Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе"

Дапнлспко Алсси Олеговна

РЕГУЛЯЦИЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И АИОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНО»! СТРЕССЕ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МА? Ш

Ростов-па-Дону 2012

005013912

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет»

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Н.П. Милютина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.М. Менджерицкий

доктор медицинских наук, профессор В.П. Терентьев

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Саратов).

Защита диссертации состоится «29» марта 2012 г. в 10й2 час. на заседании диссертационного совета Д 212.208.07 по биологическим наукам в НИИ нейро-кибернетики им. А.Б. Когана (344090, г. Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1, актовый зал).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан « » февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.208.07, канд. биол. наук, с.н.с.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Высокая чувствительность головного мозга к повреждающему действию кислорода обуславливает заболевания, при которых окислительный стресс (ОС) является одной из главных причин гибели нервных клеток - болезни Паркансона, Альцгеймера, Пика, хорею Гентингтона и др. Прогресс в области клинической неврологии не может быть обеспечен без опережающего развития фундаментальных исследований, направленных на изучение механизмов функционирования мозга в норме и при патологии. Исследование заболеваний, в патологической картине которых важное место занимает ОС (на сегодняшний день их насчитывается более 200), невозможно без создания моделей подобных состояний разного уровня сложности. Одной из наиболее адекватных моделей для исследования механизмов ОС и его биологических последствий по праву считается гипербарическая оксигенация (ГБО) (Casey et al., 2011).

Другой важный аспект этой проблемы заключается в уточнении роли митохондрий как источника активированных кислородных метаболитов, а также их участия в реализации программы клеточной гибели. Подобные задачи можно решить при помощи соединений нового класса - митохондрнально-адресованных антиоксидантов, разработанных под руководством академика В.П. Скулачева. Эти соединения представляют собой открытые В.П. Скулачевым и Е.А. Либерманом проникающие катионы трифенилфосфония, коньюгированные с эффективной ловушкой кислородных радикалов - молекулой пластохинона (Скулачев, 2007).

Следует отметить, что выявление механизмов защитного действия митохондриально-адресованных антиоксидантов - инновационное направление современной биологии и медицины. Хотя список митохондриальных патологий быстро пополняется и включает в себя рак, сердечную недостаточность, диабет, ожирение, инсульт, нейродегенеративные заболевания и старение, все эти состояния имеют общие черты - нарушение митохондриального гомеостаза кальция, АТФ или метаболизма активных форм кислорода (АФК) (Sheu et al., 2006). У соединений, минимизирующих митохондриалыгае накопление АФК и улучшающих митохондриальную биоэнергетику, есть весомый потенциал для лечения таких заболеваний.

Цель работы состояла в выяснении механизмов регуляции свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе в мозгу и крови крыс в условиях ГБО, на фоне применения митохондриально-направленного антноксиданта SkQl и при нейродегенеративном процессе в крови пациентов с болезнью Паркинсона.

Задачи исследования:

1. Оценить интенсивность свободнорадикального окисления (СРО) в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга, плазме крови, эритроцитах и лимфоцитах крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.

2. Оценить состояние антиоксидантной системы (АОС) в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга и крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.

3. Изучить структурное состояние и поверхностный заряд мембран эритроцитов и лимфоцитов крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.

4. Определить интенсивность апоптоза лимфоцитов по экстернализашш фосфатидилсерина и уровень активности каспазы-3 в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток больших полушарий головного мозга при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.

5. Изучить интенсивность свободнорадикального окисления, активность антиоксидантной системы в крови, структурное состояние и поверхностный заряд эритроцитов и лимфоцитов, уровень апоптоза лимфоцитов при болезни Паркинсона.

Научная новизна работы.

1. В работе впервые исследованы механизмы действия ГБО-индуцированного окислительного стресса (0,5 МПа, 90 минут) с корреляционным анализом показателей СРО и АОС в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс. Впервые показано, что гипероксия приводит к более, чем двукратному усилению экспрессии фосфатидилсерина (ФС) на поверхности гашфоцитарных мембран и одновременно - к увеличению активности каспазы-3 в цитоплазматической и митохондриальной фракциях клеток больших полушарий головного мозга.

2. Впервые ¡n vivo исследованы регуляторные (антиоксидантные и антиапоптозные) эффекты SkQl в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при нормоксии. Показано комплексное действие препарата: ингибирующее - на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ); стимулирующее - на активность ключевых антиоксидантных ферментов и содержание в крови метаболитов NO", модулирующее - на уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови.

3. Впервые in vivo при ГБО-индуцированном окислительном стрессе исследованы регуляторные (антиоксидантные, мембранопротекториые и антиапоптозные) эффекты SkQl в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс. Показана его способность к поддержанию стационарного уровня ПОЛ в исследованных тканях, к стимуляции или нормализации активности ферментативных антиоксидантов, к

сохранению структурных параметров и поверхностного заряда биомембран, а также выраженный антиагюптозный эффект в условиях окислительного стресса.

4. Впервые проведена комплексная биохимическая оценка про- и антиоксидантных (АО) факторов крови при нейродегенеративном процессе (на примере болезни Паркинсона). Показано, что нейродегенеративный процесс характеризуется умеренным изменением показателей хемилюминесценции (ХЛ), накоплением молекулярных продуктов ПОЛ, метаболитов N0' и депрессией активности ключевых АО ферментов -каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатион-8-трансферазы (ГСТ).

5. В работе впервые дана оценка структурному состоянию мембран эритроцитов и лимфоцитов при нейродегенеративном процессе и охарактеризован поверхностный заряд клеток крови. Показано, что интенсивность апоптотической гибели лимфоцитов при БП в полтора раза превышает норму.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ГБО (0,5 МПа, 90 мин) характеризуется избыточной продукцией АФК и активных форм азота (АФА), активацией процессов СРО, напряжением и нарушением работы ключевых АО ферментов, изменением структурных параметров и поверхностного заряда клеточных мембран, увеличением экспрессии ФС на поверхности мембран лимфоцитов и активности каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга.

2. Предварительное применение 5к(31 оказывает антиоксидантное, антиапоптозное и мембранопротекторное действие и снижает выраженность ГБО-индуцированного ОС.

3. При нормоксии 8к(21 оказывает активирующее влияние на некоторые АО ферменты, ингибирует начальные и промежуточные стадии ПОЛ, снижает экстернализацию ФС на поверхности лимфоцитов, не оказывая влияния на активность каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга.

4. Хронический окислительный стресс при нейродегенеративном процессе характеризуется умеренным повышением продукции АФК и АФА, накоплением молекулярных продуктов ПОЛ и снижением эффективности антиоксидантной защиты. Изменение структурных параметров мембран и рост отрицательного поверхностного заряда клеток крови сопровождается увеличением уровня апоптоза лимфоцитов.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные в настоящей работе данные представляют существенный интерес для понимания механизмов окислительного стресса, развивающегося как при действии острого стресс-фактора (гипербарический кислород), так и в условиях хронически протекающей патологии (нейродегенеративый процесс). Проведенное исследование позволило установить ряд фундаментальных закономерностей развития окислительного стресса в условиях

гипербарооксигенации в эксперименте и при нейродегенеративном процессе на примере БП, а также показать тесную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза при исследованных патологических состояниях. Показано, что одной из ведущих причин повреждающего действия ГБО является сверхпродукция АФК митохондриями, приводящая к мигохондриалыюй дисфункции, что определяет вовлечение этих органелл в процессы клеточной гибели. Выявлена взаимосвязь активности антиоксидантной защиты и содержания продуктов ПОЛ митохондрий клеток больших полушарий головного мозга и крови при гипероксии.

