Механизмы и факторы деструктивного действия возбуждающих аминокислот на нейроны головного мозга IN VITRO

Хаспеков, Леонид Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы и факторы деструктивного действия возбуждающих аминокислот на нейроны головного мозга IN VITRO
ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы и факторы деструктивного действия возбуждающих аминокислот на нейроны головного мозга IN VITRO"

РГБ ОД

- 15 МАЙ ЮС 5

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МОЗГА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

УДК 57.086.8:611.813+612.82:616.831 — 005 ХАСПЕКОВ Леонид Георгиевич

ЛЕХАНИЗМЫ И ФАКТОРЫ ДЕСТРУКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ НА НЕЙРОНЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА IN VITRO

Специальность 03.00.11 — эмбриология, гистология и цитология

ДИССЕРТАЦИЯ

В ВИДЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва — 1995

Научный консультант И. В. ВИКТОРОВ.

— доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

член-корреспондент Российской АМН доктор медицинских науг профессор К. С. РАЕВСКИЙ;

доктор биологических наук профессор В. Я. БРОДСКИЙ;

доктор медицинских наук профессор И. Г. ВЛАСОВА.

Ведущая организация — Российский Государственный меди цинский Университет им. Н. И. Пирогова.

Защита состоится ^ 1995 г. в №"часов нг

заседании диссертационного совета Д.053.05.68 при Московскол Государственном Университете им. М. В. Ломоносова. 11989' Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, /

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомить^ в библиотеке Биологического факультета Московского Государст венного Университета им. М. В. Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада разослана ОД.^Ъ

Ученый секретарь /

диссертационного совета к.б.н. ¿А х__. Е. И. КАЛ ИСТРАТОВА

Заказ 238 Подп. к печ. 20.03.95 г. Печ. л. 3,5 Тираж 15

Типография ВИА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Посла первых работ, показавших возбуждающие дейстюго L-глутаминовой кислоты па нейроны центральной нэрвной системы позвоночных животных IHayaahl, 1954; Curtla et al., 1909, 1960, 1961 ], вопрос о ее медиаторной функции в структурах головного мозга млекопитающих стал предметом активного исследования и обсуждения в течение нескольких последующих десятилетий [Johnson, 1972, Watkin3. Evans, 1981, Cotman et al., 1981). Благодаря этому, было достоверно установлено, что андогошше дакврбоновые аминокислоты - L-глутаминовая и L-аспарагиновая (далее глутамат, ГЛУ, и аспартат, АСП) - осуществляют функции возбуждающих нейромедааторов в синапсах различных структур головного мозга животных и человека [Cotman et al., 1987; Stora-Hathlsen, Ottersen, 19881. Данные, позволившие окончательно доказать медкаторную роль возбуждающих аминокислот (ВАК) п полученные с помощью таких современных методик, как микрохимический анализ, радиолигандное связывание, рецепторная авторадиографи, световая и электронная иммуноцитохшия, показали способность пресинаптических терминалей к Са2+-38висимому высвобождению ГЛУ и АСП при деполяризация и к их обратному высокоаффинному захвату tWlklund et al., 1982; Приходан, 1989; Nlcholls, Attwell, 1990J, высокую плотность рецепторов ВАК во многих мозговых структурах (Дамбинова, 1989; Young, ?agg, 1990], наличие в нервных окончаниях как самих медааторных ВАК fRooa, Kanazava. 1990]. так и ферментов их метаболизма [Ereslnska, Silver, 1990], высокое содержание и энергозависимое накопление ГЛУ в синаптических пузырьках [Burger et al.. 1989; Kayсох et al., 19901. Глутамат- к аснартатергаческив нейроны и иг аксонзые терминал! с особенно высоким уровнем поглощения ВАК были выявлены в гшшокампе [Storm-ÈIattilsen, 1981; Cotman et al., 1987; Bramiiam et al., 19903, a такгэ в новой коре, мозжэчхв, * базаяьных отделах переднего мозга и ряде других структур головного мозга млекопитающих ifflklund et al., 1982; Cotman et al., 1987; Storm-Hathlsen, Ottersen, 1988; AoKl et al., 1987; Dorl et al., 1987; Boos. Kanazava, 19901.

Вскоре после обнаружения возбуждающего действия ГЛУ были -получены данные, указывающие на его нейроцитотоксический эффект [Lucas, Newhoua,'1957], которые затем подтвердились в работах других авторов tOlney et al., 1969; Coyle et al., 19813. Позднее этот эффект, касающийся и других ВАК, был охарактеризован термином "excltotoxlclty" ("токсичность при возбуждении") lOlney, 19863, под которым подразумевалась способность эндогенных и экзогенных ВАК вызывать деструкцию центральных нейронов In vivo и Hl vitro, обусловленную длительным и интенсивным возбуждением : нервных клеток, опосредуемым гиперстимуляцаей глутаматных , рецепторов.

К эндогенным дикарбоновым ВАК, обладающим судорожным ж найродвструктивным эффектами, была отнесенв и хинолиновая : кислоте, медиаторная функция которой, однако, до настоящего времени не установлена. Хинолиновая (2,3-пиридивдикарбоновая) кислота (ХК) - природное соединение, впервые обнаруженное у животных более 40 лет назад IHenderson. Hirsch, 1949J и представляющее собой промежуточный продукт кянуренинового пути синтеза никотннамид-адеииндинуклеотида (НАД*) из триптофана. Первые данные о действии ХК на ЦНС были опубликованы отечественным ученым И.П.Лапиным 11981], который показал, что это соединение, как и ряд других кинуренанов, оказывает возбуждающий эффект на центральные нейроны и вызывает в них судорожную активность.

Последующая идентификация ХК в головном мозге животных, и человека [Woliena-Berger et al., 1983], ее накопление в нервной ткани с возрастом IMoroni et al., 19843 и обнаружение нейроцито-токсического эффекта при введении в стриатум и гиппокамп tSchwarcb et al., 19833 позволили предположить 'непосредственное участие ХК в физиологических к патофизиологических процессах в ЦНС. Дальнейшие эксперименты показали, что нейродеструктивнов действие ХК может опосредоваться одннм из типов глутаматного рецептора, а именно рецептором к М-метил-1)-аспартату (NHDA) IStone, Burton. 1988).

Результаты многочисленных экспериментальных исследований, проведенных за последнее десятилетие, убедительно подтвердили денные о том, что эндогенные ВАК могут вызывать деструкцию

нервных клеток, часто сопутствующую судорожному эффекту атяг соединений. Ряд важных положений, касающихся рецепторных и ионных механизмов развития нейроцитотоксичности (НЦТ) ВАН, , были сформулированы за этот период в результате экспериментов, проведенных на культурах нервных клэток и ткани и переживаниях срезах мозга. В частности, было показано, что в условиях повышенной стимуляции рецепторов ВАК происходит ускоренное накопление в нейронах ионов кальция (Ca ), обусловленное, в первую очередь, гиперактивацией глутаматных рецепторов к NMDA, управляющих Са2+-каналами. Перегрузка нейронов ионами Са2+ приводит к усилению протекающих при его участии внутриклеточных протоо- и лшолитических реакций, а также вызывает гиперпродукцию свободных радикалов и инициируемое ими перекисное окисление липидов в мембранах и внутриклеточных оргатоллах.

В экспериментах In vitro обнаружено, что степень развития НЦТ, приводящего к отсроченной гибели нейронов (ОГН), которая наступает через несколько часов после окончания воздействия ВАК, находится в прямой зависимости от концентрации внеклеточного Са2+ 1Са2+]0: ее снижение заметно ослабляет ОГН, а повышение усиливает деструктивное действие субтоксических концентраций ВАК [Chol, 1985; J.Garthwalte, H.Garthwalte, 1986; Rothman et al., 1987; Sahn et al., 1988; Ogura et al., 1988; Ellren, Lehmann, 1989; Manev et al., 1989]. О ключевой роли Ca2+ в ОГН, инициируемой гиперстимуляцией ионотропных гдутамалшх рецепторов, свидетельствуют также данные, указывающие на прямую корреляцию между степенью повреждения нейронов, вызванного кратковременной экспозицией токсических доз ГЛУ, и количеством поглощенного ими за это время меченого кальция (45Са24~). В этих экспериментах было показано, что перегрузка нейронов ионами Са2+, так же, как и деструкция нейронов, опосредуются в первую очередь NHDA-рецепторами [Chol, 1992; Hartley et al., 19931.

Способность эндогенных ВАК инициировать процессы, приводящие к гибели нейронов, в сопоставлении с данными экспериментальных исследований механизмов деструкции нервных клеток при гипоксии/ишемии In уIvo и In vitro, послужила основанием гипотезе об активном участии этих соединений в патогенезе некоторых нейродегенеративных заболеваний ВДС и повреждении нейронов при

- б -

таких патологических состояниях, как острые нарушения мозгового кровообращения и травма головного мозга 1Раевский, 1989, 1990; Choi, 1988, 1990; siesio, 1990). В связи с этим, изучение механизмов цитотоксического действия ВАК и поиск способов его предотвращения представляются особенно актуальными.

=В начвле 80-х годов, несмотря на заметный прогресс в области изучения нейродеструктивных процессов, инициируемых эндогенными ВАК, и роли последних в гибели нейронов при гипоксии/ишемии, в доступной нам литературе было опубликовано лишь очень незначительное число работ, выполненных не культивируемых нейронах ЦНС и направленных на раскрытие рецепторных и ионных механизмов этих процессов. В то же время, следует подчеркнуть, что тканевые и клеточные культуры различных структур головного мозга, широко используемые с этой целью в течение последних 10 лет в экспериментах зарубежных ученых, а с 1986 года - и в наших работах, являются одним из адекватных объектов изучения на клеточном н молекулярном уровнях механизмов повреждения нейронов под влиянием ВАК и гипоксии, поскольку позволяют в контролируемых условиях оказывать цитотоксическое и гипоксическое воздействие на живые нервные клетки, а также исследовать нейропротекторный эффект соединений, которые могут препятствовать этому воздействию.

Цвль_£ащюй_ра<^ты заключалась в исследовании:

8) цитотоксического эффекта эндогенных возбуждающих аминокислот (хинолиновой кислоты, глутамата) и экзогенных агонистов глутаматных рецепторов Ш-метил-О-аспартата, иботеновой кислоты) при их воздействии на культивируемые нейроны; б) нейродеструктив-ного эффекта при гипоксическом воздействии на культивируемые нейроны; в) влияния антагонистов глутаматных рецепторов на нейродеструктивные эффекты ВАК и гипоксии; г) защитного действия антиоксидантов на культивируемые нейроны, подвергнутые цитоток-сичаскоцу и гизоксическому воздействию; д) изменений концентрации ионов кальция в культивируемых нейронах под влиянием ВАК и гипоксии. Естественно, что использованию культур в таких экспериментах предшествовало детальное изучение процессов развития нервных клеток In vitro, а также характеристика их морфофунк-цяоаалышх свойств, раскрывающая основные закономерности дафференцнровки культивируема нейронов и обосновывающая адекватность данного объекта решению поставленных задач.

В связи с этим, были получены и исследованы следующие длительно переживающие культуры тквни и клеток головного .мозга мышей линии С57/Black:

1. Органотипические культуры гиппокампа новорожденных животных.

2. Сочетанные органотипические культуры гиппокампа, мамил-лярпых тел и голубого пятна.

3. Диссоциированные культуры клеток гиппокампа и септума 17-19-дяевных эмбрионов.

4. Сочетанные диссоциированные культуры клеток эмбрионального гиппокампа и септума.

5. Диссоциированные культуры клеток новой коры 16-17-дневных эмбрионов.

Количество культур, использованных в различных экспериментах, указано в таблице 1.

Остовныв_задачи_ра|^та_заи

1. Исследовать закономерности развития нейронов и межнейронных связей в указанных выше тканевых и клеточных культурах и адаптировать эти культуры к экспериментам, направленным на изучение рецепторных и ионных механизмов повреждения нейронов под действием ВАК и гипоксии.

2. Исследовать нейроцитотоксический эффект хинолиновой кислоты на разных стадиях дифференцировки нейронов In vitro и выявить особенности влияния на этот эффект антагонистов глутаматных рецепторов.

3. Исследовать нейродеструктивное действие гипоксии In vitro и сопоставить полученные денные с результатами изучения цито-токсического действия ВАК на культивируемые нейроны.

4. Проследить изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция при цитотоксическом и гипоксическом воздействиях и дать сравнительную характеристику влияния этих воздействий на ионный гомеостаз культивируемых нейронов.

5. Определить возможность коррекции нейродеструктивных процессов, инициируемых в культивируемых нейронах действием ВАК и гипоксии, с помощью антиоксидантов различной природы, и на основе этого оценить вклад свободнорадикальных реакций в цитотоксическое и гипоксическое повреждение нервных клеток In vitro.

¥вшица I. Количество культур, использованных в различных эксперимент по теив исследования.

1 !.. Количество исследовании! культур ;

рЕзаовндаость 1 1Не8ро- 1 (Ультра- III 1 • 1 Гистохи-1 Электро-1 Исследова-1 Исследова- 1 1 Исследова- 1 1 ■Шсследо I

1 пистолю-1 струн - 1 мичесхое 1 физиоло-1 ние веЯро-1нив нейро- ние защит- 1ние дана*. 1

культур ^ 1 гзпескоо 1 турное (иссле- 1гическое|цитотокси-1двструх- ного 1мики [Са 111 Всего

1ИССЛЭ- ¡иссле- 1дование 1иссле- 1ческого 1тинного 1 эффекта 1при действии!

црванив 1дованиэ1 дование (аффекта 1 аффекта 1антиокси- 1глутаката и. 1

1 | 1 1 1 1 1 1 1ВДК 1 1 гипоксии 1 1дантов 1 1 гипоксии 1 1 1

Органотягшчвскж»

культуры ткани:

гшпокеша Б76 62 - 220 44 - - - 902

гшгюкампа и 18 - 26 20 - - — - 64

годуОого пятна

гкшюкяыпа н ¿8 - - 26 - - - - 74

ивюдщшх тел

Дассоцюарованныэ •

культуры клеток:

гишюкамла 610 26 18 60 220 130 108 36 1208

аовоЭ хори и - - - 22 - - - 76

сеотума ' 24 - 40 - 18 - - • 82

гшшокаша ж 20 - 56 - 26 - - - 102

септуиа

Всего 1350 88 140 326 330 130 108 36

Общее количество исслвдоваяннх культур: 2506

с.

1. Длительное культивирование ткани и клеток различных структур головного мозга эмбрионов и новорожденных мышей.

2. Прижизненное исследование культур в светлом поле, с использованием фазового контраста и цейтраферной микрокиносъемки.

3. Нейрогистологический анализ препаратов культур, окрашенных крезиловым фиолетовым (по методу Ниссля), галлоцианином (по методу Эйнврсона), ванадиевым гематоксилином (по методу Викторова) и импрегнированных серебром (по методу Холмса-Вольфа).

4. Нейрохимическая идентификация холинергических нейронов септума и норадренергических нейронов голубого пятна с использованием, соответственно, гистохимической окраски на ацетилхолшестеразу и гистофлуоресцентного метода с применением глиоксиловой кислоты и параформальдегида.

5. Ультраструктурное исследование эксплантатов и диссоциированных культур.

G. Электрофизиологический внализ спонтанной и вызванной активности в эксплантатах и ионных токов в одиночных каналах мембраны культивируемых нейронов методом локальной фиксации потенциала (patch clamp).

7. Регистрация изменений концентрации ионов кальция в культивируемых нейронах с помощью флуоресцентного зонда Гига 2/АМ.

8. Количественное определение степени деструкции нейронов под влиянием ВАК и гипоксии, путем подсчёта числа погибших клеток в культурах и анализа активности лактатдегидрогеназн в инкубационной среде.

Ряд использованных методов был реализован в совместных исследованиях с сотрудниками других лабораторий НИИ мозга РАМН, а также НИИ педиатрии РАМН, Кардиологического научного центра РАМН, Научного центра психического здоровья РАМН, Центра экспериментальной и клинической медицины Польской Академии наук. Института анатомии Университета им. Гумбольдта (Германия)'*

Нахчн8я_новизна_исслезоващй.

В результате проведанной работы были впервые получены следулцие данные.'

1. В культивируемых эксплантатах гиппокампа, содержащих фрагменты аммонова рога, зубчатой фасции и анторинальной коры, происходит формирование органотипических клеточных структур, систем нервных волокон и сияаптаческих межнейронных связей, характерных для интактного гиппокампа.

2. При совместном культивировании с мишенью афферентной и источником афферентной иннервации (мамиллярные тела и голубое пятно, соответственно) эксплантаты гиппокампа формируют с этими структурами Функциональные межнейронные связи.

3. В клеточных культурах в процессе дифференцировки нейронов между ними устанавливаются зрелые синаптические контакты, а в одиночных каналах клеточной мембраны регистрируются ионные токи, активируемые глутаматом и Ы-мотид-Б-аспартатон (NMDA) а потен-циируемые глицином.

4. На ранних сроках развития In vitro хинолиновая кислота (ХК), в отличие от NKDA, не оказывает нейротоксического действия.

5. В зрелых органотипических культурах, содержащих сформированные синаптические контакты. ХК повреждает не только пост-синаптическиэ отделы дендритов, но и тела нервных клеток, в клеточных культурах повреждаются нейроны, локализованные в глионей-рональаых агрегатах, тогда как изолированные нервные клетки остаются интактными.

6. В клеточных культурах соптума, гак же кок и в сочетания культурах клеток гиппокампа и септума, ХК и глутамат, в отличив от NKDA и иботеновой кислоты, не повреждают свпталъные холинергические нейроны.

7. Деструкция культивируемых нейронов гиппокампа, подвергнутых гипоксии и после д/нцей реоксигенации, происходит главным образом в постгипоксичаский реоксигенацнонный период.

8. Внутриклеточная концентрация ионов кальция ([Са2+]^) посла ее стойкого возрастания при кратковременном действии глута-мата на культивируемые нейроны гиппокампа может быть уменьшена ингвОировашш* системы трансмембранного переноса ионов На+ и 3f.

9. Изменения во время воздействия глутамата и гипоксии и после него имеют сходную динамику и характеризуются длительным и стойким повышенном ICa^'*I..

10. Антиоксиданты различно® природа препятствуют нвйродест-руктивному действию глутамата и гипоксии In vitro и оказывают пролонгированный антигипоксический защитный аффект.

Научно=щактетвская_значишсть_исс

Полученные даные расширяют представле!шя о закономерностях дифференцировки нейронов In vitro, указывая на их способность развиваться в отсутствие афферентных вводов от окружающих структур мозга,сохранять потенцию к формированию функциональных синап-тических связей между собой (внутри культивируемой структуры) и с нейронами мишени эфферентной и источника афферентной иннервации, а также экспрессировать рецепторы, активируемые ВАК и управляющие соответствующими ионными каналами. Эти результаты свидетельствуют также о том, что культуры нервной ткани и клеток, использованные в работе, являются адекватной экспериментальной моделью, позволяющей на меточном и молекулярном уровнях изучать нейро-деструктивные процессы, вызываемые действием ВАК и гипоксии.

В результате проведенной работы получены новые данные о рецепторных и ионных механизмах этих процессов. Показано, что гипоксия является одним из факторов, вызывающих глубокие изменения ионного гомоостаза нейронов, опосредуемые глутаматнымд рецепторами. Эти изменения сопровождаются. в частности, гиперпродукцией активных форм кислорода, приводящей к поврездению нейронов, предупреждаемому антиоксидантами.

Обнаружение пролонгированного защитного действия антиокси-дантов на нейроны, подвергнутые гипоксии, создает экспериментальное обоснование для их практического использования при острых нарушениях мозгового кровообращения и их отдаленных последствиях.

