р<0,05) контрольную величину, значения данного параметра в культуре нейтрофильных лейкоцитов, выделенных из крови у больных острым аппендицитом (4,20(3,80-5,70)%). оставалось в пределах контрольных величин (р>0,05)

В проведенном нами исследовании влияние АФК на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждалось наличием положительной корреляции между увеличением внутриклеточною уровня АФК и возрастанием количества апнексин-положитсльных клеток в культурах нейтрофилов, полученных у здоровых доноров при индукции ОС 5 мМ Н202 (r=0,89, р<0,05), а также в клетках, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (1=0,71, р<0,05)

2. Влияния оксида азота на апоптоз нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

Известно, что оксид азота является, с одной стороны, одним из компонентов окислительного стресса, с другой - важнейшим медиатором клеточного метаболизма [Зенков H К , и соавт, 2001 Tuteja N et al, 2004] Для установления роли NO в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе в параллельных экспериментах клетки культивировали в присутствии индуктора или ингибитора NO-синтазы

Изучение концентрации конечных метаболитов NO в среде инкубации нейтрофилов показало, что под действием 5 мМ Н202 происходит статестически значимое увеличение продукции оксида азота по сравнению с интактной культурой (р<0,05), что в целом согласуется с данными литературы [Thomas S R, 2002] (рис 2) Оценка концентрации метаболитов оксида азота в культуре нейтрофилов, полученных у пациентов с острым воспалением, выявила увеличение значений исследованного показателя в 1,5 раза по сравнению с таковыми в интактной культуре клеток у здоровых доноров (р<0,05) и в 1,3 раза по сравнению со стресс-контролем (р<0,05) (рис 2)

Было установлено, что при культивировании нейтрофилов в присутствии L-аргинина способствует повышению концентрации метаболитов NO достоверно повышается Культивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-NAME приводило к снижению концентрации метаболитов оксида азота при экспериментальном ОС до контрольных значений При работе с нейтрофилами, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, воздействие ингибитора NO-синтазы приводило к снижению концентрации метаболитов NO до базового уровня, характерного для клеток при остром воспалении Данный факт свидетельствует о запуске как ферментативного, так и неферментативного механизмов наработки оксида азота, нечувствительных к воздействию L-NAME, в условиях воспалительного процесса [Реутов В П и соавт, 1998, Меньшикова ЕБ и соавт, 2000, Beltran В et al 2000,2002]

В результате проведенного исследования было установлено, что L-аргинин не влияет на содержание АФК в цитозоле нейтрофилов ни при ОС w vitro, ни у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями Увеличение уровня АФК отмечалось лишь при добавлении ингибитора NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса (р<0,05)

При оценке количества апоптотичсски измененных клеток оказалось, что L-аргинин эффективно снижал число аннексин-положительных нейтрофилов в культурах с моделированием ОС in vitro до уровня, не отличавшегося от контрольных значений (р>0,05) Исследование чувствительности нейтрофилов крови, полученных у больных с острым воспалением, к воздействию индуктора синтеза оксида азога не позволило выявить изменений количества апоптозных клеток по сравнению с культурой нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, не подвергавшейся воздействию L-аргинина (рис 2)

Предположение о влиянии оксида азота на развитие апоптоза нейтрофилов подтверждается существованием обратной зависимости, выявленной при проведении корреляционного анализа, между концентрацией метаболитов N0 в нейтрофилах и числом аннексин-положительных клеток в культурах нейтрофилов у здоровых доьоров при индукции ОС 5 мМ Н202 (г =-0,83, р<0,05) и в клетках, полученных у больных острыми воспалитезьными заболеваниями (г =-0,59, р<0,05)

Воздействие L-NAME на нейтрофильные лейкоциты, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось увеличением числа аннексин-положительных клеток в 1,2 раза по сравнению с базовым уровнем (р<0,05) (рис 2)

Подводя итог, можно сделать вывод о протекторной роли N0 в регуляции программированной гибели нейтрофилов в условиях окислительного стресса Однако полученные результаты не позволяют однозначно ответить на вопрос, является ли оксид азота протекторным а1ентом непосредственно или сгимулягором механизмов, защищающих клетку от повреждения Установление молекулярных механизмов реализации апопютичсской гибели в ответ на повышение или снижение концентрации оксида азота в клетке в условиях окислительного стресса является важной теоретической и практической задачей Исследования в этом направлении позволят не только сделать выводы о влиянии N0 на апоптоз неитрофилов в условиях экспериментального окислительного стресса, но и предположить схожие механизмы участия оксида азога в развитии гибечи нейтрофилов

3. Молекулярные механизмы управления апоптоза нейтрофилов крови при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении

Для определения молекулярных мишеней воздействия оксида азота при реализации программированной гибели нейтрофилов нами поставлена задача оценки причинно-следственных связей каскадных реакций передачи внутриклеточных сигналов Для исследования регуляторнои роли оксида азота изучены изменения концентрации внутриклеточных мессенджеров (цГМФ, цЛМФ, Ca2f) в нейтрофильных гранулоцитах при развитии окислительного стресса

Исследование концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах у здоровых доноров, проведенное с помощью радиоиммуппого метода, выявило, что данный показатель составл (114,13(101,96-120,55) нМ/106 кл) и (12,25(10,48-17,04) нМ/106 кл), соотве1сгвенно При количественной оценке содержания цАМФ и цГМФ в клетках, подвергшихся воздействию 5 мМ перекиси водорода, было установлено, что концентрация цАМФ возрастала в 1,2 раза (р<0,05), а концентрация цГМФ, напротив, снижалась в 3,0 раза (р<0,05), что приводило к существенному увеличению соотношения циклических нуклеотидов по сравнению с контрольными значениями в 3,4 раза

Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах, полученных у больных с острым воспалением, показало, что значения данного параметра были достоверно ниже аналогичных не только в интактной культуре нейтрофильных гранулоцитов, но и в группе стресс-контроля - в 1,3 и 1,5 раза, соответственно (р<0,05) Содержание цГМФ также было ниже соответствующего параметра в контроле (р<0,05), достигая при этом уровня, близкого к таковому в случае воздействия на клетки in vitro 5 мМ перекиси водорода (рис 2) Выраженное снижение концентрации цГМФ в нейтрофилах, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, обеспечивало увеличение (в 2 раза) отношения концентраций цАМФ/цГМФ в клетке

Увеличение отношения содержания цАМФ и цГМФ при активации программированной клеточной гибели нейтрофилов, по всей видимости, носит защитно-приспособительный характер Данные о влиянии цАМФ на апоптоз относительно малочисленны и свидетельствуют о тканеспецифическом характере регуляции программированной клеточной гибели системой циклических нуклеотидов [Chang Н S et а), 2000, Kato Т et al, 2006]

Возможная биологическая роль повышения содержания цАМФ в нейтрофилах, полученных у бочьных острыми воспалительными заботсваниями, связана со способностью данного циклического нуклеотида подавлять фагоцитоз нейтрофилов макрофагами в очаге воспаления [Rossi A G et al, 1998]

Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-аргинином в условиях окислительного стресса in vitro приводило к достоверному снижению внутриклеточного содержания цАМФ (р<0,05) и увеличению концентрации цГМФ в нейтрофилах до контрольных значений (р>0,05) Трехкратное увеличение содержания цГМФ в нейтрофильных гранулоцитах относительно базового уровня приводило к снижению отношения цАМФ/цГМФ до значений контрольной группы Воздействие индуктора синтеза оксида азота на нейтрофилы, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, не приводило к изменению концентрации цАМФ относительно собственного базового уровня (р>0,05), но сопровождалось увеличением содержания цГМФ в клетках в 2,3 раза (р<0,05), что также приводило к снижению отношения цАМФ/цГМФ Повышение содержания цГМФ, на наш взгляд, может быть

напрямую связано со стимуляцией растворимой гуанилатциклазы оксидом азота [Hanafy К А , 2001, Bian К , 2006]

Приведенная выше интерпретация результатов собственных исследований и анализ данных, полученных другими авторами, позволили высказать предположение, что оксид азота за счет повышения внутриклеточного содержания цГМФ снижает соотношение циклических нуклсотидов до близких к контрольным значениям, тем самым, стабилизируя метаболизм нейтрофилов и продлевая жизнь клетки

Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-NAME в условиях окислительного стресса in vitro приводило к достоверному снижению концентрации цАМФ и цГМФ в нейтрофилах в (1,5 и 3,0 раза, соответственно) (р<0,05) (рис 2), что, однако, сопровождалось увеличением отношения цАМФ/цГМФ в данных клетках Воздействие ингибитора NO-синтазы на нейтрофильные гранулоциты, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, сопровождалось снижением содержания цАМФ и цГМФ (в 1,4 и 1,6 раза относительно базового уровня, соответственно) (р<0,05) (рис 2) и увеличением отношения концентраций циклических нуклеотидов

Увеличение отношения концентраций цАМФ/цГМФ, отмеченное нами в нейтрофильных леикоцитах, культивированных в присутствии 5 мМ Н202 перекиси водорода и ингибитора NO-синтазы, может быть связано с токсическим влиянием Н202 на ддеиилагциклазу и гуанилатциклазу Токсическое влияние перекиси водорода во многом усиливается при отсутствии стабилизирующего влияния оксида азота на электронно-транспортную цепь митохондрий [Beltran В et al 2000,2002] Введение L-NAME в культуральную среду приводило к росту концентрации внутриклеточных АФК и усугубло развитие ОС