Проведенное исследование позволило продемонстрировать в эксперименте выраженное регуляторное действие катионного производного пластохинона SkQl на свободнорадикапьное окисление и программируемую клеточную гибель в условиях нормо- и гипероксии, которое реализуется как за счет собственного антиоксидантного потенциала SkQl, так и за счет стимуляции им эндогенных факторов защиты. На основе полученных результатов в эксперименте разработана инновационная технология цитопротекции при ОС, вызванном ГБО, посредством применения митохондриально-адресованного антиоксиданта.

В работе впервые проведена комплексная оценка нарушений свободнорадикапьного и структурно-метаболического гомеостаза при хроническом нейродегенеративном процессе, сопряженном с БП, в патогенез которого вовлекается митохондриальная дисфункция и окислительный стресс. Разработана информативная тест-система, включающая определение показателей системы «про- <-» антиоксиданты», структурного состояния биомембран и уровня апоптоза лимфоцитов в крови, что может быть использовано в клинике для оценки тяжести патологического процесса и эффективности проводимого лечения. Выявленная в работе общность ряда молекулярных механизмов окислительного стресса в условиях гипероксии и нейродегенерации, с одной стороны, и эффективность применения митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQl при гипероксии, с другой стороны, указывают на перспективность разработки нового поколения фармакологических препаратов.

Апробация диссертационной работы.

Материалы диссертации доложены на II и III научно-практических Симпозиумах «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2009, 2010 гг.); на VIII, IX и X межвузовских конференциях с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2009, 2010, 2011 гг.); на III и IV международных конференциях «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2009, 2011 гг.); на XIV пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010 г.); на 8-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь

XXI века - будущее Российской науки» (Ростов-на-Доиу, 2010 г.); на научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга» (Ростов-на-Дону, 2011 г.); на 7-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК - 3 статьи. Личный вклад - 65%, общий объем - 1,48 п.л.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики групп экспериментальных животных и обследованных больных, методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов н списка литературы. Работа содержит 21 таблицу, иллюстрирована 23 рисунками. Список литературы включает 266 наименование, в том числе 180 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом экспериментального исследования служили 106 беспородных белых крыс Rattus norvegicus массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Подопытные животные были разделены на 4 группы по 22-26 животных:

1 группа (контроль) - интактные животные;

2 группа (ГБО-индуцированнын ОС, гнпероксня) - животные, подвергнутые ГБО;

3 группа (SkQl при нормоксии) - животные, получавшие SkQl, но не подвергавшиеся ГБО;

4 группа (SkQl при ГБО-индуцированном ОС) - животные, получавшие SkQl и затем подвергавшиеся ГБО.

Препарат SkQl (10-(6'-шгастохжюнил)децилтрифенилфосфоний), растворенный в 0,2% этаноле, вводили в дозе 50 нмоль/кг в защечные мешки животных утром в течение 5 дней. Выбор дозы и схемы введения препарата проводили согласно собственным исследованиям и рекомендациям других авторов (Анисимов и др., 2008; Чистяков и др., 2010).

В день сеанса ГБО утром подопытные животные попарно помещались в барокамеру, где создавалось давление кислорода 0,5 МПа. Компрессию и декомпрессию проводили со скоростью 0,2 МПа/мин. Изопрессия составляла 90 минут. Животных декапитировали сразу по окончании пребывания в барокамере, кровь собирали в гепаринизированные стаканы. Параллельно извлекали мозг и отделяли полушария от стволовых структур. Материалом для биохимических исследований служили плазма крови, эритроциты, лимфоциты, гомогенат и митохондрии клеток больших полушарий головного мозга. Для получения достаточного количества материала для исследования кровь и мозг от двух животных объединяли в одну пробу.

Группа больных была сформирована из 28 человек (7 мужчин и 21 женщина) от 52 до 72 лет (средний возраст 59,1±1,1), поступивших в неврологическое отделение ГУЗ "Ростовская областная клиническая больница" с диагнозом болезнь Паркинсона. Стадии заболевания оценивались по критериям международной классификации по шкале Хен-Яра (Hoehn, Yahr, 1967) и соответствовали II-III стадиям. В качестве контрольной была использована кровь 30 практически здоровых доноров, женщин и мужчин в возрасте от 35 до 52 лет (средний возраст составил 46,2±0,7).

Отбор крови проводили утром натощак при поступлении больных в клинику путем пункции локтевой вены. Ту же процедуру осуществляли на станции переливания крови Ростовской области. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (50 Ед гепарина на 10 мл крови). Для исследований апоптоза лимфоцитов использовали вакуумную систему забора крови фирмы Becton Dickinson (США). Материалом для биохимических исследований служили плазма крови, эритроциты и лимфоциты.

Лимфоциты выделяли из цельной крови в градиенте плотности фиколл-верографина (Beyum, 1968). Апоптоз лимфоцитов оценивали лазерной проточной цитофлуориметрией на приборе FACS Canto, Becton Dickinson (США) с использованием набора «Annexin V-FITC apoptosis detection kit 1», BD Pharmingen (США). Выделение митохондриальной фракции клеток осуществляли ступенчатым центрифугированием (Северин, Соловьева, 1989). Митохондрии лизировали детергентом Тритон Х-100 (концентрация в пробе 0,1%). Активность маркерного фермента митохондрий сукцинатдегидрогеназы определяли по восстановлению феррицианида калия (Ещенко, Вольский, 1982).

Т ЬСЬ-шшциированнуго люминол-активированную ХЛ плазмы крови регистрировали при помощи хемилюминесцентного анализатора ХЛ-003, г. Уфа (Россия) (Шестаков и др., 1979). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в хлороформном экстракте по поглощению света при длине волны 233 им (Стальная, 1977). Уровень малонового диальдегида (МДА) оценивали по реакции с 2-тио-барбитуровой кислотой (Стальная, Гаришвшш, 1977). Концентрацию шиффовых оснований (ШО) определяли в хлороформном экстракте флуориметрическим методом при длине волны возбуждения 360 нм и длине волны эмиссии 440 нм (Bidlack et al., 1973). Хлороформный экстракт готовили по методу Bligli и Daer (1959). Содержание в плазме крови нитрит- и нитрат-ионов определяли по цветной реакции нитритов с реактивом Грисса (Голиков, 2004). Активность каспазы-3 оценивали в митохондриальной и цитоплазматической фракциях с использованием коммерческого набора реактивов фирмы «Sigma» (США).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) и супероксидустраняющую активность

плазмы крови (СУА) оценивали по ингибированию восстановления нитросинего тстразолия супероксидом, генерируемым при аутоокислении адреналина (Сирота, 1999). Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония (Королкж и др., 1988). Оксидазную активность церулоплазмина (ЦП) регистрировали по скорости окисления р-фенилендиамина (Камышников, 2002). Активность ГСТ определяли по конъюгации восстановленного глутатиона (GSH) с 1,2-динитро-хлор-бензолом (Habig et al., 1974). Содержание OSH определяли по реакции с дитио-бис-нитробензойной кислотой (Ellman, 1959). Активность ГПО определяли с гидроперекисью трет-бутила (Моин, 1986). Об активности глутатионредуктазы (ГР) судили по скорости окисления НАДФ«Н (Юсупова, 1989). Активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) измеряли по скорости восстановления НАДФ+ (Захарьин, 1967). Суммарную пероксидазную активность (СПА) оценивали по модифицированному бепзидиновому методу (Лукаш и др., 1994). Структурное состояние мембран изучали методом латеральной диффузии зонда пирена (Владимиров, Добрецов, 1980; Добрецов, 1989). Поверхностный заряд мембран эритроцитов оценивали с помощью флуоресцентного зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоиата (АНС) (Добрецов, 1989).

