Изучение активности апоптоза при воздействии некоторых алиментарных и токсических факторов

Селяскин, Кирилл Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение активности апоптоза при воздействии некоторых алиментарных и токсических факторов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение активности апоптоза при воздействии некоторых алиментарных и токсических факторов"

На правах рукописи

СЕЛЯСКИН КИРИЛЛ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ АПОПТОЗА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ АЛИМЕНТАРНЫХ И ТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

03.01.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 6 ПАР 2014

Москва - 2014

005545859

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательс институт питания» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель: академик РАН,

доктор медицинских наук, профессор Тутельян Виктор Александрович

Официальные оппоненты: Дурнев Андрей Дмитриевич, член-корреспондент РАН,

доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук.

Муронец Владимир Израилевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимии животной клетки, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «24» марта 2014 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 001.002.01 в ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, 2/14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН

Автореферат разослан «22» февраля 2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Коденцова В.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность темы

Прогрессивные исследования механизмов апоптоза создали предпосылки для использования теоретических и практических знаний в экспериментальной и клинической медицине (Feitelson М.А. et al., 1998; Скулачев В.П. 1999, 2001; Ярилин A.A., 2001; Фильченков A.A., 2003; Рязанцева Н.В. и др., 2011; Orrenius S. et. al., 2011). Показано, что после индукции апоптоза дальнейшая судьба клетки (гибель или выживание) зависит от целого ряда факторов, модулирующих программированную клеточную гибель. К таким факторам можно отнести постоянно существующие в клетке белки, такие как семейство Bel-2, IAP и каспазы, а также индуцируемые стрессом молекулы - факторы регуляции транскрипции NF-kB и р53, церамид, киназы JNK, р38 и ERK. Нарушение механизмов регуляции апоптоза, приводящее к его ингибированию или неадекватному активированию, лежит в основе патогенеза онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний (Reed J.C., 1998; Gross А. et. al., 1999; Москалева Е.Ю., 2006; Рязанцева Н.В., 2008).

Исследование молекулярных механизмов, отвечающих за контроль процессов апоптоза, позволило выявить ряд диагностически значимых маркеров различных этапов гибели клетки (Brenner С., 1998; Bilyy R., 2007; Orrenius S. et. al., 2011). Вместе с тем, наличие, как минимум, двух механизмов инициации апоптоза и сложной сети его регуляции позволяет говорить о возможной неоднозначности полученных результатов при изучении молекулярных факторов, характерных для определённого этапа апоптоза, а сравнительная оценка чувствительности различных методов значительно затруднена из-за большого разнообразия оцениваемых критериев. В прикладном аспекте одним из перспективных направлений, наряду с исследованием молекулярных маркеров апоптоза, может являться непосредственное определение количественных показателей, характеризующих процессы деструкции цитоскелета и фрагментации ДНК в тканях, позволяющих наиболее достоверно оценить активность апоптоза (Gavrieli Y., 1992; Matassov D., 2004; Wlodkwic D,

Поскольку апоптоз является эволюционно-консервативным системным процессом, обеспечивающим поддержание гомеостаза на протяжении всего периода жизни организма, показатели активности апоптоза можно рассматривать как интегральные биомаркеры, отражающие уровень адаптации организма к окружающей среде и обладающие высокой неспецифической чувствительностью к воздействиям различной природы (Siu Р., 2004; Wieckowska А., 2006; Canbakan В., 2010; Stone А., 2013; Dick S., 2013). Есть все основания полагать, что определение активности апоптоза может быть эффективно использовано в исследованиях, направленных на изучение влияния экзогенных воздействий различной природы, в том числе, низкотоксичных объектов. Комплексное изучение апоптоза под влиянием разнообразных средовых или онтогенетических факторов широко представлено в научных публикациях (Maier Р., 1996; Wang Е., 1997; Young D., 1999; Robertson J.,

2009).

2000; СоиИв Б., 2007), однако влияние алиментарных факторов на предрасположенность клетки к апоптозу остается до настоящего времени наименее изученным аспектом проблемы.

Целью настоящей работы является выявление наиболее чувствительных методов определения активности апоптоза и использование этих методов для изучения активности апоптоза при воздействии алиментарных и токсических факторов.

1.2. Основные задачи исследования

1. Провести сравнительную оценку чувствительности биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на экспериментальной модели индукции апоптоза адренокортикотропным гормоном.

2. Провести сравнительную оценку чувствительности биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на модели токсического действия низких и сверхнизких доз тетрахлорметана.

3. Охарактеризовать влияние модификации пищевого статуса животных, получавших рацион с дефицитом пантотеновой кислоты на изменение активности апоптоза в органах лабораторных животных.

4. Изучить влияние различных доз фитостероидов на активность апоптоза в органах крыс, в нормальных условиях и в условиях стресса, вызванного воздействием электрического тока.

5. Изучить активность апоптоза у крыс, получавших генно-инженерно-модифицированную (ГМ) кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена vipЗAa20.

1.3. Научная новизна

Впервые сравнительно охарактеризована чувствительность биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов, позволяющих обнаружить апоптоз на эффекторном этапе (содержание белков Вс1-2, Вах, р53, активность каспазы-3), а также этапе деструкции (фрагментации ДНК) в органах крыс при токсических воздействиях различной интенсивности. Установлено, что метод ДНК-комет является наиболее чувствительным для определения активности апоптоза при воздействии низких и минимально низких доз токсических факторов.

Показано, что дефицит пантотеновой кислоты в рационе крыс снижает активность апоптоза в печени животных, а при сочетанном действии введения ССЦ и дефицита пантотеновой кислоты имеет место обратный эффект - увеличение активности апоптоза. Введение в рацион крыс фитостероидов в нормальных условиях не влияет на интенсивность процессов апоптоза, тогда как при сочетанном воздействии фитостероидов и моделированного стресса (воздействие электрическим током), было выявлено ингибирующие действие фитостероидов и сохранение активности процессов апоптоза в пределах физиологических значений.

Схема оценки активности апоптоза рекомендована в качестве высокочувствительного системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий различных факторов окружающей среды, в частности алиментарных факторов.

1.4. Практическая значимость работы

Определение активности апоптоза в органах лабораторных животных включено в систему оценки безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения в качестве системного биомаркера.

Метод ДНК-комет предложен в качестве высокоинформативного и чувствительного метода определения активности апоптоза при изучении воздействий экзогенной природы.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Сравнительная характеристика биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на различных экспериментальных моделях свидетельствует, что метод ДНК-комет является наиболее чувствительным для оценки активности апоптоза.

2. Изучение активности апоптоза может бьггь использовано в качестве высокочувствительного системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий различных факторов окружающей среды, в частности алиментарных факторов.

1.6. Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на X Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 1-3 декабря 2008 г.), XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов (Москва, 30 ноября - 2 декабря 2009 г.), XIII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов с международным участием «Персонифицированная диетология: настоящее и будущее» (Москва, 5-7 декабря 2011г.), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.). Апробация работы состоялась 17 декабря 2013 г. на межлабораторной научной конференции ФГБУ «НИИ питания» РАМН.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НИИ питания» РАМН в рамках тем №098, №116 и №134.

1.7. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в научном журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8. Личный вклад соискателя

Все изложенные в диссертации результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.

1.9. Объём и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Указатель литературы содержит 39 российский и 124 зарубежных источника. Объем работы составляет 102 страницы машинописного текста, содержит 3 рисунка, 2 схемы и 35 таблиц.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Экспериментальные животные

Все модельные эксперименты выполнены на 220 крысах-самцах линии Вистар с массой тела 250-270 г., полученных из питомника лабораторных животных РАМН «Столбовая». Крыс содержали в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в отапливаемом (температурный режим +21-23°С) и вентилируемом помещении с естественным освещением, доступ к корму и воде ad libitum. На протяжении всех экспериментов не отмечено гибели крыс контрольной и опытных групп. Состав, пищевая и энергетическая ценность использованных рационов представлены в табл. 1.

Таблица 1. Состав полусинтетического казеинового рациона

Ингредиенты рациона Кол-во, г Белок, г Жиры, г Углеводы, г Калорийность

ккал %

Казеин 25,0 20,20 0,38 - 84,22 22,1

Крахмал маисовый 58,0 0,58 - 50,2 203,12 53,3

Масло подсолнечное 5,0 - 4,99 - 44,91 11,8

Лярд 5,0 - 4,98 - 44,82 11,8

Солевая смесь 4,0 - - - - -

Смесь в/р витаминов 1,0 - - 1,0 4,0 1,0

Смесь ж/р витаминов* 0,1 - 0,1 - - -

Микрокристаллическая целлюлоза 2,0 - - - - -

ИТОГО 100,1 20,78 10,45 51,2 381,07 100

* по МУ 2.3.2.2306-07

Изучение активности апоптоза у крыс, получавших генно-инженерно-модифицированную (ГМ) кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена у1рЗАа20 проводили на 20 крысах самцах линии Вистар, с массой тела 90-100 г. Животные получали свободный доступ к корму и воде, содержались в пластиковых клетках с древесной подстилкой, в вентилируемом помещении, по 4-5 особей в клетке.

