Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности функционирования препаратов мозга гибернирующих и гомеотермных животных in vitro

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности функционирования препаратов мозга гибернирующих и гомеотермных животных in vitro"

российская академия наук институт биофизики клетки

; ' : На правах рукописи

ПАХОТИН ПАВЕЛ ИГНАТЬЕВИЧ

особенности функционирования препаратов мозга

гибернирующих и гомеотермных животных in vitro

03.00.02 - Биофизика

03.00.13 - Физиология человека и животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 1997

Работа выполнена в Институте биофизики клетки Российской академии наук, г. Пущино Московской обл.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор М.Н.Жадин

доктор биологических наук, профессор

A.Ю.Буданцев

доктор биологических наук, профессор

B.В. Раевский

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Московский Государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита состоится " ¿4 " ПОДБОЯ 1997г в I 1 час на заседании диссертационного совета Д. 200.23.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292 г. Пущино Московской области, проспект Науки, ИБК РАН

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБК РАН (г.Пущино ИБК РАН)

Автореферат разослан о ЕСГЭьБ'Р^ 1997г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность исследования. Начиная с первых работ, в которых было установлено, что инкубируемые in vitro срезы мозговой ткани взрослых теплокровных животных обладают метаболической активностью (Warburg et al, 1924, Mcllwain, 1951), сохраняют потенциал покоя (Li, Mcllwain, 1957) и синаптические ответы нейронов (Yamamoto, Mcllwain, 1966), эти препараты стали широко использоваться для решения фундаментальных и прикладных задач нейробиологии и медицины. Применимость метода для широкого спектра исследований связана с сочетанием возможностей, присущих исследованиям интактного мозга и методам культивирования нервной ткани. Однако, существенным недостатком метода является ограниченный период стабильного состояния инкубируемой in vitro ткани мозга взрослых животных (в пределах нескольких часов).

В связи с этим представляется актуальным исследование изолированных препаратов мозга взрослых гибернирующих животных, ткани которых обладают чрезвычайно высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям среды в период зимней спячки. Сохранность функций ЦНС у гибернирующих животных после глубокого охлаждения в природных условиях (до 0 ° С и иногда ниже) свидетельствует о том, что нейроны при этом должны как минимум сохранять способность к электрогенезу после согревания. Можно полагать, что инкубируемые in vitro препараты мозга зимнеспящих обладают особыми свойствами, обеспечивающими их высокую резистентность к условиям глубокой гипотермии. Однако, исследования в этом направлении почти отсутствуют за исключением работ J.M.Horowitz et al. (1986, 1989, 1993), посвященных изучению температурных порогов электрогенеза в срезах гиппокампа зимнеспящих животных.

Следует отметить, что в условиях in vivo крайне трудно детально исследовать активность мозга зимнеспящих, не внося нарушений в естественный ход гибернации. Поэтому важным направлением изучения гибернации представляется анализ нейронной активности различных

структур мозга после изоляции их из организма зимнеспящих животных в период оцепенения и бодрствования для выявления состояние-зависимых изменений.

1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы является изучение особенностей функционирования in vitro препаратов лимбических структур мозга, активно участвующих в регуляции циклов зимней спячки, для анализа механизмов нервного контроля гибернации, определения параметров функциональной устойчивости изолированной ткани мозга зимнеспящих и поиска путей повышения стабильности in vitro препаратов гомеотермов.

Основные задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ нейронной активности in vitro препаратов, изолированных из отделов мозга, активно участвующих в регуляции циклов гибернация-эутермия, трех групп животных (гибернирующих, бодрствующих сусликов и морских свинок).

2. Сопоставить результаты исследования нейронной активности in vitro с существующими данными in vivo для теоретического анализа полученного материала.

3. Провести сравнительное исследование резистентности к посттравматическому шоку и длительной инкубации in vitro при периодическом воздействии гипотермии срезов мозга трех указанных выше экспериментальных групп животных.

4. Провести поиск и исследование новых подходов к увеличению выживаемости и резистентности к гипотермии in vitro препаратов гомеотермных животных.

1.3. Научная новизна исследования: • Впервые изучены характеристики нейронной активности in vitro препаратов мозга зимнеспящих животных в различных функциональных состояниях и на основании этого дополнены существующие представления об участии структур лимбической системы мозга зимнеспящих в контроле циклов гибернация-эутермия.

• Впервые показана высокая резистентность препаратов мозга зимнеспящих сусликов к условиям длительной инкубации при периодическом воздействии глубокой гипотермии, что расширяет спектр исследовательских задач нейрофизиологии и биофизики с применением in vitro препаратов. Устойчивость ткани мозга зимнеспящих позволила разработать метод инкубирования in vitro изолированного препарата головного мозга гибернирующего суслика.

• Разработаны оригинальные критерии и методы оценки функциональной устойчивости препаратов мозга зимнеспящих и гомеотермных животных.

• Предложен и исследован новый метод, позволяющий за счет ингибирования циклооксигеназной активности на стадии приготовления резко сократить период электрического "молчания" нейронов в срезах гиппокампа гомеотермных животных (морские свинки) после травматического шока и радикально увеличить их резистентность к длительной инкубации при периодическом воздействии гипотермии.

1.4. Теоретическая и практическая значимость. Сопоставление результатов диссертационной работы, полученных в in vitro исследованиях с литературными данными позволило дополнить существующие представления об участии структур лимбической системы в регуляции циклов зимней спячки млекопитающих. Изучение динамики активности нейронов в переходные периоды сразу после приготовления срезов, действия гипотермии, и в течение длительной инкубации дало возможность получить большой обьем новых данных о резистентности ткани мозга зимнеспящих к неблагоприятным условиям, что необходимо для анализа механизмов устойчивости нервной ткани животных и человека. Способность к электрогенезу in vitro препаратов дифференцированной ткани мозга взрослых сусликов в течение нескольких суток в достаточно простой среде инкубации позволяет решать фундаментальные нейробиологические и биофизические задачи в длительных экспериментах с их применением, что невозможно в

исследованиях на срезах мозга гомеотермных лабораторных животных. В частности, в работе показано, что срезы гиппокампа суслика способны к индукции долговременной потенциации даже на 4-е, 5-е сутки после изоляции, тогда как известно, что исследование этого феномена (модель долговременной памяти нейронных сетей мозга) ограничивается несколькими часами при работе на срезах крыс или морских свинок.

Теоретическое и практическое значение имеет показанная в работе возможность существенного повышения устойчивости срезов мозга гомеотермных животных (морские свинки) при обработке их ингибиторами циклооксигеназной активности на стадии резки ткани. Значение и новизна предложенного подхода состоит в том, что до сих пор не найдено удовлетворительных способов поддержания жизнеспособности срезов гомеотермов на достаточно высоком уровне, при котором генерация нейронной активности могла бы сохраняться более 24 часов (особенно популяционных ответов). Факгг ограниченности периода стабильного функционирования срезов мозга был особо отмечен в итоговой дискуссии на симпозиуме, посвященном этим методам (США, Луисвилл, 1994). Полученные результаты имеют также теоретическую и практическую значимость в медицине для разработки методов лечения мозговых травм, нейрологических расстройств различной этиологии, инсультов и ишемических нарушений, а также для консервации органов и тканей.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Обоснование положения об участии лимбических структур мозга зимнеспящих в регуляции циклов гибернация-эутермия по результатам впервые проведенных исследований особенностей нейронной активности срезов мозга зимнеспящих и гомеотермов в сопоставлении с данными in vivo.

2. Положение о высокой функциональной устойчивости препаратов мозга зимнеспящих к травматическому шоку, гипотермии и длительной инкубации in vitro (по критериям электрогенеза) в сравнении с препаратами мозга гомеотермов.

3. Новый подход к повышению функциональной стабильности срезов гиппокампа гомеотермов (морских свинок) путем ингибирования циклооксигеназной активности на стадии приготовления. 1.6. Апробация работы и публикации. Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, представлялись на:

• семинарах Лаборатории системной организации нейронов ИБФ АН СССР и лаборатории природных гипометаболических состояний ИБК РАН

• заседаниях Пущинского отделения Физиологического общества

• рабочих совещаниях «Моделирование и методы анализа биоэлектрической активности головного мозга», 1982, 1984, г. Пущино

• Всесоюзном физиологическом съезде, 1984, г. Кишинев

• Всесоюзном симпозиуме «Нейрон in vitro», г. Пущино, 1986

• межлабораторном семинаре института ВНД и нейрофизиологии, 1986

• Всесоюзной конференции, посвященной 80-летию чл.-корр. АН и АПН СССР Л.Г.Воронина, 1988, МГУ, г.Москва

• Всесоюзном симпозиуме «Механизмы природных гипометаболических состояний», 1989, г.Пущино

• международном симпозиуме "Living in the cold III", Colorado, 1993, США

• международной конференции «Annual Neuroscience Meeting», 1993, Boston, США.