Концентрацию белка в плазме крови определяли биуретовым методом с помощью коммерческого набора «Абрис-плюс» (Россия). Концентрацию белка в митохондриях и лимфоцитах определяли методом Lowry в модификации Shacterle-Pollack (Shacterle, Pollack, 1973). Содержание липидов в хлороформном экстракте определяли по реакции с фосфорнованилиновым реактивом с помощью коммерческого набора производства «La Chema» (Чехия). Концентрацию гемоглобина в гемолизате эритроцитов и внеэритроцитарный гемоглобин (ВЭГ) определяли с помощью коммерческого набора «Абрис-плюс» (Россия).

Результаты получены с использованием сертифицированного оборудования. Спектрофотометрические исследования проводили на DU 800, Beckman Coulter (США). Спектрофлуориметрические исследования проводили на RF-5301 С «Shimadzu» (Япония).

Статистическую обработку данных проводили с помощью MS Excel 2007 и Statistica 6.0. Для каждой серии рассчитывали средние арифметические значения показателей и их стандартные ошибки (М±ш). Анализ выпадающих значений проводили с использованием критерия Шовене. Для оценки статистически значимых различий между сравниваемыми группами использовали U-критерий Манна-Уитни и t-критерий Стьюдента. При р<0,05 различия считали статистически значимыми, при 0,05<р<0,1 предполагали тенденцию к статистической значимости различий. Корреляционный анализ проводили с использованием рангового коэффициента корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Интенсивность свободнорадикальных процессов и их регуляция в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.

Под действием ГБО в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга увеличивается содержание молекулярных продуктов ПОЛ в среднем на 21-32% (Рис. 1). Введение животным SkQl характеризуется тенденцией к снижению содержания первичных продуктов ПОЛ. При ГБО предварительный прием SkQl приводит к снижению МДА на 28%, оставляя содержание ДК и ШО на уровне нормы.

К особенностям АО ответа митохондрий клеток больших полушарий на ГБО следует отнести синхронную активацию ферментативных компонентов антиоксидантной системы (АОС) (Рис. 1) - увеличение активности СОД, каталазы, ГПО и ГСТ в среднем на 26-58%. Активность ГР и Г6ФДГ снижается в среднем на 24-26%, что приводит к падению уровня GSH в мозге на 18%. При нормоксии SkQl вызывает увеличение активности СОД, ГПО и ГСТ в среднем на 31-53%, пул GSH возрастает на 34%, вероятно, за счет усиления процессов его синтеза de novo, поскольку уровни активности ГР и Г6ФДГ не отличаются от таковых у интактных крыс. При гипероксии под действием SkQl в митохондриях клеток больших полушарий также развивается однонаправленная умеренная активация большинства АО ферментов на 16-35%, но она в целом на 13-19% ближе к норме, чем у крыс, не получавших SkQl перед сеансом ГБО.

Активность касиазы-3 в мозге крыс при гипероксии и действии SkQl.

Каспаза-3 является основным эффектором программы апоптоза в клетках (Salvesen, 2002). В виде профермента она содержится не только в цитозоле, но и в межмембранном пространстве митохондрий (Oberholzer et al., 2001). В условиях ГБО активность каспазы-3 в митохондриальной и цитоплазматической фракциях повышается на 109-135%. В условиях ГБО-индуцированного ОС выявлено ингибирующее действие SkQl на каспазу-3, активность которой остается близкой к контрольному уровню.

Интенсивность свободнорадикального окисления и его регуляция в крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии SkQl.

Согласно результатам исследования, гипероксия сопровождается приростом показателей ХЛ плазмы крови (Рис.2). Зарегистрировано резкое возрастание спонтанной ХЛ на 125%, умеренное повышение амплитуды быстрой вспышки (h) и светосуммы медленной вспышки (Sm) в среднем на 8-10%, что указывает на повышенный уровень индукторов ПОЛ - липодиоксильных радикалов и гидроперекисей липидов.

ДК МДА ШО СОД Каталаза ГПО ГСТ 0ГБО DSkQI аГБО + SkOl

ГР GSH Г-6-ФДГ

Рис. 1. Влияние БкС*] на уровень молекулярных продуктов ПОЛ, активность антиоксидантных ферментов и содержание С8Н в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при нормоксии и ГБО-индуцированном окислительном стрессе.

Обозначения: * - достоверные различия; • - тенденция к достоверности различий.

При нормоксии введение 5к(}1 умеренно подавляет инициирующие стадии СРО в плазме крыс на 20-24%. При гипероксии действие 8кС>1 характеризуется нормальным уровнем спонтанной ХЛ плазмы крови и умеренным ростом в среднем на 10-13% высоты быстрой и медленной вспышек и светосуммы медленной вспышки.

140

о

с

120

60 40 20 0 -20 -40

] * а ГБО 3Sk Q1 □ ГБО + SkQI

* * *

п 1—| р-, п п П п

1 1 u U 1

* * *

Сп. ХЛ

Sm

tga

Рис. 2. Влияние SkQI на параметры хемилюминесценции плазмы крови крыс при нормоксии и ГБО-индуцированном окислительном стрессе. Обозначения как на Рис. 1.

Сеанс ГБО приводит к накоплению продуктов ПОЛ в крови (Рис. 3). Уровень ДК в плазме крови возрастает на 14%, а в клетках - на 53-73%. Содержание МДА в плазме и

эритроцитах увеличивается на 35-37%. Уровень ШО в плазме повышается на 26%, а в клетках крови - в среднем на 46-79%. При нормоксии введение животным 8к01 способствует снижению содержания ДК и МДА в эритроцитах и плазме. При ГБО БкО 1 в значительной степени ингибирует липопереокисление в крови. Уровень большинства продуктов ПОЛ остается на уровне контроля за исключением МДА в эритроцитах (на 27% ниже нормы) и ШО в плазме (на 11% выше нормы).

Рис. 3. Влияние 8к<21 на накопление молекулярных продуктов ПОЛ в крови крыс в норме и при ГБО-чндуцированном окислительном стрессе. Обозначения как на Рис. 1.

120 100 I «О

п.

I 60

¡с

° 40

>я

I 20

о

£ О -20 -40

СОД Каталаза СУА УН202 ЦП ГПО ГСТ ГР ОБН Г-6-ФДГ

Рис. 4. Влияние БкО 1 на состояние антиоксидантной системы крови крыс в норме и при ГБО-индуцированном окислительном стрессе. Обозначения как на Рис. 1.

* ... „!--------- -г...... □ГБО йвкО □ГБО + ЭкО

|

*

• 1

* * * ■п

1П-1 з Р —

и и 1 и

* * *

Важнейшим компонентом свободнорадикальных процессов является оксид азота (N0"). Увеличение содержания метаболитов оксида азота (N00 в крови крыс было выявлено при всех исследованных воздействиях. Максимальный прирост концентрации ЫСУ наблюдается у крыс после сеанса ГБО и составляет 38%. Введение йкО 1 при нормоксии также приводит к повышению концентрации но изменения эти не

превышают 18%, а после сеанса ГБО на фоне приема 8к(}1 в крови животных обнаруживается умеренный прирост ЫОч", который составляет 12%.

При гипероксии (Рис. 4.) СУА и активность СОД в эритроцитах незначительно отличаются от контроля, тогда как скорость утилизации перекиси водорода (Унгог) в плазме и активность каталазы в эритроцитах превышают норму на 95 и 30%, соответственно. 8к(„)1 при нормоксии приводит к повышению СУА и активности СОД на 26-47%, обнаруживается тенденция к увеличению активности каталазы, оксидазная активность ЦП снижается. При совместном действии ГБО и вкСН активируется СОД эритроцитов на 23% и УН202 плазмы на 38%, активность ЦП снижается на 21%.