Изменение баланса циклических нуклеотидов, отмеченное нами при культивировании нейтрофилов, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями, с селективным ингибитором NO-синтазы, происходило на фоне увеличения числа нейтрофипов, вступивших на путь апоптоза Вероятно, что повышение отношения внутриклеточной концентрации циклических нуклеотидов при развитии программированной гибели нейтрофилов носит транзиторный характер, связанный с нормализацией клеточною метаболизма и предотвращением клеточной гибели

Как показали результаты исследования, направленного на определение концентрации кальция в цитоплазме нейтрофилов крови, значения данного показателя в интакгных клетках у здоровых доноров составили (0,220(0,114-0,234)усл ед) Добавление в культуральную среду 5 мМ перекиси водорода приводило к двукратному повышению содержания Са2+в нейтрофилах крови по сравнению с соответствующим параметром в контроле (р<0,05) (рис 2)

нМ/млн

1 - интакные нейтрофилы

2 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2

3 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 и Ь-аргингоюм

4 - нейтрофилы, культивированные с 5 мМ Н2О2 и Ь-ЫАМЕ

5 - нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями

6 - нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями и культивированные с Ь-аргинином

7 - нейтрофилы, полученные у больных с острыми воспалительными заболеваниями и культивированные с Ь-ЫАМЕ

Рис 2.Нейтрофилы в стадии раннего апоптоза (а), уровень АФК (б) в нейтрофилах, концентрация метаболитов N0 в среде инкубации (в), концентрация цАМФ (г), цГМФ (д) и кальция (е) в нейтрофилах

О

1 2 3 4 5 6 7

Д)

нМ/млн 20 к"

е)

усл. ед. 0,6 т-

0,5

0,4

По нашим данным, концентрация внутриклеточного кальция в нейтрофильных гранулоцитах, полученных у больных с острыми воспалительными заболеваниями, была достоверно в 1,9 раз ниже аналогичною показателя при индукции окислительного стресса (р<0,05) (рис 2).

Существует множество данных о взаимосвяш систем наработки и утилизации АФК с изменением уровня свободного кальция в клетке [Yermolaieva О et al, 2000, 2003] Повышение уровня внутриклеточного кальция в нейтрофилах при воздействии 5 мМ Н202 объясняется стимулирующим влиянием АФК на высвобождение Са2+ из внутриклеточных депо В то же время ионы Са2+ вызывают перестройку липидного матрикса мембраны митохондрии, приводящую к дезорганизации компонентов дыхательной цепи и повышению продукции АФК

Культивирование нейтрофилов с 500 мкМ L-аргинином в условиях экспериментального окислительного стресса приводило к снижению концентрации ионов кальция до контрольных значений (р>0,05)

При воздействий индуктора синтеза оксида азота на нейтрофилы, полученные у больных острыми воспалительными заболеваниями, отмечалось достоверное повышение (в 1,6 раз) содержания кальция по сравнению с базовым уровнем (р<0,05) Однако концентрация внутриклеточною Са2н оставалась значительно ниже по сравнению с данными, полученными при культивировании нейтрофитов той же группы с селективным ингибитором NO-синтазы (р<0,05) и стресс-контролем (р<0,05) (рис 2)

Известно, что митохондрии являются основным депо кальция в клетке Следовательно, по изменению уровня Са2+ можно косвенно судшь о митохондриальной дисфункции Возможно, снижение содержания кальция в нейтрофилах под действием NO происходит за счег стабилизирующего влияния оксида азота на проницаемость митохондриальных мембран [Реутов В П и соавт , 1998, Brune В , 1999, Beitran В et al, 2000,2002]

Наше предположение о подавлении оксидом азота развития апоптотической программы нейтрофилов за счет снижения выхода кальция из митохондрий подтвердилось наличием обратной корреляционной связи между концентрацией метаболитов NO и концентрацией внутриклеточного кальция в клетках стресс-контроля (г=-0,79, р<0,05) и содержанием, полученных у больных острыми воспалительными заболеваниями (г =-0,57, р<0,05)

Воздействие селективного ингибитора NO-синтазы на нейтрофильные гранулоциты, потученные у больных острыми воспалительными заболеваниями и в условиях экспериментального ОС, не приводило к изменению концентрации ионов кальция относительно клеток, подвергнувшихся воздействию 5 мМ перекиси водорода (р>0,05)

Активные формы кислорода и кальции могуг действовать совместно, индуцируя повышение проницаемости внутренней митохондриальной мембраны (образование гигантскои РТР-поры) Имеются сведения о

способности оксида азота предотвращать открытие гигантской поры митохондрии, блокируя тем самым выход ионов Са2+, цитохрома с в цитоплазму и предотвращая запуск каспазного каскада [Brookes PS et al, 2000] Проницаемость РТР-пор зависит от соотношения про- (Вах) и антиапоптотического (Вс1-2) белков [Ravagnan L et al, 1999, Smaih S S et al, 2000]

При оценке содержания проапоптотического белка Вах в нейтрофилах крови, проведенной методом вестерн-блоттинга, было обнаружено отчетливое его увеличение в условиях окислительного стресса in vitro, а также в случае определения этого белка в нейтрофильных лейкоцитах у больных острыми воспалительными заболеваниями

Оценка уровня Вах после воздействия L-аргинина и L-NAME на клетки здоровых доноров, культивированные при действии 5 мМ Н2О2, не выявила изменений значений указанного параметра по сравнению с аналогичным показателем в группе стресс-контроля

Исследование содержания антиапоптотического протеина Вс1-2 в нейтрофилах, проведенное методом вестерн-блоттинга, не выявило указанного белка как в условиях экспериментального стресса, так и при изучении нейтрофилов, полученных у больных с острыми воспалительными заболеваниями. Воздействие L-NAME и L-аргинина не приводило к появлению Вс1-2 в нейтрофилах в условиях окислительного стресса in vitro

Полученные результаты указывают на отсутствие влияния NO на транскрипционные регуляторные механизмы синтеза указанных протеинов Также оксид азота не изменяет функциональные свойства Вах за счет нитрозилирования, что показано для ряда других белков, локализованных на митохондриальных мембранах [Alonso D et al, 2002, Daniel P T et al, 2003]

В целом, в проведенном нами исследовании был освещен и конкретизирован ряд вопросов, затрагивающих взаимосвязь внутриклеточных сигнальных путей, участвующих в реализации программированной гибели нейтрофилов в условиях окислительного стресса При этом важная роль в системе вторичных мессенджеров, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность и функционирование клетки, принадлежит оксиду азота Дальнейшая идентификация молекулярных мишеней действия оксида азота позволит создать картину регуляции клеточных функций, что в конечном итоге будет способствовать разработке подходов управления программированной гибелью клетки при широком спектре патологических процессов, сопровождающихся развитием окислительного стресса

ВЫВОДЫ

1 Окислительный стресс, как индуцированный m vitro, так и развивающийся при остром воспалении, сопровождается увеличением продукции нейтрофильными лейкоцитами оксида азота

2 Оксид азота обладает ингибирующим влиянием на развитие программированной гибели нейтрофилов кучьтивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-аргинином приводит к блокированию развития апоптош в условиях экспериментального окислительного стресса

3 Нарушение реализации программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе не связано с влиянием молекул оксида азота на баланс про- и антиапочтотических белков

4 Блокирующее влияние оксида азота на апотоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro опосредуется через снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция и цАМФ, увеличение содержания в клетках цГМФ

5 Влияние молекул оксида азота на развитие программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов np.i остром воспалении имеет однонаправленный характер с экспериментальной моделью окислительного стресса и сопряжено с увеличением содержания в клетке цГМФ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Жаворонок ГВ, Носарева OJI, Помогаева АП, Бутусова ВН, Стариков Ю В Нарушение физиологического баланса в системе прооксиданты-антиоксиданты при остром воспалении // Тезисы V Сибирского физиологическою съезда - г Томск, 29-30 июня, 1 июля 2005г - Бюллетень сибирскои медицины -2005 -№6, Приложение 1-С 174

2 Жаворонок Т В , Петина Г В , Стсповая Е А , Стариков Ю В . Агеева Т С , Чудакова О M, Рязанцева H В Дезадаптивные изменения структурно-метаболических свойств нейтрофилов при острой пневмонии // Материалы научных конференций, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ -ВестникТГУ -2006 -№21 -С 34-35

3 Жаворонок Т В , Агеева Т С , Петина Г В , Стеновая Е А , Стариков Ю В . Рязанцева II В , Заводовская В Д , Стракевич Е Е Функциональная активность нейтрофилов и оценка окислительной модификации белков при внебольничной пневмонии в зависимости от характера легочного инфильтрата // Материалы XVI Национального конгресса по болезням органов дыхания - г Санкт-Петербург, 14-17 ноября 2006.-Санкт-Петербург, 2006 -С 27

4 Жаворонок Т В , Степовая Е А, Рязанцева H В , Петина Г В , Соколович А Г, Стариков Ю В . Дума M А, Иванов В В , Горемыкин К В , Чудакова О M Нарушение окислительного метаболизма при острых воспалительных заболеваниях // Клиническая лабораторная диагностика - 2006 -№ 12 - С 10-14

5 Zhavoronok Г V , Stepovaya Ye А , Petma G V Stankov Yu V . Ryazantseva N V , Ageeva T S Evaluation of neutrophilic and erythrocytic proteins' oxidative modification in oxidative stress conditions // Abstracts 16th ERS Annual

Congress - Munich, Germany, 2-6 September 2006 - European Respiratory Journal -2006 - Vol 28 - Supplement 50 -P Is