Научно-практическое значение проведенных исследований заключается также в создании методических разработок, которые позволяют оказывать дозированное гипоксическоа воздействие на культивируемые нервные клетки и вести непрерывную регистрацию изменений ионного гомеостаза нейронов при гипоксии In vitro, что, • наряду с новыми данными, полученными в работе, создает перспективу дальнейшего изучения отдельных звеньев гипокси-ческого нейродеструктивного процесса.

Апробация диссертации.

Основные результаты работы были представлены на XIII съезде Всесоюзного физиологического общества им. И.П.Павлова (Алма-Ата, 1979), VIII Всесоюзной конференции по электрофизиологии ЦНС (Ереван, 1980), XXVIII конгрессе Международного физиологического общества (Будапешт, 1980), I и II Всесоюзных симпозиумах "Возбудимте клетки в культуре ткани" (Пущино, 1984, 1989), VII Конгрессе Ассоциации польских невропатологов (Гданьск, 1987), XIV Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), III Европейском симпозиуме по невропатологии (Верона, 1988), XXII Дунайском симпозиуме по нейронаукам (Инсбрук, 1989), V Международном конгрессе по нейротоксикологии и прикладной неврологии (Прага, 1990), Учредительном конгрессе Международного общества патофизиологов (Москва, 1991), Симпозиуме АН СССР и Национальной академии наук США по молекулярной нейробиологии (Киев, 1991), II Международном симпозиуме по гипоксии (Берлин, 1991), Региональной конференции Международного физиологического общества (Прага, 1991), II Международном симпозиуме по ресторативной неврологии (Иркутск, 1992), Всероссийской конференции "Свободнорадикальные механизмы церебральных патологий" (Москва, 1993), VII Всероссийском симпозиуме "Эколого-физиологические проблеш адаптации (Москва, 1994), III Шведско-Российском симпозиуме "Новые исследования в нейробиологии" (Гетеборг, 1994), III Международном симпозиуме по гипоксии (Берлин, 1994), II Международном Конгрессе по патофизиологии (Киото, 1994) Кроме того, результаты работы неоднократно докладывались в обсуждались в НИИ мозга Российской АМН и в институтах за рубежом (Польша, Германия).

П_2_б_л_и_к_а_ц_и_и .

Полученные данные отражены в 60 публикациях: 39 статьях (из них 5 глав в коллективных монографиях, 6 статей в зарубежных журналах) и 21 тезисах докладов г в том числе 14 - в международных сборниках).

- 13 -

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

I. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КУЛЬТУР.

(1, 6. 8. 18, 20, 23. 24)!

Для получения органотипических культур использовали головной мозг новорожденных мышей линии С57 Black. Клеточные культуры готовили из ткани мозга 16-19-дневных эмбрионов тех же животных.

0Е5ГОТО5Л9ние_оргакоршичес1ж_ку^тщ.

Поперечные срезы гиппокампа толщиной 0,5-0,8 мм, ориентированные перпендикулярно его продольной оси и содержащие фрагменты аммонова рога (поля CAj-CAg), зубчатой фасции и энторинальной коры, получали по модифицированной нами (1976) методике lia Wall, Woli, 19731, эксплантировали на покровных стеклах (22x22 мм), покрытых коллагеном, и культивировали в камерах Максимова (Викторов, Щунгская, 19761 при температуре 35,5° С. Питательная среда (ПС) состояла из сыворотки плацентарной крови человека (333»), минимальной среда Игла (52%), куриного эмбрионального экстракта (10%) и глвкозы (до 600 мг/%). ПС меняли 2-3 раза в недели. При совместной эксплантации поперечные срезы мамиллярных тел, идентифицированных на вентральной поверхности мозга, или ткани голубого пятна, выделенной из мозгового ствола (Викторов, 1978], помещали на покровное стекло на расстоянии 0,5-1 мм от среза гиппокампа и культивировали в тех же условиях, что и одиночные эксплантаты гиппокампа.

Приготовление _?у!9точных_культщ.

Для получения клеточных культур гиппокамп извлекали из мозга 17-19-дневных эмбрионов, помещали в сбалансированный соловой раствор, не содержащий магния и кальция (CMPS), и разрезали на мелкие фрагменты, которые инкубировали 10-15 мин при 37° С в 0,25%, растворе трипсина в CMPS, промывали в С МУЗ ив ПС, диссоциировали пастеровской пипеткой в 1-1,5 мл ПС, центрифугировали 1 мин при 1500 об/мин и осажденные клетки ресуспендировали в ПС. , Выживаемость клеток контролировала с помощью 0,2% раствора трипанового синего. Подученную суспензию (до 5 х 105 кл/мл) переносили на покровные стекла размером 22x22 мм2 (по 150 мкл на 1 стекло), покрытые коллагеном с нанесенным на него поли-Ь-лизином и помещенные в модифицированную чашку Петри {Викторов,

* -порядковый номер публикации в списке основных работ, отражаицих материалы диссертации (стр. 66).

Кенарская, 1975), и культивировали в СО,-инкубаторе (95% воздуха •л- 5Я5 С02). Через 5-6 дней каадое стекло с культурой помещали в пластиковую чашку диаметром 40 мм, содержащую 1 мл ПС с добавлением Ю-6 М врабинозинмоноцитозвда, тормозящего пролиферацию глиальных клеток, и возвращали в С02-инкубатор для дальнейшего 'культивирования, которое продолжаюсь (без смены ПС) до 3-х-4-х недель. В состав ПС входили: эмбриональная телячья сыворотка (5%), сыворотка плацентарной крови человека (5Ж), минимальная среда Игле (90%), глюкоза (600 ыг/%). инсулин (0.2 ЕД/мл).

Для подучэнчя суспензии септальных клеток использовали ткань септума, извлекавшегося из рострального отдела полушария мозга тех же' эмбрионов, из мозга которых извлекали гишюкамп. Процедура получения суспензии клеток септума и их культивирования была сходной с используашй для клеток гиппокампа. Для приготовления сочетайных диссоциированных культур гиппокампа и септума суспензии клеток этих структур смешивали в соотношении 1:1 и культивировали по той же методике. Описанную выше методику использовали и для культивирования клеток новой коры, которые получали от 1.6-17- дневных эмбрионов.

II. ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУР.

(2, 7, 11, 16, 18, 24, 27 , 28 , 43, 44, 51) №йроморфологаческое_иссл©адванлв.

Органотипнческие культуры в течение всего срока In vitro (3-4 недели) микроскопировали прижизненно в светлом поле зрения, а, затем фиксировали и импрэгаировали серебром по методу Холмса-Вольфа [WolX. 19S4] или окрашивали голлоцианином по Эйнарсону [Лилли, 1966). Норадронергические нейроны и волокна в сочетанию: культурах гиппокампа и голубого пятне идентифицировали гнстофдуоресцентным методом, с использованием глиоксиловой кислоте и пэраформальдегида [Викторов, Хасиеков, 1980).

Прижизненное исследование клеточных культур гишюкамкв проводили с использованием микроскопии в светлом поле зрения ж в фазовом контрасте, с также цейтраферной микрокиносгемки (1 кадр/ 3 мин). Для найрогистолоптгоского aHajtoa клеточные культуры обрабатывали так же, как и оргавотипические (см. выше). Для идентификации септальных ходинэргических ввЩютв использовали гистохимический метод окраски ва ацетилхоланестеразу íEl-Badavl, Sbenk, 1967].

Для электронной микроскопии эксплантаты и клеточные культуры фиксировали 30 мин з 1 ,5-2,556 гдутаральдэгиде на глжозно-фосфатном буфере (рН 7,2), а затем - в 1 -255 тетроксидэ ос мая на том та буфере, дегидратировали в спиртах эоеходящей концентрации и заключали в зпон 812 или аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цгтратом свинца и уранилацетатом и исследовали в электронном микроскопе <Л5й 10В.

Электрд$ГОЕто1^ескоо_исадщдваннэ органотипичоских культур (регистрация спонтанной и вызванной биоэлектрической активности нейронов) а клеток в диссоциированных культурах (локальная фиксация потенциала методом patch clajnp tHamlH et al., 13311) проводились в наших совместных экспериментах к.О.н. И.Н.Шароновой (НИИ мозга РАМН) и д.б.н. П.Д.Врежестовским (Кардиологический научный центр РАШ).

Иссдадовате_нейроцитотоксвщости_ВАК.

Для обнаружения нэйродеструктивного эффекта эндогенных (хвлолиновая кислота, глутамат) и экзогенных (N-MeTM-D-acnap-тат. иботеновая кислота) ВАК каждое из этих соединений вводили в ПС в концентрациях и на время, требуекне по условиям эксперимента. При исследовании влияния антагонистов глутаматних рецепторов на нейродзструктивный эффект их добавляли к культурам за 5-7 мин до введения ВАК. Для прижизненной оценки цитотокснческого действия ВАК в клеточных культурах одни и те еэ их участки в начале, на протяжении и в конце эксперимента набладали н фотографировали в фазовом контрасте, после чего культуры обрабатывали для гистологического, гистохимического или ультраструктурного исследования. Ис«1ьдовани9_нейроаес^укттиото

Перед гшоксическим воздействием ПС в чашках с клеточными культурами гиппокаша заменяли на контрольный сбалансированный солевой раствор (CBSS-1), содержащий (в мМ): NaCl - 113; КС1 - 5; Na^E^ - 1; NaHCOg - 24; СаС12 - 1,8; t!gCl2 - 1; глшозу - 5 (рН. 7,4). Затем чашки помещали в сконструированную и изготовленную нами плексигласовую камеру. заполняли эе бескислородной газовой смесью, содержащей 95% N2h ъ% С02. герметизировали и помещали в тершстат при температуре 35,5" С. Чтобы избежать высыхания культур, дно камеры предварительно покрывали тонким слоем воды. По окончании гипоксичоского периода культуры извлекали из камеры и возвращали в С02-инкубатор, т.е. в условия нормэксиа, подвергая

их тем самым реоксигенации. В соответствии с условиями эксперимента, в CBSS-1 добавляли исследуемые вещества, а также варьировали продолжительность гипоксического и реоксигенационного периодов.

"Измерения t Ca ]^ в одиночных культивируемыых клетках гишхокампа проводили на 18-й - 22-й день In vitro с помощью Са2+-чувствительного флуоресцентного зонда - ацетоксиметалового эфира fura-2 (lura-2/AM) [Grynklewlcz et al., 1985]. Культуры инкубировали в течение 45 минут при 35°С с 5 мМ Гига-2/AJi в сбалансированном солевом растворе (BSS), содержащем (в мМ): NaCl 145; KCl 5; NagHPC^ 1; СаС12 0,5; KgCl2 0,5; глюкозу 10 (pH 7,4), эабуференном К-2-гвдроксиэтил1Шперазин-Н'-2-этансульфоновой кислотой (HEPES, 20 мМ). с добавлением бычьего сывороточного альбумина (1Х) и плуро новой кислоты (0,02%). Перед экспериментом клетки промывали в BSS и выдерживали 30 минут при комнатной температуре, что приводило к деэстерификации Iura 2/AM и установлению равновесия мэаду ее связанной и свободной формами. Затем стекло с культурой прикрепляли вакуумной смазкой к проточной камере, которую устанавливали на инвертированный микроскоп, сопряженный со спектрофшуориметром "Spex" (США), содержащим два шнохроматора и систему из двух вращающихся зеркал, позволяющую быстро (с частотой 100 гц) чередовать возбуждение Гига-2/Aü в длинах волн 340 и 380 нм. Абсолютные

о.

значения [Сал вычисляли из соотношения значений флуоресценции, возбуждаемой при указанных длинах волн. Камеру перфузировали со скоростью 0.2 мл/мин контрольным BSS (CBSS-2), который отличался от BS5 более высоким содержанием CaCL, (1,5 мЦ) и MgCl2 (1 мМ). Конструкция перфузионной система позволяла в соответствии с условиями эксперимента быстро изменять ионный состав раствора, омывающего клетки, и вводить в него исследуемые вещества.

Для регистрации изменений [Ca2+)i под влиянием гипоксии культуру с клетками, нагруженными lura-2/AM, помещали в герметизируемую проточную камеру, которая позволяла исключить контакт раствора, оадваицего культуру, с окружающим воздухом. Перед началом атих экспериментов клетки перфузировали CBSS-1. Гипокси-ческое воздействие, сочетавшееся, как правило, с глхкозной дэпрн-вацаей, осуществляли переключением перфузии о CBSS-1 на тот же раствор, насыщенный карбогеном (95* 02 + 5* C0«), а с него - на

безглшозша раствор, имеющий тот же ионный состав и предварительно деоксигснированный путем длительного пропускания .через наго бескислородной газовой смеси, содержащей 35% N2 и 5% 002.

Колэтестее^я_дцещм_нойродвсщх1шгон

Для определения числа нейронов, погибших после создайствяя ВАК шш гипоксии, культуры окрашивала ванадиевым гематоксилином . Ш.В.Викторов, 19901, что позволяло идентифицировать неповрежденные клетки и пшшотические ядра погибших нейронов. В каждой культуре подсчитывали количество пикнотических ядер относительно общего числа нейронов в 15 полях зрения при увеличении 400s.

Другим количественным показателем степени деструкция нейронов служила активность лактатдегидрогеназк (ЛДГ), регистрируемая спектрофо то метрически в инкубационной среда и пряш коррелирующая с количеством клеток, поврежденных щл-отоксическим воздействием tF.oh, Choi, 19ЭТ1. Количество вышедшего из нейронов фермента выражали в абсолютных единицах шш в процентах от максимально возможной активности ЛДГ, измеряемой в параллельной пробе инкубационной среда, в которой контрольные н опытные культур! подвергались замораживании и оттаиванка.

Для обработки количестпеншга дашшх использовали г-крзтерзй Стьвдзето.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. ДЖЙЕРЕЕЩРОВКА НЕЙРОНОВ И <ЮР!®Р0ВАШЕ МШШРОШ-ШХ СВЯЗЕЙ

IN VITRO

1. Органотипические__к_2_л_ь_?_£_0Л_.

(1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 17, 24)

На 7-й - 8-й день культивирования в эксплантатах гшзпбкакпа по мэре их просветления прижизненно в полях СА^-САд ашонова рога выявлялись тесно сгруппированные клетка, образущкэ плотннЗ слой, сходный по своой локализации и структуре с пирамидным слоен интактного гиппокаша. На 9-й - 10-й DI7 в зубчатой фэсцпа, становились заметными зернистые клетки, которые образовывали зернистой слой, имевший характерную подковообразную форму и состоящий из супрапирамвдального лимбэ, верхушка и ифрапираг,гадального лимба (Рис. 1, А и Б), что можно было наблвдать и в культурах, окрашенных галлоцианином по Эйнарсону. Поскольку ипфрапирамидалышй лимб у поворошенных shbotbhx на сформирован, идентификация этой структуры в эксплантатах свидетельствует о ее формировании ь процессе культивирования.

Pne. I. Элементы oprasoтипической структуры експлаетагов

гишюкаша (см. публикации 1 н 12).

А -пирамиданй слой, шля САЗ; вида* тес.ЕО сгрушшроваЕше тела нервных клеток.

Б -слой зернистых клеток ь ивфраяирагйЕделыюм дшоа аубчьтой фасции,.

В-Д -пучки нервных волокон в альвеусв ешшова рога. (В), ыеаду анторшвльной корой н зубчатой фасцией i (f)', в noJEMoptjeoH слое зубчатой фасции (Д)1.

11 (А и Б), '12 (Г и Д) н 18 (В) даей In vitro.

Присыпанная микроскопия в светло» поле зрения (А я Б): »вдрз нация серебром го Холасу-Вольфу (В-Д). Ув. 4,00х.

В культурах, импрегнированных серебром по методу Холмса-Вольфа, к концу 2-й недели in vitro пабладались пучки нервных волокон, сходные го своей локализации и ориентации с основными межнейрошшми связями интвк-гаого гиппокампа (Рис. 1 ,В - Д). Так, в вльвеусе обнаруживался хорош сформированный пучок вксонов пирамидных клеток, выходящий в фимбрио. 3 эксплантатах, содержащих фрагменты анторинальной коры, наблюдались пучки волокон, связывайте эту структуру с зубчатой фасцией, что свидетельствует о возможности формирования in vitro перфораптного пути. Нервные волокна, выявлявшиеся в области полиморфного слоя зубчатой фасции и ориентированные в направлении пирамидного слоя поля САд, представляют собой, вероятно, аксоны зернистых клеток. Одним из звеньев гишокампо-онторинальной системы мэжнейронтгх связей является эфферентный путь к анторинальной коре, образованный коллатералямл аксонов пирамидных нейронов поля САд. В культивируемом гаплокеше этот путь может быть представлен наблвдавшимся в эксплантатах пучком нервных волокон, проходящим от альвеуса поля СА^ через область разветвления апикальных дендритов пирамидных клеток аммонова рога к энторинальиой коре.

При изучении ультраструктуры эксплантатов гиппокампа сикап-тическда контакта в поле САд в точение первых 5 DIV обнаруживались редко. В пресинаптической части контактов число синаптических пузырьков было невелико, а уплотнения синаптических мембран имели небольшую протяженность. К 7-му дню культивирования происходило резкое увеличение количества синапсов в поле Câg, большинство которых имело структуру, характерную для зрелых аксодендритных и яксосоматических контактов in situ (Рис. 2). В нейропилэ шля САд обнаруживались довольно крупные (до 2,5 ' мкм) сииаптические терминали, в также контакты типа en passant.

Спонтанную биоэлектрическую активность в первые дай культивирования можно было зарегистрировать лишь у очень незначительного числа нейронов. Эта активность у всех зарегистрированных , нейронов обратимо подавлялась ' при увеличении внеклеточной концентрации ионов магния до величины, блокирующей синаптическую передачу (8 мМ). Со 2-й недели in vitro рэгзстрировались сложные форм спонтанных разрядов (одиночные, групповые я пачечные), что отражает, по-видимому, процессы дальнейшего образования новых синапсов. В те же сроки и позднее обнаруживались коротколатентные вызванные реакции нейронов поля СА3 на раздражение энториналыюй коры и зубчатой фасции, а также ответы нейронов на стимуляцию

Рис. 2. Удьграсгрухтура эксплантатов гншюкаша (полв САЗ). а -незрелый сшаятический контакт, 5 дней In vitro; б - г -7 давй In vitro: о -вксодендрнтный синапс; а -аксосоматически® синапс; г -синапс с крупней пресяваптическоВ терыянальи. Си. публикацию 9.

энторинальгой корн.

В исследованиях сочетании культур гиппокампа и одной из мишеней его эфферентной иннервации - мамяллярных тел ■ било обнаружено, что аксопы пирамидных нейронов, выходящие через фимбрив из альвеуса гиппокампа, прорастают в камадлярные тела, в нейронах которых регистрируются коротко- и длиннолатентные ответы при стимуляции пирамидного слоя аиданова рога. С другой стороны, гистофлуоресцентное и злектрофизиологическов исследование сочетавши культур гиппокампа и одного из источников его норадрэнергической иннервации - голубого пятпа показало, что растущие аксоны норадренергических пейронов достигают эксплантатов гиппокампа, в которых регистрируется коротколатентные ответы при электростмуляцни эксплантатов голубого пятна. 2. Лассоцииров ванне культуры .

(18, 19 , 20 , 24 , 25 , 27 , 31, 33 , 34).