В эритроцитах при гипероксии наблюдается умеренное снижение активности ГПО на 11% и усиление активности ГСТ на 62%. Повышенная потребность в восстановленном глутатионе, по всей видимости, приводит к росту активноси ГР на 30%, но в эритроцитах наблюдается его дефицит (на 14%). Функционирование ГР зависит от наличия в среде НАДФН, восстановление которого осуществляет Г6ФДГ. Однако статистически значимых отличий в ее активности по сравнению с контролем обнаружено не было.

Действие 5кС>1 в условиях физиологической нормы характеризуется некоторыми изменениями в активности глутатион-зависимых ферментов в эритроцитах крыс. Так, были обнаружены умеренная активация ГПО (на 14%) и умеренное снижение активности ГСТ (на 19%). Потребности ГПО в йЗН, по-видимому, обеспечиваются увеличением активности ГР (на 29%), поскольку уровень С5Н в клетках не отличается от нормы. При гипероксии у крыс, предварительно получавших 5к(21, отмечена нормальная активность ферментов глутатионового цикла, клеточный пул ОШ сохраняется на уровне контроля.

Структурное состояние, поверхностный заряд и уровень апоптоза клеток крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 5к(}1.

ГБО-индуцированный окислительный стресс вызывает изменения ряда структурных параметров мембран эритроцитов относительно контроля (Рис. 5). Так, на 33% снижается текучесть липидного бислоя (ЛБ) (Рэ/Рм (334)); на 16% снижается эффективность безызлучательного переноса энергии с триптофанилов мембранных белков на пирен (Р0-Р/Ро), т.е. на 16% изменяется показатель структурных перестроек мембранных белков (МБ); на 9% возрастает полярность областей аннулярных липидов

(АЛ) (Рз72/Рз9з(282)). В условиях физиологической нормы при введении 5кС21 несколько снижается текучесть ЛБ мембран. Исследования мембран эритроцитов в условиях ГБО свидетельствуют о мембранопротекторных свойствах 8к01. Практически все исследуемые параметры мембран сохраняются на уровне контрольных величин за исключением текучести ЛБ (ниже нормы на 22%).

Исследование структурных свойств мембран лимфоцитов с помощью флуоресцентного зонда пирена показывает (Рис. 5), что текучесть ЛБ после сеанса ГБО снижается на 18% относительно контрольного уровня. В тоже время текучесть зон АЛ возрастает относительно нормы на 31%. Показатель структурных перестроек мембранных белков изменяется на 25%. Полярность ЛБ мембран лимфоцитов статистически значимо не отличается от контроля, но полярность участков АЛ снижается 7%.

Введение 8к(31 не влияет на структурные характеристики мембран лимфоцитов крыс в условиях физиологической нормы, а в условиях ГБО-индуцированного окислительного стресса сохраняет их на контрольном уровне за исключением показателя полярности участков АЛ, который снижается на 7%.

Для характеристики поверхностного заряда мембран эритроцитов оценивали интенсивность флуоресценции мембранного зонда АНС. ГБО вызывает повышение отрицательного поверхностного заряда эритроцитарных мембран, в среднем, на 14-16%. При нормо- и гипероксии прием препарата сохраняет поверхностный заряд эритроцитов на уровне контроля.

Одним из ключевых компонентов патогенетических изменений при нарушениях окислительного метаболизма является изменение уровня клеточной гибели. Ранним событием апоптоза считается окислительная деструкция связей белков цитоскелета (аннексинов) с мембранным бислоем. В результате нарушения этих связей становится возможным переход во внешний монослой мембраны ФС, в норме экспонированного внутрь клетки. Оценка уровня апоптоза по регистрации ФС во внешнем монослое с помощью ПТС-меченого аннексина-У показывает (Рис. 6), что ГБО-индуцированный ОС резко увеличивает процент клеток, находящихся на стадии раннего апоптоза (на 110%).

Мощный антиапоптотический эффект 8кО 1 при ГБО свидетельствует о том, что митохондрии играют ключевую роль в запуске программируемой клеточной гибели в условиях гипероксии. Введение крысам БкСН в условиях физиологической нормы также вызывает ингибирование процессов апоптоза лимфоцитов крыс на 39%, что свидетельствует о регуляторной роли митохондрий в процессах программируемой гибели лимфоцитов и при нормоксии.

Из/Им (334)

Рэ/Рм (282)

Ро-И/Ро

Р372/Р393 (334) Р372/Р393 (282)

□ Эритроциты ГБО □ Эритроциты 5к01 □ Эритроциты ГБО + 8к01

□ Лимфоциты ГБО □ Лимфоциты 5к<51 ПЛимфоциты ГБО + 5к01

Рис. 5. Влияние 5к01 на структурное состояние мембран клеток крови крыс при нормоксии и ГБО-индуцированном окислительном стрессе. Обозначения как на Рис. 1.

кр37-АпУ/Р(

1 С] ■ контроль о?

27%

•а чр

АлУ ВТС-А

т ч 1 « БкО! 02

17%

"г- О! 43 ЛпУ/Р* ГБО+$К01 ог

29%

....................3.......■ АлУ ПТС-А

Рис. 6. Влияние 5к01 на распределение апоптотических и жизнеспособных лимфоцитов крыс при нормоксии и ГБО-индуцированном окислительном стрессе. 01 -ранний некроз; О2 - поздний апоптоз или глубокий некроз; 03 - живые клетки; 04 -ранний апоптоз.

Эффекты митохондриально-адресованного 8кС<»1 позволяют предположить, что его аитиоксидантиая активность связана не только с прямым антирадикальным действием пластохинонной части. По аналогии с убихиноном, пластохинон в составе мембран митохондрий может поддерживать определенную стационарную концентрацию витамина Е за счет восстановления его радикалов (Меньшикова и др., 2006). Регуляторное действие 8к(21 может реализовываться и за счет изменений гормонального фона. В работе В.А. Чистякова с соавторами (Чистяков и др., 2010) показано, что введение крысам 8кС>1 сопровождается увеличением в крови уровня эстрадиола, который, реагируя со специфическими рецепторами на поверхности митохондриальных мембран, через митоген-активируемую протеинкиназу активирует транскрипционный фактор Ы1-кВ, участвующий в регуляции экспрессии ряда АО ферментов. Как хинон с орто-положением окисляющих/восстанавливающих групп, БкСН может выступать в качестве индуктора генов с АЯЕ-контролируемой экспрессией через транскрипционный фактор ЫгО.

На основании проведенного исследования можно предположить, что при ГБО-индуцированном окислительном стрессе 8кр1 действует в самом начале патологической цепи, предотвращая избыточную продукцию супероксидного анион-радикала компонентами электронтранспортной цепи митохондрий и последующий патологический каскад, включающий интенсификацию ПОЛ, нарушение структурной организации биомембран и индукцию апоптоза (Рис. 7). Даже в случае повышения базальной продукции О/ регуляторные эффекты препарата оказывают заметное защитное действие. Активация СОД (как цитозольной, так и митохондриапыюй) позволяет конвертировать супероксид в перекись водорода, которая затем быстро устраняется при участии глутатионпероксидазы. Это говорит о физиологических, а не цитотоксических внутриклеточных уровнях Н2О2. Сохранение структурной целостности биомембран в таких условиях - ключевой фактор антиапоптотического эффекта БкС) 1.

Исходя из обнаруженных эффектов митохондриально-адресованного 8к()1, можно заключить, что митохондриальные источники АФК играют ведущую роль в повреждающем действии гипербарооксигенации, а митохондриально-опосредованный путь запуска апоптоза является важнейшим при ГБО-индуцированном окислительном стрессе. Некоторое повышение базальной продукции оксида азота под действием ЭкСП может оказывать супрессирующее действие на митохондриально-опосредованный апоптоз за счет образования нитрозильных комплексов «цитохрома с + кардиолипин», что приводит к снижению пероксидазной активности цитохрома с и снижению интенсивности процесса пероксидации липидов и белков мембран митохондрий (Осипов и др., 2006).