6 Zhavoronok T V, Stepovaya Ye A , Ryazantseva N V, Petina G V, Starikov Yu V. Ageeva T S Influence of oxidative stress on redox-state and peripheral blood heterophilic leukocytes apoptotic program realization // European journal of natural history -2007 -N6 -P 63-64

7 Zhavoronok T V , Stankov YV. Ageeva TS , Ryazantseva N V, Stepovaya E.A, Bychkov V A, Mishustin S P The effect of NO synthesis modulations on calcium accumulation and neutrophil apoptosis during the community-acquired pneumonia // Abstracts 17th ERS Annual Congress -Stockholm, Sweden, 15-19 September 2007 -European Respiratory Journal -2007 -Vol 30 - Supplement51 -P 34s

8 Агеева T С, Жаворонок T В , Тетенев Ф Ф, Кривоногов Н Г, Рязанцева Н В , Завадовская В Д, Стеновая Е А , Дубоделова А В , Петина Г В , Стариков Ю В. Даниленко В Ю Внеболышчные пневмонии клинико-сцинтиграфическая характеристика и окислительный дисбаланс клеток // Клиническая медицина -2007 -№7 -С 43-48

9 Тетенев Ф Ф, Агеева Т С . Жаворонок Т В , Кривоногов М Г , Дубоделова А В , Петина Г В , Стариков Ю В , Рязанцева Н В , Стеновая Е А Дополнительные возможности диагностики внебольничной пневмонии // Сибирский медицинский журнал -2007 -Т68, №1 -С 54-57

10 Жаворонок Т В, Петина Г.В, Стариков Ю В . Агеева Т С, Стеновая ЬА Тиол-дисульфидная составляющая редокс-регуляции нейтрофилов при внебольничных пневмониях // Материалы II Конгресса терапевтов «Новый курс консолидация усилий по охране здоровья нации» - г Москва, 7-9 ноября 2007 -Москва, 2007.-С 75-76

11 Жаворонок Т В , Петина Г В, Агеева Т С , Стариков Ю В . Рязанцева Н В, Степовая Е А, Бычков В А Окислительный метаболизм и апоптоз нейтрофильных лейкоцитов при внебольничной пневмонии // Материалы XVII Национального конгресса по болезням органов дыхания - г Казань, 2-5 октября 2007 - Казань, 2007 -С 128

12 Жаворонок ТВ, Стариков ЮВ, Рязанцева НВ, Степовая ЕА, Бычков В А, Петина Г В Механизмы реализации апоптотической программы нейтрофилов при ингибировании и активации синтеза NO в условиях окислительного стресса m vitro // Материалы Международного междисциплинарного симпозиума «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» - г Судак, Украина, 17-28 сентября 2007 - Судак, 2007 -С 46-48

13 Жаворонок Т В , Пстииа Г В , Стариков Ю В . Степовая Е А , Рязанцева Н В, Агеева Т С Оценка окислительной модификации белков и метаболический статус нейтрофилов при внебольничной пневмонии в зависимости от характера легочного инфильтрата // Материалы Всероссийской

конференции «Национальные дни лабораторной медицины России 2007» - г Москва, 10-12 октября 2007 - Клиническая лабораторная диагностика -2007 -№9 - С 85

14 Стариков Ю В. Бычков В Л Влияние оксида азота на реализацию программированной клеточной гибели неитрофильных лсикоцитов в условиях окислительного стресса in vitro // Материалы Межрегиональной научно-практичсской конференции «Актуальные проблемы медицины» - г Абакан, 1719 мая 2007 - Абакан, 2007 - С 27-29

15 Жаворонок ТВ, Степовая ЕА, Рязанцева НВ, Петина Г В Стариков Ю В. Агеева ТС Окислительный метаболизм клеток в дебюте внебольничной пневмонии // Материалы XX Съезда физиологического общества имени И П Пирогова - г Санкт-Петербург, 4-8 июня 2007 - Санкт-Петербург. 2007 -С 226-227

16 Стариков Ю В, Бычков В А Влияние оксида азота на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vvtro // Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» - г Томск, 1718 мая 2007 -Томск, 2007 - С 200-201

17 Новицкий В В , Рязанцева Н В , Часовских Н Ю, Старикова Е Г, Кайгородова Е В, Стариков Ю В. Жукова О.Б Модуляция апоптоза мононуклеаров в условиях окислительного стресса // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины -2008 -Т 145, №3 -С 251-254

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

ОС - окислительный стресс

цАМФ - циклический адеиозин-3',5'-монофосфат

цГМФ- циклический гуанозин-3',5'-монофосфат

L-NAME - NG-HHTpo-L-aprHiiHH метиловый эфир

Вах - проапоптотический белок (ассоциированный с Вс1-2 белок X)

Вс1-2 - антиапоптотический белок (белок лейкемии В-клеток-2)

NO - оксид азота

Автор выражает благодарность профессору кафедры биохимии и молекулярной биологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ру мед наук, профессору ТС Федоровой, канд мед наук, заведующей лабораторией клинической иммунологии ГУЗ ЦМСЧ № 81 ЗАТО Северск Т Т Радзивил, канд мед наук, доценту кафедры биохимии и молекулярной биологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава ТВ Жаворонок, д-ру мед наук, заведующей Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава Л С Литвиновой за проявленный интерес к работе, ценные теоретические и методические советы, а также за помощь в организации проведения исследований

Издательство «В-Спектр» ИНН/КПП 7017129340/701701001, ОГРН 1057002637768 Подписано к печати 30 05 2008 Формат 60*841/1б Печать трафаретная Бумага офсетная Гарнитура «Times New Roman» Печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ 27 634055, г Томск, пр Академический, 13-24, тел 49-09-91 E-mail bmv@sibmail com

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Стариков, Юрий Витальевич

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Современные представления о роли оксида азота в регуляции апоптоза (обзор литературы).

1.1. Образование оксида азота и внутриклеточные эффекты оксида азота.

1.1.1. Физико-химические свойства молекулы оксида азота.

1.1.2. NO-синтазы - ферменты синтеза оксида азота.

1.1.3. Механизмы накопления молекулы оксида азота в клетке.

1.1.4. Молекулярные механизмы реализации эффектов оксида азота.

1.1.5. Механизмы утилизации молекулы оксида азота.

1.2. Современные представления о молекулярных механизмах апоптоза.

1.2.1. Роль белков семейства Вс1-2 в регуляции апоптоза.

1.3. Молекулярные основы взаимодействия окислительного стресса и апоптоза.

1.3.1. Влияние оксида азота на молекулярные механизмы реализации апоптоза.

1.4. Роль апоптоза нейтрофилов в реализации воспаления: молекулярные механизмы в дизрегуляции программированной гибели эффекторных клеток.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе"

Актуальность исследования. Окислительный стресс характеризуется избыточным увеличением генерации в тканях активных форм кислорода (АФК), приводящих к повреждению нуклеиновых кислот, белков и липидов. В физиологических условиях АФК участвуют в развитии «респираторного взрыва», синтезе гормонов, процессах пролиферации клетки [Владимиров Ю.А., 2000; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Наряду с этим АФК рассматриваются в качестве внутриклеточных мессенджеров, участвующих в регуляции метаболизма клетки. Универсальным участником регуляторных процессов в клетке является оксид азота. На организменном уровне основные эффекты оксида азота проявляют себя в поддержании тонуса сердечно-сосудистой системы, участии в синаптической передаче, регуляции воспалительного ответа и апоптоза клеток [Маеда X., Акаике Т., 1998; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2000].

Апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточных популяций в многоклеточном организме [Kerr J.F.R., 1972]. Активация программированной клеточной гибели напрямую связана с развитием окислительного стресса. Активные формы кислорода вызывают открытие пор во внутренней митохондриальной мембране, набухание матрикса и разрыв внешней мембраны митохондрий с освобождением проапоптотических белков (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) из межмембранного пространства в цитозоль [Yi J. et al., 2002; Лущак В.И., 2007]. Выход цитохрома с приводит к резкому повышению внутриклеточного содержания АФК и активации каспазного каскада [Green D.R., Reed J.C., 1998; Gordon D.M., 2000].

Важнейшим радикалом, участвующим в регуляции апоптоза, является радикал оксид азота (NO). Уникальная химическая природа и большое число внутриклеточных мишеней для NO оставляют открытым вопрос, каким образом опосредуется регулирующее влияние оксида азота на апоптоз в условиях окислительного стресса [Choi В.М. et al., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006].

С одной стороны, известно, что оксид азота способен подавлять синтез белка Вс1-2 и увеличивать экспрессию Вах в митохондриях, провоцируя повышение проницаемости митохондриальной мембраны и выход в цитоплазму клетки АФК [Hortelano S. et al., 1997; Bruene В., 1999; Лущак В.И., 2006; Кулинский В.И., 2007]. Сильный окислитель пероксинитрит, образующийся при взаимодействии оксида азота с супероксиданионом, индуцирует образование гидроксильных и липидных радикалов [Маеда X., Акаике Т., 1998], окисляет NH2- и SH-группы белков, что приводит к ингибированию супероксиддисмутазы и ДНК-лигазы.

С другой стороны, в ряде работ описаны диаметрально противоположные эффекты оксида азота на развитие программированной клеточной гибели. Так, активация NO/цГМФ-зависимого пути отменяла развитие апоптоза моноцитов клеточной линии U937 [De Nadai С. et al., 2000], гепатоцитов и В-лимфоцитов [Choi В.-М. et al., .2002]. Кроме того, блокирование апоптоза может быть связано с нитрозилированием каспазы-3 [Bruene В., 1999; Mannick J.B., 1999]. Следует отметить, что имеются данные, указывающие на способность оксида азота индуцировать синтез белков семейства Вс1-2 [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Choi В.-М. et al., 2002].

