Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пути коррекции миелотоксического действия экологически вредных факторов химической природы

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Пути коррекции миелотоксического действия экологически вредных факторов химической природы"

# <ъ

На правах рукописи

УСПЕНСКАЯ ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ПУТИ КОРРЕКЦИИ МИЕЛОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ВРЕДНЫХ ФАКТОРОВ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

03.00.16- экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск - 1998

Работа выполнена в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор НЕФЕДОВ В.П.

доктор биологических наук, профессор МЕНЯЙЛО Л.Н.

кандидат биологических наук МЕЖЕВИКИН В.В.

Ведущая организация - Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН.

Защита состоится «...4^...» ............................. 1998 г.

Обо

в «...Д......» часов на заседании Диссертационного Совета Д 120.45.01

по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан «................................. 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор сельскохозяйственных наук

БАБИНЦЕВА Р.М.

Актуальность проблемы. Увеличение в экосистеме вредных факторов химической этиологии, обусловленное деятельностью человека, и отрицательные последствия применения современных лекарственных препаратов становятся причиной изменения важнейших параметров функционирования живых систем и ставит задачу комплексного изучения воздействия ксенобиотиков на организм.

Одним из базовых механизмов цитотоксичности ряда ксенобиотиков является индукция ими окислительного стресса [Н. Kappus, 1981; C.W. Olanow, 1993]. Генерация свободных радикалов, сопровождающая физиологические и патологические процессы, становится причиной альтерации биомакромолекул клеток и изменения интегративных межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов.

Рецептор-эффекторные взаимодействия, активация клеточных сигнальных систем и пролиферация являются основой жизнедеятельности всех клеток [A.M. Дыгай, 1989; М.А. Пальцев, 1995]. Регуляция эффекторных функций (изменение активности ферментов метаболизма, ионных каналов, экспрессии генов) и пролиферации клеток занимает центральное место в функционировании различных клеточных популяций многоклеточных организмов и процессах межклеточной коммуникации и интеграции. В последние годы все больший интерес представляет изучение влияния ряда эндогенных лигандов клеточных рецепторов на пролиферативные, дифференцировочные процессы, а также модуляция ими механизмов естественной (запрограммированной) клеточной гибели - апоптоза и патологической клеточной смерти - некроза. Однако, в литературе лишь в единичных работах рассматривается возможность и важность модуляции экзогенными веществами различных этапов лиганд-рецепторных взаимодействий [G. Milligan, 1993; С. Richter, 1993; F. Fernere, 1997].

Согласно современным представлениям, несоответствие поступления экстрацеллюлярной информации (потока регуляторных молекул)

метаболическому статусу клетки может быть причиной переориентации клетки при прохождении ею различных фаз клеточного цикла, что, в свою очередь, приводит к выраженным внутрипопуляционным количественным и качественным сдвигам [M.F. Clarke, 1993]. Поэтому одной из актуальных проблем биологии является поиск научно обоснованных методов и средств мобилизации компенсаторно-приспособительных механизмов и повышения резистентности организма к различным экологически вредным факторам.

Одним из наиболее серьезных проявлений токсического действия ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса является их выраженный миелоингибирующий эффект [И.А. Голова, 1984; Е.Д. Гольдберг, 1986; Е.Д. Гольдберг, 1992]. В качестве нового подхода к фармакологической регуляции такого рода нарушений в последнее время рассматривается возможность использования средств, корригирующих изменения ионного и окислительно-восстановительного гомеостаза клеток, и активирующих антиоксидантную систему организма.

Актуальность задачи поиска путей коррекции цитоповреждающего действия ксенобиотиков на гемопоэтическую ткань обусловлена отсутствием на сегодняшний день сведений о веществах - протекторах угнетающего эффекта индукторов окислительного стресса на миелопоэз и неполным раскрытием механизмов альтерации клеточных структур - компонентов сигнальных систем, позволяющих разработать наиболее эффективную стратегию антитоксической защиты клетки и восстановления ее структурно-функционального гомеостаза [В.В. Худолей, 1996].

Цель работы: поиск путей коррекции миелотоксического действия экологически вредных факторов химической природы (ксенобиотиков -индукторов окислительного стресса).

Задачи исследования:

1. Исследовать вклад нейротрансмиттерной регуляции в механизмы контроля пролиферации и запрограммированной клеточной смерти в

популяции гемоиоэтических клеток.

2. Изучить влияние ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса на процессы серотошшергической регуляции пролиферации и апоптоза клеток костного мозга.

3. Изучить вклад кальций- и НАД-зависимых процессов в миелотоксический эффект ксенобиотиков.

4. Оценить возможность коррекции физиологической активности нейромедиаторов и миелотоксического действия ксенобиотиков субстратными ингибиторами ферментов трансформации никотинамидадениндинуклеотида.