Рпс. 7. Влияние 5к(21 на свободнорадикальный и структурно-метаболический гомеостаз при ГБО-индуцированном окислительном стрессе.

Клинические наблюдения. Свободнорадикальные процессы и их регуляция в крови при пейродегеперативном процессе (на примере болезни Паркинсона).

Механизм многих известных нейродегенеративных заболеваний включает в свою патологическую программу ОС (Илларношкин, 2008). Нарушение свободнорадпкального гомеостаза в нервной ткани при БП может находить свое отражение в изменении соответствующих показателей в крови. В связи с этим, целью данного этапа исследования стала характеристика нарушений свободнорадпкального гомеостаза в крови при нейродегенеративном процессе (на примере БП).

Исследование интенсивности ХЛ как высокочувствительного показателя наличия свободных ради катов и состояния про- и антиоксидантных систем организма показало,

17

что по сравнению с контрольной группой при БП в плазме крови на 38% возрастает содержание сильных окислителей (по сп. ХЛ), но на 15% снижается содержание катализаторов, разлагающих гидропероксид по свободнорадикальному механизму (по Ь); на 60% возрастает светосумма ХЛ (8ш), зависящая от боковых цепей разветвления ПОЛ и от количества перекисных радикалов К02', образовавшихся на одну молекулу перекиси водорода; на 31% снижается угла наклона медленной вспышки, определяющий скорость окисления лшщдов.

В спонтанную светимость плазмы при ХЛ вносят вклад не только АФК, но и другие сильные окислители, в том числе, пероксинитрит. В литературе нередко указывается на возможную роль оксида азота в нейропатохимнческих механизмах БП. В плазме крови обследованных больных обнаружено увеличение на 35% содержания метаболитов оксида азота (Ж)х) по сравнению с контрольной группой (Рис. 8).

Динамика накопления продуктов ПОЛ плазменных липидов и липидов клеток крови представлена на рисунке 8. В крови пациентов с диагнозом БП обнаружено увеличение содержания всех продуктов липопереокисления, при этом накопление их в эритроцитах происходит интенсивнее, чем в плазме крови и в лимфоцитах. ДК в крови в среднем возрастает на 20-52%, МДА - на 57-68%, ШО - на 22-40%.

Хронический окислительный стресс характеризуется особой динамикой АО ферментов (Рис. 9). В активности СОД эритроцитов, как и СУА, отличий от контрольного уровня не наблюдается. В то же время активность эритроцитарной каталазы ингибируется на 40%. АОС лимфоцитов реагирует иначе - активность СОД значительно отличается от контроля (увеличивается на 76%), в то время как активность каталазы имеет тенденцию к снижению (на 23%). Анализ полученных данных свидетельствует также о повышении оксидазной активности ЦП на 58% по сравнению с контрольной группой. В эритроцитах наблюдается также снижение активности ГПО и ГСТ в среднем на 19-22% и снижение клеточного пула ОБН на 22%, несмотря на активацию на 31% ГР и на 43% - Г6ФДГ.

В качестве интегрального показателя стабильности мембран эритроцитов определяли содержание ВЭГ и уровень СПА плазмы крови (Рис. 8). Полученные данные указывают на отсутствие изменений в клинической группе уровня ВЭГ и снижение СПА на 40%, что может быть связано с ингибирующим действием фармакологических препаратов, принимаемых больными.

Данные, полученные при использовании зонда пнрена (Рис. 10), свидетельствуют об изменении структурного состояния мембран клеток крови. Текучесть ЛБ мембран эритроцитов снижается на 23% относительно контроля, участков АЛ - на 18%. Это может приводить к изменению подвижности и активности мембраносвязанных ферментов,

и

О Плазма О Эритроциты □ Лимфоциты

ДК

МДА

ШО

ЫОх

вэг

СПА

Рис. 8. Продукты ПОЛ и прооксидантиые факторы в крови при болезни Паркинсона. Обозначения как на Рис. 1.

20

[2-20 о

^-40

-- *

* п

п

гъ II

1 1 1 У п

• *

* □ Плазма а Эрит{ юшггы О Лимфоциты

СОД кат. ЦП ГПО ГСТ ГР Г6ФДГ 08Н Рис. 9. Антиоксидантная система крови при болезни Паркинсона. Обозначения как на

Рис. 1.

30

20

те - о 10

Э- 0

1 -10

н

о « -20

к

3- -30

1 -40

£

* 1—

* * ______

ПП 1

—1 1 1 1

1

*

и 0 Эритроциты □ Лимфоциты

текучесть ЛБ текучесть АЛ Структ. полярность полярность перестройки ЛБ АЛ

МБ

Рис. 10. Структурное состояние мембран клеток крови при болезни Паркинсона. Обозначения как на Рис. 1.

рецепторного аппарата, белков, обеспечивающих селективную проницаемость мембран. Параметр, характеризующий структурные перестройки мембранных белков эритроцитов, у пациентов с БП незначительно увеличивается. Полярность окружения зонда пирена в ЛБ эритроцитов возрастает на 23%, а в полярность АЛ имеет тенденцию к снижению на 10%. В мембранах лимфоцитов наблюдаются аналогичные нарушения структурно-функционального состояния. Микровязкость ЛБ возрастает на 37%, его полярность снижается на 6%; показатель структурных перестроек мембранных белков возрастает на 8%.

В мембранах клеток крови при БП обнаружено снижение интенсивности флуоресценции зонда АНС: в эритроцитах - в среднем на 37-44%, а в лимфоцитах - на 3036%, что указывает на повышение отрицательного поверхностного заряда клеток крови.

Нейродегенеративные заболевания относят к патологическим состояниям, связанным с избыточной активацией процессов клеточной гибели. Поскольку лимфоциты имеют рецепторные структуры, сходные с нейрональными, а, следовательно, могут быть чувствительны к тем же сигнальным молекулам, мы определяли уровень их клеточной гибели при БП. Показано, что в лимфоцитах пациентов обсуждаемой клинической группы уровень раннего апоптоза (по экспрессии ФС) выше, чем в контрольной на 42%.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при БП нарушение редокс-баланса в крови связано с недостаточностью и дисфункцией компонентов АОС. Это приводит к развитию каскада патологических реакций, которые способствуют нарушению структурной организации биомембран и усилению апоптоза лимфоцитов периферической крови. Вещества, подобные 8к(31, обладающие не только прямым АО действием, но и совокупностью регуляторных эффектов, могут иметь высокую эффективность в терапии нейродегенеративных процессов. Выявленные нарушения окислительного метаболизма в крови больных имеют ту же динамику, что и нарушения, отмеченные рядом авторов, в постмортальном мозге пациентов (Крыжановский и др., 2002), что подтверждает идею системности патологического процесса и расширяет перспективы поиска дополнительных маркеров тяжести заболевания.

ВЫВОДЫ

1. ГБО-индуцированный окислительный стресс характеризуется избыточной продукцией АФК, повышенным уровнем ЫОг'/ЫОз" в плазме крови и накоплением молекулярных продуктов ПОЛ в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга и крови крыс. Предварительное введение 5к(21 (5 дней, 50 нмоль/кг) в условиях нормоксии вызывает умеренное снижение продукции АФК, повышение уровня ЫОг'/МОз" в плазме крови и ингибирование ПОЛ в митохондриях и крови. При гипероксии БкСН способствует снижению

содержания АФК в крови, поддержанию стационарного уровня ПОЛ в исследованных тканях, но сохраняется повышенный уровень NOf/NOj" в плазме крови.