Известно, что продукция АФК наиболее значима в нейтрофильных лейкоцитах по сравнению с другими клетками организма. Индукция окислительного стресса при воспалении инициирует развитие программированной гибели нейтрофилов. В связи с тем, что нейтрофилы быстро вступают на путь спонтанно развивающегося апотоза, не требующего какого-либо внешнего сигнала смерти [Edwards S.W. et al., 2003], состояние внутриклеточных сигнальных систем (Са~ , цАМФ и цГМФ), баланс анти- и проапоптотических белков семейства Вс1-2 являются важными регуляторными факторами продолжительности жизни клеток.

Несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза, роль оксида азота в механизмах реализации программированной гибели нейтрофилов в полной мере до конца не ясна. Установление молекулярных механизмов регуляции продолжительности жизни нейтрофильных лейкоцитов позволит создать селективные технологии управления воспалительным процессом.

Цель исследования: изучить роль оксида азота в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить особенности продукции нейтрофилами оксида азота при экспериментальном окислительном стрессе и у больных острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит).

2. Оценить количество апоптотически измененных нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro в условиях влияния индуктора и ингибитора NO-синтазы.

3. Оценить содержание белков-регуляторов с про- (Вах) и антиапоптотической (Вс1-2) активностью при индукции синтеза N0 и ингибировании NO-синтазы в условиях экспериментального окислительного стресса.

2+

4. Определить роль внутриклеточных сигнальных молекул (Са , цАМФ и цГМФ) в регуляции апоптоза нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro при индукции синтеза N0 и ингибировании NO-синтазы.

5. Установить особенности влияния N0 на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней.

Научная новизна. Использование современных молекулярно-биологических и биохимических методов показало, что при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалительном процессе в клинике внутренних болезней (внебольничная пневмония, острый аппендицит) происходит увеличение продукции оксида азота нейтрофильными лейкоцитами.

Показано, что молекулярные механизмы влияния молекул оксида азота на апоптоз нейтрофилов при окислительном стрессе и остром воспалительном процессе сопряжены с участием ионов кальция, цАМФ и цГМФ. Установлено, что влияние оксида азота на реализацию программированной гибели нейтрофилов не связано с влиянием на баланс про- (Вах) и антиапоптотических (Вс1-2) белков.

Теоретическая и практическая значимость. Разработана экспериментальная модель окислительного стресса, позволяющего прогнозировать развитие программированной клеточной гибели нейтрофилов при использовании индукторов и ингибиторов NO-синтаз при острых воспалительных заболеваниях. Полученные в результате проведенного исследования данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы развития программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов, опосредованные молекулами оксида азота, в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней. Установленные закономерности реализации апоптотической программы нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса при воспалении могут быть положены в основу разработки селективных молекулярных технологий управления развитием воспалительного процесса, влияя на продолжительность жизни нейтрофильных лейкоцитов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Молекулы оксида азота оказывают протективный эффект на реализацию апоптотической гибели нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированным 5 мМ Н2О2, и остром воспалительном процессе.

2. Нарушение реализации программированной гибели нейтрофилов при культивировании с индуктором синтеза оксида азота в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении сопряжено с изменением внутриклеточного содержания ионов кальция, цАМФ и цГМФ, не зависит от содержания белков Вах и Вс1-2.

Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VII международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной . и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2007), на Всероссийской конференции «Национальные дни лабораторной медицины России 2007» (Москва, 2007), XX съезде физиологического общества имени И.П. Пирогова (Санкт-Петербург, 2007), II конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации» (Москва, 2007).

В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, по проблеме «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150 - ориентированные фундаментальные исследования 2007-2008), а так же проекта «Разработка способов коррекции нарушений регуляции апоптоза клеток при патологических процессах в условиях окислительного стресса» (гос. контракт № 02.442.11.7276 от 20.02.2006), реализованного в рамках Федеральной целевой научнотехнической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 - в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Стариков, Юрий Витальевич

Выводы

1. Окислительный стресс, как индуцированный in vitro, так и развивающийся при остром воспалении, сопровождается увеличением продукции нейтрофильными лейкоцитами оксида азота.

2. Оксид азота обладает ингибирующим влиянием на развитие программированной гибели нейтрофилов: культивирование нейтрофильных лейкоцитов с L-аргинином приводит к блокированию развития апоптоза в условиях экспериментального окислительного стресса.

3. Нарушение реализации программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе не связано с влиянием молекул оксида азота на баланс про- и антиапоптотических белков.

4. Блокирующее влияние оксида азота на апоптоз нейтрофилов в условиях окислительного стресса in vitro опосредуется через снижение внутриклеточной концентрации ионов кальция и цАМФ, увеличение содержания в клетках цГМФ.

5. Влияние молекул оксида азота на развитие программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов при остром воспалении имеет однонаправленный характер с экспериментальной моделью окислительного стресса и сопряжено с увеличением содержания в клетке цГМФ.

116

Заключение

К настоящему времени, несмотря на интенсивные исследования роли оксида азота в реализации апоптоза, не существует детальной картины данного процесса. Различные механизмы, активирующие или подавляющие клеточную гибель, тесно переплетены между собой и, зачастую, трудно выделить про- или антиапоптотическое влияние NO. Сегодня накоплено равное количество фактических данных, свидетельствующих как о защитных, так и о цитотоксических эффектах оксида азота, иногда напрямую противоречащих друг другу. В ряде работ продемонстрирована антиапоптотическая роль оксида азота: посредствам усиления экспрессии белков теплового шока и белков семейства Вс1-2. Нитрозилирование каспазы-3 приводит к подавлению развития внутреннего пути активации апоптоза. По другим данным, повреждение ДНК, вызванное накоплением NO, активирует экспрессию р53, снижает уровень внутриклеточного белка Вс1-2 и повышает экспрессию Вах. Вместе с тем установлено, что накопление токсических метаболитов оксида азота - нитрозония иона (NO+), нитроксила иона (N0") и пероксинитрита (0N00") - может приводить к некротической гибели клетки. При этом разнообразные эффекты оксида азота зависят от редокс-статуса клетки, определяемого функциональным состоянием митохондрий.

Весьма интересной клеточной моделью для изучения роли NO в регуляции апоптоза являются нейтрофилы. Респираторный взрыв при развитии воспалительного процесса приводит к накоплению активных форм кислорода и резкому изменению редокс-статуса данных клеток. Центральная роль в данном процессе принадлежит митохондриям, функция которых в развитии программированной гибели нейтрофилов в условиях ОС до конца не установлена. Создание экспериментальной модели окислительного стресса, имитирующей развитие «респираторного взрыва» в очаге воспаления, и изучение влияния оксида азота на продолжительность жизни нейтрофилов, позволит получить фундаментальные знания для разработки технологических подходов контролирования воспалительных реакций как путем стимуляции, так и подавления программированной гибели клеток.

Глава 2. Материал и методы исследования 2.1. Материал исследования

Для реализации предпринятого нами исследования были выделены экспериментальный и клинический блоки, включавшие манипулирование in vitro нейтрофильными лейкоцитами, полученными у здоровых доноров и у больных острыми воспалительными заболеваниями.

В исследование были включены 32 здоровых донора-добровольца (18 мужчин и 14 женщин) в возрасте от 18 до 40 лет (25,0±5,4 лет). Обследовали 54 пациента (30 мужчин и 24 женщины) в возрасте от 18 до 50 лет (32,0±3,0 лет) с острыми воспалительными заболеваниями. Из них 29 человек с внебольничной пневмонией (13 мужчин и 16 женщин) и 25 больных острым аппендицитом (17 мужчин и 8 женщин). Все пациенты поступали в стационар в порядке скорой медицинской помощи, обследование проводили до назначения терапии. У всех пациентов было получено информированное согласие на проведение исследования.

Набор клинического материала проводили на базе и при участии сотрудников кафедры терапии усовершенствования врачей (зав. кафедрой -канд. мед. наук, доцент Т.С. Агеева) Томского военно-медицинского института; терапевтического отделения (зав. отделением — канд. мед. наук А.В. Дубоделова) и хирургического отделения (зав. отделением - канд. мед. наук В.Я. Митасов) ММЛПУ «Городская больница №1» (главный врач -С.М. Кирютенко) (г. Томск); кафедры госпитальной хирургии (зав. кафедрой - член-корреспондент РАМН, проф. Г.Ц. Дамбаев) ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г. Томск).

Для верификации диагноза использовали лабораторные (общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови и др.) и инструментальные (УЗИ, рентгенологическое исследование органов брюшной и грудной полости и др.) методы исследования.

Критериями исключения являлись возраст менее 18 и более 50 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, алкогольная и наркотическая зависимости.

Материалом исследования служила венозная кровь, взятая из локтевой вены утром натощак с помощью стандартных вакуумных систем "BD VACUTAINERTM" («Greiner-bio-one», Австрия) с антикоагулянтом гепарином (25 Ед/мл).

2.1.1 Экспериментальный блок исследования

Одним из методов познания сложных механизмов развития патологических процессов в организме является биологическое моделирование [Давыдовский И.В., 1969].