• научной конференции ИБК PAH, 1996

• международной конференции IBRO, Newcastle, 1996, Англия

• III-й международной конференции стран СНГ по функциональной нейроморфологии "Колосовские чтения-97", г.Санкт-Петербург, 1997

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 29 работ, в том числе обзор по заказу главного редактора в журнале «Progress in Neurobiology». __

Объем и структура работы. Диссертация изложена на ¿ß ^ страницах и состоит из «Введения», «Литературного обзора», «Основных методов и экспериментальных разработок», четырех глав описания результатов экспериментов, «Обсуждения результатов» и «Выводов». Работа содержит 7 таблиц и 42 рисунка. Список цитируемой литературы приводится в конце диссертации, содержит 58 отечественных и 420 иностранных источников.

Благодарности

Диссертационная работа была начата в Лаборатории системной организации нейронов (зав. Лаб. проф. О.С.Виноградова), коллектив и

руководителя которой искренне благодарю за помощь и поддержку. Особую признательность выражаю С.Г. Колаевой, которая является инициатором работ по исследованию гибернации в Институте биофизики, ее помощь была существенной и в проведении данного исследования. Искренне благодарен всем соавторам и коллегам, с которыми сотрудничал при выполнении представленной работы и прежде всего: О.С.Виноградовой, Н.А.Отмахову, Т.Н.Пашовкину, А.А.Андрееву, Д.А.Мошкову, Л.Л. Павлик, И.Д.Пахотиной, Е.П. Хижняку, О.Н.Емцу, В.Н.Воронкову, а также за обсуждение и полезные советы

A.Ю.Буданцеву, М.Н. Жадину, Т.П.Семеновой, Г.В. Шильникову и

B.А.Иванову.

Часть работы выполнена при поддержке: МНФ No RN 4000 и МНФ и правительства России No RN 4300.

2. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАЗРАБОТКИ

2.1 Экспериментальные животные. Опыты проводили с соблюдением правил Европейской конвенции по обращению с лабораторными животными. Большинство экспериментов проведены с использованием трех групп взрослых животных: 1) бодрствующих сусликов (БС) Citellus undulatus (май- июль), 2) глубоко гибернирующих сусликов (ГС) (декабрь-март), 3) морских свинок (МС).

2.2 Объекты исследования. Исследования проводили с использованием как хорошо изученных вариантов in vitro препаратов (поперечные срезы гиппокампа, фронтальные срезы сепгальной области), так и на препаратах впервые нами разработанных (сагиттальные срезы гипоталамо-таламической области, препарат изолированного головного мозга гибернирующего суслика).

Срезы гиппокампа, инкубируемые in vitro (Рис.1 А), использовались в

Рис.1. Схематическое изображение трех вариантов срезов, использованных в экспериментах. А - срез гиппокампа, Б - срез септальной области переднего мозга, включающий медиальное септальное ядро и диагональную связку Брока (МС-ДБ), В - срез, включающий мамилло-таламические структуры.

качестве основною тесгируемого объекта во всех разделах диссертационной работы. Популяционные ответы срезов гиппокампа позволяют оценивать общую выживаемость нейронов, участвующих в популяционных ответах, прослеживать динамику активности в количественном и качественном аспектах. Как правило проводили регистрацию популяционной активности, иногда спонтанной и вызванной нейронной активности при внеклеточном отведении из поля CAI срезов гиппокампа на стимуляцию коллатералей Шаффера. В ряде случаев регистрировали популяционные ответы в поле САЗ (на стимуляцию мшистых волокон) и в зубчатой фасции (на стимуляцию перфорирующего пути).

Срезы септальной области переднего мозга. Значительная часть исследований проведена на срезах мозга, включающих медиальное септальное ядро и диагональную связку Брока (МС-ДБ) (Рис.1 Б). Спонтанная активность регистрировалась из медиального и латерального септальных ядер, вызванные ответы регистрировали из медиального септального ядра на стимуляцию диагональной связки Брока. Сагиттальные мамилло- таламические срезы (Рис. 16), включающие передние ядра таламуса, мамиллярные тела и мамилло-таламический тракт, являются впервые разработанным нами препаратом, позволяющим исследовать спонтанную и вызванную нейронную активность передней группы ядер таламуса и передней части реуикулярного ядра таламуса, а также осуществлять стимуляцию мамилло-таламического тракта, одного из наиболее компактных и массивных внутримозговых путей. Препарат изолированного in vitro головного мозга гибернирующего суслика инкубировали за счет ишра-артериальной перфузии через базальную артерию с помощью стеклянной канюли. Для инкубирования препарата целого мозга суслика использовали термостатируемую камеру большого объема, позволяющую полностью погрузить в раствор изолированный мозг.

2.3. Электрофизиологнческие методы включают внеклеточную регистрацию нейронной активности и популяционных ответов с использованием электрофизиологических установок, позволяющих 8

инкубировать in vitro изолированные срезы различных структур мозга теплокровных животных в камерах погружного типа. Популяционные спайки (ПС) регистрировали из пирамидных слоев срезов гиппокампа ири стимуляции афферентных путей. Прямоугольные импульсы (0.2 мс, 0.1 Гц, 50-150 мкА) наносились через биполярные вольфрамовые стимулирующие электроды. С помощью специальной компьютерной программы вызванные потенциалы усреднялись по 10 ответам, следовавшим один за другим с интервалом в 10 сек. Амплитуда ПС измерялась от базовой линии, определяемой компьютерной программой, до максимума отрицательной волны ПС. Латентный период (ЛП) измерялся от артефакта стимула до точки максимума отрицательной волны ПС. После экспериментов строили гистограммы, нормализованные относительно этих же параметров на 90-й минуте, что позволяло сравнивать динамику восстановления активности в срезах разных групп животных. В ряде опытов проводили оценку эффективности ответа, определяемой с помощью специальной компьютерной программы, измеряющей соотношение площади популяционного ВПСП и площади поп-спайка. Для анализа активности изолированного препарата головного мозга гиберниругогцего суслика регистрировали спонтанную активность в нескольких областях мозга и вызванную активность в ядрах таламуса на стимуляцию зрительных нервов.

2.4. Инкубация in vitro препаратов осуществлялась в стандартной среде Рингера-Кребса (Отмахов, 1986). В ряде опытов для изучения блокады синаптической передачи использовали среду Рингера-Кребса с пониженным содержанием Са С12 (0.2 шМ) и повышенным содержанием MgS04 (10 шМ). Инкубацию изолированного in vitro препарата целого мозга суслика проводили в растворе Рингера-Кребса с добавлением декстрана-110.

Исследование действия веществ проводили методом их добавления в инкубационный раствор и с использованием специальной смесительной камеры, в которую одновременно подавали раствор вещества и среду инкубации. Изучение действия блокаторов циклооксигеназ проводили при добавлении вещества в камеру вибратома. Для исследования

действия веществ, выделяющихся из ткани мозга суслика, проводили сбор ликвора и суперфузата, после пропускания инкубационного раствора по замкнутому циклу.

2.5. Световая и электронная микроскопия. На различных стадиях эксперимента часть срезов фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида в течение -2 час с последующей фиксацией в 2% растворе четырехокиси осмия. Срезы обезвоживали, а затем заключали в эпон-812. Из этих блоков приготавливали 10 мкм серийные срезы, которые анализировали и фотографировали под световым микроскопом №-2Е. Для электронномикроскопического изучения срезы на различных этапах экспериментов фиксировали глутаровым альдегидом и окисью осмия. Ультратонкие срезы изготавливали по стандартной методике (Павлик и др. 1991).

Дополнительные методы. Для оценки динамики пробуждения и разогрева гибернирующих сусликов был проведен термовизионный анализ поверхностного разогрева тела животных с использованием термовизионной установки. Для хранения срезов в условиях гипотермии использовали холодильные камеры с температурой 3-5°С, а в ряде опытов охлаждали инкубационную камеру с помощью элементов Пельтье.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ НЕЙРОННОЙ АКТИВНОСТИ

3.1. Активность нейронов в срезах МС-ДБ. Полная программа исследований была выполнена на 110 МС-ДБ нейронах гибернирующих сусликов, 53 нейронах бодрствующих сусликов и 91 нейроне морских свинок в день приготовления срезов. Кроме того 40 нейронов ГС и 31 БС были исследованы на второй день после приготовления, срезы хранили по предложенному нами методу в условиях гипотермии при 4°С. Общие характеристики активности. На основе паттерна спонтанной активности и величины коэффициента вариации межспайковых интервалов (Кв) все клетки МС-ДБ были разделены на 3 типа; их распределение в трех группах животных было весьма похожим. Нейроны с регулярной односпайковой активностью доминировали во

всех трех группах (65-74% от всех зарегистрированных клеток). Гистограммы межспайковых интервалов имели гауссовское распределение с низкой дисперсией (Cv < 0.7). Второй тип был представлен нейронами с ритмическими залповыми разрядами (1826%). Их гистограммы имели типичную бимодальную форму, частота залпов варьировала в пределах 0.75 - 7.0 Гц во всех группах (средняя частота была 4.45+-0.8Гц для ГС и 4.6+-0.5Гц для БС и MC). Наименьшая группа клеток имела нерегулярные одиночные потенциалы (8-9%).