5. Оценить значимость нарушений ионных механизмов в повреждающем действии ксенобиотиков и возможность их коррекции модификаторами активности кальциевых ионных каналов.

6. Исследовать механизмы протекторного действия адаптогенов растительного происхождения в отношении клеток костного мозга.

Научная новизна.

1. Впервые обнаружено, что регуляторная активность серотонина в отношении гемоиоэтических клеток опосредуется кальций- и НАД-зависимыми внутриклеточными процессами, сопряженными с активацией рецептор-эффекторных функций.

2. Установлено влияние окислительного стресса в клетках на регуляцию серотонином процессов пролиферации и естественной гибели гемопоэтических клеток.

3. Оценен вклад кальций- и НАД-зависимых механизмов в миелотоксическое действие акриламида и доксорубицина в клетках костного мозга. Доказана возможность коррекции этого действия веществами -субстратными ингибиторами ферментов каталитической деградации НАД, блокаторами кальциевых каналов и антиохсидантами.

4. Исследованы особенности проявления протекторного действия синтетического аналога природного адаптогена (п-тирозола).

Продемонстрирована возможность коррекции данным препаратом нарушений ионного и окислительно-восстановительного клеточного гомеостаза.

Научно-практическая значимость работы.

Данная работа является фрагментом темы "Исследование гомеостаза при экстремальных воздействиях: механизм, пути коррекции при нарушениях" (номер государственной регистрации 01970007696), выполняющейся на базе Международного научного центра исследований экстремальных состояний организма при Президиуме Красноярского научного центра СО РАН с 1995 г.

Научно-теоретическое значение работы заключается в том, что в ней исследованы клеточные механизмы миелотоксического действия ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса.

Разработаны патогенетически обоснованные методы коррекции экзогенной интоксикации при действии на организм экологически вредных факторов, обеспечивающие нормализацию ионного, окислительно-восстановительного гомеостаза и антиоксидантного статуса клеток.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII Всероссийском симпозиуме "Коррекция гомеостаза", Красноярск, 1996 г.; 4-ом Российско-Японском международном медицинском симпозиуме, Иркутск, 1996 г.; VIII Всероссийском симпозиуме "Гомеостаз и окружающая среда" (с международным участием), Красноярск, 1997 г.; конференции молодых ученых Красноярского научного центра СО РАН, Красноярск, 1997 г.; XXXV Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 1997 г.; студенческой международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения проф. И.И. Гительзона, Красноярск, 1997 г.; научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ "Технологии неистощительного землепользования", Красноярск, 1997 г.; 3-ем съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока, Новосибирск, 1997 г.;

Международном симпозиуме "Противоопухолевые препараты из высших растений", Париж (Франция), 1998 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. Нарушение взаимосвязи окислительно-восстановительного и ионного гомеостаза, основанное на неадекватном снижении концентрации НАД в клетке при действии факторов химической природы, лежит в основе миелотоксических эффектов ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса.

2. Ксенобиотики регулируют механизмы пролиферации и запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) в клетках костномозгового происхождения путем нарушения энергозависимых звеньев клеточной гибели, дисрегуляции ионного гомеостаза клеток и межклеточной коммуникации, изменения физиологических процессов регуляции пролиферации и апоптоза эндогенными факторами.

3. Необходимым условием реализации физиологической регуляторной функции биогенного амина серотонина является сохранение клеточного ионного и окислительно-восстановительного гомеостаза.

4. Коррекция миелотоксического эффекта ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса может быть эффективно осуществлена субстратными ингибиторами ферментов каталитической конверсии никотинамидадениндинуклеотида, модификаторами активности кальциевых ионных каналов, антиоксидантами.

5. Механизм протекторного действия синтетического аналога биологически активного вещества родиолы розовой - п-тирозола сопряжен с кальций- и НАД-зависимыми процессами.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 1 - в центральной прессе, 1 - в международной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, иллюстрирована 24 таблицами и 16 рисунками. Библиографический указатель включает 227 литературных источников, из них 114 отечественных и 113 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 300 белых беспородных мышах. Определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в суспензии клеток костного мозга проводили путем измерения содержания малонового диальдегида (МДА) в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), включающей в себя инкубацию с ТБК исследуемой пробы, экстракцию продуктов реакции бутанолом и спектрофотометрическое измерение их содержания. Оптическую плотность бутанольных экстрактов определяли на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 535 нм против бутанола. Расчет содержания МДА проводили с учетом коэффициента молярной экстинкции.