Известно, что окислительный стресс in vitro воспроизводится с использованием различных модельных систем (инкубация клеток с оксидом мышьяка (III) (As203) [Yi J. et al., 2002; Shen Z.-Y. et al., 2003] или пероксидом водорода [Yamamoto К. et al., 2003; Akishita M. et al., 2005]). Вместе с тем широкое распространение на сегодняшний день получил метод индуцирования ОС пероксидом водорода. Ряд авторов указывали на способность Н2О2 активировать митохондриальный путь запуска программированной гибели разнообразных соматических клеток, культивированных in vitro. Считается, что концентрации перекиси водорода меньше 50 мМ не вызывают гибели большинства клеток, однако, в концентрациях от 0,1 до 50 мМ Н2О2 способна вызывать различные функциональные изменения [Владимиров Ю.А. и соавт., 2006; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006].

Отсутствие данных литературы, свидетельствующих об изменениях метаболизма нейтрофилов в зависимости от концентрации перекиси водорода in vitro, различные способы индикации фенотипических проявлений апоптоза и некроза определили задачу экспериментального подбора оптимальной концентрации Н2О2, способной индуцировать как развитие ОС, так и программированную гибель нейтрофильных лейкоцитов.

Для этого выделенные нейтрофилы крови культивировали в стерильных пенициллиновых флаконах и 96-луночных круглодонных иммунологических планшетах. Во флаконы и лунки планшетов вносили суспензию клеток, доводили полной культуральной средой до концентрации 2-106/мл и добавляли перекись водорода в конечной концентрации 1, 5, 10 и 50 мМ (указанные концентрации Н2О2 являются, по данным литературы, оптимальными для моделирования влияния окислительного стресса на внутриклеточные процессы [Simon H.U. et al., 2000; Зенков Н.К. и соавт., 2001; Владимиров Ю.А. и соавт., 2006]). Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37°С и 5% СО2.

2.1.2. Клинический блок исследования

В программу исследования были включены 29 человек (13 мужчин и 16 женщин) с диагнозом внебольничной пневмонии средней степени тяжести. Указанный диагноз был поставлен в соответствии с данными анамнеза и физикального обследования пациентов. Критерием включения в группу обследованных лиц являлось наличие внебольничной пневмонии средней степени тяжести.

При перкуссии грудной клетки у больных выявлялись симптом уплотнения легкого, притупление перкуторного звука, усиливалось голосовое дрожание, при аускультации над очагом воспаления определялись крепитация или влажные звучные мелкопузырчатые хрипы.

У обследованных больных рентгенологически определялось усиление легочного рисунка, выявлялись участки инфильтрации паренхимы легких. Правое и левое легкое были поражены с одинаковой частотой — 13 (44%) и 16 пациентов (56%), соответственно. По данным бактериологических посевов и ПЦР-диагностики, у 40% пациентов определялось инфицирование Mycoplasma pneumoniae, у 60% больных - Pneumococcus (Streptococcus pneumoniae).

Клинико-лабораторное обследование включало биохимический анализ крови (содержание G-реактивного белка, серомукоидов, общего белка, глюкозы, при необходимости - активность аминотрансфераз (аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы), а-амилазы), общий анализ мочи и крови. При этом были зарегистрированы резкое повышение концентрации С-реактивного белка (выше 10 мг/л), нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево (у 97% пациентов), увеличение скорости оседания эритроцитов (выше 8 мм/ч - у 93% мужчин, выше 15 мм/ч - у 86% женщин).

В клиническую группу пациентов с острым аппендицитом были включены 25 человек (17 мужчин и 8 женщин). У 40% (10* пациентов) выявлялся острый катаральный аппендицит, у 32% (8 пациентов) - острый флегмонозный аппендицит, у 8% (2 пациента) - острый гангренозный аппендицит. Диагноз острого аппендицита ставился на основании наличия положительных симптомов Ситковского, Ровзига, Бартолье-Михельсона, Воскресенского, Волочкова и лабораторных исследований, проводимых для исключения других острых заболеваний брюшной полости. У пациентов отмечалось повышение температуры тела (в среднем - до 38,5° С), увеличение частоты сердечных сокращений. Все обследованные пациенты имели жалобы на острую боль в правой подвздошной области и наличие диспепсических расстройств.

Клинико-лабораторное обследование больных острым апендицитом включало биохимическую оценку крови (активность аминотрансфераз (аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы), а-амилазы, содержание общего белка, креатинина, мочевины, общего билирубина), общий анализ крови и мочи, оценку гемостаза. При этом были зарегистрированы резкое повышение концентрации С-реактивного белка (выше 10 мг/л), нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево (у 87 % пациентов), увеличение скорости оседания эритроцитов (у 80% мужчин и у 75% женщин).

2.2. Методы исследования

В соответствии с поставленными целью и задачами исследования был предложен дизайн, предполагающий разделение работы на два последовательных этапа.

На первом этапе исследования проводили оценку выраженности апоптоза нейтрофильных лейкоцитов крови в условиях экспериментального окислительного стресса и при остром воспалении в клинике внутренних болезней (табл. 1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Стариков, Юрий Витальевич, Новосибирск

1. Болдырев, А.А. Карнозин и защита тканей от окислительного стресса / А.А. Болдырев. М.: Изд-во Диалог-МГУ. - 1999. - 364 с.

2. Болдырев, А.А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине. / А.А. Болдырев. М.: Изд-во МГУ, 19981 -320 с.

3. Брюне, Б. Апоптотическая гибель клеток и оксид азота: механизмы активации и антагонистические сигнальные пути / Б. Брюне, К. Сандау, А. фон Кнетен / Биохимия.- 1998.- Т. 63, вып. 7. С. 966-976.

4. Бурлакова, Е.Б. Блеск и нищета, антиоксидантов / Е. Б. Бурлакова // Наука и жизнь. 2006. - №2. - С. 37-43.

5. Ванин, А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы — две возможности формы стабилизации и транспорта оксида азота в биосистемах / А.Ф. Ванин // Биохимия. — 1998а. Т. 63, вып. 7. - С. 924-938.

6. Ванин, А.Ф. Оксид азота в биологии: история, состояние и перспективы исследований / А.Ф. Ванин // Биохимия. 1998.- Т. 63, вып. 7. -С. 867-869.

7. Ванин, А.Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях / А.Ф. Ванин // Вестник РАМН. 2000. - № 4. - С. 3-5.

8. Ванин, А.Ф. Оксид азота и его обнаружение в биосистемах методом электронного парамагнитного резонанса. //Успехи физиологических наук. 2000 а.- Т. 170, №.4. - С.455-458.

9. Васильева, Е.М. Влияние системы Ь-аргинин-NO на активность АТФаз и ПОЛ эритроцитов / Е.М. Васильева, М.И. Баканов, Х.М. Марков // Бюл. экспер. биол.- 1999.- Т. 128, № 9. С. 321-323.

10. Ю.Викторов, И.В. Роль оксида азота и других свободных радикалов в ишемической патологии мозга / И.В. Викторов // Вестник РАМН.-2000.-№4.-С. 5- 10.

11. П.Владимиров, Ю. А. Свободные радикалы в биологических системах. / Ю.А. Владимиров// Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6, № 12. - С13-19.

12. Голиков П.П. Оксид азота в клинике неотложных заболеваний / П.П. Голиков. М.: ИД Медпрактика-М. - 2004. - 180 с.

13. Голиков, П.П. Роль оксида азота в патологии / П.П. Голиков, А.П. Голиков // Международный медицинский журнал. ТОП. Медицина. — 1999.-№5.-С. 24-27.

14. Гольдберг, Е.Д. Методы культуры тканей в гематологии / Е.Д. Гольдберг, A.M. Дыгай, И.А. Шахов. Томск: Изд-во Том. ун-та. -1992.- 264 с.

15. Гордеева, А.В. Взаимодействие между активными формами кислорода и кальцием в живых клетках / А.В. Гордеева, Р.А. Звягилевская, Ю.А. Лабас//Биохимия.-2003.-Т 68, № 10.-С. 1318-1322.

16. Гуревич К.Г. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функции / К.Г. Гуревич, H.JI. Шимановский // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. — 2000. № 4. - С. 16-22.

17. Давыдовский, И.В. Общая патология человека / И.В. Давыдовский. -М., Медицина. 1969. - 232 с.

18. Динитрозильные комплексы железа — новый тип гипотензивных препаратов / А. А. Тимошин, Ц. Р. Орлова, А. Ф. Ванин и др. // Российский химический журнал. 2007. - Т. LI., № 1. - С. 88-93.

19. Дромашко, С.Е. Моделирование генетических процессов / С.Е. Дромашко. Минск: Издательский дом «Право и Экономика». - 1999.200 с.

20. Дубинина, Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса / Е.Е. Дубинина // Вопросы медицинской химии.- 2001. Т.47, №6,- С. 561-581

21. Жукова, О.Б. Апоптоз и вирусная инфекция / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий. Томск: Изд-во Том. ун-та. - 2006. — 142с.

22. Зенков, Н.К., Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Ланкин, Е.Б. Меныцикова. М.: МАИК «Наука/Интерпериодика». - 2001. - 343 с.

23. Значение химических свойств оксида азота для лечения онкологических заболеваний / Д.А. Винк, Й. Водовозов, Д.А. Кук и др. // Биохимия. 1998. - вып.7. - С. 948-957.

24. Кансон, К.П. Програмированная клеточная гибель (апоптоз): молекулярные механизмы и роль в биологии и медицине / К.П. Кансон // Вопросы медицинской химии.-1997.-Т.43, вып 5.-С. 402-415.