Замещение стандартной среды инкубации на среду с пониженной концентрацией Ca 2+" и высокой Mg выявило различное влияние синаптической блокады на МС-ДБ нейроны. У большинства клеток всех трех экспериментальных групп животных паттерн и уровень спонтанной активности почти не изменялся. У небольшой группы нейронов МС-ДБ спонтанная активность значимо снижалась или полностью подавлялась при смене среды. В соседних структурах: латеральном септальном ядре, хвостатом ядре, медиальной преоптической области и т. д., блокада синаптической передачи результировалась в полной депрессии спонтанной активности. Электрическая стимуляция медиального переднемозгового пучка (MI111) вызывала ответы с характеристиками близкими во всех трех экспериментальных группах. Сходство ответов во всех группах наблюдалось и при стимуляции латерального септального ядра.

Особенности нейронов МС-ДБ в срезах гибернирующих сусликов.

Несмотря на сходство характеристик спонтанной и вызванной активности нейронов МС-ДБ у всех трех экспериментальных групп, дальнейший анализ выявил существенные отличия в активности и возбудимости нейронов в срезах гибернирующих от срезов бодрствующих сусликов и морских свинок.

В Табл. 1 приведены значимые различия нейронной активности трех исследованных групп по следующим параметрам: 1) средней плотности спонтанно активных нейронов в одном проходе микроэлектрода через срез; 2) средней частоте спонтанной активности; 3) порогам начальных ответов на стимуляцию MI III; _4) по числу залповых ответов на

афферентную стимуляцию (93% нейронов ГС отвечали залпами, тогда как в срезах активных животных около 40-45 %); 5) по плотности и/или числу спайков в залпе (у ГС эти характеристики значимо выше, чем у БС и МС).

Таблица 1. . Дифференциальные характеристики нейронов срезов МС-ДБ трех экспериментальных групп (гибернирующих, активных сусликов н морских свинок)

\Эксперимевтальные

\ группы ГС БС МС

ХАРАКТЕРИСТИКИ^ | 1-й 2-й 11-й 2-й 11-й

\ тест | тест | тест | тест | гест_

Общее число тестированных

нейронов 110 40 53 31 91 1 1 1

Плотность спонтанно активных 3.25 3.10 1.62 1.49 1.58

клеток в треке (300 мкм) +0.14 +0.09 +0.12** +0.10 +0.18** 1 1 1

Средняя частота спонт. 20.54 15.10 11.53 9.44 10.05

активности (спайки в с) +1.37 +2.25 +0.95**+1.04 +10.05** 1 1 1

Пороги ответов на 148.50 117.04 225.01 248.63 231.74

стимуляцию МПП +13.11 +13.92 +25.27* +31.70 +21.31** 1111

Длительность начальной торм. 52.13 59.97 74.55 78.49 79.91

фазы при пороговой силе (мс) +4.58 +5.14+5.05**+5.86 +7.18** 1 1 1

Залповые ответы

(при интенсивности 700 мкА) 93 81 53 56 58 1 1 1

Число спайков в залпе 10.44 12.29 5.74 6.82 5.43

(при интенсивности 700 мкА) +0.54 +0.61 +0.47**+0.71 +0.53**

Значимые различия (критерий Стьюдевта) относительно ГС группы в 1-ом тесте: *Р<0.05; **Р<0.01. Различия между 1-ым и 2-ым тестами не значимы. Второй тест проводили на следующий день после хранения срезов в холодильнике при температуре 4 *С в течение 15-36 часов.

Согласно всем этим критериям уровень возбудимости нейронов МС-ДБ у гибернирующих животных вдвое выше, чем у активных животных. Нейроны структур, окружающих МС-ДБ не обнаружили повышения уровня активности или возбудимости на стимуляцию их афферентных 12

путей у ГС. Активность их нейронов состояла из низкочастотных (0.5-5 спайков в с) и нерегулярных спайков и во всех случаях была значимо ниже, чем у нейронов МС-ДБ, залповые ответы отсутствовали.

В ряде экспериментов исследовали влияние тиротропин рилизинг гормона (ТРГ, препарат фирмы Sigma) при его аппликации на срезы МС-ДБ, гиппокампа и передней группы ядер таламуса. Было установлено, что наибольшей чувствительностью к действию ТРГ обладают нейроны МС-ДБ у гибернирующих сусликов, причем наиболее яркие реакции демонстрировали клетки этой структуры у спящих сусликов во второй половине баута спячки. В срезах гиппокампа и таламуса реакции нейронов на аппликацию ТРГ практически отсутствовали.

3.2. Исследование мамилло-таламических срезов. Из четырех исследованных структур переднего таламуса спонтанная активность присутствовала у наибольшего количества клеток в антеровентральном (АВ) и ретикулярном (РЯТ) ядрах срезов БС и МС. В то же время спонтанная активность была менее выражена в срезах ГС группы. По структуре паттернов спонтанных разрядов различия между БС и МС группами отсутствовали. Различия между ядрами по паттернам разрядов были практически идентичными в группах БС и МС. В РЯТ основным типом разрядов являлись групповые высокочастотные залпы длительностью 200-600 мс (57% спонтанно активных клеток), встречались нейроны с одиночными ритмическими спайками (12% клеток) и смешанным паттерном разрядов (31%). В целом уровень спонтанной активности по параметру средней частоты был значимо выше в РЯТ по сравнению с АВ.

Наиболее важные отличия были найдены между тремя группами по параметрам вызванной активности (Рис.2). По набору вариантов ответов, латентным периодам и динамике следования за стимулом наблюдалось сходство всех трех экспериментальных групп. В то же время, по соотношению одиночных, пачечных и групповых ответов в срезах ГС выявились существенные отличия. Чаще всего в РЯТ срезов ГС встречались групповые ответы (до 67%), некоторое количество (23%) было пачечных разрядов и еще менее было одиночных (около 10%). В АВ

13

срезов ГС заметно возрастало количество пачечных ответов по сравнению с БС и МС группами (57 и 43%). Наиболее существенно было возрастание у нейронов РЯТ групповых разрядов, обнаруженных в срезах сусликов, находящихся во второй половине баута спячки в состоянии начальной фазы пробуждения (12 и 15°С - температура мозга в момент изоляции). В РЯТ этих срезов групповой тип ответов составлял более 88%, а в АВ было значимое повышение процентов пачечных разрядов (до 75% ответов).

-с и С

и <

ы о я •а

о. н X ы со

■Л О Ь4 о,

5 1 а. <

1 О

%

90 -80 I

оО _

50

40 -

30 -

:о

10 _

П"

1-ЧН ПЧК фупп

МОР. СВИНКИ

1-ЧП П'1К групп БОДР. СУСЛИКИ

Х-ЧН ПЧК фУПП

ГИБЕР. СУСЛИКИ

Рис. 2. Различия характеристик вызванной активности на стимуляцию мамишго-таламического тракта нейронов антеро-вентрального (АВ) и ретикулярного (РЯТ) ядер таламуса в сагиттальных мамилло-таламических срезах трех групп животных.

4. ВОССТАНОВЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ НЕЙРОНОВ ПОСЛЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ

4.1. Популяционные ответы в гиппокампе. Активность в срезах всех трех групп животных сразу после приготовления полностью отсутствовала как результат травматического шока. Однако по длительности депрессии и временному ходу восстановления активности обнаружились достоверные различия между группами (Рис. 3). 14

5 юо

S

1С БС

и/Ч,

мс

А

К

Г

Г

•rffV

MHII

15 30

101520 30 40 50 60 Время (мин)

• Гибернирующие суслики

0 Бодрствующие суслики

□ Морские свинки

IV.

90

2 мв!_

Юме

Рис.3. Динамика восстановления популяционных ответов в поле CAI срезов гиппокампа трех экспериментальных групп. По оси абсцисс -время в мин, по оси ординат - амплитуда популяционных ответов в процентах относительно значения амплитуды на 90-й мин после приготовления срезов.

Наиболее быстро восстанавливалась активность в срезах ГС, в которых первые низко-амплшудные ПС наблюдались уже на 10-й минуте инкубации. Характерным для срезов ГС было быстрое нарастание амплитуды к 40-50-й мин с небольшим превышением 100%, после чего они стабилизировались. ЛП популяционных ответов градуально уменьшались в период адаптации и стабилизировались в те же периоды времени. Функциональная активность срезов двух групп бодрствующих животных восстанавливалась значительно медленнее: низко-амплитудные ПС появлялись только после 20-30 мин и стабилизация их параметров заканчивалась после 70-80-й мин (Рис. 3). В то же время восстановление ПС у бодрствующих сусликов происходило достоверно более быстро, чем у морских свинок (различия значимы при Р< 0.001).

4.2. Спонтанная нейронная активность в срезах МС-ДБ, гиппокампа и переднего таламуса. Активность отдельных нейронов в гиппокампе, медиальном ядре сешальной области и антеровентральном ядре переднего таламуса (п=20 для каждой группы) восстанавливалась несколько раньше, чем популяционные вызванные ответы в полях гиппокампа, но также выявились различия между экспериментальными группами. Наиболее быстро восстанавливали нейронную активность срезы ГС и БС . В срезах МС появление и стабилизация нейронной активности происходили значительно медленнее.