Исследование пролиферативного статуса клеток костного мозга осуществлено в рамках метода диффузионных камер /и vivo. Культивирование клеток костного мозга мышей (самцов, массой 18-22 г) проводилось следующим образом: клетки получали путем вымывания питательной средой (80% среды а-МЕМ ("Gibco", UK), 20% лошадиной сыворотки, 100 мг/л ампициллина) из 2 бедренных костей мыши-донора. Клетки в концентрации 1х106/мл добавляли в среду и заполняли ею диффузионные камеры (по 0,1 мл на камеру) через отверстие в боковой части камеры. Диаметр пор фильтра камер 0,22 мкм. Камеры имплантировали в перитонеальную полость мышей-реципиентов (по 2 на животное) хирургическим путем под гексеналовым наркозом. Через 5 дней культивирования мышей забивали методом дислокации спинного мозга в

шейном отделе, камеры извлекали, фильтры окрашивали гематоксилин-эозином. Для обезвоживания мембран фильтры проводили через батарею спиртов возрастающей крепости. Просветляли фильтры в двух сменах ксилола, переносили на предметное стекло и заключали в канадский бальзам. Методом световой микроскопии подсчитывали число образовавшихся колоний (скопления из 50 и более клеток) и кластеров (скопления, содержащие менее 50 клеток) (увеличение к 100).

Изучение токсического влияния акриламнда и доксорубицина на клетки костного мозга in vitro производилось при совместной инкубации суспензии клеток костного мозга с ксенобиотиками (5x10"4 - 5хЮ"3 М и 5х10'7 - 10~6 - 5х10"6 М, соответственно) в течение 30 минут при +37°С, а также в условиях их предварительной инкубации (30 минут) в присутствии экзогенных корректоров (изоптин, никотинамид и п-тирозол в дозах 5x10"5 М, 10"3 М и 10~6 - 10"2 г/мл, соответственно) и последующем культивировании (5 суток) в диффузионных камерах в перитонеалыгой полости животных-реципиентов.

Серотонин в форме креатинин-сульфата ("Sigma", USA) использовали в конечных концентрациях 10~9 - 10"7 М, добавляя в среду культивирования костномозговых клеток на 30 минуте инкубации. Специфический блокатор постсинаптических серотониновых рецепторов 5-НТ2 типа ципрогептадин ("Sigma", USA) в дозе 10"5 М добавляли в инкубационную среду за 20 минут до внесения серотонина.

Исследование защитного действия п-тнрозола на клетки костного мозга in vivo осуществлялось путем введения мышам п-тирозола в дозе 100 мг/кг внутримышечно в физиологическом растворе в течение 10 дней с интервалом 24 часа. В дальнейшем адаптированные животные служили донорами костного мозга. Препарат синтезирован в Институте химии Башкирского филиала РАН по оригинальной технологии.

Изучение процессов запрограммированной клеточной смерти (апоптоза) проводилось методом световой микроскопии. Под иммерсией (увеличение хЮОО) анализировалось по 200 клеток на каждом фильтре, окрашенном гематоксилин-эозином. При этом морфологическими признаками апоптоза считали конденсацию хроматина, кариорексис и кариопикноз, уменьшение размеров клеток.

Статистическую обработку полученных данных проводили методами математической статистики с использованием критерия Стыодента, критерия Фишера и метода многофакторного дисперсионного анализа. Различия считали значимыми, если вероятность случайности не превышала 5% (Р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Накопленные к настоящему времени сведения о клеточных "мишенях" действия акриламида и доксорубицина позволяют предположить высокую значимость механизмов "окислительного стресса" в повреждении клеток этими ксенобиотиками, а моделирование окислительного стресса представляет собой экспериментальный подход к изучению клеточных механизмов их токсического действия.

В экспериментах in vitro установлено, что при внесении акриламида в дозе 5х10"3 Ми доксорубицина в дозе 10"бМ в костномозговую суспензию в 2 раза по сравнению с исходным ("фоновым") уровнем нарастала концентрация малонового диальдегида, что позволяет отнести данные ксенобиотики к группе индукторов окислительного стресса.

В соответствии с нашими экспериментальными данными существенный вклад в повреждение клеток вносят нарушения кальциевого ионного и окислительно-восстановительного гомеостаза, а также активация свободнорадикальных процессов, приводящие к дисрегуляции рецептор-эффекторных клеточных сигнальных систем и вызывающие модуляцию

эффекта естественных биологических лигандов (нейротрансмиттеров).

Подтверждением этого явилось обнаружение нами в гемопоэтических клетках, обладающих сходными с клетками нейроналыюй природы компонентами рецептор-эффекторных систем, одного из механизмов цитотоксического действия ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса (акриламида и доксорубицина), связанного с нарушением физиологической регуляции пролиферации и гибели клеток костного мозга. Нами установлено, что вещество нейротрансмиггерной природы - серотонин -оказывает ингибирующее влияние на колонне- (КОС) и кластерообразующую способность (КлОС) гемопоэтических клеток в концентрациях от 10'9 до 10"7 М. Акриламид в концентрациях 5x10"4 - 5х10"3 М и доксорубицин в концентрациях 5x10"7, 10"6, 5x10"6 М в дозо-зависимой манере эффективно подавляли колонне- и кластерообразующую активность клеток костного мозга при совместной инкубации с ними в прединмплантационный период (Табл. 1, Табл. 2). Вместе с тем, если серотонин преимущественно подавлял формирование кластеров клеток, то акриламид и доксорубицин в равной степени ингибировали колонне- и кластерообразующую способность, что подтверждает неспецифический характер цитотоксичности последних в отношении клеток, находящихся на разных стадиях дифференцировки.