2. ГБО-индуцированный окислительный стресс нарушает сопряженность работы ферментов-антиоксидантов и снижает содержание GSH в исследованных тканях. SkQl при нормоксии оказывает стимулирующее действие на активность некоторых ферментативных антиоксидантов (СОД, ГПО, митоховдриальную ГСТ, эрнтроцитарную ГР) в исследованных тканях и увеличивает уровень GSH в митохондриях клеток больших полушарий. Предварительное введение SkQl при ГБО приводит к снижению дисбаланса в системе «ПОЛ-антиоксиданты» за счет стимуляции или нормализации активности компонентов антиоксидантной системы исследованных тканей.

3. ГЬО-индуцированный окислительный стресс приводит к нарушению структурной организации мембран эритроцитов и лимфоцитов. Предвартельное введение SkQl при ГБО способствует нормализации структурных параметров и поверхностного заряда мембран клеток крови. При нормоксии SkQl незначительно изменяет текучесть липидного бислоя эритроцитов.

4. ГБО-индуцированный окислительный стресс вызывает увеличение экспрессии фосфатидилсерина во внешнем монослое цитоплазматических мембран лимфоцитов; активирует каспазу-3 в мнтохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток больших полушарий головного мозга. SkQl при ГБО предотвращает активацию апоптоза в лимфоцитах крыс и способствует нормализации активности каспазы-3. При нормоксии SkQl модулирует апоптоз лимфоцитов, но не оказывает влияния на активность каспазы-3.

5. Хронический окислительный стресс при нейродегенеративном процессе (на примере болезни Паркинсона) характеризуется умеренным повышением продукции АФК и АФА, накоплением молекулярных продуктов ПОЛ и уменьшением эффективности антиоксидантной системы за счет снижения активности каталазы, ГПО, ГСТ, уровня GSH.

6. Хронический окислительный стресс при нейродегенеративном процессе (на примере болезни Паркинсона) нарушает структуру мембран клеток крови, приводит к увеличению их отрицательного поверхностного заряда и уровня апоптоза лимфоцитов в крови больных.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Даниленко А.О. Свободнорадикальные процессы в крови больных дисциркуляторной энцефалопатией с умеренными когнитивными нарушениями. / Тринитатский Ю.В., Внуков В.В., Милютина Н.П., Тринитатский И.Ю., Даниленко А.О.,

Головатенко О.И., Сычева Т.В., Булгаков В.В. // Клиническая неврология, 2009. № 3. С. 4-6 (0,12 п.л., личн. вк. 60%).

2. Данпленко А.О. Апоптоз и структурное состояние мембран лимфоцитов при болезни Паркинсона. / Внуков В.В., Даниленко А.О., Головатенко О.И., Ананян A.A., Милютина Н.П. //Валеология, 2011. № 1. С. 45-50 (0,2 пл., личн. вк. 50%).

3. Даниленко А.О. Процессы свободнорадпкального окисления в крови при болезни Паркинсона. / Тринитатскин Ю.В., Внуков В.В., Милютина Н.П., Тринитатский И.Ю., Даниленко А.О., Головатенко О.И., Чернецова С.Ю., Андриенко A.C., Булгаков В.В. // Клиническая неврология, 2011. № 2. С. 10-16 (0,24 п.л., личн. вк. 45%).

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

4. Даниленко А.О. Процессы свободнорадпкального окисления в крови больных дисциркуляторной энцефалопатией с умеренными когнитивными нарушениями. / Внуков В.В., Милютина Н.П., Даниленко А.О., Головатенко О.И. // Кислород и антиоксиданты, 2009. № 1. С. 69-70 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).

5. Даниленко А.О. Перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных ферментов в эритроцитах и структурное состояние мембран у пациентов с болезнью Паркинсона. / Даниленко А.О., Головатенко О.И., Андриенко A.C., Чернецова С.Ю., Сычева Т.В. // Материалы Vffl межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреладении». Ростов-на-Дону, 2009. С. 42-43 (0,04 п.л., личн. вк. 80%).

6. Даниленко А.О. Митохондриально-адресованный антиоксидант SkQl подавляет развитие оксидативного стресса при гипероксии. / Внуков В.В., Милютина Н.П., Даниленко А.О., Прокофьев В.Н. // Материалы Ш Международной конференции "Актуальные проблемы биологии, медицины и нанотехнологий". Ростов-на-Дону, 2009. С. 139-140(0,04 пл., личн. вк. 60%).

7. Даниленко А.О. Состояние глутатион-зависимых ферментов в эритроцитах крыс в норме, при гипероксии и защитном действии SkQl. / Даниленко А.О., Москвичев Д.В., Милютина Н.П. // Кислород и антиоксиданты, 2010. № 2. С. 31-32 (0,04 пл., личн. вк. 80%).

8. Даниленко А.О. Про- и антиоксидантный статус крови при болезни Паркинсона. / Даниленко А.О., Головатенко О.И., Чернецова С.Ю., Андриенко A.C. // Материалы XIV пущинской школы-конференции «Биология - наука XXI века». Пущино, 2010. С. 21-22 (0,04 пл., личн. вк. 70%).

9. Даниленко А.О. Структурно-функциональное состояние и поверхностный заряд мембран эритроцитов при болезни Паркинсона. / Даниленко А.О., Головатенко О.И., Чернецова С.Ю., Андриенко A.C. // Материалы IX межвузовской конференции с международным участием

«Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2010. С. 46-48 (0,12 п.л., личн. вк. 50%).

10. Даниленко А.О. Функционирование антиоксидантной системы эритроцитов в условиях нейродегенеративного процесса при болезни Паркинсона. / Даниленко А.О., Головатенко О.И., Чернецова С.Ю., Андриенко A.C. // Материалы IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2010. С. 43-46 (0,12 п.л., личн. вк. 80%).

11. Даниленко А.О. Регуляция антиоксидантом SkQl свободнорадикальных процессов и апоптоза в крови и митохондриях тканей крыс в норме и при окислительном стрессе. / Даниленко А.О., Головатенко О.И., Милютина Н.П. // Материалы 8-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь XXI века-будущееРоссийской науки». Ростов-на-Дону, 2010. С. 38-40 (0,08 п л., личн. вк. 90%).

12. Даниленко А.О. Структурное состояние и поверхностный заряд мембран клеток крови при болезни Паркинсона. / Даниленко А О., Головатенко О.И., Панина С Б. // Материалы X межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, 2011. С. 53-56 (0,12 п.л., личн. вк. 50%).

13. Даниленко А.О. SkQl как регулятор процессов свободнорадикалыюго окисления при гипероксии. / Внуков В.В., Даниленко А.О., Милютина Н.П., Ананян A.A., Вечканов Е.М. // Материалы IV международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону, 2011. С. 170-171 (0,04 п.л., личн. вк. 40%).

14. Даниленко А.О. Взаимосвязь патологических процессов в мозге и крови больных, страдающих болезнью Паркинсона. / Внуков ВВ., Даниленко А.О., Милютина Н.П., Головатенко О.И., Панина С.Б. // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Нейрохимические подходы к исследованию функционирования мозга». Ростов-на-Дону, 2011. С. 59-60 (0,04 п л., личн. вк. 70%).

15. Даниленко А.О Влияние катионного производного пластохинона SkQl на редокс-статус и апоптоз в тканях крыс при оксидативном стрессе. / Внуков В В., Милютина Н.П., Ананян A.A., Даниленко А.О., Вечканов Е.М., Головатенко О.И. // Материалы 7-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека". Смоленск, 2011. С. 5254 (0,08 п.л., личн. вк. 50%).