Животные были произвольно разделены на 2 группы (по 10 особей в каждой группе): животные опытной группы получали с рационом ГМ кукурузу, животные контрольной группы -традиционный аналог ГМ кукурузы. Измельченное зерно кукурузы включали в состав корма из расчета -10-12 г на крысу в сутки, заменяя ингредиенты рациона по принципу изокалорийности и идентичности химического состава (табл. 2).

Таблица 2. Состав экспериментальных рационов с включением кукурузы

Ингредиенты рациона Кол-во, г Белок, г Жиры, г Углеводы, г Калорийность

Ккал | %

Опытная группа, ГМ кукуруза устойчивая к вредителям

Казеин 15,06 12,74 0,18 - 52,58 15

Крахмал маисовый 24,33 0,24 - 20,31 82,20 24

Масло подсолнечное 2,57 - 2,56 - 23,04 7

Лярд 2,0 - 1,99 - 17,91 5

Солевая смесь 4,0 - - - - -

Смесь в/р витаминов 1,0 - - 1,0 4,00 1

Смесь ж/р витаминов 0,1 - 0,1 - 0,90 0

Кукурузная мука 49,90 4,18 2,43 32,29 167,75 48

ИТОГО 98,96 17,16 7,26 53,60 348,38 100

Контрольная группа, традиционный аналог ГМ куку РУЗЫ

Казеин 14,75 12,48 0,18 - 51,54 15

Крахмал маисовый 24,21 0,24 - 20,21 81,80 24

Масло подсолнечное 2,75 - 2,74 - 24,66 7

Лярд 2,0 - 1,99 - 17,91 5

Солевая смесь" 4,0 - - - - -

Смесь в/р витаминов* 1,0 - - 1,0 4,00 1

Смесь ж/р витаминов" 0,1 - 0,1 - 0,90 0

Кукурузная мука 50,15 4,44 2,25 32,39 167,57 48

ИТОГО 98,96 17,16 7,26 53,60 348,38 100

* по МУ 2.3.2.2306-07

2.2. Схемы экспериментов

Исследования включали несколько последовательных этапов, структура экспериментов представлена в табл. 3.

В первой серии исследований на классической модели активации апоптоза под действием адренокортикотропного гормона (АКТГ) были отработаны оптимальные методы определения ключевых белков апоптоза - р53, Вах, Вс1-2, активности каспазы-3, а также метод ДНК-комет для определения степени фрагментации ДНК в органах крыс (эксперимент 1).

Во второй серии исследований на модели токсического действия низких и сверхнизких доз тетрахлорметана (ССЦ) определены наиболее чувствительные методы оценки активности апоптоза, а также восприимчивые к апоптогенным воздействиям ткани и органы (эксперименты 2-4).

В третьей серии исследований оценивали влияние дефицита пантотеновой кислоты, а также сочетанное действие дефицита пантотеновой кислоты и низкой дозы ССЦ на изменение активности апоптоза в органах крыс (эксперимент 5).

Влияние различных доз фитостероидов (20 гидроксиэкдизона (20Е) и 258-инокбстерона), на активность апоптоза в различных органах крыс, получавших с рационом фитостероиды в нормальных условиях, изучено в эксперименте 6; подвергавшихся стрессорному воздействию электрическим током (ток 0,4 мА в течение 8 секунд) изучено в эксперименте 7.

Проведено определение изменения активности апоптоза в органах и тканях лабораторных животных при медико-биологических исследованиях ГМ кукурузы, содержащей кассету экспрессии гена угрЗАа20 (эксперимент 8).

Таблица 3. Структура экспериментов1

Группа животных Воздействие Время отбора проб Отбираемые органы Методы определения активности апоптоза

1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия АКТГ

Контроль - - Печень, почки, тимус, мозг, костный мозг Каспаза-3; ИГХ (р53, Вах, Вс1-2); Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 АКТГ - 4 МЕ/кг массы тела 6, 12,24 часа

Опьгг-2 АКТГ -75 МЕ/кг массы тела

2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия ССЦ

Контроль - - Печень, почки, тимус, мозг, костный мозг Каспаза-3; ИГХ (р53, Вах, Вс1-2); Метод «ДНК-комет»

Опьгг-1 ССЦ - 0,08 мг/кг массы тела 6, 12,24 часа

Опыт-2 ССЦ - 0,48 мг/кг массы тела

3. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз СОД лабораторным животным

Контроль - - Печень, почки, тимус, мозг, костный мозг Каспаза-3; ИГХ (р53, Вах, Вс1-2); Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 ССЦ - 0,01 мг/кг массы тела 24 часа

Опыт-2 ССЦ - 0,02 мг/кг массы тела

Опыт-3 ССЦ - 0,04 мг/кг массы тела

4. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз ССЦ

Контроль - - Печень, почки, тимус, костный мозг, мозг, сердце, легкие, селезенка, надпочечники, семенники, простата Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 ССЦ - 0,04 мг/кг массы тела 24 часа

Опыт-2 ССЦ - 0,08 мг/кг массы тела

5. Изучение влияния дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия ССЦ и витаминной недостаточности

Контроль - 30 дней печень, почки, тимус, костный мозг, мозг, сердце, селезенка, семенники Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 Деф. вит. В5

Опьгг-2 Деф. вит. В5 + ССЦ -0,08 мг/кг массы тела

1 Дизайн эксперимента разработан совместно с в.н.с., к.м.н. Н.В. Тышко.

6. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза в норме

Контроль - 30 дней тимус, мозг, сердце Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 Фитостероиды 5 мг/кг массы тела

Опыт-2 Фитостероиды 15 мг/кг массы тела

7. Влияние фитостероидов на изменение активности апоптоза после стрессорного воздействия электрическим током

Контроль — 30 дней тимус, мозг, сердце Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 Стрессорное воздействие

Опыт-2 Фитостероиды 2 мг/кг массы тела + стрессорное воздействие

8. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена У1рЗАа20

Контроль Традиционный аналог 180 дней печень, почки, тимус, костный мозг, мозг, сердце, селезенка, семенники Метод «ДНК-комет»

Опыт-1 ГМ кукуруза

2.3. Биохимический метод определения активности каспазы-3 Активность каспазы-3 в тканях лабораторных животных определяли, используя тест-систему «Caspase 3 Colorimetric Kit» фирмы R&D System, США согласно (Stennicke Н., 1997).

Принцип метода основан на расщеплении искусственного субстрата Ac-DEVD-pNA (Ас-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide) каспазой-3 и спектрофотометрической регистрации продукта реакции р-нитроанилина (pNA) на спектрофотометре «StatFax 1904+» через 60 мин после начала реакции при длине волны 405 нм (ешМ= 10,5). Полученные данные нормировали по количеству белка в пробе («iT Protein Assay Kits» фирмы Invitrogen, США) активность каспазы-3 выражали в пмоль/мин/мг белка.

2.4. Морфометрические методы Морфологические исследования включали гистологический и иммуногисгохимический методы. Кусочки печени крыс фиксировали в 4% растворе параформальдегида в фосфатном буфере (pH 7,2-7,4) в течение 48 ч. Проводку, заливку в парафин и приготовление парафиновых блоков выполняли по стандартной методике (Пирс Э., 1962; Лили Р.,1969; Саркисов Д.С., 1996). Из каждого блока получали 10-12 серийных срезов толщиной 4 мкм и помещали их на стекла, обработанные поли-Ь-лизином (Menzel-Glaser®, 76x26 мм). Подготовленные к окрашиванию микропрепараты (по 3-4 среза на стекло) использовали в гистологических и иммуногистохимических исследованиях2.

Гистологическое исследование. Микропрепараты окрашивали гематоксилином и эозином по (Саркисов Д.С., 1996). Гистологические исследования включали выявление клеток с начальными признаками апоптотического распада ядра (конденсация хроматина, инвагинации (вдавления)

2 Автор признателен д.м.н. Сапрыкину В.П. за помощь в подготовке гистологических срезов.

ядерной мембраны, фрагментация ядра) и свободно лежащих апоптозных телец. Расчета индекс апоптоза (ИА) проводили по формуле (стр. 10). На основании результатов гистологических исследований, отбирали препараты для иммуногисгохимических исследований с ИА > 1,5.

Для иммуногистохимического исследования методом двойных антител с иммунопероксидазной (стрептовидин-биотиновой) меткой применяли моноклональные антитела: Вс1-2 (кат. № аЬ7973), Вах (кат. № аЬ7977), р53 (кат. № аЬ4060) фирмы Abeam, Великобритания.

Анализ гистологических и иммуногисгохимических микропрепаратов проводили с помощью микроскопа Zeiss Axiolmager ZI в проходящем свете при увеличении х400, программное обеспечение Zeiss Axiolmager Version 4.7. С каждого препарата анализировали не менее 200 клеток. Содержание белков определяли как число окрашенных клеток деленное на 1000 клеток и умноженное на 100%.

2.5. Гель-электрофорез изолированных клеток «ДНК-комет»

Для оценки степени фрагментации ДНК и расчета индекса апоптоза был использован метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (ДНК-комет) (Дурнев и др., 2006).

Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель: в постоянном электрическом поле ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий хвост кометы, параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК.