При совместной инкубации клеток с акриламидом (5хЮ"3 М)/доксорубицином (10"6 М) и серотонином (10"8 М) происходило восстановление пролиферации клеток, свидетельствующее о нарушении ксенобиотиками некоторых внутриклеточных процессов, сопряженных с активацией рецепторов серотонина. При этом акриламид в умеренных концентрациях действовал подобно системе регуляции передачи гуморального сигнала (усиление антимитогенной активности нейротрансмиттеров), но в больших концентрациях обладал выраженным цитолитическим эффектом (неспецифическое нарушение ионной проводимости клеточной мембраны).

Таблица 1

Влияние изоптина (ИЗО) и никотинамида (НИК) на серотошшергическую (СТ) регуляцию пролиферации клеток костного мозга (в диффузионных камерах) при действии акриламида (АА)

Серия КОС КлОС Апоптоз,%а

Контроль 30,3313,06 162,55113,06 2,38+0,67

АА, 5х10"3М 5,7011,3**** 38,2514,16*** 10,9011,60**"

СТ, 10"8 М 25,75+3,53* 118,40122,14* 2,7110,39

ИЗО, 5x10"5 М 19,0+4,0*" 77,25+17,06** 9,5012,06*"*

АА, 5x10"э М+ИЗО, 5x10-5 М 9,67+2,07**" 157,75119,16 7,5010,45*"*

СТ, 10"8 М+ИЗО, 5х10"5 М 12,3314,59*"* 163,0+34,0 2,7111,21

НИК, 10'3М 6,1411,22**** 49,17+4,56"** 8,4210,93****

АА, 5x10"3 М+НЙК, 10"3М 8,50+0,65** 66,012,88" 8,8310,95****

СТ, 10"8М+НИК, 10'3М 16,25+4,05**** 108,011,50*" 1,25+0,48*

АА, 5x10"3 М+СТ, 10~8М 38,25+6,73 141,50+25,08 7,7411,28""

АА, 5х10"3 М+ИЗО, 5х 10"5М 14,2512,25**" 129,20115,43*** 6,3311,09**"

+СТ, 10"8 м

АА, 5x10"3 М+НИК, 10"3 М 26,33+4,06 101,0110,35 2,80+0,63

+СТ, 10"8 м

Примечание. Здесь и далее КОС и КлОС представлены как абсолютное количество колоний и кластеров, соответственно, на 105 имплантированных клеток.

Представлено относительное количество клеток с морфологическими признаками апоптоза; п в разных сериях от 5 до 16.

Здесь и далее результаты представлены как М±ш, где М - генеральная средняя, гп - ошибка разности средних, Р - уровень значимости, п - объем выборки. Достоверность отличий по сравнению с контролем: * Р < 0,05; " Р < 0,02; "* Р < 0,01; **" Р < 0,001.

Одним из механизмов цитотоксического действия ксенобиотиков -индукторов окислительного стресса признается нарушение внутриклеточного

пула пиридиновых нуклеотидов вследствие активации полиАДФ-рибозилполимеразы, обеспечивающей репарацию окислительно поврежденной ДНК и, с другой стороны, вызывающей истощение внутриклеточного пула НАД. Предварительная инкубация клеток с никотинамидом, являющимся субстратным ингибитором полиАДФ-рибозилполимеразы, вызывала выраженное подавление колоние- и кластерообразующей способности гемопоэтических клеток. Однако, никотинамид был эффективен в восстановлении кластерообразующей активности клеток, нарушенной акриламидом, но потенцировал вызванное серотонином снижение колониеобразующей способности. Обнаруженная нами "инверсия" эффекта серотонина при предварительной инкубации клеток с акриламидом блокировалась никотинамидом (Табл. 1). Никотинамид способствовал также возрастанию количества колоние- и кластерообразующих клеток костного мозга, испытавших воздействие доксорубицина, возвращая кластерообразующую способность клеток до контрольного уровня и, более того, потенцируя колониеобразующую активность выше контрольных значений (Табл. 2).

Коль скоро клеточные механизмы токсического действия ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса связывают с нарушением ионного гомеостаза клеток в результате увеличения внутриклеточной концентрации кальция, в качестве модулятора этих процессов в экспериментах использовали изоптин - блокатор потенциал-зависимых кальциевых каналов.