16. Даниленко А.О. Изменения структурного состояния и поверхностного заряда мембран лимфоцитов при болезни Паркинсона. / Внуков В В., Милютина Н.П., Ананян A.A.,

Даниленко А.О., Головатенко О.И // Материалы 7-ой национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека". Смоленск, 2011. С. 54-56 (0,08 п.л., личн. вк. 80%).

Список принятых сокращений

АЛ - апиулярные липиды

АНС - 1-анилинонафталин-8-сульфонат

АО - антиоксидантный

АОС - антиоксидантная система

АФК - активные формы кислорода

АФА - активные формы азота

БП — болезнь Паркинсона

ВЭГ- внеэритроцитарный гемоглобин

ГБО - гипербарооксигенация

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР — глутатионредуктаза

ГСГ- глугатион-8-трансфераза

Г6ФДГ - глкжозо-6-фосфатдегидрогеназа

ДК —диеновые конъюгаты

ЛБ - липидный бислой

ХЛ —хемилюминссценция

МДА - малоновый диальдегид

МБ — мембранные белки

ОС - окислительный стресс

ПОЛ - перекисное окисление лиггадов

СОД - супероксиддисмутаза

СПА - суммарная пероксидазная активность

СРО - свободнорадикальное окисление

СУА - супероксидустраняющая активность

ФС - фосфатидилсерин

ЦП - церулоплазмин

1110 — шиффовы основания

ОБИ - восстановленная форма глутатиона

N0*" - метаболиты радикала оксида азота, нитрит- и нитрат-ионы К02" и ЖЬ" 8к(}1 - 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний

Подписано в печать 16.02.2012 г. Формат 60x84 '/к,. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. пет. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №2212. Отпечатано в типографии ЮФУ. 344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 200/1.Тел. (863) 247-80-51.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Даниленко, Алеся Олеговна, Ростов-на-Дону

61 12-3/813

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

На правах рукописи

ДАНИЛЕНКО АЛЕСЯ ОЛЕГОВНА

Регуляция свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Н.П. Милютина

Ростов-на-Дону 2012

ВВЕДЕНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

Стр. 6

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................11

1.1. Свободнорадикальные процессы и их регуляция........................................................11

1.2. Биохимические механизмы апоптоза и роль митохондрий в программируемой клеточной гибели....................................................................................33

1.3. Свободнорадикальные аспекты патологического процесса при болезни Паркинсона..............................................................................................................................38

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................47

2.1. Постановка эксперимента........................................................................................................47

2.2. Клинические наблюдения........................................................................................................49

2.3. Получение биологического материала..........................................................................50

2.3.1. Получение плазмы крови..........................................................................................................50

2.3.2. Приготовление суспензии эритроцитов........................................................................51

2.3.3. Приготовление гемолизатов..................................................................................................51

2.3.4. Получение суспензии лимфоцитов..................................................................................51

2.3.5 Получение лизата лимфоцитов и митохондрий................................................51

2.4 Препаративные методы исследования..........................................................................52

2.4.1. Получение фракции митохондрий ступенчатым центрифугированием 52

2.5. Биохимические и биофизические методы исследования............................52

2.5.1 Хемилюминесцентный анализ плазмы крови в системе НгОг-люминол 52

2.5.2. Определение содержания метаболитов оксида азота......................................53

2.5.3. Экстракция липидов..........................................................................................................................54

2.5.4. Определение содержания диеновых конъюгатов................................54

2.5.5. Определение содержания продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой................................................................................................................................55

2.5.6. Определение содержания шиффовых оснований ..............................................55

2.5.7. Определение суммарной пероксидазной активности........................................56

2.5.8. Определение активности супероксиддисмутазы......................................................57

2.5.9. Определение активности каталазы......................................................................................58

2.5.10 Определение оксидазной активности церулоплазмина..................................59

2.5.11 Определение активности глутатионпероксидазы................................................59

2.5.12 Определение активности глутатион-8-трансферазы........................................60

2.5.13 Определение активности глутатионредуктазы......................................................61

2.5.14 Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы........................62

2.5.15 Определение содержания восстановленного глутатиона............................62

2.5.16 Определение структурных параметров биомембран с помощью флуоресцентного зонда пирена............................................................................................63

2.5.16.1 Определение относительной микровязкости липидного бислоя и микровязкости зон белок - липидных контактов мембран..............................63

2.5.16.2 Определение эффективности безызлучательного переноса энергии с остатков триптофана мембранных белков на пирен.... 64

2.5.16.3 Определение полярности липидной фазы и зон белок -липидных контактов мембран..........................................................................................65

2.5.17 Определение поверхностного заряда биомембран....................................................65

2.5.18 Определение интенсивности апоптоза лимфоцитов..........................................66

2.5.19 Определение активности каспазы-3................................................................................66

2.5.20 Определение содержания гемоглобина..............................................................................67

2.5.21 Определение содержания общих липидов..................................................68

2.5.22 Определение общего белка....................................................................................................68

2.5.23 Определение активности сукцинатдегидрогеназы............................................69

2.6. Статистическая обработка результатов исследования......... ................70

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................................72

3.1 Интенсивность свободнорадикальных процессов и их регуляция в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 81<С)........................72

3.2 Активность каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 8кС)1 77

3.3 Интенсивность свободнорадикального окисления и его регуляция в крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии БкС)! 79

3.4 Структурное состояние, поверхностный заряд и уровень апоптоза клеток крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и

действии 8кС)1..................................................................................................................................................90

3.5 Клинические наблюдения. Свободнорадикальные процессы и их регуляция в крови при нейродегенеративном процессе (на примере

болезни Паркинсона)...........................................................................98

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................112

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................................140

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................................................142

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ - активированные кислородные метаболиты

АНС - 1-анилинонафталин-8-сульфонат

АФК - активные формы кислорода

АФА - активные формы азота

БП - болезнь Паркинсона

ВАК - возбуждающие аминокислоты

ВЭГ-внеэритроцитарный гемоглобин

ДК - диеновые конъюгаты

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

TST - глутатион-8-трансфераза

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

КО - ксантиноксидаза

МАО - моноаминооксидаза

МГ - метилглиоксаль

МДА - малоновый диальдегид

ME - международная единица (мкмоль/мин)

МПО - миелопероксидаза

МФТИ - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин ОБ - общий белок OJI - общие липиды

ОМБ - окислительная модификация белков

ОНС - оксидативно-нитрозильный стресс

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СПА - суммарная пероксидазная активность

CP - свободные радикалы

СРО - свободнорадикальное окисление

СУА - супероксидустраняющая активность

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислот

ТБКАП - ТБК-активные продукты

ХЛ - хемилюминесценция

ЦНС - центральная нервная система

ЦП - церулоплазмин

ШО - шиффовы основания

ЭПО - эозинпероксидаза

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

ARE - антиоксидант-респонсивный элемент (от англ. «antioxidant responsive

element»)

Hb - гемоглобин

NOS - NO-синтаза

N0X" - метаболиты радикала оксида азота, нитрит- и нитрат-ионы N02" и N03

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Высокая чувствительность головного мозга к повреждающему действию кислорода обуславливает заболевания, при которых окислительный стресс (ОС) является одной из главных причин гибели нервных клеток - болезни Паркинсона, Альцгеймера, Пика, хорею Гентингтона и др. Прогресс в области клинической неврологии не может быть обеспечен без опережающего развития фундаментальных исследований, направленных на изучение механизмов функционирования мозга в норме и при патологии. Исследование заболеваний, в патологической картине которых важное место занимает ОС (на сегодняшний день их насчитывается более 200), невозможно без создания моделей подобных состояний разного уровня сложности. Одной из наиболее адекватных моделей для исследования механизмов ОС и его биологических последствий по праву считается гипербарическая оксигенация (ГБО) (Casey et al., 2011).