25. Кардиолипин активирует пероксидазную активность цитохрома с, потому что увеличивает доступность железа гема для Н2О2 / Ю. А. Владимиров, Е. В. Проскурнина, Д. Ю. Измайлов и др. // Биохимия. 2006. - Т. 71, вып. 9. - С. 1225-1233.

26. Критические состояния: качественные уровни системной воспалительной реакции / Е.Ю. Гусев, JI.H. Юрченко, Н.В. Зотова и др. // Журнал интенсивная терапия. 2006. - № 1. - С. 18-21.

27. Крыжановский, Г.Н. Дизрегуляционая патология. / Г.Н. Крыжановский // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2002. -№3. - С.2-19.

28. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высш. шк.- 1980.- 293 стр.33:Лебедев, В.В. Супероксидная теория патогенеза и терапии иммунных расстройств/ В.В. Лебедев // Вестник РАМН. 2004. С 34 -40.

29. Лущак, В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма (обзор) / В.И. Лущак // Биохимия. 2007. - Т. 72, вып. 8. - С. 995-1018.

30. Маеда, X. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке/ X. Маеда, Т. Акаике // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7.-С. 1007-1019.

31. Маянский, А. Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. Новосибирск: Наука. - 1989. -221 с.

32. Маянский, Н. А. Внутренний путь апоптоза нейтрофилов и механизмы антиапоптозного эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора / Н. А. Маянский // Иммунология. 2004. - №6. - С. 327-330.

33. Маянский, Н.А. Митохондрии нейтрофилов: особенности физиологии и значение в апоптозе / Н.А. Маянский // Иммунология.- 2004а.- №5. -С. 307-311.

34. Маянский, Н.А. Субклеточное перераспределение Вах и его слияние с митохондриями при спонтанном апоптозе нейтрофилов. / Н. А. Маянский // Иммунология. 2001. - №6. - С. 29-32.

35. Меныцикова; Е.Б. Оксид азота и NO синтазы при различных функциональных состояниях / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков, В.П. Реутов // Биохимия. - 2000. - Т. 65, № 4. - С. 485-503.

36. Методы изучения метаболизма оксида азота / Т.В. Звягина, И.Е. Велик, Т.В. Аникеева и др. // Вестник гигиены и эпидемиологии. 2001. - Т.5, №2.-С. 253-256.

37. Механизмы передачи сигнала оксидант оксид азота в сосудистой ткани / М.С. Волин, К.А. Дэвидсон, П.М. Камински и др // Биохимия. — 1998.-вып. 7.-С. 958-965.

38. Новые мутации в гене р53 человека— регуляторе клеточного цикла и канцерогенеза / К. Н. Кашкин, С. В. Хлгатян, О. В.Гурова и др. // Биохимия.-2007.-Т. 72, вып. 3. С. 346-357.

39. Окислительный стресс и эндогенная интоксикация у больных в критических состояниях / Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, И.Н. Пасечник и др. // Вестник интенсивной терапии. 2002. - № 4. - С. 4-7.

40. Пасечник, И.Н. Окислительный стресс и критические состояния у хирургических больных / И.Н. Пасечник // Вестник интенсивной терапии. 2004. - №3. - С. 27-30.

41. Пероксид водорода, образуемый внутри митохондрий, участвует в передаче апоптозного сигнала от клетки к клетке / Плетюшкина О. Ю., Фетисова Е. К., Лямзаев К. Г. и др. // Биохимия. 2006. — Т. 71, вып. 1.-С. 75-84.

42. Поленов, М.А. Окись азота в регуляции функции желудочно-кишечного тракта / М.А. Поленов // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1998. - №1. - С. 53-61.

43. Потапнев, М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами / М.П.Потапнев // Иммунология. 2002. - №4. - С. 237— 243.

44. Раевский, К.С. Роль оксида азота в глутаматергической патологии мозга / К.С. Раевский, В.Г. Башкатова, А.Ф. Ванин // Вестник РАМН.-2000. №4.-С. 11-15.

45. Регуляция пероксидазной активности цитохрома с с помощью оксида азота и лазерного излучения / А. Н. Осипов, Г. О. Степанов, Ю. А. Владимиров и др. //Биохимия. -2006. -Т. 71, вып. 10.-С. 1392-1398.

46. Реутов, В.П. Цикл оксида азота в организме млекопитающих и принцип цикличности / В.П. Реутов // Биохимия. 2002. - Т. 67, №3. -С. 353-376.

47. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционных болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, А.В. Шестопалов и др. // Вопросы медицинской химии. 2000. - Т. 46, вып. 2. - С. 35-8.

48. Руднов, В.А. От локального воспаления к системному: выход на новые представления патогенеза критических состояний и перспективы терапии / В.А. Руднов // Журнал интенсивная терапия. 2006. - № 1 С. 35-38.

49. Сапей, А.П. Роль оксида азота в формировании мотивационного поведения и обучения / А.П. Сапей, М.И. Рецкий // Вестник ВГУ. Серия химия, биология, фармация. 2003. - №1. - С. 75-80.

50. Северина, И.С. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатциклазы в механизмах его физиологических эффектов / И.С. Северина // Вопросы медицинской химии. 2002. - вып 1. - С.4-30.

51. Сомова, Л.М. Оксид азота как медиатор воспаления / JI.M. Сомова Н.Г. Плехова Н Вестник ДВО РАН. 2006. - № 2. - С. 77 - 80.

52. Тодоров, И. Н. Митохондрии: окислительный стресс и мутации митохондриальной ДНК в развитии патологий, процессе старения иапоптозе / И. Н. Тодоров // Российский химический журнал. — 2007. -Том LI, № 1.-С. 93-107.

53. Федоров, Н.А. Циклические нуклеотиды и их аналоги в медицине / Н.А. Федоров, М.Г. Радуловацкий, Г.Е. Чехович. М.: Медицина. — 1990.- 176 с.

54. Циклические превращения оксида азота в организме млекопитающих / В.П. Реутов, Е.Г. Сорокина, В.Е. Охотин, Н.С. Косицын. М.: Наука. -1998. - 159 с.

55. Штрыголь, С. Ю. Нитраты: побочное действие, его профилактика и коррекция / Штрыголь С. Ю. // Провизор. 2003. - N9. - С. 30-36.

56. A hierarchical role for classical pathway complement proteins in the clearance of apoptotic cells in vivo / P.R. Taylor, A. Carugati, V.A. Fadok et al. // J. Exp. Med. 2000. - Vol. 192. - P.359-366.

57. Abu-Soud, H.M. Nitric oxide is a physiological substrate for mammalian peroxidases / H.M. Abu-Soud, SX. Hazen // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275.-P. 37524-37532.

58. Activation of the cardiac calcium release channel (ryanodine receptor) by poly-S-nitrosylation / L. Xu, J.P. Eu, G. Meissner et al. // Science. 1998. -Vol. 279.-P. 234-237.

59. Allen, R.G. Oxidative stress and gene regulation / R.G. Allen, M. Tresini // Free Radic. Biol. 2000. - Vol.28. - P. 463-499.

60. Analysis of nitrate, nitrite, and l5N.nitrate in biological fluids / L.C. Green, D.A. Wagner, J. Glogowski et al. // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 126, N1. -P. 131-138.

61. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure / M. Van Engeland, L. J. W. Nieland, F. C. S. Ramaekers et al. // Cytometry. 1998. - Vol. 31. - P. 1-9.

62. Antonsson, В. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family "killer-proteins" and their victim the mitochondrion / B. Antonsson // Cell Tissue Res. 2001. -Vol. 306.-P. 347-361.

63. Apoptosis and airway inflammation кь asthma / A. M. Vignola, G. Chiappara, R. Gagliardo et al. // Apoptosis. 2000. - N5. - P. 473-485.

64. Arrigo, A.P. Small stress proteins: Chaperones that act as regulators of intracellular redox state and programmed cell death / A.P. Arrigo // Biol. Chem. 1998. - Vol.379. - P. 19-26.

65. Asaho, T. Various pathogenetic factors revolving around the central role of protein kinase С activation in the occurrence of cerebral vasospasm / T. Asaho, T. Matsui // Critical Rev. in Neurosurgery. 1998. - Vol. 8, N 3. -P. 176-187.

66. Association of Bax and Bak homo-oligomers in mitochondria. Bax requirement for Bak reorganization and cytochrome с release / V. Mikhailov, M. Mikhailova, K. Degenhardt et al. // J Biol Chem. 2003. -Vol. 278, N7. - P.5367-5376.

67. Bellamy, T.C. On the activation of soluble guanylyl cyclase by nitric oxide / T.C. Bellamy, J. Wood, J. Garthwaite // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2002.-V. 99.- P. 507-510.

68. Ben-juan, W. Hydrogen peroxide induced apoptosis in SV-40 transformed human salivary gland acinar cells. / W. Ben-juan, Z. Zeng-tong // Oral Oncol. 2007. - Vol. 43., N3. - P.248-251.

69. Bignold, L.P. Mechanism of separation of polymorphonuclear leucocytes from whole blood by the one step hypaque flcoll method / L.P. Bignold, A. Ferrante //J.Immunol. methods. 1987. - № 1. - Vol.96. - P. 29-33.

70. Biogenic Amines and Polyamines: Similar Biochemistry for Different Physiological Missions and Biomedical Applications/ M. A. Medina, J. L.

71. Urdiales, С. Rodriguez-Caso et al. 11 Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2003. -Vol. 38,Nl.-P.23-59.

72. Catalytic consumption of nitric oxide by prostaglandin H synthase-1 regulates platelet function / V.B. O'Donnell, B. Coles, M.J. Lewis et al. // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 38239-38244.