Действительно, антимитогенная активность серотонина и акриламида эффективно подавлялась изоптином, хотя сам блокатор кальциевых каналов ингибировал пролиферацию клеток костного мозга, будучи примененным изолированно. При этом изоптин преимущественно подавлял кластерообразующую способность клеток, но инвертировал эффект серотонина и акриламида в отношении колониеобразующей активности.

Таблица 2

Влияние изоптниа (ИЗО) и никотинамида (НИК) на серотонинергическую (СТ) регуляцию пролиферации клеток костного мозга (в диффузионных камерах) при действии доксорубицина (ДОК)

Серия КОС КлОС Апоптоз,%

Контроль 16,08±2,67 121,38+13,46 2,19+0,33

ДОК, 10"6М 7,4411,15*" 68,69±5,15**** 4,14+0,30*"*

СТ, 10"8М 12,43+3,10* 84,0+11,0"** 2,60+0,45

ДОК, 10"6М+СТ, 10"8М 14,0±3,03 114,33±15,41 3,1310,48*"

ИЗО, 5хЮ"5М 9,25+1,93*" 63,0+3,2 Г*** 6,33+0,80*"*

ДОК, 10"6 М+ИЗО, 5x10"5 М 7,0±1,24*" 68,015,32**** 3,20+0,37'"*

НИК, 10"3 М 4,26+0,85*"* 47,72+4,41**** 7,74+0,85"**

ДОК, 10"бМ+НИК, Ю'3 м 22,6712,91"" 117,3310,88 2,17+0,70

Изоптин блокировал "инверсию" эффекта серогонина в клетках, прединкубированных с акриламидом, более того, потенцируя вызванное серотонином подавление колониеобразующей активности, тогда как никотинамид обладал аналогичным действием в отношении кластерообразующих клеток (Табл. 1). Отсутствие выраженного влияния изоптина на миелоингибирующий эффект доксорубицина объясняется тем, что повреждающий эффект цитостатика связывают, главным образом, с высвобождением кальция из внутриклеточных депо (митохондрии и эндоплазматический ретикулум), а не с увеличением поступления или подавлением выхода кальция из клеток через наружные потенциал-зависимые кальциевые каналы (Табл. 2).

Таким образом, миелотоксическое действие индукторов окислительного стресса может включать в себя, в числе прочих, механизм, обусловленный нарушением НАД- и кальций-зависимых процессов в опосредованной серотонином регуляции пролиферации.

Неотъемлемым этапом метаболизма большого ряда ксенобиотиков, а также естественных метаболических процессов является образование в клетках реактивных метаболитов и свободных радикалов. Окислительный стресс имеет своим результатом обратимое или необратимое повреждение биомакромолекул клеток: белков, нуклеиновых кислот, липидов. На этом этапе важная роль отводится антиоксидантам, которые снижают активность ПОЛ посредством стабилизации мембран и липопротеидных комплексов.

В проведенных нами исследованиях п-тирозол, являющийся синтетическим аналогом одного из биологически активных веществ родиолы розовой, ингибировал ПОЛ на фоне действия доксорубицина и акриламида, снижая концентрацию малоиового диальдегида (Рис. 1).

мкмоль/л 5

4

3 2 1 О

Рис. 1. Влияние п-тирозола (ПТ) на акриламид (АА)- и доксорубицин (ДОК)- индуцируемое перекисное окисление липидов (ПОЛ) в клетках костного мозга.

Обозначения. По оси абсцисс: К - контроль, ПТ - инкубация с п-тирозолом (10~4 г/мл), ДОК - инкубация с доксорубицином (10"6 М), АА -инкубация с акриламидом (5x10"3 М), ДОК+ПТ - совместная инкубация с доксорубицином (10"6 М) и п-тирозолом (I(Г4 г/мл), АА+ПТ - совместная инкубация с акриламидом (5x10"3 М) и п-тирозолом (1(Г4 г/мл); по оси ординат - концентрация МДА (в мкмоль/л).

Примечание. Каждое значение представлено как среднее 4 определений.

Учитывая данные об усилении адаптогенами анаболических процессов, в частности синтеза ДНК, и полученные нами результаты ослабления повреждающего влияния свободных радикалов на клеточные и субклеточные структуры, можно полагать, что п-тирозол оказывает защитное действие на пролиферативную способность клеток в условиях реализации миелотоксических эффектов ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса.

Действительно, п-тирозол снижал токсическое действие ксенобиотиков на клетки костного мозга, восстанавливая колоние- и кластерообразующую способность гемопоэтических элементов, причем защитный эффект адаптогена проявлялся как при добавлении в инкубационную среду in vitro, так и при профилактическом 10-дневном внутримышечном курсе введения мышам in vivo (Табл. 3).