Микроскопический анализ проводили на микроскопе Zeiss Axio Imager ZI при увеличении 400х. Полученные изображения ДНК-комет (краситель SYBR Green I) анализировали с использованием программного обеспечения Comet Imager system, «Metasystems GmbH». В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте). Апоптотическими считали клетки с содержанием ДНК в хвосте ДНК-кометы >30%. С каждого микропрепарата анализировали не менее 200 клеток и рассчитывали индекс апоптоза (ИА) по формуле:

А +

ИА =-х 100%

1000 клеток

где А+ - количество апоптотических клеток.

■ Рисунок 1. Клетки печени крысы с различной степенью поврежденности ДНК.

а - клетка без повреждений

(до 1% поврежденной ДНК); b - клетка с некоторыми повреждениями

(до 10% поврежденной ДНК); с - клетка со значительными повреждениями

(до 30% поврежденной ДНК); d - апоптоз-положительная клетка (более 30% поврежденной ДНК).

2.6. Статистическая обработка результатов исследований

Обработку результатов исследования проводили с использованием пакета программ прикладного статистического анализа StatSoft STATISTZCA 8.0. Характер распределения количественных признаков определяли с помощью ^-критерия. Проверка гипотезы о равенстве дисперсий проводилась с помощью критерия Левена. Вычисляли среднее значение (М), стандартное отклонение (SD) и стандартную ошибку среднего (т). Данные представлены как М±ш.

Проводили сравнение количественных признаков двух независимых выборок, удовлетворяющих условиям нормального распределения и равенству дисперсий критерия ANOVA. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (р) принимали равньм 0,05.

3. Результаты и обсуждение

3.1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона

Изучены изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 4 и 75 ME/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза - содержание белков Вс1-2, Вах и р53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза - активность каспазы-3, а также этап деструкции - уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза. Результаты исследований уровня апоптоза представлены в табл. 4-7.

Как видно из табл. 4, после введения АКТГ в дозе 4 ME/кг, содержание белков Вс1-2, Вах и р53 в печени крыс опытной группы не отличалось от контрольных значений на всех сроках отбора материала. Через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 ME/кг отмечено повышение содержания белка Вс1-2 на 61% (р<0,05) по сравнению с контрольным уровнем, содержание данного белка через 6 и 12 часов не имело различий с контролем. Содержание белков Вах и р53 не отличалось от контрольных величин на всех сроках отбора материала.

Таблица 4. Содержание Вс1-2, Вах и р53 белков в печени крыс после введения АКТГ

Содержание белков, % Контроль Доза АКТГ

4 ME/кг массы тела 75 ME/кг массы тела

6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Вс1-2 М±т 2,34±0,47 2,19±0,54 2,55±0,73 2,17±0,56 2,55±0,79 2,04±0,65 3,77±0,49*

Вах М±т 1,89±0,57 1,83±0,38 1,78±0,47 2,04±0,71 2,28±0,48 2,01±0,36 1,90±0,79

р53 М±т 2,20±0,53 1,89±0,67 1,97±0,48 2,16=1=0.45 2,27±0,44 2,45±0,71 2,13±0,52

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

После введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела не наблюдалось изменений активности

каспазы-3 в печени, почках, головном мозге и костном мозге крыс на всех сроках отбора материала.

Достоверное возрастание активности каспазы-3 отмечено в тимусе (на 31%) через 24 часа после введения АКТГ. После введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг было отмечено достоверное увеличение активности каспазы-3 в почках (через 12 часов - на 45%, через 24 часа - на 29%) и тимусе (через 24 часа - на 19%). Изменений активности каспазы-3 в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.

Таблица 5. Активность каспазы-3 в тканях крыс после введения АКТГ

Активность Доза АКТГ

каспазы-3, Контроль 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела

пмоль/мин/мг белка 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Печень М±ш 23,07±1,02 22,91±1,08 22,04±1,21 23,83±1,01 22,57±0,91 23,78±0,73 22,08±0,81

Почки М±т 8,89±0,27 8,97±0,31 9,13±0,21 8,80±0,19 8,94±0,41 12,87±0,48» 11,47±0,37*

Тимус М±т 5,31±0,19 5,21 ±0,17 5,73±0,29 6,97±0,14* 5,35±0,14 5,34±0,12 6,34±0,27*

Мозг М±т 0,07±0,01 0,08±0,01 0,09±0,02 0,09±0,02 0,10±0,02 0,09±0,01 0,07±0,02

Костный мозг М±т 2,41 ±0,12 2,38±0,16 2,43±0,24 2,27±0,29 2,63±0,13 2,57±0,15 2,68±0,13

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

Таблица 6. Уровень фрагментации ДНК в тканях крыс после введения АКТГ

Степень Доза АКТГ

фрагментации ДНК, Контроль 4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела

%ДНК 6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Печень М±т 7,08±0,15 7,33±0,11 7,12±0,09 7,31 ±0,14 6,95±0,09 7,10±0,13 7,14±0,11

Почки М±т 7,32±0,29 7,15±0,21 7,35±0,31 8,18±0,21* 7,68±0,21 8,15±0,21* 8,27±0,17»

Тимус М±т 8,83±0,21 8,77±0,17 8,66±0,18 8,69±0,20 9,02±0,14 9,58±0,19* 9,87±0,21*

Мозг М±т 5,34±0,11 5,14±0,13 5,27±0,09 5,18±0,12 5,27±0,08 5,39±0,10 5,19±0,14

Костный мозг М±т 8,31±0,24 8,19±0,24 8,26±0,17 8,51±0,23 8,21±0,16 8,33±0,20 8,41±0,16

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

Как видно из табл. 6-7, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апогггоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг в целом соответствовал характеру изменений активности каспазы-3 (табл. 5): достоверное повышение уровня фрагментации ДНК отмечено в почках (через 12 часов - на 11%, через 24 часа - на 13%) и тимусе (через 12 часов - на 8%, через 24 часа - на 12%); достоверное повышение индекса апоптоза отмечено в почках (через 12 часов — на 46%, через 24 часа - на 38%) и тимусе (через 12 часов - на 28%, через 24 часа - на 27%). Изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс не выявлено.

Характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ в дозе 4 МЕ/кг несколько отличался от изменений активности каспазы-3: достоверное возрастание уровня фрагментации ДНК отмечено в почках (на 12%) через 24 часа после введения АКТГ, индекса апоптоза на 35%, тогда как изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе не выявлено на всех сроках отбора материала. Также не наблюдалось

изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени, головном мозге и костном мозге крыс на протяжении всего периода исследований.

Таблица 7. Индекс апоптоза в тканях крыс после введения АКТГ

Индекс апоптоза, % ДНК Контроль Доза АКТГ

4 МЕ/кг массы тела 75 МЕ/кг массы тела

6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Печень М±т 0,84±0,05 0,88±0,03 0,84±0,03 0,88±0,03 0,81 ±0,04 0,84±0,04 0,85±0,13

Почки М±т 1,12±0,12 1,07±0,04 1,13±0,11 1,51±0,13* 1,10±0,09 1,64±0,14* 1,54±0,10»

Тимус М±т 1,34±0,11 1,29±0,15 1,28±0,16 1,33±0,14 1,35±0,09 1,72±0,14* 1,71±0,13*

Мозг М±т 0,59±0,06 0,54±0,05 0,61±0,05 0,58±0,03 0,62±0,04 0,63±0,05 0,60±0,06

Костный ,,, М±т мозг 1,18±0,!5 1,09±0,12 1,14±0,14 ],09±0,11 1,15±0,08 1,09±0,13 1,11±0,08

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

Моделирование токсического воздействия в эксперименте путем внутрибрюшинного введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг массы тела приводит к увеличению активности апоптоза в тимусе и почках крыс, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе имеет сходный характер: значения этих показателей возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения АКТГ. При определении содержания белков Вс1-2, Вах и р53 не было выявлено какой-либо динамики: на всех сроках отбора проб содержание белков Вах и р53 оставалось в пределах контрольных значений, некоторое повышение содержания белка Вс1-2 через 24 часа после введения АКТГ в дозе 75 МЕ/кг не позволяет расценивать этот факт, как свидетельство усиления процессов апоптоза: поскольку реализация апоптоза - комплексное явление, только комплексная реакция всех рассмотренных ключевых белков эффекторного этапа может быть принята как доказательство активации апоптоза.

Введение АКТГ в дозе 4 МЕ/кг массы тела через 24 часа приводит к повышению активности каспазы-3 в тимусе крыс и повышению уровня фрагментации ДНК и апоптозного индекса в почках крыс. Поскольку реакция изученных показателей на введение 4 МЕ/кг находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась от фонового уровня апоптоза, такая доза АКТГ не является предпочтительным индуктором апоптоза для постановки модельных экспериментов.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что показатели, характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24 часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень фрагментации ДНК>активность каспазы-3.

3.2. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия ССЦ

В исследованиях оценивали изменения показателей апоптоза через 6, 12, 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения ССЦ в дозе 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза — содержание белков Вс1-2, Вах и р53, завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза - активность каспазы-3, а также этап деструкции - уровень фрагментации ДНК, индекс апоптоза.