Другой важный аспект этой проблемы заключается в уточнении роли митохондрий как источника активированных кислородных метаболитов, а также их участия в реализации программы клеточной гибели. Подобные задачи можно решить при помощи соединений нового класса - митохондриально-адресованных антиоксидантов, разработанных под руководством академика В.П. Скулачева. Эти соединения представляют собой открытые В.П. Скулачевым и Е.А. Либерманом проникающие катионы трифенилфосфония, конъюгированные с эффективной ловушкой кислородных радикалов - молекулой пластохинона (Скулачев, 2007).

Следует отметить, что выявление механизмов защитного действия митохондриально-адресованных антиоксидантов - инновационное направление современной биологии и медицины. Хотя список митохондриальных патологий быстро пополняется и включает в себя рак, сердечную недостаточность, диабет, ожирение, инсульт, нейродегенеративные заболевания и старение, все эти состояния имеют общие черты - нарушение митохондриального гомеостаза кальция, АТФ или метаболизма активных форм кислорода (АФК) (Sheu et al., 2006). У соединений, минимизирующих митохондриальное накопление АФК и улучшающих митохондриальную биоэнергетику, есть весомый потенциал для лечения таких заболеваний.

Цель работы состояла в выяснении механизмов регуляции свободнорадикальных процессов и апоптоза при окислительном стрессе в мозгу и крови крыс в условиях ГБО, на фоне применения митохондриально-направленного антиоксиданта 8кС>1 и при нейродегенеративном процессе в крови пациентов с болезнью Паркинсона.

Задачи исследования:

1. Оценить интенсивность свободнорадикального окисления (СРО) в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга, плазме крови, эритроцитах и лимфоцитах крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 8кС) 1.

2. Оценить состояние антиоксидантной системы (АОС) в митохондриях клеток больших полушарий головного мозга и крови крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 8кС>1.

3. Изучить структурное состояние и поверхностный заряд мембран эритроцитов и лимфоцитов крыс при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 8кС> 1.

4. Определить интенсивность апоптоза лимфоцитов по экстернализации фосфатидилсерина и уровень активности каспазы-3 в митохондриальной и цитоплазматической фракциях клеток больших полушарий головного мозга при ГБО-индуцированном окислительном стрессе и действии 8к(21.

5. Изучить интенсивность свободнорадикального окисления, активность антиоксидантной системы в крови, структурное состояние и поверхностный заряд эритроцитов и лимфоцитов, уровень апоптоза лимфоцитов при болезни Паркинсона.

Научная новизна работы.

1. В работе впервые исследованы механизмы действия ГБО-индуцированного окислительного стресса (0,5 МПа, 90 минут) с корреляционным анализом показателей СРО и АОС в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс. Впервые показано, что гипероксия приводит к более, чем двукратному усилению экспрессии фосфатидилсерина (ФС) на поверхности лимфоцитарных мембран и одновременно - к увеличению активности каспазы-3 в цитоплазматической и митохондриальной фракциях клеток больших полушарий головного мозга.

2. Впервые in vivo исследованы регуляторные (антиоксидантные и антиапоптозные) эффекты SkQl в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс при нормоксии. Показано комплексное действие препарата: ингибирующее - на процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ); стимулирующее - на активность ключевых антиоксидантных ферментов и содержание в крови метаболитов N0', модулирующее - на уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови.

3. Впервые in vivo при ГБО-индуцированном окислительном стрессе исследованы регуляторные (антиоксидантные, мембранопротекторные и антиапоптозные) эффекты SkQl в крови и митохондриях клеток больших полушарий головного мозга крыс. Показана его способность к поддержанию стационарного уровня ПОЛ в исследованных тканях, к стимуляции или нормализации активности ферментативных антиоксидантов, к сохранению структурных параметров и поверхностного заряда биомембран, а также выраженный антиапоптозный эффект в условиях окислительного стресса.

4. Впервые проведена комплексная биохимическая оценка про- и антиоксидантных (АО) факторов крови при нейродегенеративном процессе (на примере болезни Паркинсона). Показано, что нейродегенеративный процесс характеризуется умеренным изменением показателей хемилюминесценции (ХЛ), накоплением молекулярных продуктов ПОЛ, метаболитов N0' и депрессией активности ключевых АО ферментов - каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), птутат и о н - S -тр ан с ф ер аз ы (ГСТ).

5. В работе впервые дана оценка структурному состоянию мембран эритроцитов и лимфоцитов при нейродегенеративном процессе и охарактеризован поверхностный заряд клеток крови. Показано, что интенсивность апоптотической гибели лимфоцитов при БП в полтора раза превышает норму.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ГБО (0,5 МПа, 90 мин) характеризуется избыточной продукцией АФК и активных форм азота (АФА), активацией процессов СРО, напряжением и нарушением работы ключевых АО ферментов, изменением структурных параметров и поверхностного заряда клеточных мембран, увеличением экспрессии ФС на поверхности мембран лимфоцитов и активности каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга.

2. Предварительное применение 8кС>1 оказывает антиоксидантное, антиапоптозное и мембранопротекторное действие и снижает выраженность ГБО-индуцированного ОС.

3. При нормоксии 8кС>1 оказывает активирующее влияние на некоторые АО ферменты, ингибирует начальные и промежуточные стадии ПОЛ, снижает экстернализацию ФС на поверхности лимфоцитов, не оказывая влияния на активность каспазы-3 в клетках больших полушарий головного мозга.

4. Хронический окислительный стресс при нейродегенеративном процессе характеризуется умеренным повышением продукции АФК и АФА, накоплением молекулярных продуктов ПОЛ и снижением эффективности антиоксидантной защиты. Изменение структурных параметров мембран и рост отрицательного поверхностного заряда клеток крови сопровождается увеличением уровня апоптоза лимфоцитов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в настоящей работе данные представляют существенный интерес для понимания механизмов окислительного стресса, развивающегося как при действии острого стресс-фактора (гипербарический кислород), так и в условиях хронически протекающей патологии (нейродегенеративый процесс). Проведенное исследование позволило установить ряд фундаментальных закономерностей развития окислительного стресса в условиях гипербарооксигенации в эксперименте и при нейродегенеративном процессе на примере БП, а также показать тесную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза при исследованных патологических состояниях. Показано, что одной из ведущих причин повреждающего действия ГБО является сверхпродукция АФК митохондриями, приводящая к митохондриальной дисфункции, что определяет вовлечение этих органелл в процессы клеточной гибели. Выявлена взаимосвязь активности антиоксидантной защиты и содержания продуктов ПОЛ митохондрий клеток больших полушарий головного мозга и крови при гипероксии.

Проведенное исследование позволило продемонстрировать в эксперименте выраженное регуляторное действие катионного производного пластохинона 8кС>1 на свободнорадикальное окисление и программируемую клеточную гибель в условиях нормо- и гипероксии, которое реализуется как за счет собственного антиоксидантного потенциала 8кС>1, так и за счет стимуляции им эндогенных факторов защиты. На основе полученных результатов в эксперименте разработана инновационная технология

цитопротекции при ОС, вызванном ГБО, посредством применения митохондриально-адресованного антиоксиданта.

В работе впервые проведена комплексная оценка нарушений свободнорадикального и структурно-метаболического гомеостаза при хроническом нейродегенеративном процессе, сопряженном с БП, в патогенез которого вовлекается митохондриальная дисфункция и окислительный стресс. Разработана информативная тест-система, включающая определение показателей системы «про- антиоксиданты», структурного состояния биомембран и уровня апоптоза лимфоцитов в крови, что может быть использовано в клинике для оценки тяжести патологического процесса и эффективности проводимого лечения. Выявленная в работе общность ряда молекулярных механизмов окислительного стресса в условиях гипероксии и нейродегенерации, с одной стороны, и эффективность применения митохондриально-адресов