Исследование клеточных культур гиппокампа с помощью цейтраферной шкрокинссъемки показало, что в течение первых нескольких часов культивирования происходит частичная агрегация . клеток и иг прикрепление к опорному субстрату. К началу 2-х суток lii títro начинается интенсивное формирование отростков, растущих из агрегатов и обособленных клеток и имеющих на своих дастальных концах конусы роста. В течение посладуицих 2-3 суток отростки удлинялись и в виде пучков и отдельных волокон связывали агрегата между собой.

В пгоых культурах и па препаратах, нмпрегнированных серебром, можно было обнаружить, что у нейронов, локализованных преимущественно вне агрегатов, происходит формирование отростков (децдритов), поперечный размер которых по мере отхождокая от' тела клетки и деления на более мелкие ветви постепенно уменьшается.

' Клетки, у которых один из депдритов по сравнению с другими имел больший начальный диаметр и большую протяяенность, морфологически оказывались сходными с пирамидными нейронами гиппокампа, развива- , вдегося 1п aitu (Рис. 3, А - Г). Наряду с нейронами, дендритная система которых приобретала ясно выракенную полярность, происходило формирование мульти- и биполярных нервных клеток с неупорядоченной системой отростков. У некоторых клеток, локализованных вне агрегатов, наблюдался рост тонкого отростка, поперечный размер которого, в отличие от других,резко уменьшался сразу поело отховдения от тела нейрона и сохранялся постоянным на всем протяжении, что позволяло идентифицировс ь этот отросток как аксон.

Pix. 3. Нейроны в дисооцшфоваыаой культуре клеток гиптюкаша (си. публикации 18 в 19).

А - Б -4 дня 1л vitro; В - Г -10 дней In vitro; Я - Е -19 дней la vitro.

Прагазненвав микроскопия в фазовом контрасте (Л) и в светлом поле зреши (Ю; импрегнация серебром да катоду Холмса-Вольфа iB-D; окраска крезиловш» фшлэтоши (Ü • Ыасатиб 16 нкк.

При дальнейшем культивировании в агрегатах и между ниш продолжалось формирование диффузных сетей и пучков нервных волокон. Вместе с тем наблюдалось просветление и истопчэние агрегатов, которые превращались в монослой, содержащий скопления тел нейронов и сплетения их отростков. В некоторых агрегатах нейроны образовывали упорядоченный слой, сходный с пирамидным слоем гиппокампа in situ. Наряду с этим происходило образование отдельных групп из нескольких обособленных нейронов. Следует подчеркнуть, что в большинстве культивируемых клеток, идентифицированных нами прижизненно как нервные на основании размера и Форш их тела, а такта структуры ядра и характера отростков, при окраске крезиловнм фиолетовым выявлялось характерное для нейронов вещество Няссля (Рис. 3, Д, Е).

Как показывают результаты световой микроскопии и цейтраферной микрокшосъемки, стабилизация нейронной структура культур наступает к концу 2-й недели In vitro, поскольку в течение последуггдих дноЯ форма нейронов, а таюгэ количество я характер ветвления отростков заметно не изменяются. Необходимо отметить, что непременным условием длительного (более 3-х недель) переживания как сгруппированных, так и изолированных нервных клеток является наличие уплощенного глиального монослоя, формирующегося в процессе культивирования мэаду ниш и опорным субстратом.

Электроннсмикроскопяческое исследование клеточных культур гиппокампа обнаружило высокий уровень дайеренцировки нейронов я развития межнэйронкых связей. К 10-му дна In vitro ультраструк-турпые характеристики большинства нервных клеток оказываются сходными с наблюдаемыми в зрелом гиппокадаэ In situ, однако нейрогшль содержит разреженную сеть отростков пэрвннх и глиальных клеток, а также преимущественно незрелые скнаптические контакты. Через 3 недели культивирования, наряду с дифференцированными пирамидными и зернистыми клетками, расположенными в плотном окружении глиальных клеток (главным образом, астроцитов), , наблюдается компактная сеть нейритов и глиальных отростков в нейропале, где обнаруживаются также многочисленные зрэлыэ синаптические контакты (Еис. 4). Большинство этих контактов ассиметричнн и являются аксодондритпыми или яксошипжовы».я, тогда как симметричные синапсы локализованы преимущественно на телах пирамидных и зернистых клеток и лишь изредка - на дендрнтах.

При культивировании диссоциированных клеток новой коры происходила морфогенотические процессы, в основном сходные с наб-

Ргс. 4. Ультраструктура нейронов гшшокампа в диссоциированной

культуре, 21 день in vitro (см. публикация 31).

а -перикарион, ядро и ядрышко нервной клетки; б -асимметричней аксодендритный синапс; в -асимметричный аксоши-пиковай синапс; г -симметричный аксодендритный синапс (цоказаны стрелками).

А -аксон; D -дендрит; S -шипик; С -аппарат Гольда; в -митохондрии; Ру -тело нейрона

Масштаб 0,5 мкм.

лвдакпимзся в развивающихся клеточих культурах гшпокампа: первоначальная агрегация клеток в суспензии, нанесенной на субстрат (правда, более выраженная, чем в культурах гшпокампа),.. рост отростков у изолированных нервкых клеток и нз глионейроналышх агрегатов, формирование глионейрктных пучков мззду агрегатам, развитие морфологических разновидностей нейроноз. Со 2-й подели in Yitro в культурах обнаруживались дифференцированные нервные клетки, локализованные как в агрегатах, так и обособленно.

Диссоциированные культуры септума отличались теп, что агрегация клеток в них была выражена незначительно, тогда как в сочетанных культурах септума и гиппокаша наблвдались ж обособленные клетки, и глионейроналыше агрегаты. На 2-й - 3-й неделе in vitro в живых культурах клеток свитума иоано было обнаружить крупные (до 25 мкм) тела мюгоотростчатых нейронов, расположенных обособленно друг от друга. В сочетанных культурах наряду с такими нейронами выявлялась группы и монослойяыэ агрегаты клеток, характерные для описанных выше диссоциированных культур гиппокаша и содержащие тесно сгруппированные нейроны.

Гистохимическая окраска культур клеток септума на ацетилхо-лннестеразу (АХЭ) позволяла идентифицировать крупные нейроны, имеющие от 2 до 5 и более разветвленных отростков, которые прослеживались на значительном расстоянии от тела клеткн (Рис. 5, А-Д). В сочетанных культурах, окрашонных на АХЭ и докрашенных ш методу Ниссля, отростки таких клеток достигали агрегатов, содержавших нейроны, в которых АХЭ не выявлялась, и формировали в них густые сплетения (Рис. 5, Е). Эта агрегаты образуются, скорее всего, клетками гшпокампа, поскольку, как указывалось выше, агрегация в культурах клеток септума была виражана слабо и, кроме того, в нейронах гиппокампа, культивируемых в отсутствие клеток септума, реакция на АХЭ была отрицательной.

Электрофизиологическио исследования в клеточных культурах были проведены на нейронах гиппокаша. В мембране этих нейронов с , помощью метода локальной фиксации потенциала ("patch-clamp") были исследовяш свойства одиночных иошзых каналов, управляешх глутаматными рецепторам к И-метил-В-аспартату (NUBA). Эксперименты проводили не клетках, культивировавшихся в течение 14-30 дней. Для регистрации токов через одиночные ионные ' каналы использовали изолированные мембранные фрагменты, обращенные наружной стороной в инкубационный раствор (конфигурация "outside-out"). Глутамат (10 мкМ) и NMDA (1-10 мкМ) вызывали активации

Рис. 5. Нейрота я диссоциированных культура* клзток септума и гиппокампа (см. пу&ликацию 20}.

А к Г: кавые нейроны в культуре югеток септума (А) и в сочетанной культуре клоток септума и гипокаша (Г). Б, В и Д -морфологические разновидности холинергическкж нейронов септума в диссоциированной культуре; гистохимическая окрнска иа ацеталхолинэстервзу; Е -мвзшзйронкэ связа. формируемые холинергичаскики волокнами нейрона септума (стрелка) в сочетааюй культуре септума и гшгоо-каыцэ; НГ -груапв нейронов гиппокампа (докраска крвзило-PUM фиолетовым). 20 дней Iii vitro. Масштаб 100 мкм.

токов через одиночные каналы. В присутствии На2"1" наблвдалась потоЕциалБепяскиая блокада ионных каналов. Глицин (1 мкЩ пошагал частоту открывания ЖОА-активируомых каналов а в ряде случаев пизывал появление '"долгохивущих" каналов с временем открытого состояния около 1 сек. Эти рэзультэтн свидетельствует об активной экспрессии глутаматкых ШВА-рецепторов культивируемюда нейронами.

II. ДЕСТРУКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ НЕЙРОНЫ.

1 . Х_и_н_о_л_и н_о_в_а_я__к_и_с_л_о_т_а_ .

(21, 22, 26, 28, 30, 31, 35, 36, 40).

Органотипические культуры гиппокэмпа подвергались действию хшюляновой кислот (ХК, 1 к?,!) в течение 24 часов на 10-й, 14-й и 20-3 РГУ. При этом при световой микроскопия гашкх культур заметных изменений нейронной организации эксплантатов и морфологических характеристик нейронов не наблюдалось. Электронно-микроскопическое исследование, проведенное через 24 часа после добавления ХК на 10-й В1У, кэ обнаруживало признаков повреждений нейронов и глиальных клеток и их отростков в яейропиле.

3 эксплантатах, подвегнутых действию ХК на 14-й ИГУ, ультраструктурл пэрикяриона нервных и глиальвых клеток через 24 часа также сохранялась неизменной, а в найропиле наблвдалось умеренное набухание и просветление отростков нейронов, тогда как аксонныэ терминали оставались интвктшлга. Вырахенные ультраструк-турныо изменения происходили в эксплантатах через 24 часа после добавления ХК па 20-3 Ш? (Рис. 6). Цитоплазма пиремвдшх нейронов набухала, становилась электронносветлой, содержала мелкие вакуоля и в ней'сохранялось лишь незначительнее количество неповрежденных органелл. Рибосомы диспергировались и утрачивал!! связь -с мембранами эндоплазматичоского ретикулума. Метрике митохондрий уплотнялся и в них наблшдались разрушенные крксты. , В то 29 время, ядра пирамидных нейронов, а тэкжэ зернистые клетки не поврездвлнсь. В нейропилз аксоны и их пресинаптичоские терминали . оставались интактныда! и сохраняла сходство с наблюдаемыми в контрольных культурах. Наряду с этим, крупные дендрита набухала, а в их постсинаптических отделах происходило разрушение органелл. Из последних сохранялись только немногочисленные рибосомы, набухшие митохондрии и микротрубочки, дезорганизация которчх была наиболее постоянным

-2в>-

Рнс. 6. Деструктивное действие ХК на нейрона в органотшшческой

культуре 'п:аии гилпокампа, 21 В1У (см. публикацию 28).

е -нейрон в культуре через 24 ч после введения ХК (I мМ). Набухание цитоплазмы, дйспергирование. рибосом, расширение канальцев гранулярного энлоплазматического ретакулума (gг), конденсация митохондрий (т). Ув. 4.800.

б -дендриты в контрольной культуре: аксодендритный контакт (косая стрелка,А),многочисленные микротрубочки (пИ) в рибосомы (стрелки) в профиле дендрита (В). Ув. 9.000.

в -ексодендритные синапсы (косые стрелки. А) в культуре через 24 ч после введения ХК. Электронно-прозрачный ствол дендрита (Ю) с разрушенными ншфотрубочкамв (тг) и нэкногочислешаши рибосомами (стрелки). Аксонныэ терминала (А) интактны. Ув. 9.000.

повреждения дондритов. Характер изменений в дендрите не зависел от типа контактирущей с ним аксонной терминала.

В диссоциированных культурах клеток гяппокаота к новой коры ояодекяэ ЮС (0,5 мМ) в питательную сроду па 10-й БIV не вызывало заметных морфологических изменений нейронов. При электронно-макроскопическом исследовании через 16 часов после добавления ХК обнаруживались интактпые нервные клот.ст и их отроспси. лишь в поржарионе и дендритах отдельных нейронов наблвдались немногочислошшэ вакуоли, а также дилатация канальцев и цистерн аппарата Гольдам. Формирующиеся сяяактическио контакты оставались неповрежденными. Во время последующего культивирования рост отростков нервных клеток и синаггтогонез продолжаетеь, и к концу 3-й недели ультраструктурные характеристики нейронов в культурах, подвергнул« на 10-й БIV воздействию ХК, и в контроле были сходными.

Нейроцитотоксический эффект ХК (набухание дендрятов и отек тела клетки) в диссоциированных культурах на 20-22 бал

заметнш прижизненно уже через 30-40 мин, а через 1,5-2 часа наблюдалась деструкция нейронов (Рис. 7). В контрольных культурах за гораздо больияй отрезок времени (2-3 суток) заметных морфологических изменений нейронов в этот период культивирования не отмечалось. При болэе низкой концентрации ХК (0,25 мМ) дегенерация клеток, при мввее выраженном отеке, развивалась значительно медленнее и наступала к концу первых суток. Цитотоксичвскому действию ХК были подвержены, как правило, нейроны, локализованные в глиопейронадьных агрегатах, тогда как обособленные нервные клетки не дегенерировали.

Электронно-микроскопическое исследование показало, что при добавлении к клеточным культурам ХК ка 21-й ШУ, когда в нейро-пиле преобладают ярелые синаптическио контакты, в ультраструктуре нейронов происходят глубокие дегенеративные изменения, наблюдаемые в телах нервных клеток и в дендритах (Рис. 8): сжатие ядра, , клямнирование хроматина, отек цитоплазмы, набухание депдритов к их равномерное) заполнение диспергированным флокуллярным материалом. В цитоплазме сохранялись только расширенные цистерны эндо-плазматическош ретикудума, набухшие митохондрии с разрушенными кристакн и единичные лнзосомы. В то ¡ад Ерем, аксонике терминала оставались иятчктными, а пре- и постстшаптические мембраны в различных типах сипапсов, содержащих в пресинаптических окончаниях многочисленные сипаптические ; /зырыет, нэ повреждались.

-Ъ 0-

Рис. 7. Деструктизное двйствиа ХК на нейроны в диссоциированной культуре клеток гшшокампа (см. публикации 26 в 37). А -до введения ХК: Б и в - через 2 часа посла введения ХК (0,в мМ).

Живая культура, фазовый контраст (А и Б); окраска крезиловым фиолетовым (В). 21 В1У. Ув. 400х.

Рис. 6. Ультраструктура культура клеток гшшокампа (20 217)

через 2 часа после введения ХК (см. цубликацяю 31).

а и С-внтактныэ аксовяые терминала(А) в контакта с дэге-нэрированньмн постсинаптичаскямх участками доввратов (й); в -догеяерировашма нейрон с разрушенными оргаголламн (стрелка) а повреадвнным ядром (и).

Масштаб 0.5 юок.

Следует отметить, что в органохапнческих и клеточпых культурах, подвергнутых действию ХК, выраженных 1штоморфологических ультраструктурных изменений в аст{ющггах и олягодвндро-глиалъных клетках не наблюдалось. Кроме того, наряду с поврежденными, обнаруживались и интактвые нейроны, среди которых преобладали зернистыэ клетки, с хорошо сохранявшейся ультраструктурой.

В диссоциированных культурах клеток септума холинергические нейроны, идентифицируемые с по?.кэдью гистохимической окраски па оцетилхолшюстеразу, были устойчив« к действию ХК. В сочетвнных культурах клеток гилпокаша и септума ХК в отношвгога холкнергя-ческих нейронов также не оказывала цитотокснческого эффекта, тогда кок большинство других, локализованных рядом с ними в глионейронвльннх агрегатах, дегенерировали.

2 . Г_л_1_т_а_м_а_т__и__§_к_з_о_г_е_н_н ы_е____LLOÜJJ

N_M_D_A_- JiJJJ.t.5JAl___?_3JL"_8Jf

(29, 34, 35. 36, 37, 28, 41, 46. 48,).

Добавление глутамэта (ГЛУ, 1 мМ) к культурам клеток гиппокампа на 3-й нэделе in vitro в течение 3-х часов приводило к набухания и вакуолизации перикариона и разрушению отростков нервных клеток. Первые признаки повреждения нейронов отмечались через 2 ш. после введения ГЛУ и нарастали в течение даследущих 15-20 нин. Более низкие концентрация ГЛУ (0,1-0,3 Ш) оказывала замедленный цитотоксический эффект, с меное выраженным отеком клеток, и деструкция нейронов наступала позднее, в течение 8-10 и более часов.

Так re, как и ХК, ГЛУ не визывзл заметного повреждения холинергических нейронов при его введении в культуры клеток саптуна н в сочетайте культуры юте ток септума и гиппока.'ята. Кроме того, нейроцитотоксического действия ГЛУ ко наблэдвлось в незрелых (до 10-12 DIV) культурах.

Зависимость нейродеструктивного эффекта Ы-мэтил-О-аспартата (NKDA) от срока культивирования и от медиаторной природы нейронов , отличалась от наблюдавшейся при действии ХК и ГЛУ. При добавлении к клеточным культурам гиппокампа ГОША (0,1 мМ) на 10-й DI7 прижизненные изменения структуры норвных клеток наблюдались ум в течение первых нескольких часов, а через 14-16 часов происходила их заметная деструкция.

При ультраструктурном исследовании з нейронах выявлялась . массивная вакуолизация перикариона и сжатие ядерного хроматина. В

отдельных нервных клетках вакуоле обнаруживались и в нуклео--шюзме, причем некоторые из них локализовались между мембранами расщепленной ядерной оболочки. В клетках с наиболее выраженными деструктивными изменениями можно было обнаружить исчезновение митохондрий, диспергирование рибосом, а также липидные гранулы и скопления электронно-плотного материала. В нейропиле набладалось сальное набухание нейрональных отростков. Глиалъные клетка, как правило, оставались интактвыми, однако в телах и отростках некоторых из них содержались вакуоли, жировые включения и частицы гликогена. Дальнейшее культивирование в течение последующих суток сопровождалось тотальной дегенерацией нейронов.

Цитотоксяческое действие NHDA, сходное с действием ХК и ГЛУ, наблюдалось при его введении в культур« гшшокампа и в более поздние сроки In vitro (до 4-х недоль). Однако в эти сроки в сочеташшх культурах клеток гашокампа и септума МША, в отличие от ХК и ГЛУ, вызывал деструкцию и септальных холшергических нейронов. Последние, как и нейроны гшшокампа, дегенерировали ■также ьод действием другого эгоняста Л5Я)А-р8цепторов - иботеновой кислоты (0.05 Mil).

3. ¿LQ_!_c_?_B_li_e__а_н_т_а г о н иj_i_oj___C_9JJ_9_H.XJ2.JL.o_h

___н_а____ыейродвотруктивикВ

з ф ф о к т ВАК. .

(29, 32, 35, 37, 38, 39, 40. 42).

В экспериментах использовались конкурентный (D,Ir-2-aMHiio-5- • фосфоковалерат) и неконкурентные (МК-801, кетамин) антагониста NKDA-рецапторов, а такзэ вятатдасты югрокого спектра действия -у-D-глутамилглицин и кииуроновая кислота.

Селективный конкурентный антагонист ¡ЛША-роцеггтороз В.Ь-г-амшю-б-фосфоноваларат (АФВ, 0,3 мМ) при его доб&вливии к клеточным культурам гиппокамоа за 5-7 иин до введеяня ХК предотвращал ее нейродбструктивный эффэкт. Аналогичное до2стаие оказывали неконкурентные антагонисты - блоквтора ионых каналов, управляемых ШВА-роцепторама, МИ-801 (0,03 ы?4) к кетамин (0,1 ыМ), 'а неселективние антвгонасти глутанатшх рецепторов г-и-гдутлюшиащян (BGG.3 мМ) и кянуренопая кислота (КК, 1.5 nsM).