После введения ССЦ у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено каких-либо макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований уровня апоптоза представлены в табл. 8-11.

Таблица 8. Содержание Вс1-2, Вах и р53 белков в печени крыс после введения ССЦ

Содержание белков, % Контроль Доза ССЦ

0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела

6ч 12 ч 24 ч бч 12 ч 24 ч

Bcl-2 М±т 2,34±0,27 2,01±0,55 3,12±0,21* 3,03±1,05 4,74±0,62* 5,07±0,33* 4,18±0,76*

Вах М±т 1,89±0,57 1,78±0,31 2,73±1,34 2,11±0,79 4,07±0,38» 4,70±0,64* 3,17±0,59*

р53 М±т 2,20±0,53 2,43±0,67 2,19±0,66 2,15±0,44 3,07±0,52 4,15±0,27* 3,44±0,21*

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

Как видно из табл. 8, через 6 часов после однократного внутрибрюшинного введения ССЦ в дозе 0,08 мг/кг не отмечалось повышения содержания белков Вс1-2, Вах и р53, через 12 часов зарегистрировано повышение содержания белков Вс1-2 (на 33%, р<0,05) и Вах (на 44%, р>0,05), содержание белка р53 не отличалось от контрольного уровня, через 24 часа содержание белков не отличалось от уровня контроля.

После введения ССЦ в дозе 0,48 мг/кг, повышение содержания белков Вс1-2, Вах и р53 отмечено на всех сроках отбора образцов: через 6 часов - на 103% (р<0,05), 115% (р<0,05) и 40% (р>0,05); через 12 часов - на 117% (р<0,05), 149% (р<0,05) и 89% (р<0,05); через 24 часа - на 79% (р<0,05), 68% (р<0,05) и 56% (р<0,05), соответственно.

Таблица 9. Активность каспазы-3 в органах крыс после введения ССЦ

Активность каспазы-3, пмоль/мин/мг белка Контроль Доза ССЦ

0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела

6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Печень М±т 23,07±1,02 22,9± 1,08 24,38±1,12 34,12±1Д7» 28,07±0,92» 27,01±1,09* 45,98±0,87*

Почки М±т 8,89±0,27 9,07±0,41 9,31±0,28 10,17±0,49* 9,53±0,44 9,89±0,61 12,09±0,34*

Тимус М±т 5,31±0,19 5Д1±0,17 5,73±0,29 5,87±0,31 4,83±0,25 5,01±0Д6 5,68±0,32

Мозг М±т 0,07±0,01 0,08±0,01 0,09±0,02 0,09±0,02 0,09±0,01 0,07±0,02 0,10±0,02

Костный .,, М±т мозг 2,41 ±0,12 2,38±0,16 2,47±0,24 2,51±0,13 2,35±0,24 2Д8±0,18 3,77±0Д9*

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличил от контроля достоверны при р<0,05

После введения CCI4 в дозе 0,08 мг/кг массы тела не наблюдалось изменений активности каспазы-3 в тимусе, мозге и костном мозге крыс на всех сроках отбора материала. Достоверное возрастание активности каспазы-3 отмечено в печени (на 48%) и почках (на 15%) крыс через 24 часа после введения ССЦ.

После введения ССЦ в дозе 0,48 мг/кг было отмечено достоверное увеличение активности каспазы-3 в печени (через 6 часов - на 21%, через 12 часов - на 17%, через 24 часа - на 99%), почках (через 24 часа - на 27%) и костном мозге (через 24 часа - на 60%). Изменений активности каспазы-3 в тимусе и головном мозге крыс не выявлено.

Как видно из табл. 10-11, характер изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тканях крыс в целом соответствовал характеру изменений активности каспазы-3 (табл. 9), однако изменения уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза проявлялись на более ранней стадии: после введения ССЦ в дозе 0,08 мг/кг массы тела достоверное возрастание уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза отмечено в печени через 12 и 24 часа: на 28 и 29%, и на 81 и 155%, соответственно. Также отмечено возрастание индекса апоптоза в почках - на 87 и 60% через 12 и 24 часа, при отсутствии изменения уровня фрагментации ДНК, соответственно. Изменений активности апоптоза в тимусе, мозге и костном мозге не выявлено.

Таблица 10. Уровень фрагментации ДНК в органах крыс после введения ССЦ

Степень Доза ССЦ

фрагментации Контроль 0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела

ДНК, % ДНК бч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Печень М±т 7,08±0,15 7,34±0,18 9,07±0,23* 9,14±0,14* 12,34±0,28» 14,37±0,23* 18,19±0,44»

Почки М±т 7,32±0,29 7,43±0,21 7,29±0,16 7,38±0,21 7,69±0,12 8,42±0,24» 9,54±0,25*

Тимус М±т 8,83±0,21 8,71±0,18 8,64±0,15 8,89±0,22 8,71±0,18 8,64±0,15 8,89±0,22

Мозг М±т 5,34±0,11 5,14±0,09 5,21±0,12 5,17±0,08 5,14±0,09 5,21±0,12 5,17±0,08

Костный мозг М±т 8,31±0,24 8,24±0,31 8,09±0,18 8,1б±0,15 8,05±0,17 9,24±0,21* 9,88±0,26*

Представлены средние данные (M±m) от п = 10

* отличия от контроля достоверны при р<0,05

Таблица 11. Индекс апоптоза в органах крыс после введения ССЦ

Индекс апоптоза, % ДНК Контроль Доза ССЦ

0,08 мг/кг массы тела 0,48 мг/кг массы тела

6ч 12 ч 24 ч 6ч 12 ч 24 ч

Печень М±ш 0,84±0,05 0,98±0,18 1,52±0,23 * 2,15±0,31 * 1,53±0,24* 2,44±0,54 * 2,43±0,19 *

Почки М±т 1,12±0,12 1,23±0,14 2,09±0,17 * 1,79±0,26 * 1,19±0,15 1,83±0,11 * 2,23±0,12 *

Тимус М±т 1,34±0,14 1,23±0,11 1,44±0,17 1,34±0,27 1,27±0,15 1,33±0,18 1,48±0,19

Мозг М±т 0,59±0,0б 0,55±0,04 0,б5±0,05 0,60±0,10 0,61 ±0,04 0,58±0,03 0,64±0,05

Костный ,,, М±т мозг 1,18±0,15 1,09±0,09 1,20±0,12 1,15±0,12 1,19±0,15 1,34±0,06* 1,48±0,04*

Представлены средние данные (М±т) от п = 10

После введения ССЦ в дозе 0,48 мг/кг было отмечено достоверное повышение уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в печени (через 6 часов - на 74% и 82%, через 12 часов - на 102% и 190%, через 24 часа-на 156% и 189%), почках (через 12 часов - на 15% и 63%, через 24 часа - на 30% и 99%) и костном мозге (через 12 часов - на 11% и 14%, через 24 часа - на 19% и 22%), соответственно. Изменений уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза в тимусе и мозге крыс не выявлено.

Таким образом, моделирование токсического воздействия путем внутрибрюшинного введения ССЦ приводит к увеличению активности апоптоза в печени, почках и костном мозге лабораторных животных, при этом динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза имеет сходный характер: значения этих показателей возрастают постепенно, достигая максимума через 24 часа после введения ССЦ. Динамика изменения содержания белков Вс1-2, Вах и р53 имеет иной характер, их содержание в печени начинает увеличиваться через 6 часов после введения ССЦ, достигая максимальных значений через 12 часов и снижаясь через 24 часа. Следует отметить, что время реализации каждой стадии апоптоза не зависело от использованных доз воздействующего фактора: начало эффекторного этапа отмечено через 6 часов, максимальное развитие эффекторного этапа - через 12 часов, завершение эффекторного этапа и этап деструкции -через 24 часа. Полученные данные соответствуют современным представлениям о молекулярных механизмах регуляции апоптоза и времени реализации стадий апоптоза.

На основании полученных результатов можно сделать вывод, что показатели, характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений через 24 часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень фрагментации ДНК>активность каспазы-3. Показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза (содержание белков Вс1-2, Вах и р53), по чувствительности сопоставимы с показателем индекса апоптоза, однако оптимальное время отбора образцов тканей для регистрации содержания данных белков составляет 12 часов после однократного воздействия.

3.3. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз ССЦ лабораторным животным

В данной серии исследований оценивали динамику изменений показателей апоптоза через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения ССЦ в дозах 0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела по сравнению с животными контрольной группы. В эксперименте были изучены показатели, характеризующие завершающую стадию эффекторного этапа апоптоза - активность каспазы-3, а также этап деструкции - уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза.

После введения ССЦ у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено

макроскопических изменений внутренних органов. Результаты определения активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза представлены в табл. 12-14.