При этом сам п-тирозол, будучи примененным изолированно, лишь в высоких концентрациях оказывал неспецифическое повреждающее действие на клетки, свидетельствующее об отсутствии у препарата выраженных цитотоксических свойств (Рис. 2).

Обнаруженная нами "инверсия" эффекта серотонина при прединкубации клеток с доксорубицином блокировалась коинкубацией таких клеток с п-тирозолом, что с учетом "отмены" эффекта п-тирозола блокатором серотониновых рецепторов 5-НТ2 типа - ципрогептадином (ЦТ), серотошшопозитивного действия п-тирозола и способности фитоадаптогенов восстанавливать ряд биохимических нарушений, в том числе обмен биогенных аминов, позволяет предполагать участие серотонинергических механизмов в реализации модулирующего влияния адаптогена на процессы пролиферации клеток костного мозга.

В силу того, что одним из возможных механизмов "инверсии" регуляторной активности серотонина в отношении пролиферирующих клеток костного мозга может являться нарушение доксорубицином ионного

КОС КлОС

а б

Рис. 2. Эффект п-тирозола (П'Г) на колонне- (КОС) (а) н кластерообразугохцуго способность (КлОС) (б) клеток костного мозга при культивировании в диффузионных камерах.

Обозначения. По осям абсцисс: инкубация с п-тирозолом в концентрации 10'6, 10°, 10 4, 10"3, 10"2 г/мл; по осям ординат: на а - абсолютное количество колоний на 105 имплантированных клеток, на б - абсолютное количество кластеров на 105 имплантированных клеток.

гомеостаза клеток, а также эффективность п-тирозола в плане предотвращения доксорубицин-индуцируемого нарушения активности серотонина, возможно предположить, что механизм защитного действия п-тирозола сопряжен с кальций-зависимыми процессами, доказательством чего является обнаруженная нами "отмена" изоптином специфического эффекта п-тирозола и "инверсия" блокатором кальциевых каналов гемопоэзвосстанавливагощего действия адаптогена в популяции клеток костного мозга (Табл. 3).

Известно, что характерной особенностью действия доксорубицина, как и других интеркалирующих агентов, является их способность подавлять активность ферментов репарации и тем самым нарушать репарацию повреждений ДНК. Данные наших экспериментов, свидетельствующие о реализации миелотоксических эффектов доксорубицина через НАД-зависимый механизм, и устранение п-тирозолом подобного рода нарушений послужили

основанием для предположения о существовании НАД-опосредованного механизма действия п-тирозола в отношении гемопоэтических клеток.

Таблица 3

Влияние п-тирозола (ПТ) на индуцированное доксорубицином (ДОК) и акриламидом (АА) нарушение регуляторной активности серотоннна (СТ) в клетках костного мозга

Серия КОС КлОС Апоптоз,%

Контроль 16,08±2,67 121,38±13,46 2,19+0,33

ДОК, 10"6 М 7,4411,15*" 68,69+5,15"" 4,14+0,30""

А А, 5x10"3 М 3,67+0,67**" 63,2516,61*"* 10,71+1,38"**

ПТ, 10'" г/мл (.in vitro) 8,75+2,30**" 87,09±15,30"" 4,50+0,56**"

ДОК, 10"6 М+ПТ, 10"4 г/мл 14,50±2,50 110,67+18,75 2,33±0,67

ПТ, 1(Г4 г/мл+ИЗО, 5xlO'5 М 12,50±1,71 104,40+17,26 3,010,41*"*

ДОК, 10"6 М+ПТ, 10"4 г/мл+ 1,5010,29**** 58,75+6,41"" 7,7510,85****

ИЗО, 5х10"5 М

ПТ, 10"4 г/мл+НИК, 10"3 М 17,50±4,13 71,5014,97*" 3,29±0,68

ДОК, КГ6 М+ПТ, 10'4 г/мл+ 22,20+1,93*" 133,25±10,58 2,33±0,63

НИК, 10"3 М

ЦТ, 10'5 М 14,0±3,79 88,0+14,74**" 7,88+1,30""

ПТ, 10"4 г/мл+ЦГ, 10'5 М 13,50+2,10 116,75±8,16 1,63±0,50

ПТ, 10"' г/мл+СТ, 10"s М 2,50+0,29"" 76,5011,85*" 3,33±0,42""

ПТ, 100 мг/кг (in vivo) 21,20+4,59 144,50+20,11 2,50+0,42

ДОК, 10"6 М+ПТ, 100 мг/кг 20,33+3,84 132,25+4,25 2,67+0,47

АА, 5x10"3 М+ПТ, 100 мг/кг 8,5010,50*** 134,50±19,36 3,3310,88

СТ, 10"8М 12,4313,10* 84,0± 11,0**** 2,60+0,45

ДОК, 10'6М+СТ, \(ГН М 14,0±3,03 114,33115,41 3,1310,48"*

ДОК, 10"6 М+ПТ, 10"4 г/мл+ 10,25±2,5б"" 62,0±1,0*"* 2,40+0,51

СТ, 10_8М

Совместная инкубация клеток с доксорубицином, п-тирозолом и никотинамидом, а также добавление субстратного ингибитора полиАДФ-рибозилполимеразы в инкубационную среду с п-тирозолом увеличивала эффективность адаптогена (Табл. 3).