Сходный янтидоструктавнъй аффект АФЗ, КК к DGG наблвдалея при введении в культурк NMPA, причем в сочетанных культурах клэток гшшока«иа к септума АФВ предотвращал деструкцию еэпталылд холгявргичвеких нейронов под действием Ш)А и

ибо те новой кислоты. С"другой* стороны, в клеточных культурах гшпюкаша А® не препятствовал нвйродеструктивюму действии ГЛУ» которое лишь частично предотвращалось DGG.

С целы) сравнительного анализа антидеструктивного и протиВосудорожного эффектов антагонистов НЬЮА-рецепторов - АФВ а КК.а также аптиконвульсантов - Ь-кинуренина (КИН) и этилимидазол-4,5-дикарбоновой кислоты (ИЭМ-1442, синтезирована д.б.н. Л.Б.Пиотровским в Институте экспериментальной медицины АМН СССР), нами было проведено исследование способности этих соединений препятствовать цитотоксическому эффекту ХК In vitro и ее конвульсивному действию in situ. В отличие от КК и АФВ, КИН (1,5 мМ) и ИЭМ-1442 (1,5 мМ) не предотвращали деструкции культивируемых нейронов гиппокампа под влиянием ХК. В то гэ врешь по данным наших соавторов И.П.Лапина и И.В.Рыжова (1988), КК, в отличие от АФВ, при ее введении в боковые желудочки мозга мышей в дозе 1-5 мкг не препятствовала развитии судорог, вызываемо: ХК (5 мкг), тогда как КИН (10-25 мкг) и ИЭМ-1442 (2,5-5 мкг) оказывали противосудорожяый эффект.

Сводные данные об особенностях нейроцитотоксического действия ВАК па культивируемые нейроны и влияния на пего антагонистов глутаматных рецепторов и антиконвульсантов представлены в таблицах 2 и 3.

III. ДЕСТРУКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГИПОКСИИ НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ НЕЙРОНЫ (43, 49, 50, 52, 57, 58, 60) В экспериментах по гидаксическому воздействию in vitro использовались клеточные культуры гиппокампа, содержащие дифференцированные нейроны и зрелые синаптическне связи (2-3 недели in vitro).

Инкубация в гипоксической камере в течение 6-8 часов и последугщее культивирование в С02-инкубаторе в течение 12-16 часов Приводили к деструкции значительной части нейронов. При приязненном исследовании этих культур в фазовоконтрастном, микроскопе деструктивные изменения нейронов выявлялись, как правило, через 2-3 часа после гиноксического воздействия, а затем число поврежденных нейронов быстро нарастало, достигая максимума через 7-8 часов. Глиалыше клетки (астроциты), как показало иммувоцитохимичоское исследование на кислый глиофибряллярный белок, оставались интактными. Последующее культивирование в течение 1-2 суток не приводило к заметному увеличению количества

1аблищ>_3. Действие агонистов глутаыатных рецепторов на культивируемые нейроны различных структур головного мозга.

Структура i 1 А г о н и с т Срок культивирования !-1-1- j ХК ¡ HMDA j ИК

Гиппокамп или новая кора До 10 дней +■ +

колвп ?т'в глионей- Б о е в ¿-z |ро сальных i агрегатах недель 1 + •+■ +

i — ■ — i Обособлений нейроны + +

Септум (холинер-гические нейроны) Более 2-х недель - + +

+ шрагвшшй нейродеструктившй аффект (>8СЯЕ погибших нейронов). - отсутствие Еыраженюго но ^»деструктивного эффекта (<1и* погибших нейронов).

SSSJSKiS_3- Действие антагонистов Ш5А-рецепторов н протавосудо-рохных препаратов на конвульсивный (ln vivo) в нейродэ-структиввый (1п vi tro) аффекты ХК.

Антагонист кля антмконвульсант I n vivo I n vi tro

А Ф В 1 1

К К + _

К И Н j +

И Э VI 14 4 2 +

♦ конвульсивное или нвйродоструктивное действие ХК. - отсутствий конвульсивного или нойродеструктивного действия ХК

поврежденных нейронов. Показатели активности ЛИГ в •инкубациопной среде, полученной от культур, подвергнутых гипоксии и последующей реоксигенации, составляла 32,2-3,0%, тогда как в контрольных культурах - 18,0-2,9%, а количество погибших нейронов соответственно, 40,2^-1,0 и 7,2±0,6!6 (табл. 4, рис. 9). Активность ЛДГ в контроле можно объяснить, по-видимому, постепенным накоплением фермента в инкубационой среде вследствие того, что в ней за продолжительное время эксперимента (около 20 часов) происходит спонтанная гибель некоторого количества нейронов. Следует также отметить, что измерения активности ЛДГ в среде после замораживвния контрольных культур и культур, подвергнутых гипоксии, не выявили достоверных различий, что свидетельстыует об отсутствии влияния гипоксического воздействия на этот фермент.

Поскольку приведение выше результата указывали на преобладание нейродеструктивных процессов в постгипоксический период, в следующей серии экспериментов была предпринята попытка прямого выяснения роли этого периода в деструкции культивируемых нейронов гишюкампа. С этой целью была проведена сравнительная количественная оценка гибели нейронов в культурвх в период собственно гипоксии и в равный по- продолжительности период, вклшащий более кратковременную гипоксию и последующую посттагоксическув реоксигенацию.

Первую группу культур подвергали непрерывному гипоксическому воздействию в течение 10 часов. Параллельно вторую группу культур выдерживали в условиях гипоксии в течение 7 часов, а затем помещали на 3 часа в условия нормоксии. По окончании экспериментов проводили одновременную гистологическую обработку культур обеих групп. Анализ препаратов показал, что в первой группе после 1с-чассвой гипоксии число погибших нейронов составило 27,1-1,3%. В параллельном опыте, когда культуры выдерживались в гипоксической каморе 7 часов, а затем в течение 3 часов находились в условиях нормоксии (около 212 Од), число погибших нейронов увеличивалось до 40,3-1,5%. Активность ЛДГ в инкубационой среде, полученной от ■ культур первой группы, составила 13,2-0,8%. В то же время, после 7-часовой гипоксии и 3-часовой реоксигонации активность ЛДГ достоверно возрастала и составляла 1G.8il.3i (см. табл. 4 и рис 9).

Активация ¡юЯродеструктшзных процессов в постгипоксический реоксигенециопный период наблюдалась и в том случае, когда этому периоду предшествовало менее продолжительное гипоксическое

Таблица 4. Количественные показатели деструкции нейронов при гипоксии (ГИЛ) и последуАлцей реоксигенации (Р/0).

i & i ь * 'Характер __!_

п/п jвоздействия • IS погибших нейронов jактивность ДДГ {%)

1. ГШ 6-8 часов + Р/0 12-16 часов 40,2 + 1.0 * 32,2 + 3,8 *

2. Контроль 7.2 + 0,6 18,0 + 2,9

3. ГШ 7 часов + Р/0 3 часа 40,3 + 1,5 ** 16,8 1,3**

4.. ГШ 10 часов (без Р/0) 27,1 + 1.3 13,2 + 0,8

5. Контроль ______§»2. + .1x1 - _ . 12,2 + Ij.6

Маш средние значения ± БЙ1. п = : (5-20 (А); 15-17 (Б 1-2); 5-6 (Б 3-5). «и *♦ - достоверно отличается от 2 (р<0,001) и 4, 5 ЕИЮ_Стьк$онта. гЧисло_ис слеаованных_кхльт^р._

Соотношение количественных показателей деструкции нейронов при гипоксии (ГИГ!) и реоксигенации (Р/0).*.

lOO

S X

Ы 80

ыво

й 40 S

1 20

¿fr.

WA ■wvw

■MtZ.

WW»*

SJSi'S,

/271:. fuif.

.V>VW S//SS, Wr'yV ///iY-■WV*V rss/s.

WVW

VA'//.

AVAV

s/szs.

'U.

VrWVS SSSS S y-w-M-v

SS/SS yWyV-

'vAW. 'S/SS/

'.'s

S s/SS

VvV.--.r-. ' •'///.-

WSS'S

f/sss

'/SS SS A'iV/-

»W/V. ■SS/SS

,-vVvs SS ¿SS

3 4

1 - ITC! 6-8 часов + P/0 12-16 часов; 2 - контроль; 3 - ГИЛ 7 часов + Р/0 3 чеса; 4 - ГИЛ 10 часов (без Р/0); 5 - контроль. А А - негибкие клетки; Б - активность ДДГ.

2 а 4 ,ь отшсьни, соответственно, к 1 а 3 (=100). п и досто-во (люсть _рлз-гич ий_-_Tti Jto х_что ив jrafljuiiiu _ 4 ______

•Калачествошше данные приведены в публикациях 43, 49, 50 и 58.

воздействие. Так, при 5-часовой гипоксии и последуодей з-чвсовой реоксигенации число погибших нейронов составляло 35,8-3,0%, .в то время как после 8 часов гипоксии без реоксигенации - 21,2-1,8%. Деструкция нейронов усиливалась примерно в той же степени (на 16Ж) и в том случае, если после 5 часов инкубации в бескислородной атмосфере их продолжали выдерживать в течение 5 часов не в условиях нормоксии, а в камере с газовой смесью, содержащей лишь 5% 02. При этом необходимо указать, что после пребывания культур в такой газовой смеси в течение 10-14 часов без предшествующей инкубации в бескислородной среде число погибших нейронов составляло 2,3-0,7%, что было сравнимо с контрольными культурами, находившимися в условиях нормоксии.

Таким образом, нвйродеструктивпые процессы, вызываемые гипоксическим воздействием на культивируемые нейроны гиппокампа, в период постгипоксической реоксигенации протекают более активно, чем в течение равного по времени периода гипоксии.

IV. ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНТИОКСИДАНТОВ ПРИ ГИПОКСИЧЕСКОМ ПОЗРЕЯДЕ-НИИ НЕЙРОНОВ IN VITRO.

(39, 43, 49, 50, 52, 53. 54, 57, 59, 60)

В экспериментах, направленных на предотвращение нейродеструктивного эффекта гипоксии, были применены липофильный антиоксидант класса экранированных фенолов (U-18), синтезированный в Центре психического здоровья Российской АМН (Либо с соавт., 1991), и эндогенный гидрофильный антиокислительный метал-лофермент супероксиддисмутаза (СОД).

Присутствие в культурах U-18 (25 ^М) на протяжении всего эксперимента, т.е. во время и гипоксичэского (6-8 час), и постгипоксического (16-18 час) периодов, снижало активность ЛДГ в инкубационной среде до 16,5-3,3 яСс. ед., а число погибших нейронов - до 17,7io,9% (без антиоксиданта, соответственно, 30,7±3,8 абс■ ед. и 67,7-1,856). Подобный результат - активность ЛДГ 20,5-4,0 абс. ед., число погибших нейронов 25,3^0,9% -наблюдался и при добавлении U-18 к культурам сразу после гипоксического воздействия, только на период реоксигенации (табл. 5, рис. 10),.

Отчетливый антидеструктивный эффект U-18 наблюдался и тогда, когда его введение в культуры во время 6-8-часовой гипоксии предшествовало 16-18-часовой реоксигенации (без антиоксиданта). В этом случае по окончании реоксигенационного периода наблюдалось более чем 4-кратное снижение числа погибших нейронов (до

Таблица 5. Защитный эффект антиоксвданта и-18 (25 ^М) в культурах, подвергнутых гипоксии (ТТШ, 6-8 часов) и последующей реоксигенации (Р/0, 16-18 часов).

Я jХарактер п/п ¡воздействия

2 погибших нейронов активность ДЦГ(абс.ед)

1. ГШ без U-18 + Р/0 без U-18 67,7 + 1,8 * 30,7 + 3,8

2. ГШ с U-18 + Р/0 с U-18 17,7 + 0,9 16,5 + 3,3

3. ran без U-18 + Р/0 с U-18 25,3 + 0,9 20,5 + 4,0

4. ГШ с и-18 + Р/0 без U-18 15,5 + 1.9 6,5 ± 2,3

5. Контроль . ЗА. + 0.6 8,0 £ 2,9

Даны средние значения - SHI. п = : 14-17 (А); 5-9 (Б). « - дост • ~

и 5 (р<0 культур.

« - достоверно отличается от 2 (р<0,001), 3 (р<0,05), 4 (р<0,05) и 5 (pcO.OOl) по t-критерис Стьвдента. п - число использованных

Рис._10. Соотношение количественных показателей защитного эффекта антиоксвданта U-18 в культурах, подвергнутых гипоксии (ГИП, 6-8 часов) и последующей реоксигенации (Р/0, 16-18 часов). »

10Q

5 X

b во

и ц

X 60

и X

3 ш

J 20

О С

■'■¡Xi'fí Y&uj XÓn

■/■'SJ/ .WÍVÍ

✓A-Vw

■'ЛМ

AV.-A

,Wvy. í.'.'j; v.

■i/íri v.v.

V.VA

W/itl/Ali

.->УА ТЛ-ЛУ

-W/+1////-■

■AVV^ i:/:.

'/////

C{ JLOO

Ul BO-|

s s

Ы *

o tí o a

и 20-|

w A ffl

40.

¡AiÍlu

uní.

fía.

'Av

'•'Sifí,

УЛ">V

i/M 4WW

f/ш

•WWV 'VVS'VV

vvwv . >vyyv WvVV

•уда.

"A'AV '-Vv-Л'

vva-

VVVW '.y///

■дал. «йу;

AV>V>

«ли* '/¿sw

VvVHA

y««

73^77.

......

A*VA avav w^-w

WAV л^ .v.-.v ///„y

'W/yy

"áiz

h^yyv

3 4 5.

3 .4

1 - ГШ без U-18 + Р/0 без U-18: 2 - ГИП с U-18 + Р/0 с U-18; 3 - ГИП без U-18 + Р/0 с u-18; 4 - ГИП с U-18 + Р/0 без U-18; 5 - контроль (24 часа). А - погибшие клетки; Б - активность ЛИГ.

2, 3, 4 н 5 отнесены к 1 (=!00). п и достоверность различий

________________,_____________

»Количественный данные приведены в публикациях 43, 54, 57, 59. 60

15,5—1 ,935). Этот количественный показатель нейродеструктивных процессов прямо коррелировал с параллельными измерениями активности ЛДГ (см. табл. 5 и рис. 10). Следует отметить, что при введении в контрольные культуры U-18 не влиял ни на выживаемость нейронов, ни на активность ЛДГ.

Вше было показано, что 10-часовое гипоксическое воздействие (без последупцей реоксигенации) приводит к гибели относительно небольшого количества (около 30%) культивируемых нейронов. При увеличении продолжительности гипоксического периода до 15 часов это количество возрастало до 62,3-5,155. Присутствие в культурах антиоксиданта на протяжении этого периода почти в 4 раза (до 17,5-3,д%) снижало число погибших нейронов по окончании гипоксического воздействия (табл. G, рис. 11 А).

0 способности цитоплазматических антиокислительных систем препятствовать гипоксическому повреждении нейронов гиппокампа In vitro свидетельствовал защитный эффект СОД (300 ЕД/мл) в культурах, подвергнутых гипоксии (8-10 часов) и последующей реоксигенации (16-18 час). В этих опытах было обнаружено снижение уровня ДДГ до 7,7±1,1 абс. ед,, по сравнения с культурами, инкубированными в тех гэ условиях, но в отсутствие СОД (15,8^2,1 абс.ед.). Контрольные эксперименты показали, что СОД сама по себе не влияет на активность ЛДГ. В то же время, уровень ЛДГ в культурах, не подвергавшихся гипоксии и инкубированных в течение 24 часов в CBSS-1, был выше в отсутствие СОД, чем в ее присутствии (см. табл. 6 и рис. 11 Б).

Для сравнительной оценки защитного действия внтиоксидантов при цитотоксическом и гипоксическом повреждении нейронов было исследовано влияние U-18 на нейродеструктивный эффект ГЛУ in vitro. Было обнаружено, что обработка культур антиоксидантом (25 j^M) за 20-30 мин до введения ГЛУ (100 рМ) и их последующая инкубация в присутствии антиоксиданта препятствует цитотокси-ческому повреждению нейронов. Число погибших нейронов в культу- , pax, инкубированных с ГЛУ в присутствии U-18 в течение 7-8 часов, составило 26,5-1,9%, а в течение 18-24 часов 38.1^2,7%, тогда как без U-18, соответственно, 38,1-1.9% и 70,1±2,5$ (табл. 7, рис. 12). Необходимо отметить, что указанное действие антиоксиданта не связвно с блокадой глутаматных рецепторов, поскольку тестирование этого соединения на изолированных нейронах методом patch-claup не выявило у наго свойств антагониста рецепторов к ГЛУ.

Таблица б. Влияние 4-18 (25 рИ) на деструкцию нейронов, подвергнутых 15-часовой гипоксии (без реоксигенации). Антидеструктивный аффект супероксиддисмутазы (СОД,300 ЕД/мл)

—ГРТБ—

% погибших нейронов

Я (Характер I СОД

а/а ¡воздействия активность ЛДГ I (абс. ед.)

а/а

ТГ 2.

Характер воздействия

ГИП без 0-18 ГИП С U-18

3. Контроль

62,3 - 5,1 17,5 - 3,9 *

9,9 ± 1,9

1. ГШ1 8 час.+ 15,8 - 2,1 Р/0 16 час.

без СОД

2. ГИП 8 час.+ Р/0 16 час. с СОД

3. Контроль без СОД

4. Контроль с СОД

7,7 ± 1,1 **

9,3 - 1,4 4,1 ± 0,9 **

Даны средние значения ± SEK. п = : 5-6 (U-18); 15-25 (СОД). Достоверно отличается: * - от 1 и 3 (р<0,001); » « - 2 от (р<0,05) и 4 от 3 (р<0,05) ш t-критерию Стыщента. п - число исследованных ¡су ль ту р.

Рис. 11. А. Влияние U-18 (25 рМ) на деструкцию нейронов, подвергнутых 15-часовой гипоксии (без реоксигенации). Б. Антидеструктивный аффект супероксиддисмутазы (СОД,300 ВД/мл) *

ХОО

X ■ h 80

с; ' * во

ы S

3 ш s

о с

МП"

'Ш.-.а yWss,

r-VÂV,

ЧМи?

y^VVV» HZ/î!

r-SSSS,

Y//.'/ и.-.'.v.

rS VVV>

'n'a.

vv--.

'WW.

i:ll:

VW,','

vwW

C[ iOO

U 80 S

s ы Ci

ï о й о я и

A ffl

VMV

V/WV

'ÀJZ/Ï. wyvv

■¿Xz/A

VAW

'i/'M

VMV

Ж/г.

-yvyvv

»if

'/Л/

--.'л--

/////¿AVfV

:•->/// VMV

WAV

V,V)V,

[«¿У.

^rV/И

art//

'ut/.'' w^y

•vorn.

■m/i

yVCvW •••y»'A-

/MV. v-wv

1 2 3 1 2 3 4

А: 1 - ГИП 15 часов без и-18; 2 - ГИП 15 часов с и-18;

3 - контроль. 2 и 3 отнесены к 1 (=100). Б: 1 - ГИП 8 часов + Р/0 16 часов, без СОД; 2 - ГИП 8'часов + Р/0 16 часов, с СОД; 3 - контроль без СОД; 4. - контроль с СОД. 2, 3 и 4 отнесены к 1 (=100). п и достоверность различий -те «е, что и в табл. 6._

Количественные данные приведены в публикациях 43, 54, 59, 60.

Таблица 7. Защитный эффект антиоксиданта U-18 (25 рМ) в культурах, подвергнутых цитотоксическому действию гдутаматв (100 рИ) в течение 7-в (А) и 18-24 (Б) часов.