Таблица 12. Активность касназы-3 в органах крыс после введения ССЦ

Активность каспазы-3, пмоль/мин/мг белка Доза ССЦ

Контроль 0,04 мг/кг массы тела 0,02 мг/кг массы тела 0,01 мг/кг массы тела

Печень М±т 23,07±1,02 25,12±0,78 23,04±0,51 22,04±0,58

Почки М±т 8,89±0,27 9,47±0,37 8,94±0,2б 8,88±0,17

Тимус М±т 5,31±0,19 5,34±0,12 5,07±0,13 5,01 ±0,10

Мозг М±т 0,07±0,01 0,07±0,02 0,08±0,01 0,07±0,02

Костный мозг М±т 2,41±0,12 2,59±0,15 2,68±0,13 2,51±0,14

Представлены средние данные (М±т) от п = 10

Как видно из табл. 12, активность каспазы-3 во всех исследованных органах крыс после введения ССЦ в дозах 0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела, не отличалась от контрольного уровня. Сравнение этих результатов с данными, представленными в табл. 9 указывают на то, что внутрибрюшинное введение ССЦ в дозе 0,08 мг/кг массы тела является минимально действующей дозой, вызывающей изменение активности каспазы-3 в печени крыс.

Достоверное повышение уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза было вьивлено в печени крыс после введения ССЦ в дозе 0,04 мг/100 г массы тела - на 6 и 16% (р<0,05), соответственно. Других достоверных изменений степени фрагментации ДНК в органах крыс не выявлено (табл. 13).

Таблица 13. Уровень фрагментации ДНК в органах крыс после введения ССЦ

Степень фрагментации ДНК (% ДНК) Доза ССЦ

Контроль 0,04 мг/кг массы тела 0,02 мг/кг массы тела 0,01 мг/кг массы тела

Печень М±т 7,08±0,15 7,51±0,11* 6,94±0,08 7,06±0,09

Почки М±т 7,32±0,29 7,58±0,13 7,39±0,09 7,23±0,07

Тимус М±т 8,83±0,21 8,09±0,12 8,15±0,13 8,08±0,15

Мозг М±т 5,34±0,11 5,13±0,09 4,98±0,10 5,09±0,11

Костный мозг М±т 8,31±0,24 8,51±0,09 8,43±0,11 8,44±0,14

Представлены средние данные (М±т) от п = 10

* отличия от контроля достоверны при р<0,05

Таблица 14. Индекс апоптоза в органах крыс после введения ССЦ

Индекс апоптоза, % ДНК Доза ССЦ

Контроль 0,04 мг/кг 0,02 мг/кг 0,01 мг/кг

массы тела массы тела массы тела

Печень М±ш 0,84±0,05 0,98±0,04* 0,88±0,06 0,8б±0,05

Почки М±ш 1,12±0,12 1,08±0,13 1,10±0,11 1,14±0,12

Тимус М±ш 1,34±0,11 1,29±0,14 1,30±0,09 1,32±0,12

Мозг М±т 0,59±0,06 0,62±0,03 0,64±0,03 0,61 ±0,04

Костный мозг М±т 1,18±0,15 1,15±0,13 1,21±0,14 1,17±0,12

Представлены средние данные (М±т) от п = 10

В проведенном исследовании изменение активности апоптоза было выявлено в печени, что соответствовало ожидаемому эффекту, так как ССЦ является классическим гепатотропным агентом. Реакция изученных показателей на введение ССЦ в дозе 0,04 мг/кг массы тела находилась на грани диагностического порога и практически не отличалась от фонового уровня апоптоза. Дозы 0,02 и 0,01 мг/кг не вызывали изменений изученных показателей, поэтому в дальнейших модельных экспериментах в качестве минимальной действующей дозы ССЦ следует использовать 0,04 мг/кг массы тела.

Чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень фрагментации ДНК>активность каспазы, поэтому использование методов оценки уровня фрагментации ДНК оптимально для выявления токсических воздействий малой интенсивности.

Таким образом, метод «ДНК-комет» показал более высокую чувствительность относительно биохимического метода определения активности каспазы-3 в печени. Фрагментация ДНК является конечным этапом апоптоза, что позволяет эффективно применять метод ДНК-комет для оценки активности апоптоза при исследовании токсического действия различных химических агентов, когда низкие дозы сочетаются с различной длительностью воздействия неблагоприятного фактора.

3.4. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз ССЦ

В исследовании оценивали активность апоптоза в печени, почках, тимусе, костном мозге, головном мозге, сердце, селезенке, семенниках, тонком и толстом кишечнике методом ДНК-комет. Образцы для исследований отбирали через 24 часа после однократного внутрибрюшинного введения СС14 в низкой и минимально действующей дозах - 0,08 и 0,04 мг/кг массы тела. В эксперименте были изучены показатели апоптоза, характеризующие этап деструкции - уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза.

После введения ССЦ у животных на всех сроках эксперимента не наблюдалось каких-либо видимых проявлений токсического действия. На вскрытии также не было выявлено макроскопических изменений внутренних органов. Результаты исследований уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза представлены в табл. 15-16.

Таблица 15. Уровень фрагментации ДНК в органах крыс после введения низких и минимально действующих доз ССЦ

Степень фрагментации ДНК (% ДНК) Доза ССЦ

Контроль 0,08 мг/кг массы тела 0,04 мг/кг массы тела

Печень М±т 7,12±0,21 8,03±0,16* 7,84±0,17*

Почки М±т 7,35±0,17 7,22±0,11 7,41 ±0,12

Тимус М±т 7,68±0,19 7,53±0,14 7,72±0,09

Головной мозг М±т 4,89±0,13 5,01±0,16 4,95±0,12

Костный мозг М±т 7,36±0,19 7,22±0,16 7,51 ±0,13

Селезенка М±т 8,14±0,16 8,03±0,11 7,98±0,14

Семенники М±т 8,57±0,28 8,23±0,17 8,69±0,16

Тонкая кишка М±т 9,27±0,32 11,07±0,17* 9,38±0,21

Толстая кишка М±т 8,бЗ±0,28 8,39±0,21 8,57±0,14

Представлены средние данные (М±т) от п = 10

* отличия от контроля достоверны при р<0,05

Как видно из табл. 15-16, после однократного внутрибрюшинного введения ССЦ в низкой (0,08 мг/кг) и минимально действующей (0,04 мг/кг) дозах не было выявлено изменений изученных показателей в почках, тимусе, головном мозге, костном мозге, селезенке, семенниках, толстом кишечнике.

Повышение уровня фрагментации ДНК на 13% (р<0,05) и 10% (р<0,05), индекса апоптоза - на 28% (р<0,05) и 22% (р<0,05) было выявлено в печени крыс при введении ССЦ в дозах 0,08 и 0,04 мг/кг массы тела, соответственно.

Повышение уровня фрагментации ДНК на 19% (р<0,05), индекса апоптоза - на 14% (р<0,05) было выявлено в тонком кишечнике крыс при введении ССЦ в дозе 0,08 мг/кг; при введении ССЦ в дозе 0,04 мг/кг уровень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тонком кишечнике не отличались от фонового уровня.

Таблица 16. Индекс апоптоза в органах крыс после введения низких и минимально действующих доз ССЦ

Индекс апоптоза, % Доза ССЦ

Контроль 0,08 мг/кг 0,04 мг/кг

массы тела массы тела

Печень М±т 0,89±0,03 1,14±0,06» 1,09±0,05*

Почки М±т 1,07±0,09 1,08±0,05 1,05±0,07

Тимус М±т 1,18±0,09 1,13±0,05 1,15±0,06

Головной мозг М±т 0,57±0,03 0,60±0,04 0,61 ±0,04

Костный мозг М±т 1,28±0,10 1,19±0,09 1,24±0,07

Селезенка М±т 1,24±0,06 1,19±0,05 1,23±0,06

Семенники М±т 0,98±0,05 1,02±0,06 1,05±0,04

Тонкая кишка М±т 1,04±0,05 1,19±0,05* 1,09±0,06

Толстая кишка М±т 1,15±0,11 1,12±0,09 1,19±0,07

Представлены средние данные (М±т) от п = 10

В проведенном исследовании чувствительность внутренних органов крыс к воздействию низкой и минимально действующей доз ССЦ снижается в ряду печень >тонкая кишка>прочие органы, поэтому использование печени для оценки уровня апоптоза оптимально для выявления токсических воздействий малой интенсивности.

3.5. Изучение влияния дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия ССЦ и витаминной недостаточности

Дефицит пантотеновой кислоты (витамина В5) и связанные с ним метаболические нарушения приводят к снижению адаптационных возможностей организма, и, как следствие, повышают чувствительность к токсическому воздействию (51узЬепкоу V., 2001; Wojczak Ь., 2003). В качестве токсического фактора, индуцирующего апоптоз, был использован ССЦ в дозе 0,08 мг/кг массы тела, чье действие на изменение активности апоптоза в тканях крыс было охарактеризовано в предыдущих разделах.