73. Chen, Q. Redox regulation of apoptosis before and after cytochrome С release / Q. Chen, M. Crosby, Almasan A. // Korean J. Biol. Sci. 2003. -Vol. 7, N 1. — P. 1-9.

74. Coexistence of translocated cytochrome с and nitrated protein in neurons of the rat cerebral cortex after oxygen and glucose deprivation. / D. Alonso, J. M. Encinas, L. O. Uttenthal et al. // Neuroscience. 2002. - Vol! 111. - P. 47-56.

75. Concentration-dependent effects of nitric oxide on mitochondrial permeability transition and cytochrome с release. / P. S. Brookes, E. P. Salinas, K. Darley-Usmar et al. // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 20474-20479.

76. Coxon, A. Cytokine-activated endothelial cells delay neutrophil apoptosis in vitro and in vivo. A role for granulocyte/macrophage colony-stimulatingfactor / A. Coxon, T. Tang, T.N. Mayadas // J. Exp Med. 1999. - Vol. 190. - P. 923-934.

77. CXC chemokine suppression of polymorphonuclear leukocytes apoptosis and preservation of function is oxidative stress independent / A.L. Dunican, S.J. Leuenroth, A. Ayala et al. // Shock. 2000. - Vol. 13. - P. 244^-250.

78. Cyclic AMP delays neutrophil apoptosis via stabilization of Mcl-1. / T. Kato, H. Kutsuna, N. Oshitani et al. // FEBS Lett. 2006 Vol. 580. - P. 4582-4586.

79. Cyclic AMP regulation of neutrophil apoptosis occurs via a novel protein kinase A-independent signaling pathway / M.C. Martin, I. Dransfield, C. Haslett et al. // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, N. 48. - P. 45041-45050.

80. Diffusion-limited reaction of free nitric oxide with erythrocytes. / X. Liu, M.J. Miller, M.S. Joshi et al. // J. Biol Chem. 1998. - Vol. - 273. -P.18709-18713.

81. Direct demonstration of delayed eosinophil apoptosis as a mechanism causing tissue eosinophilia / H.U. Simon, S. Yousefi, C. Schranz et al. // J. Immunol. 1997. - Vol. 158. - P. 3902-3908.

82. Disruption of Fas receptor signaling by nitric oxide in eosinophils / H. Hebestreit, B. Dibbert, I. Balatti et al. // J. Exp. Med. 1998.- Vol. 187. - P. 415-425.

83. Distinct and specific functions of cGMP-dependent protein kinases / S.M. Lohmann, A.B. Vaandrager, A. Smolenski et al.// Trends Biochem Sci.-1997.- V. 22.- N. 8.- P. 307-312

84. Edwards, R. M. Interaction of L-arginine analogs with L-arginine uptake in rat renal brush border membrane vesicles / R. M. Edwards, E. J. Stack, W. Trizna // JPET. 1998.-Vol. 285,N.3.-P. 1019-1022.

85. Effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and cyclic. AMP interaction on human neutrophil apoptosis / C. Tortorella, G. Piazzolla, F. Spaccavento et al. // Mediators Inflamm. 1998. - Vol. 7, N.6. -P. 391-396.

86. Endothelial cell determinants of susceptibility to neutrophil-mediated killing / H. S. Murphy, R.L. Warner, N. Bakopoulos et al. // Shock. 1999. - Vol. 12.-P. 111-117.

87. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders / D. B. Cines, E.S. Pollak, C.A. Buck et al. // Blood.- 1998. Vol; 91.-P. 3527-3561.

88. Evidence for the involvement of cGMP and protein kinase G in nitric oxide-induced apoptosis in the pancreatic p-cell line, HIT-tl5 / A.C. Loweth, G.T. Williams, J.H.B. Scarpello et al. // FEBB Lett. 1997. - Vol. 400. - P. 285-288.

89. Extracellular matrix regulates apoptosis in human neutrophils / R. Kettritz, Y.X. Xu, T. Kerren et al // Kidney Int. 1999. - Vol. 55. - P.562-571.

90. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: A graded response to membrane stimulation / D.A. Bass, J.W. Parce, L. R. Dechatelet et al. // J. Immunol. 1983. - Vol. 130. - P.1910-1917.

91. Friebe, A. Regulation of Nitric Oxide-Sensitive Guanylyl Cyclase / A. Friebe, D. Koesling // Circ. Res. 2003. - Vol. 93. - P. 96-105.

92. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis / N. A. Maianski, J. Geissler, S.M. Srinivasula et al. // Cell Death Differ. 2004. - Vol. 11. - P. 143-153.

93. Genome-wide comparison of human keratinocyte and squamous cell carcinoma responses to UVB irradiation: implications for skin and epithelial cancer / J.E. Dazard, H. Gal, N. Amariglio et al. // Oncogene. 2003. - Vol. 22.-P. 2993-3006.

94. Ghosh, M. Role of oxidative stress and nitric oxide in regulation of spontaneous tone in aorta of DOCA-salt hypertensive rats / M. Ghosh, H.D. Wang, J.R. McNeill // Br. J. Pharmacol. 2004. - Vol. 141. - P. 562-573.

95. Gordon, D.M. Mechanisms of mitochondrial protein import / D.M. Gordon, A. Dancis, D. Pain // Essays Biochem. 2000. - Vol. 36. - P.61-73

96. Gottlieb, R.A. Mitochondria: execution central / R.A. Gottlieb // FEBS Lett. 2000. - Vol. 482. - P. 6-12.

97. Green, D.R. Mitochondria and apoptosis / D.R. Green, J.C. Reed // Science. 1998. - Vol. 281. - P.1309-1312.

98. Gregory, C.D. CD14-dependent clearance of apoptotic cells: Relevance to the immune system / C.D. Gregory // Curr. Opin. in Immunol. 2000. - N12. - P. 27-34.

99. Guanylyl cyclases and signaling by cyclic GMP / K.A. Lucas, G.M. Pitari, S Kazerounian et al. // Pharmacol Rev. 2000. - Vol. 52, N. 3. - P. 375-414.

100. Guardians of cell death: the Bcl-2 family proteins / P.T. Daniel, K. Schulze-Osthoff, C. Belka et al. // Essays Biochem. 2003. - Vol. 39. - P. 73-88.

101. H202 induces DNA repair in mononuclear cells: Evidence for association with cytosolic Ca 2+ fluxes / A. Korzets, A. Chagnac, T. Weinstein et al. // J. Lab. Clin. Med. 1999. - Vol. 133. - P 362-369.

102. Hanafy, К. A. NO, nitrotyrosine, and cyclic GMP in signal transduction / K. A. Hanafy, J. S. Krumenacker, F. Murad // Med Sci Monit. 2001.-Vol.7, N4. - P. 801-819.

103. Heparin-binding protein targeted to mitochondrial compartments protects endothelial cells from apoptosis / A. M. Olofsson; M. Vestberg, H. Herwald et al. // J. Glin Invest. 1999; - Vol. 104. - P. 885-894.

104. Hofmann, F. Rising behind NO: cGMP- dependent protein kinases / F. Hofmann, A. Ammendola, J. Schlossmann //J. Cell Sci. 2000. - Vol. 113. -P. 1671-1676.

105. Hydrogen peroxide modulates meiotic cell cycle and induces morphological features characteristic of apoptosis in rat oocytes cultured in vitro. / S.K. Chaube, P.V. Prasad, S.C. Thakur et al. / Apoptosis.- 2005. -Vol. 10, N.4. P.863-874.

106. Inhibition of mitochondrial respiration by endogenous nitric oxide: A critical steps in Fas signaling / B. Beltran, M. Quintero, E. Garcia-Zaragoza et al. // Proc Natl Acad Sci USA.-2002.-Vol. 99.-P. 8892-8897.

107. Interleukin-8 delays spontaneous and tumor necrosis factor-a-mediated apoptosis of human neutrophils. / R. Kettritz, M. L. Gaido, H. Haller et al. // Kidney Int. 1998. - Vol. 53. - P. 84-91.

108. Involvement of reactive oxygen intermediates in spontaneous and CD95 (Fas/APO-l')-mediated apoptosis of neutrophils / Y. Kasahara, L Kazuyuki, A. Yachie et al. // Blood. 1997. - Vol.89. - P. 1748-1753.

109. Kerr, J.F.R. Apoptosis: a basic biological phemomenon with'wide-ranging implications in tissue kinetics/ J.F.R. Kerr, A.H. Wyllie, A.R. Curne //Br J Cancer. 1972. - Vol. 26, N2. - P. 239-257.

110. Khan, S.A. The role of nitric oxide in the physiological regulation of Ca2+ cycling / S.A. Khan, J.M. Hare // Curr Opin Drug Discov Devel. -2003. Vol. 6, N5. - P.658-666.

111. Kowaltowski, A.J. Mitochondrial permeability transition and oxidative stress / A.J. Kowaltowski, R.F. Castilho, A.E. Vercesi // FEBS Lett.-2001 Vol. 495.-P. 12-15.

112. Krammer, P.H. CD95 (APO-l/Fas)-mediated apoptosis: Live and let die/P.H. Krammer//Adv. Immunol. 1999. - Vol. 71. - P. 163-210.

113. Laemmli, U.K., Clevage of structural proteins during the assembly of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680685.

114. Liu, L. Ametabolic enzyme for S-nitrosothiol conserved from bacteria to humans / L. Liu, A. Hausladen, M. Zeng // Nature. 2001. - V.410. -P.490-494.