п/п

1. ГЛУ без U-18

2. ГЛУ с U-18

3. . Контроль__

погибших нейронов

38,1 - 1,9 26,5 - 1,8 *

70,1 - 2,5 38,1 ± 2.7 *

Даны средние значения - SM. п = : 10-12 (А); 6-14 (Б).

« - достоверно отличается от 1 (А: р<0,05; Б: р<0,001) по t-кра-терию Стьюдента. п - число использованных культур.

Рисл_12. Соотношение количественных показэтелей защитного аффекта антиоксиданта U-18 (25 иИ) в культурах, подвергнутых цитотоксическому действию глутамата (100 рМ) в течение 7-В (А) В 18-24 (Б) часов. «

JJQO 80 60-I 40 20

х^ул

■иж ~ат

rW>V>

хит

Xvw* 1VI.

itii г

vVvVVS rV>Vy-,

■iXttt ■¿r.'ij lYÜ'A

PT*

vww

am.

■WVVV

i/Л/.

VyWV

"WiV»' AW

'¡tri. ггш/

AVW'v

uiiu

rrTir

-ywvv

да«.

100 80 60 40 20

/WW,

irvyw*. Mvy> MWs

'/¿cür

ЛУу'/, yVA'A ¡rWvVS >Vvvv» >w»v> >v> w>

гтйтя

yVW ЛуС'г*-

1 - ГЛУ без U-18; 2 - ГЛУ с U-18; 3 - контроль.

2 и 3 отнесены к 1 (=100). п и достоверность различий что и в табл, 7. А и Б - погибшие клетки.

те за,

* Количественные данные приведены в публикациях 49, 57, 59, 60.

V. ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ (1Са2+]1) ПРИ ДЕЙСТВИИ ГЛУТАМАТА И ГИПОКСИИ НА КУЛЬТИВИРУЕТЕ НЕЙРОНЫ (39, 41. 44. 45, 47. 51. 55. 56).

В опытах, связанных с регистрацией 1Са2+31 и ее изменений под действием глутамата (ГЛУ) и гипоксии, так же. как и в предшествующих экспериментах (разд. III и IV), использовались нейроны, срок культивирования которых составлял 2-3 недели. 1. Д_е_й_с_т_в_и_е__г_л_х_т_а_м_а_т_в_.

В большинстве экспериментов в нейронах, пврфузируешх 0ВБЗ-2, наблвдались фоновые осцилляции 1Са2+11, отражахшие, по-видимому, спонтанную биоэлектрическую активность этих клеток, связанных друг с другом сетью синаптических' контактов. При минимальной концентрации (20 нМ) внеклеточного кальция ЦСа2+10), достигавшейся путем исключения СаС12 при приготовлении раствора и добавления в него кальциевого хелатора ЭГТА (50 /ЛС), эти осцилляции устранялись и происходило существенное снижение (Са24^. При повышении 1Сал+10 до исходной (1,8 Ш) осцилляции и исходный уровень 1Са2+1^ восстанавливались (рис. 13).

Введение глутамата (ГЛУ, 50 иШ) в инкубационный раствор, не содержащий конов вызывало почти трехкратное быстрое

повышение [Са2+1^, которая не снижалась после прекращения воздействия ГЛУ. Высокий уровень 1Са2+)^ в постглутаматный период лишь очень медленно и слабо снижался в растворе с минимальной 1Са2+1. При последующей перфузии нейронов СБйЗ-1 и удалении из него ионов Ыа+ (путем эквивалентной замены Ка+ на Ы+. не способный обмениваться на Са^) к , тормозящего обмен внутриклеточного На2+ на Са2*, повышенная (Са2+1, заметно не изменялась.

•Э.О 1

Снижения ЕСа" не происходило также под воздействием 2 мЬ5 четвертичного производного лидокаана ОД 314 (рас. 14).обладаадвго спос-оОаостьв блокировать при его наружном применении нек.оторыа рецепторуправляекые каналы, например, каналы холинорецвптора №еЬег, Б1е1пЬасЬ, 1978) и каналы, управляемые рецептором к ШМ (Кошэдев, Ход ров, 1992) при их переходе из закрытого состояния в открытое. Повышение в постг^таматнон периода осмотической силы раствора добавлением в него 250 № сахарозы (см. рис. 14) кли использование гипертонического раствора не уменьшало ССа2+1,.

Заметное снижение . повиданной после глутаматного

воздействия,достигалось только применением атилизопропиланилорида (ЮРА), известного как сильный ингабитор Ыа+/¡Г1"-обмена (Бега-

Рис, 13. Стойкое повышение ССа2+)1 в культивируемом нейроне гшшокамоа после действия 50 мЦ глутамата (см.публикации 45. 51).

'ноЧш

0.1

ОН

* {

1000 3000

Типа.1

эсоо

N -контрольный пврфузионннй раствор (СВББ-2): 2 -введение в СВЗБ^г 50 мИ ГЛУ: 3 -замена СВЗЛ-г на раствор, не содержащий ?На а К*г : 4 -удаление из контрольного пзрфузионного раствора Сай .

Ряс. 14.Устойчивость Са2+-шито в ностглутаматный период к действию ОХ-314 (1) а к повышении осмолярности наружного раствора (3). Остальные обозначения те та, что и ва рис. 13 (см. публикации 45, 51).

1.70

1.20-

0.М-

• ол

У»

- I I—

1000 1300

Т1о»,«

0.15

а!

atertcan, 1985). При действии ГЛУ на фоне НРА (20 «¿M, рис. 15) сразу после быстрого начального повышения 1Са2+]^ происходаю ее □осененное уменьшение. После переклгнения перфузии на CBSS-2 lCa?'f 1, начинала возрастать. При повторном введении SIPA, уже в постглутамвтном периоде, повышение ICa быстро сменялось ее паданием.

2 • С_1_п_о_к_с_и_^е_с_к_о_е._в_о_э_д_е_а_с_т_в_и_е_.

В серии опытов, один из которых представлен на рис. 16, замена контрольного раствора (CBSS-1) на раствор такого же состава, насыщенный нарбогеном, не вызывала существенных изменений (Ca¿+1Не происходило изменения (Са2+)^ и после переключения протока на раствор с тем же ионным составом, не содержала глшозу я дооксигепарованный бескислородной газовой смесью (5¡S COg+^S N2). Однако устранение из этого раствора ионов Bg2* вызывало быстрый в стойкий подъем [Са2+]^. причем при последующем переводе культуры в CBSS-2, насыщенный карСогеноы, повышенный уровень tCalj изменялся мало.

В другой серии опытов при удалении líg2^ из деоксигенированного бэзглпкозтого раствора, содержащего 1 Ш Ь,Ь-2-аышю-5-фосфоновалерата (АФВ) - конкурентного антагониста рецептора к SUDA, увеличения (Ca2vJj на происходило (рис. 17). Последующее удаление АФВ приводило к постепенному, но хорошо выраженному повышению ICal^, которое сохранялось в при переключении протока на контрольный оксигенированный раствор. Сладуот отметить, что описанные выше динамику 1Са"+и аффекты

и АФВ можно было наблюдать при последовательном использовании в эксперименте нескольких нейронов в одной в той же культуре. Таким обрезом, гшкжсическов воздействие в отсутствие глюкозы вызывало в культивируемых нейронах гиппокампа быстрый, значительный и стойкий подъем 1Са2+)1, сравнимый с тем, который наблюдался нами при добавлении в инкубационный раствор 50 »Ы глутамата.

№0. 15.Эффект двукратного применения 20 рЫ КГРА во время действия глутамата и в постглутаматвый период (см. публ. 47).

? -л

1 -50 ^М ГЛУ и 20 & 81?А; N -контрольный СВБЗ-2; 2 -20 рМ К1РА.

Рис,_1§. Влияние удаления аз деоксигешфованного безглякоз-ного раствора на динамику IСа2+1^ в нейроне гиппокампа, 20 дней 1п уПго (см. публикации 44).

1.00

й75

! I .А

1ССО

№ \ф.

ч í

2000

5000

СтрелкашЕ указаны моменты начала замени растворов, последовательно: 1 -контрольного (СВБЗ-1) на тот «э раствор, насыщенный карбогеном; 2 -на беэглюкозный раствор, насыщенный гипоксической газовой смесью; 3 -на такой же раствор, но не содержавши ионов Нет ! 4 -на контрольный растэор. насыщенный карбогеном.

Тимца

Рис. 17. Влияние АФВ (1 iril) на динамику CCa2+]j в нейрона гишю-кампа (19 даей In vitro) при гипоксии ж глшозной депри-вациж (см. публикация 44).

Wш

Стрелками указаны моменты начала замены растворов, последовательно: 1 -контрольного (СВ&3-1) на тот *е раствор, насыщенный кербогеноы; 2 -на безглюкозный безмагниевый раствор, насыщенный гипоксичвской газовой смесь» к содержащий 1 ш АФВ; 3 -на такой же раствор, во не содержащий АФВ.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОДУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

I. ЗАКОНОМЕРНОСТИ МОРООФУНКЦИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ КУЛЬТИВИРУБШХ

НЕЙРОНОВ.

Длительно пэрекиващаа оргавотишческш? и диссоциированные культуры различных структур головного мозга, использованные в данной работе, характеризовалась высоким уровнем морфофункцио-налыюго развития.

Эксгыантаты__гиппокамто новорожденных »мшей развивались 1л

vitro в структуру, обладающую морфологическими и ^шзиологичесюиз свойствами, ьо многом сходными со свойствами гиппокамоа In situ. На 2-й неделе культивирования в эксплантатах, импрогнировашшх серебром, выявлялись cacTovej волокон, соответствующие перфорантному пути и некоторым другим ассоциативным системам межнойронных связей гишокампа. Элэктрошю-мшфоскопическое исследование показало величие большого числа зрелых и развивахщихся синапсов в культурах на &-й - 7-3 день посла

- а -

эксплантации. Данные по сияаптогенезу в гиппокампа In 3ltu tCraln et al., 1973; Prlcke, Cowan, 19771 позволяют считпть, что подавляпцее большинство этих сннаптических контактов образуется de novo.

Отмеченная нами в указанный период интенсификация синаптоге-неза, а такжо увеличение количества спонтвнно активных нейронов и появление вызванных реакций позволяют прийти к заключению, что конец 1-й недели культивирования является периодом наиболее активного развития синапсов. Обратимое подавление спонтанной активности повышением наружной концентрации ионов у всех

зарегистрированных нейронов указывает на то, что она является результатом их синаптической активации, а не эндогенной генэрации импульсов. В свою очередь, это дает основание рассматривать увеличение числа активных нейронов в ходе культивирования как результат интенсивного синаптогенеза и усложнения синаптичо-ского взаимодействия между нейронами, а не как следствие иных процессов, приводнгда к появлению спонтанных разрядов.

Формирование в эксплантатах пучков волокон, соответетнуюгцих перфорантному пути и мкистым волокнам интактного гиппокампа, а появление коротколатентных, по-видимому, моносинаптических, реакций нейронов ари активации этих путей свидетельствуют о продолкавщамся In vitro процесса образования и созревания окончаний афферентных волокон от энторявальной коры и аксонов зернистых клеток зубчатой фасции.

Приведенный вдгае анализ полученных результатов позволяет заключить, что в эксплантатах гиппокампа э результате диффоренцировки нлеточннх структур, направленного роста нервных волокон а синаптогенеза формируется органотипическая система ассоциативных функциональных межнейронных связей, состоящая из ряда моносикаптаческих звет.ев (Fhc. 18).

Кроме того, нейроны культивируемого гиппокампв формировали функциональные сичалткческие связи на ' только внутри этой структуры, но и устанавливали их в сочетанных культурах со специфической миаепью зфферэнтной иннервации (мвмаллярныо тела) и источником афферентэции (голубое пятео).

Таким образом, результата исследования процессов развития эксплантатов гиппокампа указывают на высокую степень их структурной и функциональной организации и позволяют предположить, что эти процессы являются в значительной степени следствием реализации генотической программы и, по крайней шрв. на ранних

Рис. 18. Оргвнотшическив системы нервных волокон в гишюкамш после 2-х недель культивирования. Зарисовка с препаратов, импрегни-рованных серебром (см. публикации. 3. 11 в 12).

А - внторинальная область; Б -аммонов рог; В - зубчатая фасция.

1а - латеральный перфорантный путь; 16 - медиальный перфорантный путь; 2 - зфференты от гип-покампа к энторинальной коре; 3 - альвеус; 4 - мшистые волокна; 5 - фмбрия; а - зернистый слой зубчатой фасции; б - пирамидный слой шмонова рога.

стадиях оостаатадьаого онтогенеза не зависят от воздействия внешних афферентных волокон и гуморальных факторов,а определяются внутренними свойствами самих нейронов и их внутриструктурныма взаимодействиями. Благодаря атому, культивируемой неонатальный гишюкамл развивается в структуру, во многом сходную по своим морфофункцоональным свойствам с интактным гшшокампом. Кроме того, необходимо иметь в виду, что одним вз основных найромедаа-торов в синапсах аммонова роге и зубчатой фасции является глутамат (ВгашЬат ег а1.. 1990). Поэтому подученные данные позволят1 считать исследованную нами органотишческую культуру гшпюкампа адекватной моделью для изучения синаптических рецвпторных механизмов нейродеструктивных процессов, инициируемых возбуждящимд аминокислотами.

В дассоциированных__к^лът^раг клеток гяппокампа тптитпя

эмбрионов нейроны ужа на ранних стадиях 1п т1гго были способны к экспрессии ряда специфических морфологических признаков. Характерное . ее проявление - форыгрование нейронов со специфической пространственной организацией дэндритов, один из которых, превращаясь в апикальный дендрит, придает клетке пирамвдную форму, наблюдаемую в гишюкамав 1д а Пи. Следует подчеркнуть, что выделение нейронов осуществлялось нами на той стадии эмбриогенеза (18-19 суток), когда в гипаокампэ обнаруживаются первые афферонтные волокна. Поэтому можно предположить, что продшествупцее культивированию подрастание афферентов к развивающимся 1п з1ш нервным клеткам индуцирует процесс формирования двндритов и является одной из предпосылок

последующего развития In vitro, в условиях деаффэрептации, характерах для этих клеток дендритных систем. Такое предположение согласуется с данными, полученными на тканевых и клеточных культурах мозасэчка (И.В.Викторов, 1984, 1985) и свидетельствующими о пусковой роли афферентных волокон в реализации программы нейрогенеза. что приводит к формировании нейронов определенного морфологического фенотипа. Вместе с тем, развитие In vitro других, в тон числе, атиличннх для интактного гиппокампа, дондритных систем нервных клеток, сопровождающееся интенсивным неупорядоченным ростом и фасцикуляцией их нейритов, свидетельствует о возможности пластических перестроек неаропов, развивающихся в условиях культивя^хшаяия.

Дифференцировкв нейронов в клеточных культурах гиппокампа сопровождалась интенсивным формированием функциональных синапти-ческях саяззй. Ко времени стабилизации нейронной структура культур (конец 2-й неделя In vitro) на соме и дендрктах нервных клеток обнаруживалась многочисленные зрелые синаптические контакты различных типов. Даннне электрофизиологяческсго исследования зтах культур указывает1 на экспрессии постсинаптичесгап глутаматных рецепторов NMDA-тши).

При культивирозашга клеток септу;,« происходило формирование нейронов, морфологические характеристики которых, а ткав положительная окраска на ацетилхоликестэразу свидетельствуют об их холяяергической природе. В сочетаниях культурах клеток гиппокампа и соптумя развитие этих нейронов происходило и тесном взаимодействии с мишенями их иннервации - нейронами гиппокампа. Эти результата свидетельствуют о том, что а процессе развития нервных клеток свптума in vitro происходит их фэнотшшческая диффьронцпровка, приводящая к формировании холинергическях нейронов, способных, по-видимому, к специфической иннервации своих мишеней. Зкспорим8нтально9 использование сочетаниях культур гжшоквмпа и сентуиа расширяет перспективу изучения механизмов направленного влияния нейротрошых веществ ни ндэн-пфлщрованннэ нейропы определенной мвдиаторлой природы.

Полученныэ нБ.'ги данные о некагора. закономерностях дЩферевдировки in vitro нервных клеток различна! структур эмбрионального головного мозга, развиващихся в отсутствие специфических афферентных влияний и мишеней аМвраятвой иннервации, свидетельствует о том, что в этих условиях нейроны способны к экспрессии ряда характерных морфофункцаоналышх

признаков, касающихся кх структурной организации, сшаптнчвских связей, медааторной природа, рецепции нейромедиаторов.

Приведенные выше морфологические и функциональные характеристики культивируемых нейронов указывают на адекватность атого объекта исследования задачам данной работы. Использование этих культур дает возможность в хода экспериментальных воздействий и при контролируемом изменении их условий вести длительные прижизненные набладения за нейронными популяциями и отдельными нервными клетками н изменением их состояния под влиянием ВАК. Прамэквнае соответствующих нейроморфологических и биохимических методов обработки культур по окончании эксперимента позволяет дать количественную оценку достигнутого эффекта. Все это существенно расширяет круг вопросов, решаемых при изучений роцепторных и иошшх («вхвнизмов нейродеструктивных процессов.

II. ОСОБЕННОСТИ НЕИРОЦИТОТОКСЙЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЭНДОГЕННЫХ ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ И ЭКЗОГЕННЫХ АГОНИСТОВ NKDA-РЕЦЕПТОРОВ.

1 • Хин _о_л_и_н_о_в_а _я„к_и. с_л_о_т_а_.

Предшествующие эксперименты на органотшшческих культурах ювой коры и стриатума показала, что ХК In vitro так s», как и in vivo, повреждав? преимущественно шстсинагггическио отделы дивдратов, тогда как аксоны и кх пресинаптические терминала не повреждаются (т.н. "а10п-зраг1п^"-эффвкт; Whetaell, Schwarcz, 1S83). Изшнения ультраструктури тела нейрона заключались, по втши данным, только в незначительной далятацин цистерн аппарата • Гольдаи. В наших опытах в аксшта!гг8тах пашкжампа под действием ХК, оказанном ва 21-2 DIY. выраженные деструктивные изменения ааблодалиоь нй только в нвйрогашз, но 2 в соме нервных клеток. Эти данные дополняют опубликованные ранее результата, свндетелгхтвуищю о том, что гшаокама, в отличие от стриатума, более подвержен деструктивному действию ХК IScbwarcz, Koler, 1983) и что между новой корой в гнппокампом существуют различия в фармакоданакике NMDA-рецепторов (Stone, Burton, 1S83).

В нашил опытах ультраструктурные измэиения в большинстве швроЕдэнных ХК нейронов были сходным» и заключались в интенсивном набухании тела клетки, уменьшении количества органелл и почти полном исчезновении рибосом, с другой стороны, после действия ХК. наряду с поврезденными клетками, наблвдались тела нейронов (прежде всего, зернистых клеток) и аостсинаптические отделы дендритов с неизмененной ультраструктурой, что может быть обусловлено различными факторами. Среда них следует назвать

отсутствие или недостаточная экспрессия рецепторов, опосредувдих цитотоксическое действие ХК, а также относительная, по сравнении с интактннм гншюкампом, девффереятированность нейронов и связанная с этим меньшая плотность сипаптическЕХ контактов In vitro, поскольку In situ даже менее высокие дозы ХК достаточны для повреждения практически всех нейронов пирамидного слоя гшшокаыпа (Poster et al., 1383).