Таблица 17. Влияние дефицита пантотеновой кислоты, и сочетанного действия

дефицита пантотеновой кислоты и внутрибрюшинного введения ССЦ на фрагментацию ДНК в органах крыс

Степень фрагментации ДНК, % ДНК

Органы Контроль Деф. вит. В3 Деф. вит. В5 + ССЦ

Печень М±т 7,54±0,14 6,24±0,16* 8,75±0,14*

Почки М±т 7,08±0,11 7,15±0,13 7,89±0,12*

Тимус М±т 8,13±0,14 8,05±0,13 7,98±0,15

Головной мозг М±т 4,43±0,05 4,21 ±0,06 4,67±0,17

Костный мозг М±т 7,14±0,16 7,58±0,12 7,27±0,14

Селезенка М±т 7,32±0,19 7,55±0,21 7,27±0,15

Семенники М±т 8,18±0,23 8,32±0,21 8,15*0,17

Тонкая кишка М±т 9,84±0,14 9,89±0,16 11,35±0,17*

Толстая кишка М±т 8,34±0,17 8,16±0,14 8,51 ±0,12

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

Как видно из данных, представленных в табл. 17-18, достоверные изменения степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза, были выявлены в печени крыс обеих опытных групп. При этом в печени крыс, получавших дефицитный по пантотеновой кислоте рацион, наблюдалось достоверное снижение фрагментации ДНК и индекса апоптоза, в то время как у крыс, испытывающих сочетанное воздействие дефицита пантотеновой кислоты и однократного внутрибрюшинного введения ССЦ в дозе 0,08 мг/кг массы тела, было выявлено достоверное увеличение фрагментации ДНК индекса апоптоза в печени и тонкой кишке.

Таблица 18. Влияние дефицита паитотеновой кислоты, и сочетанного действия

дефицита пантотеновой кислоты и внутрибрюшинного введения ССЦ на индекс апоптоза в органах крыс

Индекс апоптоза, %

Органы Контроль Деф. вит. В; Деф. вит. В5 + ССЦ

Печень М±т 0,89±0,03 0,74±0,0б* 1,09±0,05»

Почки М±т 1,07±0,09 1,08±0,05 1,05±0,07

Тимус М±т 1,18±0,09 1,13±0,05 1,15±0,06

Головной мозг М±т 0,57±0,03 0,60±0,04 0,61±0,04

Костный мозг М±т 1,28±0,10 1,19±0,09 1,24±0,07

Селезенка М±т 1,24±0,06 1,19±0,05 1,23±0,06

Семенники М±т 0,98±0,05 1,02±0,06 1,05±0,04

Тонкий кишечник М±т 1,04±0,05 1,19±0,05» 1,09±0,06

Толстый кишечник М±т 1,15±0,11 1,12±0,09 1,19±0,07

Представлены средние данные (М±т) от п = 10 * отличия от контроля достоверны при р<0,05

Снижение активности апоптоза в печени крыс, получавших дефицитный по пантотеновой кислоте, может быть объяснено «нехваткой» ряда белков участвующих в рецептор-зависимом пути апоптоза. Поскольку ССЦ вызывает апоптоз, преимущественно запуская митохондриальный путь апоптоза в клетках печени крыс, то полученные результаты повышения активности апоптоза свидетельствуют о раннем токсическом действии данного соединения, усиленном на фоне дефицита пантотеновой кислоты.

3.6. Влияния фитостероидов на активность апоптоза у крыс Как известно, общий адаптационный синдром в условиях неблагоприятного стрессорного воздействия может сопровождаться выраженными изменениями интенсивности процессов апоптоза и некроза в различных органах, и, в первую очередь в тимусе (МопвЬка 8., 1997; Тагас N.. 1998). Соответственно, представляется перспективным определение активности апоптоза в качестве биомаркера для оценки возможного влияния алиментарного фактора на дисстресс. У крыс, получавших получавших фитостероид-содержащий экстракт соответственно из расчета 5,0 и 15,0 мг фитостероидов на кг массы тела, определяли фрагментацию ДНК и индекс апоптоза в тимусе, мозге и сердце. Результаты исследований представлены в табл. 19.

Таблица 19. Влияние фитостероидов на степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в органах крыс

Орган Группа животных

Степень фрагментации ДНК (%ДНК) Индекс апоптоза, %

Контроль 5 мг/кг 15мг/кг Контроль 5 мг/кг 15мг/кг

Тимус М±т 7,58±0,34 7,63±0,24 7,49±0,27 1,02±0,09 1,10±0,08 1,09±0,0б

Мозг М±т 4,28±0,14 4,03±0,18 4,15±0,11 0,38±0,06 0,40±0,05 0,37±0,06

Сердце М±т 7,38±0,22 7,24±0,16 7,34±0,22 0,91 ±0,12 1,02±0,14 0,98±0,13

У животных, получавших фитостероид-содержащий экстракт, не выявлено достоверных различий степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза в сравнении животными контрольной группы. Полученные результаты свидетельствуют, что ежедневное получение крысами в течение 30 дней фитостероидов в доза 5,0 и 15,0 мг на кг массы тела, не влияло на активность апоптоза.

В следующей серии исследований, оценивали влияние фитостероидов на активность апоптоза у животных, подвергнутых, стрессорному воздействию электрическим током. Результаты эксперимента представлены в таблице 20.

Таблица 20. Влияние фитостероидов на степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в органах крыс, подвергнутых стрессорному воздействию

Орган Группа животных

Степень фрагментации ДНК <%ДНК) Индекс апоптоза, %

Контроль Стресс Стресс + 2 мг/кг массы тела Контроль Стресс Стресс + 2 мг/кг массы тела

Тимус М±т 7,58±0,34 8,14±0,16 7,6140,14* 1,02±0,09 1,34±0,07 1,08±0,10*

Мозг М±т 4,28±0,14 4,08±0,14 4,12±0,13 0,38±0,06 0,41 ±0,07 0,42±0,05

Сердце М±т 7,38±0,22 7,53±0,15 7,23±0,13 0,91±0,12 1,23±0,10 1,02±0,14

Представлены средние данные (М±т) от п = 8 * - отличия между опытными группами достоверны при р<0,05

Степень фрагментации ДНК и индекс апоптоза в тимусе у животных подвергавшихся стрессорному воздействию, были достоверно выше по сравнению с животными подвергшихся стрессу и получавшими фитостероид-содержащий экстракт в дозе 2,0 мг/кг массы тела. В других органах не выявлено каких-либо достоверных изменений степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза у этих двух групп животных. Результаты, представленные в данном разделе, подтверждают высокую информативность показателя активности апоптоза как биомаркера влияния алиментарного фактора на тяжесть проявления стрессорного воздействия.

3.7. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена \прЗАа20

На протяжении всего эксперимента не было отмечено гибели крыс контрольной и опытной групп. Общее состояние животных в обеих группах было удовлетворительным. По внешнему виду, состоянию шерстного покрова, поведению и скорости роста животные опытной группы не отличались от животных контрольной группы. Результаты определения степени фрагментации ДНК и индекса апоптоза представлены в табл. 21-22.

Таблица 21. Степень фрагментации ДНК в органах крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог

Степень фрагментации ДНК, % ДНК Контрольная группа Опытная группа Норма

Печень М±ш 7,22±0,11 7,11±0,15 7,01-7,54

Почки М±т 7,23±0,14 7,14±0,12 7,08-7,68

Тимус М±т 7,53±0,11 7,68±0,12 7,35-8,13

Мозг М±т 4,08±0,03 4,01±0,03 3,97-4,43

Костный мозг М±т 7,59±0,15 7,68±0,17 7,14-7,79

Селезенка М±т 6,14±0,12 6,31 ±0,15 6,04-7,32

Семенники М±т 7,21 ±0,20 7,33±0,19 7,06-8,18

Тонкий кит. М±т 8,91±0,25 9,07±0,21 8,55-9,84

Толстый киш. М±т 8,97±0,18 9, И ±0,20 8,34-9,10

Таблица 22. Индекс апоптоза в органах крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу и ее традиционный аналог

Индекс апоптоза, % Контрольная Опытная Норма

группа группа

Печень М±ш 0,80±0,03 0,78±0,04 0,78-0,89

Почки М±ш 1,08±0,09 1,04±0,08 0,98-1,07

Тимус М±ш 1,18±0,10 1,10±0,14 1,03-1,28

Мозг М±ш 0,60±0,05 0,54±0,06 0,49-0,61

Костный мозг М±т 1,07±0,07 1,02±0,06 0,93-1,28

Селезенка М±т 1,11±0,08 1,04±0,10 1,05-1,24

Семенники М±т 1,15±0,15 1,07±0,12 0,98-1,15

Тонкий киш. М±т 1,21±0,13 1,30±0,16 1,04-1,39

Толстый киш. М±т 1,33±0,17 1,27±0,18 1,15-1,54

Фрагментация ДНК и индекс апоптоза в органах крыс опытной группы не отличались от аналогичных показателей у крыс контрольной группы. Все исследованные показатели находились в пределах физиологических норм, характерных для животных данного вида и возраста. Результаты проведенных исследований, наряду с результатами гематологических, биохимических, морфологических исследований, позволили рекомендовать ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена трЗАа20 для государственной регистрации в Российской Федерации.