Полученные нами данные демонстрируют выраженные протекторные свойства п-тирозола, сопряженные с кальций- и НАД-зависимыми процессами, в отношении миелоингибирующего эффекта доксорубицина и акриламида, что позволяет применять препарат для коррекции гемопоэзповреждающего действия ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса.

Принимая во внимание данные о тесной взаимосвязи окислительного стресса с феноменом запрограммированной клеточной смерти (апоптоза), следующим этапом наших исследований явилось изучение роли нарушения передачи экстрацеллюлярного сигнала в системе "рецептор-эффектор" в необратимом повреждении клеток и их гибели.

Акриламид и доксорубицин в наших экспериментах вызывали увеличение количества клеток с морфологическими признаками апоптоза. Изоптин эффективно блокировал вызванную акриламидом и доксорубицином индукцию апоптоза в популяции клеток костного мозга, при этом сам изоптин, будучи примененным изолированно, стимулировал процессы запрограммированной клеточной гибели (Табл. 1, Табл. 2).

Изолированное применение никотинамида также достоверно увеличивало количество клеток в состоянии апоптоза, но именно он был эффективен в плане предотвращения доксорубицин-индуцируемого апоптоза. Анализ изменения процента клеток с морфологическими признаками апоптоза в клетках, эффект серотонина в которых был модифицирован прединкубацией с акриламидом и доксорубицином показал, что как никотинамид, так и изоптин "нейтрализовали" действие ксенобиотиков, как это было обнаружено при оценке колонне- и кластерообразующей способности клеток (Табл. 1, Табл. 2).

Природный антиоксидант п-тирозол предотвращал доксорубицин- и акриламид-индуцируемый апоптоз в клетках костного мозга как в экспериментах in vitro, так и при профилактическом применении in vivo. При этом сам п-тирозол, будучи примененным изолированно, стимулировал процессы запрограммированной клеточной гибели, что может отражать направленный на поддержание гомеостаза процесс элиминации дефектных клеток, утративших свою функцию, клеток, достигших стадии терминальной дифференцировки и клеток, представляющих потенциальную опасность для организма (мутантные и аутореактивные клетки и др.) (Табл. 3).

Полученные экспериментальные данные подтверждают возможность коррекции экзогенных интоксикаций, возникающих при воздействии на организм экологически вредных факторов химической природы, путем направленной модуляции рецептор-активируемых механизмов межклеточной коммуникации.

В совокупности результаты нашей работы дают право предложить следующую схему миелотоксического действия ксенобиотиков - индукторов окислительного стресса и возможной коррекции вызванных ими повреждений клеток (Рис. 3).

Рис. 3. Схема миелотоксического действия ксенобиотиков -индукторов окислительного стресса и возможной коррекции вызванных ими повреждений клеток.

ВЫВОДЫ

1. Клеточные механизмы токсического действия ксенобиотиков -индукторов окислительного стресса связаны с индукцией ими дисрегуляторных процессов в механизме межклеточной коммуникации и интеграции.

2. Миелотоксическое действие индукторов окислительного стресса может включать в себя, в числе прочих, механизм, обусловленный нарушением кальций- и НАД-зависимых процессов в опосредованной серотонином регуляции пролиферации и запрограммированной смерти клеток костного мозга (апоптоза).

3. Серотонин в физиологических концентрациях оказывает ингибирующее влияние на пролиферацию клеток костномозгового происхождения. Вероятен вкдад кальций- и НАД-сопряженных механизмов, лежащих в основе обеспечения баланса между процессами пролиферации, дифференцировки и апоптоза, в реализацию такого регуляторного влияния.

4. Возникающее в условиях окислительного стресса истощение клеточного пула НАД имеет своим результатом нарушение НАД-зависимых эффектов эндогенных регуляторных молекул, в том числе регуляции активности ионных каналов. Применение никотинамида - субстратного ингибитора полиАДФ-рибозилполимеразы является одним из патогенетически обоснованных путей коррекции цитотоксического эффекта ксенобиотиков в отношении активно пролиферирующих клеток.

5. Коррекция миелотоксического действия ксенобиотиков может быть эффективно осуществлена блокатором потенциал-зависимых кальциевых ионных каналов - изоптином, что указывает на важную роль кальций-зависимых механизмов в повреждающем действии ксенобиотиков -индукторов окислительного стресса.