Нейроны в Солее ранних органотипических культурах пшпокампа (10 и 14 DIV) сказались устойчивыми к действию ХК. Такая "возрастная" зависимость нейродеструктивного эффекта ХК, а тает» отмеченная выше избирательная подверженность а то,чу эффекту различных нейронных ноцуляцдй, в особенности пира,»одних нейронов шля СА1 гишюкампа [Schrarcz et al., 1384), наблюдались ранее в исследованиях in vivo и In vitro IPoeter et al., 1383; grhetsell, Scfcwarcs, 1983; Уletегоv st al.. 19871.

Результаты наши экспериментов с диссоюировзашмя культу-рамя также свидетельствуют о завксшюсти цктотсксического эффекта Ж от лрододЕятелыюстн развитая нэйропов In vitro. К 11 -í-íy blV в культурах преобладали незрелые синаптическиэ контакты, хотя ультряструктуря нейронов уже стявоЕклась близкой к дефинитивной. В аткх культурах, так тв, как к в сргоЕотшяческих, з тфотизвопо-лозноеть глубоким дегэкэратявянм процессам в телах нейроиов а шйропилв при действии ХК на 21-2 BÍV, корфояничесхн» изменения балл Bb"paseeíí очень слабо и сподялись к незначительноад наОухепию цистерн гладкого зндогглазматзческого ретакудума в гарикарагонв и дэндритах немногих нервных моток. Зта азмененая могут о грата-г ь вызвэппне дэйствзьм ХК обратамнв нарушения внутриклеточных иотабаличоскшс процэссоз, поскольку дальнейшее культавироваюю сопровождалось нормальным развитием нейронов, с актиш&ш скнаптогенезом и без каких-либо поврэздэякй их ультраструктур!.

После 20-го DIV характер емнаптачеекзх контактов в клеточных культурах оказывался близким п Н8<5ллдоэмому в гиппскямго взрослых еявотных (асскмэтричпые и, pese, ежмотричкые сянэпеи па стволах дендрите®, шшшках и сода нейронов). Морфологические изменения, внзывазлмо ХК в этих куль?ура:к (в частности» деструкция пост-еанаптических структур при отсутствии повреждений аксонов и прэ-сшшптичэскш: тергшналай), соответствовали наблпдазштаоя наш в эксплантатах и в гашокаклз in situ. (Sctrrarca et al., 1983). В то se время, отмечалась избирательная подаераениость рвйрошзв цито-токснческому действия ХК., поскольку некоторые вз них оставались

иеповреадонпыми. Резистентность этих клеток также может быть обусловлена упомянутыми выше факторами и, в первую очередь, недостаточной плотностью синаптических контактов, так как обособленные пейроны, локализованные вне глионейрональшх агрегатов и поэтов лишенные аффоронтщ« нервных волокон, под влиянием ХК не дегенерировали.

Астроглиальные клетки и олигодондроциты при действии ХК но повреждались. Ранее было показано, что естроциты обладают специфической иммунореактияностью к одному из ферментов синтеза ХК - оксигеназв 3-гидроксиантраниловой кислоты IKoler et al., 1 'ЛО). Поэтому поступление в культуры экзогенной ХК, не conpoms-диодоеся повреждением астроцнтов, но приводит, по-видишмиу. к нарушению ее метаболизма, и синтез эндогенной ХК может продолжаться, потонциируя во нейроцитотоксический эффект при добавлении извне.

Опубликованные одновременно с нйшимн данными результаты иммуноцитохимического и биохимического исследования цитотоксн-ческого действия ХК на культивируемые неокортикЕльныв нейроны Г Kim. Chol, 19871 также указали на рад особенностей инициируемого ею In vitro нейродеструктивного процесса, обнаруженных нами в клеточных культурах гинпокямна. Слодуот, однако, отметить, что деструкция нейронов, по дашшм этих авто рои, развивалась медленнее даже при более высокой концентрации ХК (1 мМ), что, возможно, связано с меньшей плотностью In vitro Ж1)А-роцвпторов на ней^юпах ноьэй коры, по сравнению с нейронами гшпокаша.

2. Сравнительный сна л из__ц и т о т о к, с я ч е-

н_й с т о_в__N_1!_D_a_;_в_8_ц_е_п_т_о_р_д_в_.

Проведенное нами комплексное исследование влияния конкурент--них и неконкурентных антагонистов ШВА-рецопторов на нвйроцато-токсичь-скоо д&Яствио ХК и NKDA обнаружило, что все они эффективно ему препятствуют, что подтверждает полученные ранее данные о важной рола р^ депторов к ШВА в деструкции нейронов под влиянием ХК IStone, CoimicK.1985). Однако сравнительный анализ результатов наших экспериментов указывает на рад различий в нейродоструктив-ных эффоктех, оказываемых ХК и другими ягонистаки NMDA-рецепторов. Так, в культурах, содержащих преимущественно незрелые синаптичвскко контакты (до 2-й недели In vitro), нейрона под действием NKDA дегенерировали, тогда как ХК не вызывала существенных изменений их ультраструктуры, и массивная догонера-

ция нервных клеток под влиянием ХК наблодалась в более поздние сроки, в культурах со зрелыми- синапсами, сопровождаясь, в отличив от NMDA, "ахоп-зраг1щ"-эффвктом. Кроме того, в сочетании культурах септума и гиппокампа цитотоксическое действие МША и другого агониста NMDA-рецепторов - ис»о то новой кислоты не зависело от медиаторной природа нейронов, тогда как при действии ХК холинергические нейроны септума оставались неповрежденными. Эти различия в нейроцитотоксичности могут быть связаны с предполагаемым существованием двух подтипов ШЭА-рецепторов, один' из которых активируется только NHDA (мозжечок, спинной мозг), а другой - и МША. и ХК (гшшокамп, стриетум, новая кора) (PerKlna, Stone, 1983: PIrench-tiullen et al., 1986; Stone, Burton, 19883. В зрелых культурах гиппокампа, na-ввдшому, имеет место экспрессия обоих подтипов рецепторов, поскольку в это время и KMDA, и ХК оказывай? нейродеструктивный эффект, предотвращаемый антагонистами NMDA-рецепторов. С другой сторонп, отсутствие .этого эффекта у ХК в более ранних культурах может свидетельствовать о том, что подтип NMDA-рецептора, специфически опосредующий цитотЬкси-ческов действие ХК, зкспрессируотся нейронам гиппокампа по мере созревания можпейрошшх сшаптических связей и реализует свои функции в составе зрелого синаптического комплекса. При этом следует принимать во внимание сформУ-ИфОЕашюе ранее рядом авторов [Stone et al., 198Т; Stone, Bui-ton, 1938] предположение о вероятном воздействии ХК на специфические аффинные уч«с«ш пресянаптических терминалов, активация которых жжет приводить к избыточному высвобождении Ез них ГЛУ ns таким образом, потешда-ровать неЯродеструктивннй процесс, инициируемый ХК. Отсутствие цитотоксического действия ХК на холинергические нейроны, возможно, объяснязтся тем, что In vitro эти клетки и (или) оканчивающиеся на них прзсиватические терминала не экснресскруют специфический для ХК подтип NMDA-рецвптора.

Сравнительный анализ ангддэструктивного эффекта антагонистов NMDA-рецепторов, а также антиконвулъсантов L-кинурошша (iilffl) z атилимидазол-4,5-дякарбоновой кислота (ИЗМ-1442) in vitro к противосудорозяого действия агих соэдаяепий In situ показал, что я цятотоксическому, а конвульсивному действии Ш)А я - ХК препятствует АФВ. Однако направленность аффектов других исследозанжх соединений в отношении ХК In vitro и in situ оказалась противоположной. 'Гак, КК, являясь нвепецифичеекш антагонитом NMDA-рецепторов, оказывала антидеструктиваый эффект -

In vitro, но не препятствовала конвульсивному действии ХК. Другой эндогенный метаболит триптофана, КИН, так хэ, как и синтетический аятиконвульсант ИЭЫ-1442, не обладая сам по себе нейроцито-токсическим действием in vitro, не предотвращал деструкцшэ культивируемых нейронов под влиянием ХК., хотя в экспериментах In altu препятствовал судорогам, вызываемым ее введением в мозг,

В одном из более ранних исследований IKoh, Choi, 1987] было обнаружено, что некоторые антиконвульсанта (фенобарбитал, диазвпам, фежггоин) не блокируют нейроцатотокс-ичоскяй аффект в культурах клеток новой коры. Использованные в наших опытах аята-конвулъсанты', оказывая противосудорожный эффект in situ, также не предотвращали цитотоксическое повреждение нейронов in vitro. Таким образом, этот афрект, по-видимому, не связан с прямой блокадой NMDА-рецепторов, а реализуется путем опосредованного влияния на нейроны, которое возможно только в целом мозге, при участия сложных систем межнейрошшх связей.

3. Г_л_у_т_а_м_а_т .

Динамика нейродеструктивного процесса, инициируемого ГЛУ (1 Ш) и развивапдегося в течение первых нескольких часов после ого введения в клеточные культуры гашюкампа в концентрации 0,5-1 mU, была в основном сходной с няблэдаемой при деЯствяи ХК и NKDA и характеризовалась острим набуханием нейронов с цоследукшдм их лизисом. Быстрый цитотоксилеский эффект высоких концентраций ГЛУ (и, по-видимому, других исследованных нами ВАК) вероятнее всего связан с массивным входом в нейроны ионов Яа+, в за пим е 01" по каналам, управляемым гдутаматными рецепторами, что вызывает нарушение осмотического равновесия и избыточное поступление в клетки воды по осмотическому градиенту (Rothnan. 108-1, 1Э851.

При меньших концентрациях ГЛУ (0,1-0,3 мУ) набухание нейронов было выражено слабое, а деструкция раздавалась медленнее. Такув замедленнум. или отсроченную, гибель нейронов (т.н. "delayed neuronal death") большинство авторов объясняют в первую очере;,, их перегрузкой ионами Са"+ [Olney et al., 1986; Choi et al., 1987; Hartley et al., 1993!, наступающей в результате того, что при избыточной стимуляции глутаматных рецепторов длительная деполяризация, связанная с поступлением Ка+ в нейрон, приводит к стойкому устранении блокада кальциевых каналов, управляемых NMDA-роцепторами, ионами Kg2*. Повышенная концентрация внутриклеточного Сал+ (ICa2+ J ^) вызывает активацию протео- и лшолитичоских ферментативных реакций, а также

гиперпродугаспз свободных радикалов, инициирупцах шрекисноо окисление липидов, с последущ8й деструкцией белков цитосквлзта и нейрональных мембран (Seubert et al.,1988; Sleajo et al.,1989; Slesjo, Katsura, 1992 К

В наших опытах селективный конкурентный антагяист ШГ)А-рецепторов, АФЗ (0,3 Ш), Локируя, так г», как и DGG, аойродеструктивное действие NMDA и ХК, на влиял на цитотокси-ческий эффект ГЛУ. В то яе время, DGG, антагонист широкого спектра действия, блокируищй рецепторы ко только к NMDA, но и к каинату (Connelly et al., 1985; ft'atklns, Olverman, \<Ж!], заметно ослаблял этот эффект. Это позволяет предположить, что з механизм нойроцнтотоксичности ГЛУ вовлекаются, хотя бы частично, кялнатвш рецепторы ГЛУ, стимуляция которых моаат приводить к возрастанию lCa2+j1, отзываемому поступлением Са через потенциало-гезавасимае каналы (Mayer, Westbrook,19871.' Тем не менее, следует подчеркнуть, что, по дзгпшм большинства зксп&ршентальннх исследований, водугцг» роли, в перегрузка юнака при

гшгерстнмудяцин нейронов глутематом, особенно в условиях энергетического дофицитз, наступавшего при гшгокски/ищемии, играв* КИВА-рецепторн INovelly et al., 1983; CHOI, 1990; Slcsjo, Katsura, 1992; Hartley et al., 1993 и др.].

Повышение fCa J^, опосредуемое глутсклткнчи роцепторпш, могет, как указывалось выше. антцяярозать гипэрпродукциго реактивных форм кислорода, приводящую к цепной реакции нарастания пс-рекисного окисления ляшадов (ПОЛ) в нейрональных мембранах и внутриклеточных органеллах. Предполагсвтся, что длительная изрегрузка нейронов ионами Са2+ интенсифицирует ряд ферментативных реакций, способствующих формированию CP, а именно: опосредуемое фосфолотазой А, шевобождешш арахадоновой кислота, послэдунщая метабо^шзация которой соярозоздаэтся активной продукцией CP; трансформация .чсантаздещдрогбнззы в ксантинокси-дазу, один из ферментативных источников активных форм кислорода; и высвобождение окиси азота (NU), активируемое КО-синтазой, с образованием пероксинитрита (в реакции N0 с супзроксвдом), усиливающим продукцию гидроксильных радакалоз.

Выяснению вклада ПОЛ в нвКродэструктивный эффект ВАК способствовало исследование ыпшгяя на него энтиоксидантов. В экспериментах на культивируема клеткга-зорявх мозжечка (Шло показано, что антноксидативннй фермент супероксвддясмутаза. ь также липофшгьпые антиоксидакты а-токоферол я U-18 препятствуют

нейроцитотоксическому действию каиновой кислоты IDyKens et al.» 1987; Андреева с соавт., 19911. В наших опытах U-18 ослаблял нейродеструктивный аффект ГЛУ в клеточных культурах гиппокампа, подвергнутых ого воздействию в течение 7-8 или 18-24 часов. Таким образом, эти данные свидетельствуют о важной роли свободно-радикальных реакций в повреждении нейронов, инициируемом ГЛУ.

III. ВКЛАД СВОБОДНОРАЩВОШШ: МЕХАНИЗМОВ В НЕЙРОДЕСТРУКТИВНЫЕ

ПРОЦЕССЫ, ИНИЦИИРУЕМЫЕ ГИПОКСИЕЙ И ОПОСРЕДУЕМЫЕ ГЛУТАМАТНЬШ РЕЦЕПТОРАМИ.

Гипотеза о том, что избыточная продукция реактивных фор,! кислорода, инициирующих порекисное окисление липвдов нейрональных мемОраа, может быть одной из причин нарушений структуры и функции головного мозга, вызываемых гипоксией/ишемией, была предложена более Ю лет назад (Demopoulos et al., 19801 и подтверздена результатами более поздних исследований IBraugiiler et al., 1989; Hall, Braughler, 1989]. Кроме того, в других работах эта гипотеза была дополнена рядом данных, позволивших предположить, что свободнорадикальноо повреждение нейронов тесно связано с усиленным высвобозденяем из пресинаптических терминалей нейро-медиаторных возбуждающих аминокислот, Ь-глутаминовой и L-acnapa-гиновой tChol, 1988; Pellegrlnl-Glaaipletro et al., 1990), и поэтому может быть обусловлено перегрузкой нейронов ионами Са~+, которые инициируют каскад укззанзшх вше ферментативных реакций, приводящих к гиперпродукцни СР.

В наших опытах .гипоксическое воздействие, оказанное на клеточные культуры гиппокампа в течение 6-6-часов. по окончзнии 16-18-часово1х> рвоксигенационного нориода приводило к гибели почти 70% нейронов, тогда как сразу после гипоксии, до реоксигенации, число погибших нейронов было незначительным. Этот количественный показатель активности нейродеструктивного процесса прямо коррелировал с нарастанием уровня ЛДГ в инкубационной.срэдэ в постгилоксический период. При добавлении липофильного антиокси-данта U-18 к гультураы, подвергнутым 6-8-часовой гипоксии. во время реоксигенации морфологический и биохимический показатели деструкции нейронов достоверно снижались. Наряду с этим, наши эксперименты обнаружили выраженное антидеструктивное действие U-18 и в том случае, если он присутствовал в культурах только во время гипоксического периода (6-8 часов), а не время реоксигенации (16-18 часов) удалялся из инкубационной среда. Защитный эффект этого соединения, способного нейтрализовать CP, дает

серьезные осйования предполагать, что они являются одной из причин деструкции нейронов, инициируемой в данном случае гипоксическим воздействием.

Принимая во внимание результаты этих опытов, а тага® предположение об активной продукции CP и преобладании их вейродеструктивного эффекта в период реоксигенации (Jesberger, Richardson, 1591; Slesjo, Kataura, 1992], мы попытались дать прямую оценку роли этого периода в гипоксичоском повреждении нейронов. В этих экспериментах показатели гибели нервных клеток, подвергнутых 5 или 7-часовой гипоксии и последующей 3-часовой реоксигенации, оказались более чем на 20S выше наблюдавшихся в культурах, на которые было оказано 8- или 10-часовое гипоксиче-ское воздействие без реоксигенации.

Таким образом, нейродеструктивные процессы развиваются более интенсивно в постгшокснческий период, чем на протяжешш равного по времени периоде гипоксии. Одной из причин этой интенсификации могэт быть гшюрпродукция CP, обусловленная возобновлением доступа кислорода к нервным клеткам. Такое заключение подтверждается и тем, что деструкции нейронов, инициированной гипоксией, эффективно препятствует воздействие лкпофильного антаоксидантя и-18, оказанное в постгипоксичэский период. Кроме того, этот антиокси-дянт, введенный в культуры на протяжении только гипокснческого периода» моает оказывать, по-видимому, пролонгированный антиде-структивннй эффект, благодаря стойкому включении в фосфолипидные чембраны и предотвращению перекисвого окисления их липидов путем нейтрализации CP, активно фор?,шрукдяхся в период рооксигзнзцви.

С другой стороны, следует принимать во внимание вероятность нейродеструктивного действия CP во время длительной (до 15 часов) гипоксии (без последущей реоксигенации), когда количество погибших нейронов в наших опытах достигало 60%. Поскольку защитный эффект антиоксздантов является весомым аргументом в пользу свободнорадикальных механизмов деструкции нейронов, более чем 4-крэтное уменьшение этого количества в присутствии U-18 мояэт отранать гипэрпродукцю» CP и (или) повреждение эндогенных систем антисксидантной эащггы во время длительного гипокснческого периода.

Ослабление нейродеструктивного эффекта под влиянием сунер-оксиддисмутазы (СОД), вводившейся в наших опытах в клеточные культуры готпокампа во время гипоксии и в постгшоксичвский период, подтверждает шЯропротекторные свойства этого природного-

цитоплазматического 8нтиокислителътаго метаялофермевта,, наблюдавшиеся в экспериментах In vivo и In vitro при цитотоксическом и гшоксическом повреждении нейронов [Liu et al., 1989; Chan et al., 1990; Klnouchl et al., 1991; Dawson et al., 19931. Несмотря на то, что прямых данных о проникновении внеклеточной СОД через цитоплазматическую мембрану пока но получено, показана возможность внутриклеточного накопления экзогенной СОД б условиях длительной деполяризации, которая происходит, по-видимому, в результате гттерстимуляции гдутаматных рецепторов при гипоксии [Saez et al., 19871. Предполагают, что защитное действие СОД связано с нейтрализацией гвдроксильных радикалов IDawson et al., 1993), генерируемых в присутствии супероксида Са2±8КТивируемой синтазой окиси азота, которая, таким образом, опосредует цктопла-зматическую гиперпродукцию этих высоко реактивных соединений [Рои et al., 1992). Следовательно, защитное действие СОД на культивируемые нейроны гшпокаша, подвергнутые гипоксии, может отражать способность цитоплазматических антиоксидантных систем препятствовать нейродеструктивным процессам, обусловленным действием анионных супэроксидных радикалов в условиях гипоксии/ реокскгенации.

Показанная многими авторами (см. обзор: Choi, 1990) способность антагонистов глутамэтных рецепторов, в особенности, рецепторов к NMDA, предупреждать деструкцию нервных клеток In vivo и in vitro при гипоксии свидетельствует о вэжпой роли этих рецепторов в медиащгл инициируемых эа нейродеструктивннх процессов. В наших опытах селективный конкурентный антагонист ШЕА-роцопторов, АФВ (0,3 мМ) T8Ksa препятствовал гипоксическому повреждению культивируемых нейронов. В культурах клеток новой коры ингибиторы ПОЛ, 21-аминостероида, оказывали защитный эффект и при действии NMDA, и при гипоксии [Monyer et al., 1990). Сходный эффект набладвлся нами в клеточпых культурах гиппокампа при использовании антиоксиданта U-18 на фоне как цятотокскч&ского (ГЛУ), тзх в —таоксичоского воздействия. Эти данные можно считать существенным аргументом в пользу предположения об активном участки глутаматных рецепторов в развитии гипоксиче.ских нейро-деструктивных процессов, обусловленных свободнорадикальныш механизмами повреждения нейронов.

Таким образом, анализ результатов данного раздела исследований свидетельствует о том, что одним из важных факторов деструкции нейронов, инициированной гипоксией и развязавшейся

наиболее интенсивно d " постгшюкснческий период. является гнперпродукцпя CP, происходящая в результате возобновления оксигенации нервных клеток. В то го чреия, выраженное защитное действие U-18 в культурах, подвергнутых длительной гипоксии (боа реокскгенации), указывает на вероятность свободнорадикального повревдэния нейронов и в отсутствие их снабжения кислородом. Кроме того, возможность включения липофильвого ентиоксиданта U-1Q в фосфолипидные мембраны, а гидрофильной СОД - в цитоплазму позволяет предположить, что их аптидеструктивный аффект отражает поврэздащее действие CP в различных морфофункциональных компарт-мантах нервной клетки.

17. ОСОБЕННОСТИ ВОЗДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМАТА И ГИПОКСИИ НА ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СВОБОДНЫХ ИОНОВ СА2+.

В предыдущих разделах данной работы неоднократно упоминалось о результатах многочисленных экспериментальных исследований, указывающих не ваануа роль повышения ICa2*!^, вызываемого кратковреданнш воздействием ГЛУ а других ВАК и длительно сохранявшегося после их удаления из инкубационной среды, в отсроченной гибели нервных клеток In vitro. До недавнего времена большинство авторов [Mane? et al., 1990; De Sraaquln et al., 1990; Khodorov et al., 1991; Ciardo, Heldoleai, 19911 полагали, что плато [Ca^Jj в постгдутаматвом периоде сохраняется г.ре где всего вследствие усиленного поступления в клетку внеклеточного Са2+ по каналам, проницаемость которых возрастает под шдулирущим влиянием протеинкиназы С, трапслоцированной из цатозоля к цэтоплазматаческой мембране.

Результаты наших опытов позволили,не отвергая, однако, этого предположения, высказать другую точку зрения на причину стойкого швишвотя [Ca2+]j, которое может быть обусловлено изменением функции На+/Са2+~обмвна. [Reeves, 1990] после воздействия ГЛУ. До этого воздействия снигонее внеклеточной кояцентрацви Са2+ UCa2+]_) изншука (20 вМ) приводило к падению [Са2+],, которая быстро нормализовалась после восстановления (Са )Q до исходного уровня (1,8 Ш). С другой стороны, блокада Ка+/Са2+ -обмена замэной внеклеточного Na+ на Ь1!" шзывала повышение [Ca^Jj, которое сразу ае устранялось возвращением клеток в раствор с исходным содержанием На+. Это свидетельствуат о нормальном функционирования сжстеми тр8Нскьабрашюго переноса аонов На+ а Са2"1". Однако ни ода из этих воздействий в постглутаматный период не вызывало зйкйтншс гпзгмнбнлЗ повшенпой

tCa2"1"^. Более того, "даже удаление из безнатриевого раствора ионов усиливающее обмен внеклеточного Са2+ на внутри-

клеточный Na+ IReeyea, '9901, не влияло на ICa2+lj-плато.

Таким образом, маловероятно, что устойчивость повышенной (Са2+]1 после глутаматного воздействия может быть связана только с усилением пассивного поступления Са2+ в нейрон или с реверсией Na+/Ca2+- обмена. Поскольку это состояние не изменялось и при блокада последнего, можно предположить, что гипврстимуляция глутаматных рецепторов подавляет систему выведения Ca2*, зависимую от внеклеточного Na4', и, следовательно, ослабляет ее вклад в регуляцию ICa l^. Это предположение согласуется с данными, указывающими на важную роль Ка+/Са2+-обдана в предохранении нервных клеток от цитотоксичоского действия ВАК IKattaon et al., 1990). Действительно, [Ca2+J1 по окончании глутаматного воздействия может вернуться к исходному уровню, когда вта система функционирует достаточно активно [Segal, 1992]. Кромь того, нейродеструктивный эффект Г'ЛУ в культурах клеток-зерен мозжечка при блокаде Ка+/Сал+-обмена производным акалорида дихлорбензамилом или удалением внеклеточного Na+ в постглутаматном периоде усиливается [Andreeva et al., 1991]. Причинами нарушения функции атой ионообменной системы может быть также вызываемое действием ГЛУ стабильное снижение внутриклеточного pH 1Пинелис с соавт., 19921 и почти двукратное падение в культивируемых клетках уровня АТФ (Богачев с соавт., 19921, необходимого для эффективной работы и Са2+-насосов, и Ыа+/Са2+-обмэшз [DlPolo, Beauge, 1988; Blauateln et al., 1991).

Учитывая имепцее достаточно оснований положенио о важной роли стойкого повышения С Ca Ц, вызывавший ГЛУ, в цнто токсическом я гипоксическом повреждении нейронов, представляется актуа-. льным поиск соединений, способных снизить уровень ICa2+Jj в постглутаматном периоде. Таким соединением оказалось использованное в наших экспериментах ente одно производное упомянутого выше аыилорида - • ^ализопропиламилорвд (BIPA), ннгибируиций другую систему трансмембранного переноса ионов - Na+/H+-oöM8H (Bergster-man et al., 1985]. В этих опытах присутствие ЮРА во время действия ГЛУ могло частично препятствовать развитию высокого Са2+-пдато вследствие способности этого ингибитора блокировать ' входящие токи по каналам, активируемым глутаматными NMDA-рецеп-торами (Воробьев с соавт., 1992]. Однако lCa2+]j, значительно возросшая после устранение EIPA и ГЛУ из инкубационного раствора,

вновь, уже в постглутаматном периоде, снижалась под действием BIPA. Аналогичный результат был получен и в культурах клеток-зерен мозжечка [Ходоров с соавт., 1992), в которых, кроме того, ВГРА в постглутаматный период оказывал умеренный антидострук-тивный аффект [Андреева с соавт,, 1992]. Поэтому естественно предположить, что снижение [Са2+]^, вызываемое в этот период блокадой Na+/H+-o6Meiia под влиянием KIPA, может быть одной из причин защитного эффекта последнего в постглутаматный пориод. Следует подчеркнуть, что этот эффект не является следствием способности EIPA блокировать каналы, управляемые NMDA-рецеп-торамн, так как блокада последних их селективным антагонистом (АФВ, 1 Ш) после глутаматного воздействия не препятствует отсроченной гибели нейронов [Андреева с соавт.. 1992]. Возможный механизм снижения ГСа2+в постглутаматный период, происходящего под влиянием EIPA, заключается в том, что его ингибирущее действие на Na+/H+-o6MeH приводит к уменьшению [Na+]^, что, в свою очередь, вызывает поступление в клетку Na+ извне и активацию системы Naf/Ca2+-o6t46Ha, ускорявшую выведение Са2+ из клетки".

Повышение tCa2+J| в культивируемых нейронах гиппокампа при гипоксическом воздействии так ке, как и при действии ГЛУ, характеризовалась быстротой, высокой амплитудой и устойчивостью. Замена дооксигенированного бэзглккозного инкубационного раствора нв коатрольный, насыщенный карбогеном, не приводила к уменьшению [Са2+]1 до исходного уровня. Возрастание [Ca2f^ под влиянием гипоксии происходило только в отсутствие Kg24, который, как известно, является неконкурентным антагонистом NMDA-рецвптора и блокирует Са2+-канал, управляемый этим рецептором. АФВ также эффективно предотвращал повышение [Са2^. Поэтому представленные данные с достаточной определенностью свидетельствуют в пользу предположения о том, что возрастание [Са^+в нейронах гиппо-кампа in vitro при гипоксии происходит вследствие усиленного выброса ГЛУ аз пресинаптических терминалей а преимущественной гиперактивации глутаматных NEDA-рецепторов. Кроме того, наблздавшееся нами при повторении эксперимента на одной и той же культуре повышение от исходного уровня [Са2+]1 в других нейронах указывает, по-видимому, на то, что эти клвтки либо не реагировали на первоначальное пшоксическое воздействие, либо способны были посте-

пенно снизить повысившуюся ранее при этом воздействии [Ca Следует отметить, что эти результаты впервые продемонстрировали динамику ССа2+]1 в одиночных культивируемы нейронах при гипоксии

и таким образом существенно дополнили имевшиеся в доступной нам литературе немногочисленные данные, полученные ранее (Goldberg, Choi, 1990) и позднее [Goldberg, Chol, 19931 в аналогичных исследованиях на культурах клеток новой кора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возраставшее вниманию к исследованиям механизмов и факторов нейроцитотоксического действия эндогенных ВАК связано прежде всего с накопленным за последние 10 лет большим количеством экспериментальных данных, свидетельствующих о важной патогенетической роли этих соединений при многих широко распространенных и тяжелых формах заболеваний центральной нервной системы (острые наруиения мозгового кровообращения, эпилепсия, хорея Гвнтингтона, болезнь Альцгеймерв) и травма головного мозге.-

Учитывая то, что глутамат является одним из основных нвВромедааторов в синапсах ЩЮ млекопитающих, и что содержание ХК во многих мозговых структурах также достаточно велико, головной мозг, по образному выражению авторов одной из работ, буквально "насыщен семенами своей будущей смерти" (Cowan et ai., 1987]. Поэтому, не подвергая сомнению значение множества других патогенетических звеньев, прямо не связанных с участием ВАК, в развитии указанных заболеваний, следует подчеркнуть, что эксперименты, направленные на моделирование In vitro нейродэструктивного эффекта природных и экзогенных агонистов глутамзтных рецепторов и поиск способов предотвращения этого эффекта, можно считать.полностью оправданными в актуальными.

Результаты исследования органоткпнческих и клеточных культур, использованных в нашей psöoTo, выявило ряд закономерностей морфофункционального развития нейронов In vitro и свидетельствуют об адекватности этого объекта поставленным' задачам. Данные, полученные в ходе решения этих задач, показали, что цитотоксическое действие хинолиновой кислоты (ХК) обнаруживается в культурах, содержащих сформированные синагггическиа контакты, тог," • как на изолированные нейроны, а тага» на более ранних стадиях культивирования, в отсутствий зрелых синапсов, она не оказывает не Ирода с трук т и ш ю го эффекта. Поэтому можно предположить, что подтип NMDA-рецептора, специфически опосредующий цитотоксическое действие ХК, функционирует в составе зрелого синапти-ческого комплекса, и уровень развития мвжнейрошшх синаптических связей является важным фактором, от которого в прямой зависимости находится степень деструкции нейронов под влиянием ХК.

С другой сторопн, конвульсивное действие ХК In altu Kose? быть по связано с постсянаптической гиперстшулядЕей атях рецепторов, поскольку один из их действенных конкурентных антагонистов эндогенной природы, кинуреповая кислота, предотврати цпстотоксичность ХК In vitro, но оказывает протквосудорозного эффекта, а некоторые ангшюнвульсанты из прешзтствуБТ деструкции культивируема нейронов под влияние« ХК.

Полученные нами результаты свидетельствую* о преобладании из Яро деструктивных процессов, ишщяироваяшх гипоксией и обусловленных свободнорадшсалышмп механизмами повреждения нейронов, в постгипоксический реокскгонационный период; В то 28 время, ве ксшючена возможность реализации этих (.этатагмов и во время длительной гипоксии без послэдущей реоксигенации.

Представленные данные указывают также па важный вклад свободных радгкалов в нэйродеструктивнее действие и глутамата, и ггпоксии, поскольку этому действии и в том, к в другом случае препятствует аптпоксиданта. Роль гипоксии как фактора, приводящего к срыву регуляторннх процессов, упраш}явдкх мэдаатсрпой функцией глутвмата, подтверждается сходством в динамике ззмепешШ tca2t"]^, особенно устойчивостью ее повышенного уровня по окончания воздействия как глутамта, так и гипоксии, а тайге тем, что возрастание этого уровня предотвращается антагошютагла Ш)А-рзцепторов глутамата. Обнаруженный нами аффзкт снзжепия [Са2"1']^ при иптибированш йа+/Н*"-обмэна в пост-глутаматный период свидетельствует в пользу предположения об участии систем трансми«бранного переноса в ее регуляшгл, нарушенной при перегрузке пейронои Са .

Последу езди эксперимента, связанные с изучением шханезмзя гипоксического повреждения нейронов, инициируемом гишрактивацтай глутаматних рецепторов, и с поиском способов предупроздания этих поврегдешй, долгпы • быть, по-виднмому, сосредоточен!! на дальнейшем исследовании влияния внтажсидантов, регуляторов конного транспорта, а такга найротррфяческав факторов н других вероятных нейропротекторов на деструктавшэ аффекта а нарушения ионного гомэостаза нервных клеток, вызываемые in vivo и in vitro воздействием ВАК и гшоксия/вшешш.

- 64 -ВЫВОДЫ

1. В органотипическш культурах гишюкампа в результата диМ»ренцкровки клеточных структур, направленного роста нервных волокон и сннаптогепеза формируется система функциональных мвжнвйронвнх связей, состоящая из ряда моносинаптических звеньев, характерных для интактного гишюкампа.

2. В процессе развития в диссоциированных культурах нервные клетки акспрессируют морфологические признаки, характерные для нейронов структуры, использованной для культивирования, формируют между собой функциональные синаптические связи и приобретают способность к рецепции возбуждапцих аминокислот (ВАК).

3. Высокий уровень норфофункцяонадьной организации нейронов в исследованных культурах позволяет считать этот объект адекватной биологической моделью для изучения синаптическах рецепторных механизмов нейродеструктивного действия ВАК.

4. В культурах гипшкамна, содержащих сформированные синаптические контакты (свыше 2-х недель 1г. vitro), не Вроде отру к-тиваое действие хинолиновой кислоты (ХК) приводит к повреждении постсинаптических структур, тогда как аксонные терижналз остаются иптактными ("nxon-aparlrig effect"). Это действие предотвращается конкурентными к неконкурентными антаговзстеми KMDA-рэцвпторов глутамата, что нодтБорздает прэдпологшпиэ об участии одно1\ аз подтяпав рецзптора к NtíDA в мэдзащш кейродеструк-теезого аффекте ХК.

5. Холилоргнчзскнв нейроны сентука. во-видиыоку, на акспрес-свруют In vitro подтип WMDA-рецептора, спещфгтескн опосредуюсь действие ХК, поскольку, в отличие от нейронов гиппокампа, онв не иодзэрзэны ее цлтотоксическому еф^кту, тогда как под влияние^ КИБй. и и5о те новой кислоты происходят их деструкция.

6. На нейроны в культурах с не сформированными сннапткческЕШ контактами (а 10-12 дней In vitro), так гв, как и на изолированные нейроны в зрелых культурах, ХК, в отличие от NUDA, не оказывает цитотоксического действия. Поэтому уровень развития межней-рояных снняптических связей является важным фактором, определящим степень экспрессии рецепторов, опосредувцах действие ХК.

7. ИсслеДованпые нами антиконвульсанты (Ь-кинуренин, ИЭМ-1442), препятствуя 1п эИи судорогам под влиянием ХК, пэ предотвращают ее деструктивное действие на культивируемые нейроны. Следовательно, противосудорожный эффект этих соединений может Сыть обусловлен не прямой блокадой Ш)А-рецопторов, а реализуется путем опосредованного влияния на нейроны, осуществляемого при участии систем межнейронных связей целого мозга.

8. Сравнительный анализ количественных показателей нейро-деструктивных процессов в культурах, подвергнутых в течение одинакового времени либо только гипоксии, либо гипоксии с последующей реоксигенацией, указывает на преобладание этих процессов в постгипоксическкй реоксигенационный период.

9. Защитное действие антноксидантов при гипоксии и последующей реоксигенации свидетельствует о том, что в нейродеструктивные процессы существенный вклад вносят свободнорадикальные механизмы повреждения нейронов. В то не время, ке исключена возможность реализации этих механизмов и в период длительной гипоксии, без последующей реоксигенации, поскольку в этих условиях ентиоксиданты также препятствуют деструкции нейронов. •

10. Защитный эффект антноксидантов при цитотоксическом воздействии глутамата указывает на важную роль активных форы кислорода в деструкции нейронов, подвергнутых этому воздействию, и, таким образом, на общность механизмов цнтотоксического и гипоксического поврездения нейронов.

11. Сходство в динамике изменений (Са2^ под влиянием глутамата и гипоксии и в действии на эту динамику антагонистов ЛММ-рецепторов, а также устойчивость повышенной 1Са I, в пост-глутаматный и постгшокснческий периоды свидетельствуют об участии глутаматных рецепторов (в частности, рецепторов к МША) в медиации нейродеструктивных процессов, инициируемых гипоксией.

12. Снижение высокого уровня 1Са2+)1, длительно сохраняющегося по окончании действия глутамата, достигается ингибированием системы трасмембракного На+/В*-обмена, что указывает на участке этой системы в регуляции [Са2*^, нарушенной в результате перегрузки нейронов ионами кальция.

- 66 -

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОТРАЖАЮЩИХ МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Л.Г.Хасгоков, И.В.Викторов. Формирование органотшических структур в пшюкампе новорожденных мышей In vitro В кн. "Функционально-структурные основы системной деятельности н механизмы пластичности мозга", вып. 3, U., 1975, стр.156-160.

2. И.Н.Шаронова, Л.Г.Хаспеков. Морфологическое и злектро-физиологическое исследование шжнейронннх связей в органо-типических эксплантатах гиппокашовой формации новорожденных мышэй. Там же, вып. 4, 1976, стр. 120-124.

3. И.В.Викторов, Л.Г.Хаспеков. Формирование клеточных структур и не «нейронных связей в органотипической культуре ткани гиппокампа новорожденных мышей. Нейрофизиология, 1976, т.8, N 4, стр. 384-390.

4. И.Н.Шаронова, Л.Г.Хаспеков, В.Г.Скребицкий, И.В.Викторов, В.С.Воробьев. Функциональная синаптология на моделях In vitro: культура нервной ткани и переживающие срезы мозга. В кн. "Структурно-функциональные механизмы корковой интеграции", Горький, 1976, стр. 57-61.

5. И.В.¡Викторов, Л.Г.Хаспеков. Моделирование In vitro различных по степени сложности межнейронных связей мозга. В ich. "Проекционные и ассоциативные свете«J мозга", М., 1977, вал. 6. стр. 38-42.

5. Л.Г.Хаспеков. Приготовление а культивирование оргаиотшшче-сккх эксплантатов гиппокампа новорожденных ьышей. Там же, стр. 138-140.

7. К.Н. Шаронова, Л.Г.Хаспеков, В.Г.Скребицква, И.В.Викторов. Формирование спонтанной и вызванной активности нейронов в органотипической культуре ткани гиппокампа. Нейрофизиология, 1977. т. 9, N 3, стр. 257-266.

8. Л.Г.Хаспеков. Формирование нервных волокон между органо-типичвскими эксплантатами гиппокампа и намиллярных тел новорожденных мышей. Билл, эксперим. биол. и мед., 1977, Т. 84. N II, стр.626-628.

9. И.Н.Шаронова, Л.Г.Хаспеков, В.С.Воробьев, В.Г.Скребицкий. Пластические свойства нейронов гиппокампа In vitro. Вестник АМН СССР, 1978, N 12, стр. 36-43.

- 6710. И.В.Викторов, • И.Н.Шаронова, Л.Г.Хаспеков. Морфофункционалыюе развитие межнейронных связей при совместной культивировании органотипических эксплантатов гшшокампа и мамиллярных тел коворовденных мышей. В сб. "XIII съезд Всес. физиол. общества им. И.П.Павлова". Алма-Ата, 1979, т. I, стр. 471.

11. И.В.Викторов, Л.Г.Хаспеков. Исследование диМеренцировки и пластических свойств новроцнтов в культуре нервной ткани. В моногр. "Современные аспекты учения о локализации и организации церебральных функций" (ред. О.С.Адрианов). М., "Медицина", 1980, стр. 146-166.

12. I.N.Sharonova, L.G.Chaspekow. Zur norphofunktlonellen Entwicklung der Hlppocampalen ?orniatlon der neuegeborener . Mause in organotypischen Gewebekulturen. <J. Hirnlorsch., 1980, B. 21, H. 6, S. 609-625.

13. А.Н.Чепкова, И.II.Шаронова, Л.Г.Хаспеков, В.Г.СкребкцкиЯ, И.В.Викторов. Исследование роли порадренэргической иннервации in vitro. В сб. "Материалы VIII Всесоюзной конференция по электрофизиологии ДОС". Ереван, 1980, стр. 426-427.

14. I.N.Sharonova, L.G.Khaspekov. Functional characteristics of hlppocampsl пеигопз In organotypic tissue culture. In: Proc. Internat. Union Physiol. Sei. (XX?III Internat. Congress), Budapest, 1980, p. 697.

15. И.Н.Шаронова. Л.Г.Хаспеков. Длительная посттетаническая потенциацая в нейронах культивируемой тканн гшшокампа. Билл, аксперим. биол. и кед., 1982, т. 93, N 6, стр. 14-16.

16. И.В.Викторов, Л.Г.Хаспеков. Применение культуры нервной ткани в биологическом моделировании. ' В моногр. "Методологические аспекта наука о мозго" (Ред. O.G.Адрианов, Г.Х.Шннгаров). U., "Медицина", 1983, стр.48-53.

17. H.H. Шаронова. Л.Г.Хаспеков, В.Г.Скребицкий, И.В.Викторов. Формирование синаптических связей норвдренергическими волокнами голубого пятна с нейронами лшпокампа я культуре ткани В кн. "Возбудимые клетка в культуре ткани", Пущяно, IS84, стр. II6-II9.

18. Л.Г.Хаспеков, И.В.Викторов. Дифференцировка нейронов и формирование межнейронных связей в клеточных культурах гиппок8мпа. В кн. "Синапсы головного мозга". М., 1985, стр. 87-91.

19. Л.Г.Хаспеков, И.В.Викторов. Морфологические характеристики нейронов гиппокампа, развивающихся в условиях клеточных культур. Бюлл. аксперим. биол. и мед., 1987, т. 103, N 6, стр. 738-741.

20. Л.Г.Хаспеков. Развитие холинергических нейронов в диссоциированных культурах септума и гиппокампа. В кн. "Развивающийся мозг". M., 1987, стр. 54-56.

21. I.V.Vlctorov, L.G.Chaspekow, E.Klda. Neurocytotoxlc ellect oí qulnollnlc acid on hlppocampal, neocortlcal and septal neiirons In cell culture. Light and electron microscopic study. In: "Abatr. VII Congress of Association ol Polish Neuropathol.". Cdansk, 1987, p. 78.

22. И.В.Викторов, Л.Г.Хаспеков. Деструктивное действие хинолино-вой кислоты на нейроны головного мо:и-а In vivo и In vitro. В сб. "Методологические, теоретические и методические аспекты

' совращенной нейроморфологии. (материалы Всес. кои£. ) M-, 1987, стр. 22-23.

23. Л.Г.Хаспеков. Питательные среды для длительного культивирования тканей и клеток развивающейся нервной системы теплокровных животшх. В моногр. "Руководство по культивированию нервной ткани: методы, техника, проблемы" (Ред. Б.Н.Веприкцев, И.В.Викторов, Б.Я.Вильнер). М.. "Наука", 1988, стр. 37-43.

24. И.В.Викторов, Л.Г.Хаспеков, Н.А.Шашкова. Культивирование тканей и клеток центральной нервной системы. Там же, стр. 141-166.

25. Л.Г.Хаспеков, И.В.Викторов, Н.А.Шашкова. Применение тканевых и клеточных культур для изучения нейротрофических факторов ЦЦС. Там же, стр. IG7-I8I.

26. Л.Г.Хаспеков. И.В.Викторов. Действие хинолияовой кислоты не нейроны в диссоциированных культурах клеток различных структур головного мозга. Бюлл. аксперим. биол. и мед., 1988. T.I06, N 7, стр. 103-106.

27. И.Н.Шаронова, Л.Г.Хаспеков, П.Д.Врежестовский. Свойства глутамат-активируемых ионных каналов в мембрана культивируемых нейронов гиппокампа. Биол. мембраны, 1988, т. 5, N 10, стр. I09I-I099.

28. B.Klda. B.HatyJa, L.Khaspekov. The infrastructure of rat hlppocampal formation In organotypic tissue culture after exposure to qulnollnlc acid. Neuropatol. Pol., 1988, т. 26, N 4, p.p. 5СГГ-520.

29. V.Llay, b.Chaspekov, p.stastny, I.VlctoroT. neurotoxicity of glutamate and Its analogues In mouse hlppocampal cell culture. In: Abstr. of the 14th Internet. Congress Blochem., Prague, 1988, p. 236.

30. I.Vlctorov, I.Khaapekov, K.Klda, M.Mossakowskl. Neurodegenerative action of qulnollnlc acid on hlppocampal neurons In situ and in dissociated cell culture. Clinical Neuropathol.,

1988, у 7, N 4, p. 219.

31. L.Khaspekov. K.Klda, I.Vlctorov, М.Иоззакозгзку. Neurotoxic effect Induced by. qulnollnlc acid in dissociated cell culture of mouse hippocampus. J. Neuroscl. Research, 1989, v. 22, N 2, p.p. 150-157.

32. Л.Г.Хаспеков, И.П.Латшн, И.В.Рыжов. И.В.Викторов. Влияние антагонистов возбуадащах аминокислот на нейродвструктивный эффект хинолиновой кислоты In vitro в сопоставлении с их антиконвульсивным действием In situ. Билл, эксперим. бнал. я мед., 1989, т. 108, N 8, стр. 190-193.

33. И.Н.Шаронова, Л.Г.Хаспеков. П.Д. Брежестовский. Модуляция активности ЮША-управляемых ' каналов глицином и глицинсодержащими пептидами. В сб. "Одиночные ионные каналы в биологических мембраны" (материалы Всес. симп.) Пущино,

1989, стр. 102.

34. I.Vlctorov, L.Chaspekor, МЛзаеу. Cholinergic neurons of septum and basal forebraln nuclei In vitro: Influence of neurotrophic factors and neurocytotoxlns. In "22nd Danube Symposium for Neurological Sciences". Innsbruck, 1989, p. 8.

35. Л.Г.Хаспеков, Э.Кяде. И.В.Викторов, М.Моссаковски. Сравнительный анализ цитотоксического действия хинолиновой кислоты и N-Menui-D-аспартата на культивируемые нейроны гишюкампа. Билл, эксперим. биол. и мод., 1990, Т.НО, N 9, стр. 246-249.

36. Л.Г.Хаспеков, И.В.Викторов, Ф. Счастный, В.Лисы. Цитоток-сическое действие эндогенных возбуадапцих аминокислот и их экзогенных аналогов на нейроны различных структур головного мозга In vitro. В кн. "Возбудишв клетки в культуре ткани", шп. 2. Пущино, 1990, стр. 50-56.

37. L.Khaspehov, F.Stastny, I.victorov, V.Llsy. Cytotoxic effect of glutamate and Its agonists on mouse hlppocampal neurons. J.Hlrnforsch., 1990, B. 31, H. 5, S. 635-643.

38. L.Khaapekov, F.Stastny, I.Vlctorov, V.Llsy. Neurocytotoxlc effects of some endogenous and exogenous excitatory amino acids in cell co-cultures of embryonal mouse Hippocampus and septum. In: "bth Intemat. Congress of Neurotoxlcology and Occupational Neurology". Prague, 1990, p. 4.

39. N.Andreeva,- A.Krm, L.Khaapekov, B.Khodorov, B.Sokolova, I.Vlctorov. In vitro and In vivo studies of neurocytotoxlc effects of excitatory amino acids. In "Symp. on Mol. Neuro-blol"., NAS (USA) and AS (USSR). Kiev, 1991, p.p. 105-107.

40. L.Khaapekov, I.Vlctorov. The significance of NUBA receptors In mediation of destructive action of qulnollnlc acid on hlppocampal neurons In vitro. In: "Constitutional Congress of Pathophysiology". Koscow, 1991, p. 26.

41. B.Khodorov, V.Plnells, D. Fajuk, N.Andreeva, L.Khaspekov, I.Vlctorov. Intracellular calcium and glutamate-Induced

delayed neurotoxicity. Ibid., p. 217-218.

42. N.Andreeva, L.Khaapekov, B.Khodorov, I.Vlctorov. Pharmacological protection against neurocytotoxlcIty of excitatory amino acid. In: "Regional Meeting of Intemat. Union of Physiological Sciences". Prague, 1991, p. 45.

43. Л.Г.Хаспеков, А.Н.Ерин, И.В.Викторов. Защита культивируем« нейронов гишюкампа при гипоксии и последующей реокисгенации антиоксидантом класса пространственно-затрудненных фенолов. Вии. эксперим. биол. И мед.. 1992, т.114, N 9, стр. 234-236.

44. Л.Г.Хаспеков, Д.А. Фат, И.В.Викторов, А.А.Лыжин, В.А.Головина, В.Г. Пинелис, Б.И.Ходоров.Динамика концентрации ионов кальция в культивируемых нейронах гиппокамиа при гипоксии и глпкозной депривации Биол. мембраны, 1992, т. 9, N 10, стр. I042-1045.

45. Б.И.Ходоров, В.Г.Пинелис, В.А.Головина, Д. А.Фак\ Г.М.Уварова, Н.А.Андреева, Л.Г.Хаспеков, И.В.Викторов. 0 природе "кальциевой перегрузга" нейрона после токсического воздействия глутамата. Там жо, стр. 1045-1049.

46. В.Г.Пинелис, Б.И.Ходоров, Д.А. Фаю. Д.Загулова, Н.А.Андреева, Т.М.Уварова, Л.Г.Хвспеков, В.А.Головина, И.В.Викторов. Стойкое кальцийзависимое снижение цитоолазматического pH в культивируемых нервных клетквх после токсического воздействия глутамата. Там же, стр. I049-I05I.

47. Б.И.Ходоров, В.Г. Пинелис, Д.А.Фаго. В.А.Головина, Л.Г.Хаспеков. Н.А.Андреева, И.В.Викторов. Ингибитор натрий-протонного обмена - этилизопропиламилоряд (BIPA) уменьшает калыщевуп перегрузку нейрона при применении в постглутаматний период. Там же, стр. I05I-I055.

48. А.В.Богачев, Л.П.Быкова, Б.И.Ходоров, H.A.Андреева, Л.Г.Хаспеков, В.Г. Пинелис, И.В.Викторов. Стойкое снижение внутриклеточного содержания АТФ в культивируемых нервных клетках мозжечка и гшгаокампа во время и посла окончания токсического воздействия глутамата. Там же. стр. 1057-1059.

49. И.В.Викторов, Л.Г.Хаспеков, Н.А.Андреева, А.Н.Ерин, A.A. Лыжин. Защитное действие антпоксидантов при гипоксическом. и пейроцитотоксическом повреждении культивируемых нервных клеток гиппокемпа и мозжечка. В сб. "Восстановительная неврология-2" (Мэздународный симпозиум). Москва, 1992, стр. 38-39.

50. Л.Г.Хаспеков, А.А.Лмжин, И.В.Викторов. Роль постгипоксиче- • ской реоксигенации в деструкции культивируемых нейронов пшпокампа. Билл, аксперим. биол. и мед., 1993, т.115, N 2, стр. 130-132.

51. B.Khodorov, V.Plnells, V.Golovlna, D. Fajuk, N.Andreeva, T.Uvarova, L.Khaspekov, I.Vlctorov. On tbe origin of a sustained Increase In cytosollc Ca2+ concentration aiter a toxic glutamate treatment of tne nerve cell culture. PEBS Letters, 1993, V. 324, N 3, 271-273.

52. И.В.Викторов. Л.Г.Хаспеков, H.А.Андреева, И.В.Барсков, Н.К. Исаев, А.Л.ЛКжин, А.М.Душга, А.Н. Ерин. Роль свободноради-кальных реакций в деструкции нейронов in vitro в In vivo при действии возбуждающих аминокислот и при гипоксии/ишемии. В со. "Организованный мозг" (Материалы научной конф.). М.,

1993, стр. 42.

53. L.G.Khaspskov, A.M.Dupln. A.A.Ijrzln, A.N.Krln, I.V.Vlctorov. Attenuation by antioxidants of hypoxic and posthypoxlc neuronal Injury In hlppocampal cell culture. In: "3d Swedish-Russian Symposium "New Research In Neurobiology", Goteborg, 1994, p. 27.

54. B.Khodorov, V.Plnella, D.PayuX. N.Vlnakaya. T.StoroghevlMi, L.Bykova, K.Araenleva, N.Isaev, N.Andreeva, L.Khaspekov, I.Vlctorov. Mechanisms ol deterlratlon of the Ionic homeostasis in cultured nerve cells after a toxic glutamate treatment In: "3rd International Symposium on Hypoxia". Berlin,

1994, p.p. 21-21a. 68.

55. L.Khaspekov, A.Duptn, A.LyzJn, A.JSrln, I.Vlctorov. The neuro protective effects of llpophyllc and hydrophyllc ant 1 oxidative substances In hlppocampal cell culture exposed to hypoxia/reoxygenatlon. Ibid., p.p. 6i-6la.

56. B.Khodorov, V.Plnells, M.Segal. D.FaJu*, t.Vlnskaya, L.Khaspekov, N.Andreeva, N.Isaev, I.Vlctorov. Na+/Ca2+ exchange, Na+-K+ pump and a delayed glutamate neurotoxicity. Pathophysiology. 1994, v. 1, Suppl., p. 106.

57. Л.Г.Хаспе'-ов, А.М.Дупин, А.А.Лыжин, А.Н.Ерин, И.В.Викторов. Защитный эффект антиоксиданта U-I8 и супероксиддасмутазы при гишжсическом повреждении культивируешх нейронов гиппокампа. Бюлл. эксперим. биол. и мед.. 1994. т. 117. N 2, стр. 222.

0. Л.Г.Хаспеков, А.А.Лыжин, И.В.Викторов. Участив свободных радикалов в нейродеструктивных процессах в период пост-гипоксической реоксигенации. В сб. "Материалы VII Всеросс. симпозиума "Эколого-физиологические проблемы адаптации". М., 1994, стр. 291.

59. Л.Г.Хаспеков, А.М.Дупин, А.А.Лыжиы, А.Н.Ерин, И.В.Викторов. Липофильный антиоксидант U-I8 и супероксвддисмутаза препятствуют деструкции культивируема нейронов гиппокампа во время гипоксии и в постгипоксический период. Бюлл. аксперим. биол. и мед.. 1995. т.119, * I, стр. 36-39.

60. L.Khaspekov, A.Dupln, A.Lyzhln. A.Erin, I.Vlctorov. Hypoxic and posthypoxlc neuronal Injury In hlppocampal cell culture: attenuation by lypophyllc antioxidant U-18 and superoxide dlsmutase. Intern. J. Neuroscl., 1995, preprint.

Ш®|я™е_сокрадения.

АСП - L-аспарагиновая кислота (вспартат).

АФВ - С,]>2-амино-5-фосфоновалерат.

АХЭ - ацетилхолинэстбраза.

ВАК - возбуждаодие аминокислоты.

ГЛУ - L-глутаминовая кислота (глутамат).

ИК - иботеновая кислота. i

ГОМ-1442 - атилимидазол-4,5-дикарбоновая кислота.

КИН - L-кинуренин.

КК - кинуреновая кислота.

ДЩ' - лактатдегидрогеназа.

ПОЛ - перекисное окисление липидов.

ПС - питательная среда.

СОД - супероксиддисмутазв.

CP - свободные радикалы.

ХК - хшолиновая (З.З-пирадиндикйрбоновая) кислота.

ЭГТА - Гзтален-бис(окси8тклэннитрил)]тетрауксусяая кислота.

CBSS - контрольный сбалансированный солевой раствор.

DGG - г -О-глутамилглицин.

ИРА - этилизопропиламилорид. —-

NMDA - N-Menm-D-acnapraT. bCue&Ji

Д.Хасшжов

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы . ..................3

Цель рвботы........................6

Основные задачи работы...................7

Научная новизна исследований ....... . .......10

Научно-практическая значимость исследований ....... 11

Апробация диссертации .............. ....11

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Приготовление культур .................. 13

Исследование культур...................14

Нейроморфологическое исследование...........14

Элоктрофизиологическое исследование ..........15

Исследование нейроцитотоксичности ВАК ..... ...15 Исследование нейродеструктивного эффекте гипоксии . . .16 Измерение внутриклеточной концентрации ионов кальция 16 Количественная оценка нейродеструктивного эффекта ВАК и гипоксии....................17

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. ДяОДеренцировка нейронов и формирование межнейронных связей In vitro.........;..........17

1. Органотипические культуры ............. 17

2. Диссоциированные культуры . ............21

II. Деструктивное действие возбуждающих аминокислот на

культивируемые нейроны ................ 27

1. Хинолиновая кислота................27

2. Глутамат и экзогенные вгонисты МША-рецепторов глутамата.....................31

3. Действие антегонистов рецепторов глутамата на нейро-деструктивный эффект ВАК ..............32

III. Деструктивное действие гипоксии на культивируемое нейроны........................33

IV. Защитное действие оатиоксадантов при гипоксическом повреждении нейронов In vitro .............37

V. Измененйе внутриклеточной концентрации ионов кальция ([Са2*]^) при действии глутамата и гипоксии на культивируемые нейроны...................42

1. Действие глутамата.................42

2. Гипоксическое воздействие...... . .•.....44

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

I. Закономерности морфофушсционального развития культивируем« нейронов....................46

II. Особенности нейроцитотоксического действия эндогенных возбуадводих аминокислот и экзогенных а го аистов Ш)А-рецепторов......................50

1. Хинолиновая кислота (ХК).............50

2. Сравнительный анализ цитотоксического эффекта ХК и экзогенных агонистов Ш)А-рецепторов........52

3. Глутамат......................54

III. Вклад свободнорадикалышх механизмов в нвйродеструкткв-ние процессы, инициируемые гипоксией я опосредуемые глутаматными рецепторами ......... ...... 56

IV. Особенности воздействия глутамата и гипоксии на изменение внутриклеточной концентрации свободных ионов Св2< .59

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................62

ВЫВОДЫ...............................64

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ. ОТРАЖАВШИХ ИАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ . . .66

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ .....................73

Информация о работе

Хаспеков, Леонид Георгиевич
доктора биологических наук
Москва, 1995
ВАК 03.00.11

Автореферат

Похожие работы