4. Заключение

На основании полученных экспериментальных данных обоснована высокая информативность

определения активности апоптоза как системного биомаркера, обладающего высокой

неспецифической чувствительностью к воздействию низких и минимально низких токсических

факторов. Результаты сравнительной оценки чувствительности биохимического,

иммуногистохимического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения активности

апоптоза в органах крыс при токсических воздействиях различной интенсивности, показали, что

показатели, характеризующие завершающие этапы апоптоза, достигают максимальных значений

через 24 часа, поэтому оптимальное время отбора образцов ткани для исследований данных показателей составляет 24 часа после однократного воздействия, при этом чувствительность изученных показателей снижается в ряду индекс апоптоза>уровень фрагментации ДНК>активность каспазы-3. Показатели, характеризующие начало эффекторного этапа апоптоза (содержание белков Вс1-2, Вах и р53), по чувствительности сопоставимы с показателем индекса апоптоза, однако оптимальное время отбора образцов тканей для регистрации содержания данных белков составляет 12 часов после однократного воздействия.

Результаты определения активности апоптоза методом ДНК-комет в органах крыс свидетельствуют об отсутствии различий изученных показателей у животных, получавших в составе полусинтетического рациона ГМ кукурузу и ее традиционный аналог. На основании результатов комплексных токсиколого-гигиенических исследований и доказательств безопасности, ГМ кукуруза, содержащая кассету экспрессии гена \ip3Aa20, прошла государственную регистрацию, внесена в государственный реестр и разрешена для использования на территории Российской Федерации (свидетельство № 77.99.26.011.Е.022882.06.11 от 29 июня 2011 года).

5. Выводы

1. Сравнительная оценка биохимического, морфологического и электрофоретического (ДНК-комет) методов определения апоптоза в органах крыс на различных экспериментальных моделях свидетельствует, что метод ДНК-комет является наиболее чувствительным для определения активности апоптоза при воздействии низких и минимально низких доз токсических факторов.

2. На модели активации апоптоза путем внутрибрюшинного введения крысам тетрахлорметана в дозах 0,08 и 0,48 мг/кг массы тела выявлено дозозависимое повышение активности апоптоза в печени, почках и костном мозге. Динамика изменений активности каспазы-3, уровня фрагментации ДНК и индекса апоптоза имеет сходный характер - постепенное возрастание с максимумом через 24 часа Содержание белков Вс1-2, Вах и р53 в печени достигает максимальных значений через 12 часов.

3. На модели активации апоптоза путем внутрибрюшиниого введения крысам теграхлорметана в минимально низких дозах (0,04, 0,02 и 0,01 мг/кг массы тела) обнаружено, что минимально действующей дозой, вызывающей достоверное повышение активности апоптоза в печени, является доза 0,04 мг/кг массы тела.

4. Содержание крыс на рационе с дефицитом пантотеновой кислоты приводит к достоверному снижению активности апоптоза в печени до 6,24±0,16% (на 20%) по сравнению с контрольным уровнем (7,54±0,14%). Однократное введение теграхлорметана дозе 0,08 мг/кг массы тела на фоне дефицита пантотеновой кислоты приводит к увеличению активности апоптоза в печени до 8,75±0,14% (на 40%), тогда как у контрольных животных аналогичная доза тетрахлорметана вызывает повышение активности апоптоза до 9,14±0,14% (на 21%).

5. Введение в рацион крыс фитостероидов в дозах 5,0 и 15,0 мг/кг массы тела не приводит к достоверным изменениям активности апоптоза в клетках тимуса, сердца и мозга. Сгрессорное воздействие электрическим током вызывает повышение активности апоптоза в клетках тимуса на 1% (до 8,14±0,14%) по сравнению с контрольным уровнем (7,58±0Д4%). Стрессорное воздействие электрическим током на фоне введения в рацион крыс фитостероидов в дозе в дозе 2,0 мг/кг массы тела не вызывает увеличение активности апоптоза.

6. Физиологические границы уровня фрагментации ДНК у половозрелых крыс, составляют: 7,01-7,54% в печени, 7,08-7,68% в почках, 7,35-8,13% в тимусе, 3,97-4,43% в головном мозге, 7,14-7,79% в костном мозге, 6,04-7,32% в селезенке, 7,06-8,18% в семенниках, 8,55-9,84% в тонкой кишке и 8,34-9,10% в толстой кишке.

7. Метод ДНК-комет впервые использован для определения уровня активности апоптоза при медико-биологической оценке безопасности ГМ кукурузы, содержащей кассету экспрессии гена vip3Aa20. Не выявлено каких-либо изменений активности апоптоза во всех исследованных органах крыс, получавших ГМ кукурузу, по сравнению с животными, получавшими ее традиционный аналог.

8. Определение активности апоптоза рекомендовано в качестве высокочувствительного системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий различных факторов окружающей среды, в частности алиментарных факторов.

Список опубликованных работ по теме диссертации Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России:

1. Тышко Н.В., Брицина М.В., Гмошинский И.В., Захарова Н.С., Зорин С.Н., Мазо В.К., Озерецковская М.Н., Селяскин К.Е. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированной сои линии MON 89788 сообщение 2. Генотоксикологические, иммунологические и аллергологические исследования. Вопросы питания,- 2010. -Т. 79. -№ 3. -С. 13-17.

2. Тышко Н.В., Жминченко В.М., Пашорина В.А., Селяскин К.Е.. Сапрьшин В.П., Утембаева Н.Т., Тутельян В.А. Оценка влияния ГМО растительного происхождения на развитие потомства крыс в трех поколениях. Вопросы питания. -2011. -Т. 80. -№ 1. -С. 14-28.

3. Тышко Н.В., Селяскин К.Е.. Мельник Е.А., Пашорина В.А., Жминченко В.М. Оценка репродуктивной функции крыс при раздельном и сочетанном воздействии алиментарного и токсического факторов. Вопросы питания. -2012. -Т. 81. -№ 1. -С. 33-43.

Материалы научных конференций

4. Селяскин К.Е. Поражение гепатоцитов четыреххлористым углеродом: стадия апоптоза // Материалы X Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье».-М„ 2008,- с.97.

5. Селяскин К.Е. Сравнительная оценка методов определения активности апоптоза на стадии фрагментации ДНК // Материалы XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье»,- М., 2009.- с. 142-143.

6. Бучанова A.B., Селяскин К.Е. Эффективность использования новых пищевых источников органической формы цинка в питании растущих лабораторных животных (крыс) // Материалы XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье».- М., 2009.-с.26.

7. Селяскин К.Е. Влияние адренокортикотропина на активность апоптоза в некоторых органах крыс // Материалы XIII Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье».- М„ 2012.-С.11-12.

8. Селяскин К.Е. Сравнительная оценка методов определения активности апоптоза на стадии фрагментации ДНК в различных органах крыс // Материалы V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». - Ростов-на-Дону, 2013. - с. 449-450.

Подписано в печать: 22.02.2014 Тираж: 100 экз. Заказ № 1039 Объем: 1,5 усл.п.л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 wwv.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Селяскин, Кирилл Евгеньевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПИТАНИЯ» РАМН

На правах рукописи

04201456268

СЕЛЯСКИН КИРИЛЛ ЕВГЕНЬЕВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ АПОПТОЗА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НЕКОТОРЫХ АЛИМЕНТАРНЫХ И ТОКСИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

03.01.04. - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, Тутельян Виктор Александрович

Москва - 2014

Содержание

Содержание.................................................................................... 2

Введение........................................................................................ 4

Глава 1. Обзор литературы................................................................. 8

1.1. Молекулярные механизмы апоптоза и его биологическая роль в поддержании тканевого гомеостаза........................................... 8

1.2. Влияние токсических и алиментарных факторов на систему программируемой гибели клетки............................................. 20

1.3. Современные методические подходы к исследованию активности апоптоза............................................................................. 23

Глава 2. Материалы и методы исследования....................................... 31

2.1. Экспериментальные животные.................................................. 31

2.2. Схемы экспериментов........................................................... 34

2.3. Биохимический метод определения активности каспазы-3................ 40

2.4. Морфометрические исследования.............................................. 41

2.5. Гель-электрофореза изолированных клеток «ДНК-комет»................. 43

2.6. Статистическая обработка результатов исследований..................... 45

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение............. 46

3.1. Сравнительная характеристика методов определения активности апоптоза у крыс на экспериментальных моделях токсического воздействия......................................................................... 46

3.1.1. Определение активности апоптоза в органах крыс на модели токсического воздействия адренокортикотропного гормона.................................................................. 46

3.1.2. Определение активности апоптоза в органах крыс на

модели токсического воздействия СС14........................... 51

3.2. Оценка чувствительности различных методов определения активности апоптоза при внутрибрюшинном введении низких и минимально действующих доз ССЦ лабораторным животным......... 57

3.3. Оценка чувствительности различных органов лабораторных животных к действию низких и минимально действующих доз ССЦ.. 59

3.4. Определение активности апоптоза у крыс как биомаркер при оценке

влияния алиментарных факторов............................................... 63

3.4.1. Влияние дефицита пантотеновой кислоты на активность апоптоза в органах крыс на модели сочетанного действия СС14 и витаминной недостаточности.............................. 63

3.4.2. Влияние фитостероидов на активность апоптоза у крыс............ 66

3.4.3. Определение активности апоптоза у крыс, получавших с рационом ГМ кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена У1рЗАа20........................................................... 70

Глава 4. Заключение........................................................................ 75

Выводы.......................................................................................... 83

Список литературы......................................................................... 85

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Прогрессивные исследования механизмов апоптоза создали предпосылки для использования теоретических и практических знаний в экспериментальной и клинической медицине [28, 31, 32, 36, 39, 64, 113]. Показано, что после индукции апоптоза дальнейшая судьба клетки (гибель или выживание) зависит от целого ряда факторов, модулирующих программированную клеточную гибель. К таким факторам можно отнести постоянно существующие в клетке белки, такие как семейство Вс1-2, 1АР и каспазы, а также индуцируемые стрессом молекулы -факторы регуляции транскрипции ОТ-кВ и р53, церамид, киназы ЛЫК, р38 и Е11К. Нарушение механизмов регуляции апоптоза, приводящее к его ингибированию или неадекватному активированию, лежит в основе патогенеза онкологических, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваний [20, 27, 28, 72, 124].