6. Механизм протекторного действия синтетического аналога биологически активного вещества родиолы розовой - п-тирозола в отношении миелоингибирующего эффекта экзогенных химических веществ сопряжен с

кальций- и НАД-зависимыми процессами.

Список работ, опубликованных но теме диссертации:

1. Применение диффузионных камер для изучения гемопоэтических клеток // Коррекция гомеостаза: Матер. VII Всерос. симпоз., Красноярск, 17-22 марта 1996. - Красноярск, 1996. - С. 86-87 (соавт. В.В. Нефедова, Т.А. Романова, О.В. Щеглова).

2. Система крови в условиях акриламидной интоксикации // Коррекция гомеостаза: Матер. VII Всерос. симпоз., Красноярск, 17-22 марта 1996. -Красноярск, 1996. - С. 95-96 (соавт. В.В. Нефедова, Е.Г. Маркелова, Е.В. Демиденко).

3. Фитоадаптогены как корректоры гомеостаза // Коррекция гомеостаза: Матер. VII Всерос. симпоз., Красноярск, 17-22 марта 1996. - Красноярск, 1996. - С. 126-127 (соавт. В.П. Нефедов, Е.А. Краснов, A.C. Саратиков).

4. Влияние акриламида на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в изолированной печени // Коррекция гомеостаза: Матер. VII Всерос. симпоз., Красноярск, 17-22 марта 1996. - Красноярск, 1996. - С. 148-149 (соавт. А.П. Винокуров, А.Б. Егорова, А.П. Рупенко).

5. Иммуномодулирующие свойства экстракта родиолы розовой в коррекции гомеостаза: Тез. докл. 4-го Российско-Японского междупар. медицинского симпоз., Иркутск, 3-8 сентября 1996. - Иркутск, 1996. - С. 165 (соавт. В.П. Нефедов, Б.В. Протопопов).

6. Нарушение серотонинергических механизмов регуляции гемопоэза in vivo при острой экзогенной интоксикации // Гомеостаз и окружающая среда: Матер. VIII Всерос. симпоз. (с междунар. участием), Красноярск, 10-14 марта 1997. - Красноярск, 1997. - С. 119-124 (соавт. А.Б. Егорова, О.В. Круглик, В.П. Нефедов).

7. Кальций-зависимые эффекты серотонина и акриламида в клетках костного мозга // Гомеостаз и окружающая среда: Матер. VIII Всерос. симпоз. (с междунар. участием), Красноярск, 10-14 марта 1997. - Красноярск, 1997. -

С. 124-128 (соавт. О.В. Круглик, А.Б. Егорова, В.П. Нефедов).

8. Индуцированное акриламидом нарушение серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга: Тез. докл. конф. молодых ученых КНЦ СО РАН, Красноярск, 18 марта 1997 - Красноярск, 1997. - С. 107.

9. Изменение пролиферативного статуса клеток костного мозга при действии эндогенных регуляторов гемопоэза и ксенобиотиков // Студент и научно-технический прогресс: Матер. XXXV Междунар. науч. студ. конф. -Новосибирск, 1997. - С. 17-18 (соавт. О.В. Круглик).

10. Кальций- и НАД-зависимые процессы в серотонинергической регуляции апоптоза клеток костного мозга на фоне действия ксенобиотика -индуктора окислительного стресса: Сб. тез. студ. междунар. науч.-нракт. конф., посвященной 100-летию со дня рождения проф. И.И.Гительзона. - Красноярск, 1997. - С. 67 (соавт. Ж.Э. Кондратова, Н.Э. Мусаева, О.В. Круглик).

11. Нарушение ксенобиотиком - индуктором окислительного стресса серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга: Тез. докл. 3-го съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1997. - С. 239 (соавт. А.Б. Егорова, В.П. Нефедов).

12. Влияние серотонина и ксенобиотика на пролиферацию костномозговых клеток и процессы запрограммированной клеточной смерти // Технологии неистощительного землепользования: Матер, науч. конф. профессорско-преподавательского состава КрасГАУ. - Красноярск, 1997. — С. 55-56 (соавт. А.Б. Егорова, Л.Н. Лапшина).

13. Role of P-Tyrosol in the treatment of proliferative disorders // Proc. Intern. Symp. "Antitumour Products from Higher Plants", Paris, France, 8-10 January 1998. - Paris, France, 1998. - P. 107 (coauthors V.P. Nefedov, O.V. Kruglik, E.A. Krasnov).

14. Нарушение серотонинергической регуляции пролиферации клеток костного мозга при действии ксенобиотика - индуктора окислительного стресса // Эксперим. и клинич. фармакология. - 1998 (в печати) (соавт. А.Б. Егорова, О.В. Круглик, В.В. Нефедова).