115. Lonidamine triggers apoptosis via a direct, Bcl-2-inhibited effect on the mitochondrial permeability transition pore / L. Ravagnan, I. Marzo, P. Costantini et al. // Oncogene. 1999. - Vol 18. - P. 2537-2546.

116. Maianski, N. A. Tumor necrosis factor a induces a caspase-independent pathway in human neutrophils / N. A. Maianski, D. Roos, T.W. Kuijpers//Blood.-2003.-Vol. 101.-P. 1987-1995.

117. Mannick, J.B. Fas-induced caspase denitrosylation / J.B. Mannick, A. Hausladen, L. Liu // Science. 1999. - Vol. 284. - P.651-654.

118. Mates, J.M. Role of reactive oxygen species in apoptosis: Implications for cancer therapy / J.M. Mates, F.M. Sanchez-Jimenez //Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. - Vol. 32. - P. 157-170.

119. Mcl-1 expression in human neutrophils: Regulation by cytokines: and correlation with cell survival / D.A. Moulding, J.A. Quayle, C.A. Hart et al. // Blood. 1998. - Vol. 92. - P. 2495-2502.

120. Methionine sulfoxide reductase A protects neuronal cells against brief hypoxia/reoxygenation. / O: Yermolaieva, R. Хщ С. Schinstock et al. // Proct. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 101, N5. - P 1159-1164.

121. Nitric oxide as a.pro-apoptotic as well as anti-apoptotic modulator / B.-M. Choi, H.-O. Рае, S. I. Jang et al. // Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2002. - Vol. 35, N1. - P.l 16-126.

122. Nitric Oxide as. a Unique Bioactive Signaling Messenger in Physiology and Pathophysiology / N. Tuteja, M. Chandra, R. Tuteja.et al.// J Biomed Biotechnol. 2004. - N4. - P. 227-237.

123. Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition / S. Hortelano, B. Dalloporta, N. Zamzami et al. // FEBS Letters. 1997. - Vol. 410. - P. 373-377.

124. Nitric oxide inhibits lipopolysaccharide-induced apoptosis in pulmonary artery endothelial cells / G.D. Ceneviva, E. Tzeng, D.G. Hoyt et al. //Am. J. Physiol. 1998. - Vol. 19. - P. L717-L728.

125. Nitric oxide inhibits tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis by reducing the generation of ceramide / C. De Nadai, P. Sestili, O. Cantoni et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 5480-5485.

126. Nitric oxide signaling: systems integration of oxygen balance in defense of cell integrity / L. Gong, G.M. Pitari, S. Schulz et al. // Curr Opin Hematol. 2004. -N 11. - P. 7-14.

127. Nitric oxide suppression of apoptosis occurs in association with an inhibition of Bcl-2 cleavage and cytochrome с release. / Y. M. Kim, Т. H. Kim, D. W. Seol et al. //J. Biol. Chem. 1998.-Vol. 273. - P. 31437-31441.

128. Niu, X.-F. A balance between nitric oxide and oxidants regulates mast cell-dependent neutrophil-endothelial cell interactions / X.-F. Niu, G. Ibbotson, P. Kubes // Circulation Research. 1996. - Vol.79. - P. 992-999.

129. Pawloski, J.R. Export by red blood cells of nitric oxide bioactivity / J.R. Pawloski, D.T. Hess, J.S. Stamler // Nature. 2001. - Vol". - 409. -P.622-626.

130. Peachman, К. K. Mitochondria in eosinophils: function role in apoptosis but not respiration / К. K. Peachman, D. S. Lyles, D. A. Baas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. - P. 1717-1722.

131. Pierce, G.B. Hydrogen peroxide as a mediator of programmed cell death in the blastocyst Л Pierce G.B., Parchment R.E., Lewellyn A.L. // Differentiation. 1991. - Vol. 46. - P. 181-186.

132. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome с from mitochondria blocked / J. Yang, X. Liu, K. Bhalla et al. // Science. 2003. -Vol. 275.-P. 1129-1132.

133. Properties of the permeability transition pore in mitochondria devoid of Cyclophilin D // Basso E., Fante L., Fowlkes J. et al. / J Biol Chem. -2005.-Vol. 280.-P. 18558- 18561.

134. Protective effect of docosahexaenoic acid against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in human lymphocytes / S. Bechoua. M. Dubois, Z.

135. Dominguez et al. // Biochem-Pharmacol.- 1999. Vol.57., N9. - P. 10211030

136. Protein interactions with nitric oxide synthases: controlling the right time, the right place, and the right amount of nitric oxide / B.C. Копе, T. Kuncewicz, W. Zhang et al. // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2003. - Vol. 285. — P. F178-F190.

137. Reactive oxygen species and antioxidants in apoptosis of esophageal cancer cells induced by As203 / Z.-Y. Shen, W.-Y. Shen, M.-H. Chen et al. // International Journal of Molecular Medicine. 2003. - Vol. 11. - P. 479484.

138. Reactive oxygen species and nitric oxide mediate plasticity of neuronal calcium signaling / O. Yermolaieva, N. Brot, H. Weissbach et al. // Proct. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P 448-453.

139. Red blood cells inhibit apoptosis of human neutrophils / K. Aoshiba, Y. Nakajima, S. Yasui et al. // Blood. 1999. - Vol 93, N11. - P. 40064010.

140. Regulation of Fas antibody induced neutrophil apoptosis is both caspase and mitochondrial dependent. / R.W. Watson, A. O'Neill, A. E. Brannigen et al. // Febs Lett. 1999. - Vol. 453. - P. 67-71.

141. Regulation of macrophage phagocytosis of apoptotic cells by cAMP / A.G. Rossi, J.C. Mc Cutcheon, N. Roy et al. // The Journal of Immunology. 1998. - Vol. 160. - P. 3562-3568.

142. Regulation of neutrophil apoptosis / S.W. Edwards, D.A. Moulding, M. Derouet et al. // Chem Immunol Allergy. 2003. - Vol. 83. - P.204-224.

143. Renin-Angiotensin System Modulates Oxidative Stress-Induced Endothelial Cell Apoptosis in Rats / M. Akishita, K. Nagai, H. Xi et al. // Hypertension.- 2005.- V.45.- P. 1188-1194.

144. Revisiting the kinetics of nitric oxide (NO) binding to soluble guanylate cyclase: the simple NO-binding model is incorrect / D.P. Ballou,

145. Y. Zhao, P.E. Brandish et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2002. Vol. 99. -P. 12097-12101.

146. Role for IgE in airway secretions: IgE immune complexes are more potent inducers than antigen alone of airway inflammation in a murine model / R.I. Zuberi, J.R. Apgar, S.S. Chen et al. // J. Immunol. 2000. -Vol. 164.-P. 2667-2673.

147. Role for tyrosine phosphorylation and Lyn tyrosine kinase in Fas receptor-mediated apoptosis in eosinophils / H.U. Simon, S. Yousefi, B. Dibbert et al. // Blood. 1998. - Vol. 92. - P. 547-557.

148. Role of cAMP-dependent pathway in eosenophil apoptosis and survival / H.S. Chang, K.W. Jeon, Y.H. Kim et al // Cell. Immunol. 2000. -Vol. 103.-P. 29-38.

149. Savill, J. Apoptosis. Phagocytic docking without shoking / J. Savill // Nature. 1998. - Vol. 392. - P. 442-443.

150. Shen, Y.H. Nitric oxide induces and inhibits apoptosis through different pathways / Y.H. Shen, X.L. Wang, D.E.L. Wilcken // FEBS Letters. 1998. - Vol. 433. - P. 125-131.

151. Simon, H.U. Role of reactive oxygen species (ROS) in apoptosis induction / H.-U. Simon, A. Haj-Yehia, F. Levi-Schaffer. //Apoptosis. -2000. N5. - P.415-418.

152. Stamler, J.S. Nitrosylation. The prototypic redox-based signaling mechanism / J.S. Stamler, S. Lamas, F.C. Fang // Cell. 2001. - Vol. 106. -P. 675-683.

153. The effect of nitric oxide on cell respiration: A key to understanding its role in cell survival or death / B. Beltran, A. Mathur, M.R. Duchen et al. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2000 December. - Vol. 97. - P. 1460214607.

154. The inherent cellular level of reactive oxygen species: One of the mechanisms determining apoptotic susceptibility of leukemic cells to arsenictrioxide / J. Yi, F. Gao, G. Shi et al. // Apoptosis. 2002. - Vol. 7, N.3. - P. 209-215.

155. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory bust activation, and commitment to apoptosis / G. Fossati, D. A. Moulding, D. G. Spiller et al. // J. Immunol; 2003. - Vol. 170.-P. 1964-1972.

156. The role of phosphatidylserine in recognition of apoptotic cells by phagocytes / V.A. Fadok, D.L. Bratton, S.C. Frasch et al. // Cell Death Differ. 1998. - N5.- P. 551-562.

157. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications / H. Towbin, T. Staehelint, J. Gordon.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354.

158. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms / D. Wallach, E.E. Varfolomeev, N.L. Malinin, Y.V et al. // Annu Rev Immunol. 1999.-Vol 17. - P. 331-367.

159. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+. / J. E. Merritt, Mc S.A.

160. Carthy, M.P. Davies et al. I I J. Biochem. 1990. - Vol. 269, N2. - P.513-519.

161. Yallow R.S., Berson S.A. Radioimmunoassay of gastrin / R.S. Yalow, S.A. Berson // Gastroenterology. 1970. - Vol. 58. - P. 1 - 14.