Исследование молекулярных механизмов, отвечающих за контроль процессов апоптоза, позволило выявить ряд диагностически значимых маркеров различных этапов гибели клетки [44, 49, 113]. Вместе с тем, наличие, как минимум, двух механизмов инициации апоптоза и сложной сети его регуляции позволяет говорить о возможной неоднозначности полученных результатов при изучении молекулярных факторов, характерных для определённого этапа апоптоза, а сравнительная оценка чувствительности различных методов значительно затруднена из-за большого разнообразия оцениваемых критериев. В прикладном аспекте одним из, перспективных направлений, наряду с исследованием молекулярных маркеров апоптоза, может являться непосредственное определение количественных показателей, характеризующих процессы деструкции цитоскелета и фрагментации ДНК в тканях, позволяющих наиболее достоверно оценить активность апоптоза [67, 101, 154].

полагать, что определение активности апоптоза может быть эффективно использовано в исследованиях, направленных на изучение влияния экзогенных воздействий различной природы, в том числе, низкотоксичных объектов. Комплексное изучение апоптоза под влиянием разнообразных средовых или онтогенетических факторов широко представлено в научных публикациях [58, 103, 125, 147, 161], однако влияние алиментарных факторов на предрасположенность клетки к апоптозу остается до настоящего времени наименее изученным аспектом проблемы.

Цель и задачи исследования

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

5. Изучить активность апоптоза у крыс, получавших генно-инженерно-модифицированную (ГМ) кукурузу, содержащую кассету экспрессии гена У1рЗАа20.

Научная новизна работы

Практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

2. Изучение активности апоптоза может быть использовано в качестве высокочувствительного системного биомаркера для выявления неблагоприятных воздействий различных факторов окружающей среды, в частности алиментарных факторов.

Апробация работы

1.7. Публикации

1.8. Личный вклад соискателя

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные ¡механизмы апоптоза и его биологическая роль в поддержании тканевого гомеостаза

В самообновляющихся тканях организма человека ежедневно погибают 5070 миллиардов клеток, освобождая место для новых генераций. Физиологическая гибель клетки - апоптоз - это нормальный процесс поддержания гомеостаза за счет элиминации клеток, исчерпавших свой физиологический ресурс, дальнейшее существование которых представляет по какой-либо причине угрозу для организма. Апоптоз является физиологически активным способом гибели клеток, контроль над которым осуществляет сложная иерархическая система внеклеточных и внутриклеточных факторов, при этом механизмы индукции и динамика процессов клеточной смерти могут варьировать в зависимости от целого ряда факторов, в том числе - от характера питания индивидуума.

Впервые термин «апоптоз» был предложен в работе J. R. Kerr с соавт. (1972) «Апоптоз как фундаментальный биологический феномен», и исходно обозначал динамику структурных изменений тканей, морфологическую картину гибели клетки. Так, было показано, что структурные изменения клетки происходят в виде двух дискретных этапов: первый этап сопровождается изменениями структуры цитоскелета, коллапсом клеточных органелл в цитоплазме, конденсацией и сморщиванием гранул, распадом ядра и образованием апоптозных телец; на втором этапе происходит фагоцитоз апоптозных телец макрофагами или окружающими паренхиматозными и стромальными клетками образовавшихся апоптозных телец и их последующее разрушение под действием лизосомальных ферментов [90, 158, 159].

Биохимические и молекулярные механизмы апоптоза были изучены несколько позднее в эксперименте на нематодах (Caenorhabditis elegance) [63, 73,75, 76, 98, 105, 123] (Lettre Gumienny Metzstein Ellis Reddien Hengartner). На основании полученных данных был сделан вывод, что физиологическая гибель клеток осуществляется по сходной генетической программе у филогенетически различных организмов - нематод, растений, насекомых и позвоночных [66, 89, 98, 129, 107].

Реализация апоптоза происходит в соответствии с генетически детерминированной программой, которую можно условно разделить на три этапа: инициации (индукции), эффекторный и деструкции.

Инициация апоптоза может быть вызвана различными факторами:

• внеклеточными, опосредующими свое действие через рецепторные системы;

• внутриклеточными, опосредующими свое действие через повреждение ядра и повреждение мембран митохондрий.

Внеклеточные факторы обеспечивают реализацию апоптогенного сигнала через специальные рецепторы смерти (death receptor, DR) расположенные на поверхности клетки и служащие сенсорами внеклеточных сигналов к апоптозу (схема 1). Сигналы подают рецептор-специфические лиганды смерти (death ligand, DL), которые могут быть сцеплены с мембраной или находиться в растворенной форме. Наиболее изученными и имеющими наибольшее биологическое значение являются специфические рецепторы смерти Fas (С95, APO l/FAS) и TNF-R1 (tumor necrosis factor receptor 1) и соответствующие им лиганды смерти — Fas-лиганд и TNF-лиганд. Вместе с тем, в настоящее время обнаружен ряд других рецепторов гибели клеток: DR3 (Death Receptor 3 он же АроЗ, WSL-1, TRAMP и LARD), DR4 (Death Receptor 4), DR5 (Death Receptor 5 он же Apo2, TRAIL-R2, TRICK2 и KILLER) и DR6 (Death Receptor ) [19, 33, 52, 81, 108].

При связывании Fas-лиганда и Fas-рецептора происходит тримеризация рецептора и накопление С-концевого внутриклеточного домена смерти (death domen, DD), что приводит к образованию сигнального комплекса, индуцирующего апоптоз (death-inducing signaling complex, DISC), и мобилизации цитоплазменного белка FADD (Fas-associated death domain) (схема 1). В свою очередь FADD вступает во взаимодействие с прокаспазами 8 и 10 - неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз и инициирует апоптоз через активацию каспазы-8 и 10. При связывании TNF-лиганда с TNF-рецепторами происходит аналогичный процесс, результатом которого является мобилизация белка TRADD (TNF receptor-associated death domain) и его взаимодействие с каспазами 8 и 10. Активация каспазы-8 и 10 является началом эффекторного этапа клеточной гибели, вызванного внеклеточными факторами.

Молекулярные механизмы регуляции апоптоза включают возможность ингибирования процесса на каждом из этапов развития. Так, реализация внеклеточного апоптогенного сигнала может быть остановлена на этапе активации каспазы-8, 10 белком FLIP (FADD-like inhibitory protein). Ингибитор каспаз FLIP избирательно связывается с Ра5-/ТЫР-ассоциированными доменами смерти (FADD/TRADD), блокируя активацию каспазы-8, 10 и передачу проапоптотического сигнала от рецепторов смерти [5]. FLIP существует в двух формах - короткой (FLIPS), содержащей два эффекторных домена смерти, и длинной (FLIPL), в которой, помимо эффекторных, присутствует каспазоподобный домен [5, 22, 107, 108].

Внутриклеточные факторы инициирует апоптоз посредством двух механизмов: ядерного, включающегося в результате повреждения ДНК, и митохондриального, включающегося в результате повреждения мембран митохондрий [6, 70, 71, 92, 119, 126] (схема 1). Внутриклеточные инициаторы апоптоза можно условно разделить на физико-химические и биологические (табл. 1).

Таблица 1

Внутриклеточные факторы инциации апоптоза

Физико-химические факторы Биологические факторы

Ионизирующее излучение (УФ-лучи, гамма-лучи) Гормоны (глюкокортикоидные, тиреоидные, минералокортикоидные и др.)

Механическое или термическое повреждение тканей Токсины (альфа токсин, токсин Шига и др.)

Химические вещества, фармакологические препараты, витамины и микроэлементы Вирусы (гепатотропные, нейротроппые и др.)

Окислительный стресс

В реализации ядерного механизма апоптотического сигнала важная роль принадлежит белку р53, накопление которого является диагностическим критерием повреждения ДНК [36, 47, 84, 93]. Действительно, повреждение ДНК стимулирует накопление белка р53, который активирует систему репарации клетки. Быстрое накопление белка р53 вызывает репрессию ряда генов, регулирующих транскрипцию, и способствуют остановке клеточного цикла в фазе С1 (пресинтетической фазе).

Активация апоптоза через внешнее (внеклеточное)воздействие

Внутриклеточная активация апоптоза

Сигналь�

Информация о работе

Селяскин, Кирилл Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение активности апоптоза при воздействии некоторых алиментарных и токсических факторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы