Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование ранних и отставленных последствий препарационного повреждения в срезах гиппокампа in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пахотина, Ирина Дмитриевна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ КЛЕТКИ ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

Пахотина Ирина Дмитриевна

ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ И ОТСТАВЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ ПРЕПАРАЦИОННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ В СРЕЗАХ ГИППОКАМПА IN VITRO

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, проф. Мошков Д.А. кандидат биологических наук Пашовкин Т.Н.

Пущино -1998

Список сокращений.............................................................................5

Введение.............................................................................................6

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Срезы мозга in vitro как естественная модель острых и отставленных реакций повреждения..........................................................................12

1.1.1.Срезы мозга как объект для нейробиологических исследований.............12

1.1.2. Восстановительный период...........................................................13

1.1.2.1. Краткий обзор метаболического профиля восстановительного периода .14

1.1.2.2. Электрофизиологические и морфологические характеристики восстановительного периода..............................................................15

1.1.3. Препарационное повреждение.......................................................17

1.1.4. Последствия препарационного повреждения (отставленные реакции повреждения)......................................................................................18

1.1.5. Срезы - адекватная модель острой травмы мозга..............................20

1.2. Анализ возможных подходов к блокаде последствий препарационного повреждения......................................................................................21

1.2.1. Существующие методы коррекции состояния срезов.........................21

1.2.2. Оценка принципиальной возможности коррекции некоторых ключевых стадий посттравматических процессов на модели срезов..........................23

1.2.3. Гипотермическое хранение как способ длительного поддержания жизнеспособности срезов in vitro...........................................................29

1.2.3.1. Возможность гипотермического хранения срезов мозга теплокровных животных in vitro................................................................................29

1.2.3.2. Протективное и деструктивное действие гипотермии.......................30

Глава 2. Основные методы

2.1. Экспериментальные животные и обьекты исследования.....................34

2.1.1. Срезы гиппокампа морских свинок..................................................35

2.1.2. Срезы продолговатого мозга золотой рыбки.....................................35

2.2. Инкубация in vitro препаратов и модельные условия для электрофизиологического тестирования................................................35

2.2.1. Инкубация.................................................................................35

2.2.2. Схема нанесения и исследование действия веществ...........................35

2.2.3. Моделирование условий ишемии.....................................................36

2.2.4. Исследование длительности инкубирования срезов в некарбогенизированной среде.................................................................36

2.2.5. Гипотермическое хранение...........................................................36

2.3. Электрофизиологическая регистрация..............................................38

Результаты экспериментов

Глава 3. Оценка нейропротективного потенциала ингибиторов каскадов АК и окиси азота........................................................................................42

3.1. Скорость постпрепарационного восстановления срезов гиппокампа......42

3.2. Устойчивость к гипотермии срезов гиппокампа in vitro........................46

3.3. Основные результаты и заключения.................................................48

Глава 4. Динамика постпрепарационного восстановления электрической активности ........................................................................................49

4.1. Динамика постпрепарационного восстановления................................50

4.2. Основные результаты и заключения.................................................54

Глава 5. Сохранность специфических свойств вызванной нейронной активности в срезах гиппокампа............................................................54

5.1. Размер и персистенция ответа..........................................................55

5.2. Сохранность пластических свойств...................................................56

5.2.1. Ответы на парную стимуляцию в срезах гиппокампа.........................56

5.2.2. Индукция и поддержание долговременной потенциации.....................61

5.3. Основные результаты и заключения.................................................61

Глава 6. Устойчивость срезов гиппокампа в условиях гипоксии и ишемии.............................................................................................63

6.1. Популяционная активность в условиях некарбогенизированной среды...64

6.2. Ишемия в срезах гиппокампа..........................................................68

6.3. Вариации ишемической устойчивости срезов гиппокампа....................77

6.4. Основные результаты и заключения................................................77

Глава 7. Толерантность in vitro препаратов мозга к длительной инкубации в

условиях периодической гипотермии.....................................................79

7.1. Восстановление электрической активности в срезах гиппокампа после воздействия гипотермии.......................................................................79

7.2. Длительное инкубирование срезов при периодическом хранении в

гипотермии........................................................................................80

7.3. Гипотермическая устойчивость срезов продолговатого мозга золотой рыбки................................................................................................84

7.4. Основные результаты и заключения.................................................84

Глава 8. Обсуждение результатов

8.1. Стадия приготовления in vitro препаратов как триггенрная фаза ранних и отставленных нарушений клеточного гомеостаза.....................................87

8.2. Возможность коррекции последствий препарационого повреждения......94

8.3. Ранние последствия препарационного повреждения в срезах гиппокампа........................................................................................98

8.4. Отставленные последствия препарационого повреждения..................111

8.4.1. Ишемия....................................................................................115

8.4.2. Гипотермия..............................................................................118

8.5. Адекватность критериев нейропротективности.................................122

Выводы...........................................................................................125

Список литературы...........................................................................126

Сокращения, использованные в тексте:

ПС, популяционный спайк А ПС, амплитуда ПС ЛП ПС, латентный период ПС

ВПСП, возбуждающий постсинаптический потенциал

ДПТП, долговременная посттетаническая потенциация

ПФ, парная фасилитация

АК, арахидоновая кислота

ИМ, индометацин

АС, аспирин

Гб, гемоглобин

АФВ, аминофосфовалериановая кислота,

ПЦТ, парацетамол,

ДЕКС, дексаметазон,

Ь-ИАМЕ, Ь-пкгоа^ттетеШукШег,

ЦО, циклооксигеназа

ВАК, возбуждающие аминокислоты

ФЛА2, фосфолипаза А2

НМДА, Ы-теШуЮ-аБраг^^е

МН, Маутнеровский нейрон

СЖК, свободные жирные кислоты

ПНЖК, полиненасыщенные жирные кислоты

Введение

Актуальность исследования. In vitro препараты различной степени сложности занимают ведущее место в современных нейробиологических и биофизических исследованиях. Срезы мозга млекопитающих, инкубируемые in vitro - распространенная модель фундаментальных исследований мозга и обьект для тестирования различных фармакологических веществ. Такие препараты также широко используются для изучения последствий различных стрессовых ситуаций - ишемии, гипоксии, гипотермии. Однако срезы мозга как и многие in vitro препараты других тканей, содержат клетки, испытывающие последствия острой механической травмы и полной или частичной ишемии при приготовлении, которые традиционно считаются недоступными для коррекции. Важно отметить, что стадия так называемого "стабильного" состояния препаратов фактически является выражением равновесия между процессами развития посттравматической патологии и реализацией репаративных возможностей клеток. Однако, так как ресурсы клеток in vitro, в отсутствие системных, в частности трофических, факторов, невелики, а среда инкубации для срезов содержит лишь минимально необходимые компоненты, то репаративные процессы в клетках быстро затухают, и в дальнейшем нарастают деструктивные изменения.

Известно, что срезы мозга характеризует длительный период электрического молчания сразу после приготовления, а также ограниченная жизнеспособность в дальнейшем, которая выражается как в коротком периоде поддержания электрогенеза , так и в высокой чувствительности к различным повреждающим факторам, таким как ишемия и гипоксия (Shurr, Rigor, 1992, Aitken et al., 1995). Таким образом, срезы мозга - это нервная ткань, в которой помимо адаптации к in vitro условиям, реализуются процессы острого (молчание в постпрепарационный период) и отставленного клеточного повреждения. Следовательно, эти препараты являются естественной моделью для исследования последствий препарационного, травматического и ишемического, повреждения мозга.

При этом такая модель дает возможность исключить влияние системных факторов, что позволяет более аналитично подойти к исследованиям последствий травмы и ишемии на тканевом и клеточном уровне с применением всего арсенала in vitro методов, что невозможно in vivo.

Следует отметить, что несмотря на большое количество работ, посвященных изучению различных функций мозга на модели срезов, в литературе практически отсутствуют данные, характеризующие срезы как нервную ткань в условиях развивающегося постпрепарационного повреждения.

Исследования возможности повышения стабильности срезов мозга in vitro за счет блокады ключевых стадий реакций травматического и ишемического повреждения крайне немногочисленны и результаты этих исследований не внесли принципиальных изменений в развитие такого подхода. В настоящее время не существует способов, позволяющих поддерживать функциональную активность срезов in vitro более 24 часов (Aitken et al., 1995). Не найдено также и адекватных методов коррекции последствий ишемического повреждения в срезах мозга. Поиск путей, радикально увеличивающих период стабильного функционирования срезов имеет значение 1) для оценки вклада и временной организации различных деструктивных процессов в острые стрессовые ситуации клетки и вторичные реакции повреждения, 2) для экспериментальной и клинической коррекции последствий ишемии и острой травмы мозга и реакций вторичного повреждения, 3) для оптимизации методики срезов мозга и также других тканей in vitro.

Периодическое хранение в условиях гипотермии, по-видимому является необходимым условием длительного поддержания жизнеспособности срезов in vitro для предотвращения истощения запасов ткани в результате вымывания при инкубации в обедненной среде при высокотемпературном (32С) инкубировании. Эта проблема является также одной из ключевых и для трансплантологии. Однако традиционно

приготовленные срезы мозга теплокровных животных, как известно, не восстанавливают электрическую активность уже после единичной длительной (12 часов) гипотермической экспозиции. Поэтому важным аспектом исследования представляется поиск подходов к повышению гипотермической толерантности срезов.

Общая стрессовая реакция на тканевом уровне объединяет многие клинические ситуации, такие как воспаление, ишемическое повреждение, острая травма, холодовое повреждение. Изучение неспецифических реакций клетки на стрессовые воздействия различной природы является одной из классических задач клеточной биологии (Браун, Моженок, 1987).

Основной целью диссертационной работы было исследование динамики параметров электрической активности в срезах гиппокампа, предобработанных ингибиторами общих звеньев травматического и ишемического повреждения, в условиях экспериментально-вызванных неспецифических стрессов. Задачи:

1. На основании литературных данных проанализировать возможную последовательность событий, развивающихся в ткани мозга в процессе приготовления срезов и на начальных стадиях их инкубации in vitro и выявить общие ключевые звенья травматического и ишемического повреждения

2. Исследовать влияние предобработки срезов гиппокампа ингибиторами общих звеньев травматического и ишемического повреждения на динамику постпрепарационного восстановления популяционной активности

3. Исследовать гипотермическую устойчивость предобработанных срезов, у которых скорость постпрепарационного восстановления была выше, чем в контроле

4. Исследовать сохранность некоторых специфических свойств нейронов гиппокампа (длительная персистенция ответа, возможность индукции парной фасилитации и долговременной потенциации) в предобработанных срезах

5. Исследовать особенности динамики электрической активности предобработанных срезов в условиях in vitro ишемии

6. Исследовать возможность длительного инкубирования предобработанных срезов гиппокампа в условиях некарбогенизированной среды

7. На основе полученных результатов проанализировать возможные подходы к исследованию молекулярно-клеточных механизмов протективного эффекта исследованных веществ

Научная новизна исследования.

Впервые срезы мозга in vitro использованы в качестве естественной модели повреждения нервной ткани, в которой реализуются ранние и отставленные последствия препарационной травмы\ишемии. Выявлены ключевые звенья деструктивных процессов, реализующих постпрепара-ционное повреждение. С использованием ингибиторов некоторых клеточных каскадов обоснован принцип блокады ключевого деструктивного звена (общего для травматического и ишемического повреждения) непосредственно во время нанесения повреждения при приготовлении in vitro препарата. Показано, что такая предобработка срезов гиппокампа оказывает положительное корректирующее влияние как на ранние (постпрепарационное восстановление), так и на отставленные реакции повреждения (устойчивость к ишемии, гипоксии, гипотермии). Впервые было предпринято длительное успешное инкубирование срезов гиппокампа, предобработанных гемином и гемоглобином, в некарбогенизированной среде. Исследована сохранность пластичности нейронных сетей гиппокампа в предобработанных срезах. Выявлен нейропротективный потенциал гемина.

Определены подходы к выявлению механизмов наблюдаемых протективных эффектов.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные данные вносят вклад в понимание механизмов ранних и отставленных последствий постпрепарационных процессов. Результаты работы дают возможность сравнить устойчивость срезов с определенным заблокированным звеном при воздействии последующих стрессов другой природы (ишемии, гипоксии, гипотермии) на основании характеристик электрогенеза как специфической функции ткани мозга. Принцип блокады ключевого деструктивного звена непосредственно во время нанесения механического повреждения может использоваться в дизайне многих экспериментов с другими in vitro препаратами. Так как срезы мозга являются естественной моделью острой травмы мозга, вещества, повышающие устойчивость срезов к посттравматическому шоку и гипоксии, могут иметь клиническое применение. Исследование гипотермической толерантности после обработки ингибиторами деструктивных процессов может иметь значение для экспериментального и клинического долговременного хранения тканей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предобработка срезов гиппокампа ингибиторами общих звеньев ишемического и травматического повреждения оказывает положительное корректирующее влияние как на ранние (ускорение постпрепарационного восстановления электрической активности), так и на отставленные последствия препарационного повреждения (устойчивость к ишемии, гипоксии, гипотермии).

2. Срезы гиппокампа, обработанные в период приготовления индомета-цином, гемоглобином и гемином, сохраняют основные специфические свойства, связанные с пластичностью нервных сетей поля CAI гиппокампа.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на: международном симпозиуме "Living in the cold III", Colorado, 1993, США, научной конференции ИБК РАН, 1996, 1997, конференции ISN/ASN (Boston, 1997), 8-м международном симпозиуме по нейротравме и нейрологическим заболеваниям (New Orlean, 1997), III-й международной конференции стран СНГ "Колосовские чтения-97", Санкт-Петербург, 1997, III-й городской конференции молодых ученых (Пущино, 1998), совместном семинаре группы «Экологической акустики» ИБК РАН и лаборатории "Нейронных механизмов пластических процессов" Института мозга РАМН (1998), рабочем совещании «Консервация генетических ресурсов» (Пущино, 1998), расширенном семинаре лабораторий "Системной организации нейронов", "Механизмов синаптической пластичности" и "Ультраструктуры нейрона" ИТЭБ РАН (1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов», 5-и глав «Результатов исследования», «Обсуждения результатов», «Заключения», «Выводов» и списка литературы, включающего 200 источников. Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 24 рисунка.

Благодарности:

Автор искренне благодарен всем соавторам и коллегам, с которыми сотрудничала при выполнении и обсуждении данной работы. Особую благодарность выражаю Пашовкину Т.Н., Пахотину П.И., Андрееву A.A., Жадину М.Н., Колаевой