4.3. Различия структурной сохранности срезов в первые часы после приготовления: данные световой микроскопии. Сразу после резки срезы гиппокампа всех трех групп животных демонстрировали примерно одинаковую морфологическую сохранность.

Однако, в срезах гиппокампа морской свинки уже через три часа после инкубации были видны нарушения в структуре нейронов и дендритов. Размеры клеточных тел увеличены вследствие набухания, ядра гипертрофированы. Хотя на этой стадии были хорошо различимы дендриты и места их бифуркации, признаки их деструктивных изменений наглядно проявлялись в размытости очертаний и заметном разбухании. В то же время срезы мозга как ГС так и БС трупп были практически неотличимы от препаратов, полученных сразу после приготовления.

5. ТОЛЕРАНТНОСТЬ ПРЕПАРАТОВ МОЗГА К УСЛОВИЯМ ГИПОТЕРМИИ И ДЛИТЕЛЬНОЙ ИНКУБАЦИИ 5.1. Сравнение динамики электрической активности в срезах после гипотермии. Перемещение срезов после глубокого охлаждения в теплую среду инкубации не сопровождалось продолжительным периодом инактивации. Популяционные ответы появлялись после 2-й мин инкубации, а к пятой мин амплитуда нарастала и к 20-й -30-й мин почти достигала плато (ГС) либо составляла около 60-70% стабильного уровня (МС). Аналогичный временной ход стабилизации наблюдался для средних частот спонтанных разрядов отдельных клеток. 16

5.2. Длительное инкубирование срезов при периодическом хранении в гипотермии. Популяционные ответы в срезах гиппокампа. Периодическое воздействие в режиме 4 часа инкубации/4 часа гипотермии выявило принципиальные различия между тремя экспериментальными фуппами. В большинстве срезов гиппокампа МС происходило значительное падение амплитуды ответов в поле CAI при инкубации в таком режиме. Лишь 12% срезов го всех тестированных (п = 40) сохраняли стабильную активность в течение первых 24 часов. В дальнейшем и в этих срезах наблюдалось градуальное снижение амплитуды и практически полное исчезновение ответов к концу второго дня тестирования. На третьи сутки активность полностью отсутствовала. Иная картина наблюдалась при тестировании срезов гибернирующих и бодрствующих сусликов. При периодическом тестировании через каждые 8 часов (4часа инкубации/4часа гипотермии) на вторые сутки не было обнаружено достоверных изменений. На трех срезах ГС и 2-х срезах БС была прописана полная программа исследования в течение 7-8 суток в указанном выше режиме. В дальнейшем было проведено исследование при других режимах воздействия гипотермии.

(п=60) гс

(п=60) БС

всего (%)

too too too 100 100 100 83 38 0

100 100 k 100 83 38 0

100 100 90 40 0

• 100 100 85 40 0

too 100 80 34 0

too 90 40 0

too too 100 100 too 100 86 38 0

too 100 100 100 100 100 60 0

100 100 too 100 70 0

100 100 58 0

100 100 55 0

100 100 62 0

100 65 0

too 100 100 100 100 100 62 0

n=40)MC

too 12 0

1 2 3 4 5 6 7 8 ДНИ

1 2 3 4 5 6 7 ДНИ

О 1 2

Рис.4. Диаграмма, показывающая различия выживаемости срезов (в % от числа приготовленных срезов в каждом варианте) между тремя экспериментальными группами при различных вариантах хранения в гипотермии. День приготовления срезов обозначен цифрой «0». Точками обозначены дни тестирования для групп ГС и БС.

При всех вариантах на пятый день в группе ГС еще сохраняли активность все 100% срезов, а на 6-й день 10-15% срезов не генерировали активность, на 7-й день нейроны 5олее половины срезов не отвечали на афферентную стимуляцию и на 8-й день невозможно было обнаружить признаки ответов во всех срезах ГС. Подобная же динамика обнаружена и в срезах БС, но в отличие от ГС на 6-й день в этой группе прекращала генерировать активность почти половина срезов, а на 7-й - все тестированные срезы. Срезы гиппокампа МС уже на вторые сутки в подавляющем большинстве (88%) не генерировали активность, а на третий день ни один срез не генерировал ПС, не было и поп-ВПСП, можно было наблюдать лишь потенциалы волокон.

Ежедневное тестирование ПС в поле CAI гиппокампа показало, что в первые 4 суток существуют лишь незначительные колебания амплитуды ответов (по абсолютным значениям ПС). Достоверно (Р< 0.05) возрастала амплитуда лишь на 5-й день тестирования. В последующие дни амплитуда резко редуцировалась в тех срезах, которые еще сохраняли активность. Аналогичное явление обнаружено и для срезов БС, в которых после 5-го дня (экзальтация ответов) наступала еще более выраженная деградация ПС. На Рис.5 А приведена гистограмма, показывающая динамику амплитуды ПС, суммированную для обеих групп (ГС+БС). Следует отметить, что при всех режимах холодовой экспозиции динамика ответов и их экзальтация на 5-е сутки достоверно воспроизводилась. Однако на 6-й день наступала значительная деградация ответов также при всех вариантах действия гипотермии. Спонтанная активность срезов медиального септального ядра в срезах МС-ДБ показала, что при ежедневном режиме тестирования активность в срезах ГС сохранялась до 7-9 суток, в срезах БС до 6-7 суток, а срезы МС не сохраняли активность более чем на вторые сутки (15% срезов).

Регистрация спонтанной активности в срезах МС-ДБ выявила значимое возрастание частоты спонтанных разрядов, в отличие от гиппокампальных ответов, на 6-е сутки инкубации у сусликов в обоих экспериментальных группах (Рис.5Б). Средняя частота спонтанной активности градуально снижалась в течение первых 5-ти дней, но затем 18

возрастала на 6-ой день инкубации. На 7-й день инкубации наблюдалось резкое падение частоты спонтанных разрядов, а на 8-й и 9-й день только у половины срезов ГС можно было наблюдать редуцированную но частоте активность нейронов (в 3-4 раза ниже чем в первый день).

о 1

2 3 4 5 6 7

Дни регистрации

Рис.5. Динамика амплитуды популяционных ответов и средней частоты спонтанных разрядов в срезах мозга сусликов (суммированные данные для БС и ГС групп), при длительном хранении в условиях периодической гипотермии. А - динамика амплитуды ПС в срезах гиппокампа (п = 70) сусликов. Светлыми кружками отмечены значения амплитуды ПС при ежедневном тестировании, черными кружками отмечены значения амплитуд при тестировании после 2-х, 3-х и т.д. суток гипотермии. Значимость различий амплитуд высчитывалась относительно их среднего стабильного уровня в первый день. Б -динамика средней частоты (за 4-х мин. период регистрации) спонтанных разрядов нейронов в срезах МС-ДБ.

Спонтанная активность в срезах гиппокампа. Как уже отмечалось выше популящюнная активность в поле CAI не регистрировалась более чем в течение 7-ми суток. Спонтанная активность в этом поле также не обнаруживалась в последующие дни наблюдения. В то же время в поле САЗ спонтанные разряды отдельных клеток можно было регистрировать еще в течение 14-24 часов после исчезновения активности в поле CAI. Зубчатая фасция гиппокампа сохраняла активность максимально долго -10-12 часов после полного исчезновения активности в поле САЗ. Сохранность пластических свойств. Для проверки способности к долговременной посгтетанической потенциации (ДПП), на афферентные пути полей CAI и САЗ срезов гиппокампа в различные дни тестирования наносили высокочастотную электрическую стимуляцию (тетанус 100 Гц, в течение 1 с) при субпороговых значениях стимулов.

Было установлено, что сразу после восстановления срезов ГС и БС после травматического шока можно было вызвать ДПП. Амплитуда ПС после тетануса возрастала на 115-200 % от контрольного уровня. Это увеличение сохранялось в течение всего последующего периода тестирования (3 часа). Необходимо отметить, что способность к индукции ДПП сохранялась в течение всех 4-х первых дней инкубации, а в отдельных случаях можно было наблюдать ДПП в срезах ГС и БС групп даже на 5-6-ой день в обоих тестированных полях гиппокампа.

53 Морфологические наблюдения. Данные гистологического анализа (световая микроскопия) срезов гиппокампа показали, что есть прямая корелляция между функциональной и структурной сохранностью нейронов.

Все исследованные срезы морской свинки демонстрировали нарушения в структурах нейронов и дендритов уже через 1час после действия холода. Нейрональные тела теряли пирамидную форму, ядра гипертрофировались. Дальнейшее пребывание на холоде приводило к прогрессивному разрушению структуры ткани до такой степени, что через 1 сут после охлаждения на срезах не удавалось различить слой апикальных дендритов и они практически не прослеживались.

Разительный контраст такой деструкции нервной ткани наблюдался в срезах гиппокампа обеих групп сусликов, подвергнутых воздействию глубокой гипотермии (4°С) не только в течение 1 часа, но и 5 суток. Тела нейронов сохраняли свою форму . Их цитоплазма оставалась умеренно плотной. На ее фоне хорошо выделялись прозрачные светлые ядра, содержащие очень плотные ядрышки. Отходящие от нейронов апикальные дендриты до бифуркации формировали хорошо различимый слой str. radiatum, а после деления на более тонкие веточки - str. lacunosum moleculare. При этом не наблюдалось аномалий внутреннего строения дендритов по ходу их следования, не встречалось ни расширений, ни включений более плотного материала в строму дендроплазмы. Следует отметить, что во все изученные сроки лучшей сохранностью по сравнению с полем CAI обладали поле САЗ и зубчатая фасция.

Исследование ультраструктурных характеристик клеток поля CAI гиппокампа еще более полно показало различия в сохранности ткани морской свинки и суслика. Уже после часовой гипотермии в срезах морской свинки были выявлены деструктивные изменения органелл, цитоскелета, набухание дендритов и митохондрий. После 24 часов содержания срезов морской свинки в условиях околонулевой гипотермии можно было говорить о мацерации ткани.

Совершенно иная картина наблюдалась в срезах гиппокампа сусликов (обеих групп) после инкубации в теплой среде и последующем содержании в условиях околонулевой гипотермии (1час, 24часа). Отсутствовали следы заметного набухания дендритов, синапсов и митохондрий. Была четко выражена мембрана бутонов. В них хорошо идентифицировалась активная зона по характеру прилежания везикул в пресинаптической области и по равномерному осмиофильному уплотнению. Следует отметать сохранность цитоскелета в соматической части нейронов, дендритах, шипиках и в синаптических окончаниях, что может способствовать большей сохранности, в конечном счете, всей структурной организации ткани.

6. ПОВЫШЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ СРЕЗОВ МОРСКИХ СВИНОК.

6.1. Влияние суперфузатов и ликвора мозга сусликов. В качестве методического приема для оценки влияния выделяющихся регуляторов использовали сбор суперфузата (СС) после инкубации срезов мозга сусликов по замкнутому циклу (250-500мл). Было проведено тестирование (п=10) динамики восстановления срезов гиппокампа морских свинок сразу после приготовления в условиях инкубации по замкнутому циклу с использованием в качестве среды инкубации СС.

Результаты экспериментов показали ускорение восстановления амплитуды ПС поля СА1 гиппокампа морских свинок. Уже на 15-й минуте инкубации появились первые ответы (37 мин в контрольных срезах). Полное восстановление ответов происходило к 45-50 мин (58-60мин в контроле). Еще более существенные отличия выявились при длительной инкубации в условиях периодического хранения в глубокой гипотермии (6°С). Срезы, инкубированные в СС, оказались способными генерировать ПС на вторые сутки практически сразу после перемещения из гипотермии в стандартные условия (к 10-й мин ответы стабилизировались полностью). В то же время в контрольных срезах активность на вторые сутки отсутствовала. Экспериментальные срезы были способны генерировать активность и на третьи сутки после повторного хранения в гипотермии, хотя при этом отмечалась существенная деградация ответов.

Аналогичные эффекты наблюдались и после обработки срезов морских свинок ликвором спящих и бодрствующих сусликов в период резки (около 3-4 мин, сбор ликвора от одного суслика разводили в 200 мл стандартного раствора Рингера-Кребса).

6.2. Влияние ингибиторов циклооксигеназ на функциональную устойчивость срезов гиппокампа морских свинок. В качестве рабочей гипотезы для проведения экспериментов с ингибиторами циклооксигеназ послужило предположение, что именно в период резки срезов избыточно нарабатываются регуляторы, запускающие ряд цитотоксических событий, ограничивающих жизнеспособность срезов гомеотермных животных, но 22

не проявляющихся в срезах зимнеспящих, как можно полагать, в связи с наличием эндогенных стабилизаторов ионного гомеостаза.

А X к 140-

3 JS 1 го-

о ov то-

Ü

^ о - во-

са -

и 60-

С

ta 40-

Ч

Р s 20-

ч _

п

У 0

<Г 0

Б S 260-.

100

1 о с-о о-э ú оооо о ооО 1 I I i I i i I II I I I I I I I I 60

i I i i

20 40

тт 80

100

>=: ВРЕМЯ (мин)

после приготовления * контроль —о— предобработка индометацином —о— предобработка аспирином

Рис. 6. Динамика амплитуды и латентных периодов популяционных спайков в поле CAI после приготовления срезов гигаюкампа морских свинок в контроле и после предобработки ингибиторами циклооксигеназной активности ( индометацин или аспирин).

Динамика восстановления после приготовления срезов. В контрольных срезах гиппокампа электрическая активность полностью отсутствовала в течение 20-30 мин. вследствие шокового состояния, а затем медленно восстанавливалась к 40-50-й мин. Амплитуда популяционных спайков медленно нарастала и стабилизировалась к 4050-й мин (Рис. 6А). Латентные периоды ответов постепенно сокращались

23

и стабилизировались (Рис. 6Б).

Принципиально иная динамика восстановления ПС в поле CAI срезов гиппокампа наблюдалась после предобработки срезов ингибиторами циклооксигеназ (3-4 мин. во время резки). Уже на 2-й минуте после приготовления в срезах, подвергнутых краткой обработке ИМ, наблюдали ответ, достигающий 70% от стабильного уровня (90 мин). К 10-15 мин. амплитуда ответа достигала 100% а затем к 20-30 мин. превышала стабильный уровень на 20-25%. В дальнейшем амплитуда медленно снижалась и к 45-50 мин. приближалась к 100%. При действии аспирина динамика восстановления ПС в срезах была практически аналогична описанной для срезов обработанных ИМ. Единственным отличием было превышение амплитуды ответа в период "экзальтации" на 25-30% по сравнению с 90-й мин. тестирования. Все компоненты ответов также присутствовали уже в первых тестах.

Повышение толерантности к условиям периодической гипотермии. Перемещение срезов после глубокого охлаждения в теплую среду инкубации так же как и у срезов мозга сусликов не сопровождалось продолжительным периодом инактивации. Рис.7 демонстрирует динамику амплитуды ПС в поле CAI срезов гиппокампа, предобработанных ингибиторами циклооксигеназы после хранения в холодильнике на второй день инкубации. Популяционные ответы появлялись сразу на 2-й мин. инкубации, а к пятой мин амплитуда нарастала и к 20-й -30-й мин. почти достигала плато.

В экспериментах на срезах, не обработанных ингибиторами циклооксигеназ, подтверждены ранее установленные нами данные о том, что после хранения в условиях гипотермии (4° С) срезы гиппокампа морской свинки не сохраняют электрической активности на второй день после приготовления. В данной работе срезы хранились в условиях гипотермии при 6°С. Однако и в этих условиях в контрольных срезах отсутствовала активность уже после однократного воздействия гипотермии в ночное время.

uo

I ' I ' I 1 I ' I 1 I ' I ' 1 1 I О 10 20 30 40 50 60 70 «О 90 100 ВРЕМЯ (мин) после гипотермии

—о— предобработка индометацином —о— предобработка аспирином

Рис. 7. Динамика амплитуды и латентных периодов популяционных спайков в поле CAI срезов гиппокампа морских свинок, обработанных ингибиторами циклооксигеназной активности после воздействия гипотермии.

Срезы предобработанные ИМ, сохраняли активность в течение не менее 3 суток при периодическом воздействии гипотермии (6°С) (Рис.8). Через 24 часа и 48 часов после приготовления наблюдалась активность, соответствующая таковой в срезах в 1-й день после приготовления. Некоторое ухудшение активности выражалось в снижении амплитуды ПС на 15-30% и в увеличении на 10-30% пороговых величин стимуляции.

Через 72 часа после приготовления (4-й день тестирования) и 96 часов (5-й день тестирования) активность в срезах, обработанных ИМ,

сохранялась, но амплитуда ПС была заметно ниже, ЛП возрастали и форма ответов иногда была нестандартной. Дни регистрации:

второй третий четвертый пятый

5 мс

Рис. 8.0бразцы записей популяционных ответов в поле CAI срезов гиппокампа, предобработанных индометацином, на 2-й, 3-й, 4-й и 5-й день после приготовления в условиях периодического хранения в гипотермии.

Через 120 часов после приготовления активность в срезах отсутствовала. В срезах гиппокампа, предобработанных аспирином, при периодическом воздействии гипотермии (6°С) вызванные ПС также сохранялась в течение 3-х суток. Однако, в отличие от срезов, обработанных ИМ, деградация ответов была несколько большей и уже через 48 часов после приготовления амплитуда ПС снижалась на 50-60% а на 4-5 сутки в большинстве срезов активность отсутствовала.

Следует отметить, что добавление в раствор ингибиторов цикло-

оксигеназной активности после резки срезов не приводило к увеличению функциональной стабильности препаратов. Это позволяет предполагать, что период приготовления ткани является ключевым для протективного действия ингибиторов.

Данные световой микроскопии. Сразу после резки, как контрольные так и обработанные ингибиторами срезы гиппокампа демонстрировали морфологическую сохранность, однако уже на этой стадии клетки в контроле были более округлыми, что говорит о начавшемся набухании.

Гораздо большие различия между контрольными и обработанными срезами наблюдались через 3 часа инкубации. В контрольных срезах нейрональные тела теряли свою пирамидную форму, ориентация дендритов нарушалась. Оптическая плотность клеток и дендритов изменялась. Некоторые клетки набухали, другие подвергались некрозу. В то же время в обработанных срезах клетки и их отростки сохранялись значительно лучше, несмотря на некоторое набухание нейрональных тел. Через 24 часа после приготовления в контрольных срезах наблюдалась полная деструкция как нейрональных тел так и дендритов. Дендритный слой не выделялся. Клетки сильно набухали и теряли свою начальную форму. Наряду с этим в срезах, обработанных индометацином или аспирином , нейрональные тела, ядра, ядрышки и ориентированные дендриты хорошо различались, хотя присутствовали заметные деструктивные изменения. Подобная картина наблюдалась в этих срезах и через 48 часов после приготовления. Еще большая деструкция наблюдалась в обработанных ингибиторами срезах через 72 часа и через 96 часов.

7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

7.1. Роль септо-гиппокампальной системы в циклических процессах зимней спячки. В исследованиях ЭЭГ зимнеспящих показано, что многие лимбические структуры мозга сохраняют периодическую ЭЭГ активность даже при низких температурах мозга во время состояния оцепенения (Backman, Stanton, 1982; Chatfield, Lyman, 1954; Штарк, 1970; South et al„ 1972; Strumwasser, 1959; Walker et al., 1977). Это позволяет полагать, что септо-гиппокампальная система играет особую роль в

нервном контроле цикла гибернация-эутермия. Медиальное септальное ядро и ядро диагональной связки Брока (МС-ДБ) рассматривается многими авторами как источник гиппокампального тета-ритма в ЭЭГ (Anderson, 1979; Mitchell et al„ 1982; Nachkebya et al„ 1987; Petshe et al.„ 1962; Rawlins et al., 1979). Показано, что нейроны МС-ДБ различных лабораторных животных сохраняют высокий уровень спонтанной активности после устранения внешних афферентных путей (Vinogradova et al., 1980; Brazhnik, Vinogradova, 1986). По-крайней мере, часть МС-ДБ нейронов могут рассматриваться как эндогенные регулярные пейсмекеры (Виноградова и др. 1987).

Результаты исследований нейронной активности срезов МС-ДБ трех групп животных выявили ряд существенных отличий, связанных с гибернацией. Прежде всего достоверно показано, что нейроны МС-ДБ в срезах гибернирующих животных в отличие от БС и MC обладали повышенной возбудимостью, а также активировались при аппликации тиреотропин-рилизинг гормона (ТРГ), что не наблюдалось в других исследованных структурах.

Согласно гипотезе нервного контроля гибернации, предложенной Heller (1979) (Рис 9А), запуск процессов пробуждения во время циклов гибернации, наступает при превышении заданного значения температуры над температурой гипоталамуса. Повышение восходящего активаци-онного потока от гипоталамуса и РФ приводит, по мнению автора, к возбуждению септальных клеток и генерации тета-ритма. В результате тормозные влияния гиппокампа на РФ снижаются, что оказывает на активность последней усиливающее действие по принципу положительной обратной связи и поддерживает процесс выхода животного из спячки. С учетом полученных данных по 2-деоксиглюкозе (Kilduff et al., 1982), было высказано предположение об участии латерального септального ядра в запуске процессов пробуждения, которое, получая циркадные влияния от супрахиазматического ядра и термальную информацию от преоптической области, воздействует, в свою очередь, на мамиллярные тела и медиальную септальную область. Исходя из полученных в данной работе результатов, с учетом литературных данных, 28

можно построить следующую модель участия септальной области в контроле цикла гибернация-эутермия (Рис. 9Б).

В состоянии гибернации источник гиппокампалыюго тета-ритма -медиальная область септум, сохраняя неустойчивую, периодически возникающую нейронную активность и, возможно, синаптическое влияние на гиппокамп, тем не менее, генерации тета-ритма (и как следствие - пробуждения) не вызывает. С другой стороны, гиппокампальные афференты к септум, проецирующиеся на ее латеральную область (Raisman, 1966; Swanson, Cowan, 1979, Leranth, Frotscher, 1989), участвуют в контроле сигналов, проходящих через медиальную септум. Дискриминация в септо-гиппокампальной системе сигналов, не достаточных для того, чтобы вызвать генерацию тета-ритма, обеспечивает продолжительное поддержание состояния гибернации. Тета-ритм может возникнуть лишь при дополнительных влияниях на септо-гиппокампальную систему, например, при появлении или повышении потока афферентных сигналов экзогенной или эндогенной природы (циркадных, цирканнуальных, термальных и других сенсорных сигналов) от РФ и/или гипоталамуса. При поступлении в медиальную септум, прямо - через Ml ill и/или опосредовано - через латеральную область септум, эти сигналы оказывают модулирующее влияние на нейроны MC-ДБ, увеличивая частоту и число нейронов , с ритмической залповой активностью. Тиротропин-рилизинг гормон при этом может рассматриваться как один из медиаторов, который участвует в активации септальных нейронов, снижает порог активации этих клеток и делает их чувствительными к слабым афферентным сигналам. Вовлечение в ритмический режим активности критической популяции нейронов септум вызывает тета-ритм в гиппокампе. В период тета-генерации гиппокампальные влияния, поступающие через JIC и далее через нисходящую часть Ml 111, в свою очередь, влияют на гипоталамические терморегуляторные механизмы, что приводит к быстрому повышению температуры тела и пробуждению животного.

Согласно данной модели, МС-ДБ является важным специфическим звеном в функциональном контроле цикла гибернация-эутермия и может

29

рассматриваться как сторожевой пункт переднего мозга во время зимней спячки.

. поп thermal peripheral stimuli

Iheimal stimuli

В

Ö ритм

ритм веретен

МС-ДБ ЛС

дс

РФ ствола

МПП >

Рис. 9. Схемы взаимодействия структур мозга гибернирующего животного, участвующих в контроле циклов гибернация-эутермия. А -схема, предложенная Heller и соавт., показывающая взаимодействие структур мозга, участвующих в стадии пробуждения из спячки; Б - схема, показывающая участие сегггогиппокампальной системы в стадии пробуждения (по результатам исследований срезов мозга); В - схема вовлечения мамилло-таламической системы мозга в запуск генерализованного ритма веретен (по результатам исследований in vitro и in vivo).

7.2. Участие мамилло-таламической системы в регуляции циклов гибериации. Параллельно с температурными изменениями в различных структурах мозга при погружении в спячку и пробуждении в них происходит реорганизация активности, описанная по данным ЭЭГ (Strumwasser 1959; Kayser 1963; Johnson 1965; Штарк, 1970). Этими авторами показано, что выход из состояния оцепенения и пробуждение неизбежно характеризуются формированием, а затем и преобладанием в электрограммах (генерализация) так называемой "взрывной активности", которая одновременно может быть зарегистрирована во всех отделах головного мозга. Биопотенциалы, формирующие "веретена" этой активности, следуют правильными группировками амплитудных модуляций 60-100 мкВ и частотой 7-14 в с.

Веретенообразная активность представляет собой один из наиболее сложно организованных ритмов мозга млекопитающих. Ключевую роль в генерации этого ритма играет таламус, который по существующим представлениям, выполняет осцилляторную функцию в таламо-кортикальной системе мозга (обзоры Steriade, 1986, 1990). Веретенообразная активность в ЭЭГ, на уровне отдельных клеточных групп и нейронов, как правило обусловливается наложением двух осцилляций: 1) ритма пачек, образующих веретено (7-МГц), и 2) ритма воспроизведения самих веретенообразных эпизодов (0,1-0,3 Гц).

В хронических экспериментах на кроликах нами было показано, что при субпороговой низкочастотной стимуляции МТТ в нейронах передней группы ядер таламуса обнаружилось усиление веретенообразной активности (частота пачек в веретене 12-14 Гц, длительность веретена 0.5 -1.2с), повышалась вероятность генерации веретен, которые после снижения уровня бодрствования животного возникали в активности таламических нейронов и в кортикальной ЭЭГ. В то же время возрастание частоты стимуляции МГТ до 10-15Гц (т.е. приближение частоты стимуляции к частоте пачек внутри веретена) вызывало стабилизацию межверетенного интервала. Автокорелляционный анализ и анализ спектральной плотности нейронной активности показал, что межверетенный интервал становится строго постоянным при длительной

31

непрерывной стимуляции (10-15 мин). При этом автокореллограмма нейронной активности приобретает строго синусоидальную форму. Пачки самого веретена подстраиваются к пику медленного ритма веретенообразной активности. Таким образом было установлено, что стимуляция МТТ на фоне понижения уровня бодрствования животного способна вызывать стабилизацию ритма веретен в переднем таламусе и в проекционных зонах коры.

Возвращаясь к анализу ритмических процессов у губернаторов, следует отметить, что веретенная активность в определенной фазе погружения в спячку и особенно при пробуждении приобретает в мозге зимнеспящих характер строго стабильного ритма с постоянным периодом следования веретенообразных вспышек. В то же время необходимо учесть, что из ядер стволовой ретикулярной формации идут мощные прямые проекции в мамиллярные ядра гипоталамуса, которые проецируются через один из наиболее развитых внутримозговых пучков (МТТ) в передний таламус, а также являются местом переключения для МПП, идущего к септо-гиппокампальной системе.

Сопоставляя упомянутые выше данные с результатами КШий- и др. относительно состояние-зависимого изменения во время гибернации захвата меченой глюкозы в мамиллярных ядрах гипоталамуса, мы предполагаем, что полученные различия вызванных ответов в ядрах срезов передней области таламуса на стимуляцию МТТ у трех экспериментальных групп может являться свидетельством их участия в генерации синхронной и стабильной веретенной активности на стадиях погружения сусликов в спячку и пробуждения (Рис. 9В).

7.3. Толерантность срезов мозга зимнеспящих к повреждающим воздействиям и условиям гипотермии. По современным представлениям одним из первичных механизмов повреждающего действия гипотермии является нарушение ионного гомеостаза при охлаждении клеток гомеотермных млекопитающих. Полученные в данном исследовании результаты показывают, что срезы гиппокампа и МС-ДБ сусликов значительно быстрее, чем срезы этих же структур морских свинок восстанавливают активность после процедуры выделения 32

и резки мозговой ткани. Наряду с этим, срезы зимнеспящих сохраняли способность к электрогенезу в течение длительного времени инкубации in vitro в условиях периодического воздействия гипотермии. Одной из важных причин таких различий могут быть особенности состава клеточных мембран (Hulbert, 1993) в клетках зимнеспящих, выражающиеся, например, в повышении количества полиненасыщенных жирных кислот (Geiser, 1993). Однако, полученные данные позволяют также предполагать, что в ткани мозга сусликов вырабатываются эндогенные регуляторы, стабилизирующие ионные градиенты в условиях холодового воздействия, а также после повреждений, таких как механическая травма во время резки срезов. Синтез таких регуляторов может возрастать накануне погружения в спячку и прекращаться во время действия гипотермии. Это и может быть той существенной причиной, которая заставляет животных периодически пробуждаться на короткий срок, тратя огромные ресурсы на разогрев тканей.

Подобное предположение подтверждают наши данные о стабилизирующем действии на срезы мозга морских свинок суперфузатов и ликвора мозга зимнеспящих. Эффективность суперфузатов срезов мозга гибернирующих и бодрствующих сусликов свидетельствует о том, что синтез подобных регуляторов происходит не только в связи с периодом оцепенения животных. Это коррелирует с высокой функциональной стабильностью срезов мозга бодрствующих сусликов, устойчивых к длительной инкубации при действии гипотермии лишь несколько в меньшей степени, чем срезы сусликов в состоянии спячки. Это совпадает также с данными исследований, в которых показано повышенное содержание в тканях зимнеспящих специфических регуляторов, обнаруживающихся на протяжении всего года, а не только в периоды оцепенения (Kondo, 1991, 1993; Martin et al. 1993).

Сохранность пластических свойств нейропов. Исследование функциональной стабильности срезов гиппокампа сусликов показало, что сразу после выхода из шока и даже после 5 суток хранения в условиях околонулевой гипотермии в CAI и САЗ областях срезов гиппокампа можно вызвать долговременную потенциацию путем высокочастотной

33

стимуляции афферентных путей. Эти результаты свидетельствуют о функциональной сохранности клеточных механизмов обучения и памяти даже в условиях длительного действия гипотермии и чрезвычайного обеднения среды. Можно полагать, что на клеточном и тканевом уровне в мозге зимнеспящих действуют достаточно эффективные механизмы защиты основных систем, ответственных за пластические перестройки нейронов, прежде всего связанные с гомеосгазом кальция (Horowitz et al, 1989, 1993), которые включаются сразу после восстанавления ткани от травматического шока, вызванного резкой и способны сохраняться при последующей длительной инкубации в условиях периодического воздействия гипотермии.

7.4. Повышение функциональной устойчивости срезов гиппокампа морских свинок. Общая идеология устойчивости ионного клеточного гомеостаза к условиям гипотермии и различным неблагоприятным факторам во многом связана с представлениями о роли кальция как универсального клеточного регулятора. Этим ионом при посредстве Са 2+ -связывающих белков и многих других вторичных мессенджеров запускается и регулируется широкий спектр Са 2+ -зависимых реакций. В качестве важнейшей причины холодовой гибели клеток животных рассматривают деструктивные последствия Са 2+ -гиперактивации катаболических ферментов (Nagle et al, 1990, Arnand et al, 1990, Асланиди и др., 1996). Чрезвычайно важным является то, что базовая концентрация внутриклеточного кальция регулируется механизмом со множеством положительных обратных связей.

Последовательность событий, ведущая к клеточному повреждению и отставленной клеточной гибели является общей для некоторых форм цитотоксичности, вызванной различными патологическими стимулами, включая механическое повреждение мозга. При неблагоприятных воздействиях увеличивается неспецифическая проницаемость для ионов кальция, происходит выброс кальция из внутриклеточных депо (обзор Асланиди и др., 1996) и активируются глютаматные рецепторы (Dumuis, 1990), еще более увеличивая вход кальция в клетку. Возросшая концентрация кальция в клетке может активировать многие ферменты, в 34

том числе фосфолипазы, которые высвобождают арахидоновую кислоту (АК) из поврежденных клеточных мембран (Dumuis et al, 1988, Pellerin, Wolfe, 1991, Siesjo, Katsura, 1992). AK и многие ее метаболиты могут изменять высвобождение нейротрансмиттеров в ряде нервных путей и препаратов (Piomelli, 1994). AK быстро конвертируется в простагландины (ПГ) с помощью циклооксигеназы, скорость-лимитирующего фермента в синтезе ПГ (Campbell, 1990), образуя О2", который вызывает повреждение ряда молекул путем их окисления. Сами ПГ могут продуцировать патологические события при больших концентрациях (Hertting and Seregi, 1989, Keyser, Alger, 1990, Ordway et al., 1991, Schweitzer et al., 1993, Piomelli, 1994, Owens and Schwartzkroin, 1995).

Полученные нами результаты на препаратах мозга зимнеспящих показывают, что гетеротермные млекопитающие успешно решают на уровне клеток и тканей проблему защиты ионного гомеостаза при гипотермии и действии неблагоприятных факторов. Обработка срезов мозга морских свинок суперфузатами, собранными в период инкубации срезов мозга сусликов или добавлением ликвора из мозга зимнеспящих в инкубационный раствор, значительно ускоряет восстановление срезов мозга морских свинок после приготовления и увеличивает их функциональную стабильность. На основании анализа полученных результатов и литературных данных возникло предположение, что ингибирование избыточной наработки короткоживухцих регуляторов при повреждающих воздействиях может оказать положительное влияние на функциональную стабильность клеток гомеотермов.

Проведенные исследования подтвердили возможность повышения функциональной устойчивости in vitro препаратов гомеотермов. Краткая (3-4 минуты) обработка срезов морской свинки во время резки ингибиторами циклооксигеназной активности (индометацином или аспирином) ведет к исчезновению начального периода "электрического молчания", характерного для контрольных срезов. Кроме того, предобработанные срезы поддерживали электрическую активность в течение, по крайней мере, 3 дней в условиях периодической гипотермии. -

35

Активность в контрольных срезах отсутствовала, либо нарушалась на второй день инкубации после гипотермии, а деструктивные изменения в них были заметны уже через 3 часа после приготовления. Важно отметить, что только период приготовления срезов являлся наиболее эффективным для получения протективного действия ингибиторов.

Нестероидный противовоспалительный препарат индометацин хорошо известен как ингибитор нескольких метаболических процессов. В связи с этим индометацин может играть разнообразные роли на различных стадиях деструктивных изменений, запускаемых повреждением клеток.

Индометацин является известным циклооксигеназным ингибитором синтеза мозговых ПГ. Это действие индометацина может быть главным в эффекте, обнаруженном нами в данном исследовании. ПГ являются нормальными сигнальными молекулами в мозге, в частности, в гиппокампе. Содержание мозговых простагландинов драматически увеличивается при воздействии патологических стимулов, включая судороги и повреждение (Fostermann et al, 1982, Hertting and Seregi, 1989). Например, после судороги, уровень ПГД2 увеличивается 50-кратно в пределах 5 минут в гиппокампе и возвращается к базальному после 30 минут (Fostermann et al, 1982, Hertting and Seregi, 1989).

Различия в действиях индометацина и аспирина могут объясняться различными типами ингибирования ими циклооксигеназ. Индометацин, как известно является обратимым конкурентным ингибитором (Rome and Lands, 1975), а аспирин, кроме конкурентного ингибирования циклооксигеназы, ацетилирует серии вблизи активного сайта и необратимо инактивирует энзим (DeWitt et al, 1990). Индометацин, кроме того, обладает кальций-антагонистическим действием (Northover, 1977) и ингибирует активность фосфолипазы А2 (Franson et al., 1980), уменьшая доступность АК для синтеза ПГ.

О перспективе исследования. Во многих тканях действие простагландинов опосредуется через систему циклических нуклеотидов (Andreev et al., 1986; Лазарева и др., 1989). Представляется перспективным исследование особенностей этой и других систем 36

клеточной трансдукции у зимнеспящих и гомеотермов при действии гипотермии и неблагоприятных факторов на ткани мозга наряду с поиском специфических эндогенных стабилизаторов ионного гомеостаза у гибернирующих животных. Эти направления исследований, с использованием описанных в данной работе тестовых систем, могут привести к пониманию ключевых регуляторных механизмов, определяющих структурно-функциональную стабильность тканей зимнеспящих.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительные исследования срезов лимбических структур мозга зимнеспящих в двух функциональных состояниях (оцепенение и бодрствование) и гомеотермов позволило выявить специфические функциональные особенности, связанные с активным участием лимбических образований мозга в регуляции циклов зимней спячки и впервые зарегистрировать параметры уникальной толерантности этих образований к условиям длительной инкубации in vitro при периодическом действии гипотермии.

2. Установлены состояние-зависимые характеристики нейронной активности септальных срезов мозга гибернирующих сусликов, свидетельствующие о важной роли медиального комплекса септальной области в качестве "сторожевого" пункта переднего мозга во время спячки.

3. Полученные результаты выявили сходство основных паттернов активности в срезах септальной области мозга трех экспериментальных групп животных и дают основания рассматривать около 50% нейронов МС-ДБ гибернирующих сусликов в качестве эндогенных пейсмекеров.

4. Выявлены особенности вызванных ответов на стимуляцию МТТ в мамилло-таламических срезах гибернирующих сусликов, позволяющие при сопоставлении с данными in vivo заключить, что мамиллярные тела и МТТ играют существенную роль в развитии строго ритмической генерализованной веретенообразной активности зимнеспящих на стадиях

погружения в спячку и пробуждения, что является одним из переходных режимов деятельности мозга.

5.Установлены достоверные различия в скорости восстановления в посттравматический период и после гипотермии трех вариантов срезов мозга глубоко спящих, бодрствующих сусликов и гомеотермных животных (морских свинок). Быстрое восстановление электрической активности в срезах мозга зимнеспящих после шока свидетельствует о наличии в нервной ткани этих животных эндогенных механизмов, повышающих устойчивость ионного гомеостаза клеток к воздействию гипотермии и неблагоприятных факторов.

6. Установлено, что инкубируемые in vitro препараты мозга зимнеспящих (срезы трех различных областей и изолированный препарат целого мозга при интра-артериальной перфузии) обладают значительно более высокой толерантностью к длительной инкубации in vitro (до 7-9 суток для срезов) в условиях периодической гипотермии по сравнению со срезами гомеотермов (в пределах одних суток).

7. Показано, что выделяемые в ликвор мозга или в суперфузат во время инкубирования срезов мозга биохимические регуляторы способны вызывать значительное повышение функциональной устойчивости срезов мозга гомеотермных животных как в посттравматический период так и при длительном воздействии гипотермии.

8. Установлено, что предобработка срезов гиппокампа морских свинок ингибиторами циклооксигеназной активности (индометацин или аспирин) радикально увеличивает скорость восстановления срезов в посттравматический период и повышает структурно-функциональную устойчивость этих препаратов мозга, что позволяет регистрировать в них электрическую активность до 3-5 суток (1 сутки в контроле).

9. Показано, что стадия приготовления срезов является ключевым периодом для прерывания каскада нарушений в срезах мозга, определящим их дальнейшую структурно-функциональную устойчивость при длительной инкубации и воздействии гипотермии.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Пахотин П.И., Виноградова О.С. Характеристики реакций нейронов лимбических ядер таламуса. Антеровентральное и антеромедиальное ядра. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1981,т.31,вып.4, 819-828

2. Пахотин П.И., Виноградова О.С., Собянин В.И. Реакции нейронов антеродорзального ядра таламуса и сравнительный анализ трех лимбических ядер. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1981, т.31, вып.5, 10381047

3. Пахотин П.И., Виноградова О.С. Активность нейронов передних ядер таламуса при устранении афферентных путей от гиппокампа и лимбической коры. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1984, т.34, вып.6, 11351143

4. Пахотин П.И.. Виноградова О.С. Влияние перерезки маммилло-таламического тракта на нейроны лимбических ядер таламуса. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1984, т.34, вып.2,303-310

5. Пахотин П.И. Влияние электрической стимуляции корковых отделов лимбической системы на активность нейронов передних ядер таламуса у кроликов. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1984, г.35, вып.6, 1125-1132

6. Пахотин П.И., Каранов A.M. Анализ фоновой активности нейронов передних (лимбических) ядер таламуса кролика. Нейрофизиология, 1985, т. 17, 5, 579-586

7.Виноградова О.С., Пахотин П.И. Сравнительные характеристики активности нейронов антеродорзального и антеровентрального ядер в срезах таламуса у морских свинок. Журн. Высш. Нервн. Деят., 1986, т.36, вып. 1,140-149

8. Пахотин П.И. Роль нейронов передних ядер таламуса в учете временных характеристик сигналов. В сб.: Сравнительная физиология высшей нервной деятельности человека и животных., Москва, 1988, ч.1, 155-156

9. Zhuravleva Z.S., Pakhotin P.I., Vinogradova O.S. Some unusual characteristics of the nucleus anterodorsalis thalami: neurophysiological and ultrastructural investigation, J. Himforsch., 1989, V. 30,5, 619-635

10. Pakhotin. P.I., Belousov A.B. and Otmakhov N.A. Functional stability of the brain slices of ground squirrels, Citellus undulatus, kept in conditions of prolonged deep periodic hypothermia: electrophysiological criteria. Neuroscience, 1990, V. 38,p.591-598.

11. Belousov A.B., Vinogradova O.S., Pakhotin P.I. Paradoxical state-dependent excitability of the medial septal neurons in brain slices of ground squirrel, Citellus undulatus. Neuroscience, 1990, V. 38, 3, 599-608

12. Пахотин П.И.. Белоусов А.Б., Отмахов H.A. Сравнительный анализ функциональной сохранности (по электрофизиологическим критериям) срезов мозга сусликов и морских свинок при содержании в глубокой

гипотермии. Жури. Эвол. Биох. и Физиол., 1991, т. 27, N 4,479-485

13. Белоусов А.Б., Виноградова О.С., Пахотин ПИ. Возбудимость нейронов медиальной области септума в срезах мозга гибернирующих и активных сусликов Citellus Undulatus. Журн. Эвол. Биох. и Физиол., 1991, т. 27, N 5,653-660

14. Пахотин П.И., Белоусов А.Б., Отмахов Н.А. Высокая толерантность срезов мозга сусликов к условиям глубокой длительной гипотермии. Сб. «Механизмы природных гипометаболических состояний», 1991, Пущино, ОНТИПНЦ, 113-119

15.Pakhotin P.I.. Belousov A.B., Otmakhov. N.A. High tolerance of the brain slices of ground squirrels Citellus undulatus to conditions of prolonged deep hypothermia (electrophysiological study). In: "Mechanisms of natural hypometabolic states", 1992, pp.35-40

16. Belousov A.B., Vinogradova O.S., Pakhotin P.I. High level of neuron activity and excitability in septal slices of hibernating ground squirrels, Citellus undulatus. In: "Mechanisms of natural hypometabolic states", 1992, pp. 136-142

17. Pakhotin, P.I., Pakhotina, I.P., Belousov. A.B. The study of brain slices from hibernating mammals in vitro and some approaches to the analysis of hibernation problems in vivo. Progress in Neurobiology, 1993, V.40, 2, 123-162.

18. Pakhotin P.I.. Pakhotina I.D., Pashovkin T.N. Preparation of isolated ground squirrel brain maintained by intraarterial perfusion, Int. Symp. "Living in the cold III", 1993, p.32, Colorado, USA

19. Pakhotin P.I., Khizhnyak E.P., Voronkov V.N. Dynamic changes of EEG and surface temperature of arousing ground squirrels, Int. Symp. "Living in the cold III", 1993, p.33, Colorado, USA

20. Otmakhov N.A., Pakhotin P.I. Characteristics of neuronal activity of hippocampal slices isolated from hibernating ground squirrel. Annual Neuroscience Meeting, 1993, p. 192, Boston, USA

21. Pakhotin, P.I, and Pakhotina, I.D. Preparation of isolated perfused ground squirrel brain. Br. Res. Bulletin, 1994, V. 33, 719-721

22. Pakhotin P.I.,Yemets O.N.,Voronkov V.N., Pashovkin T.N. The influence of hypothermia on the restoration of neural activity of brain slices from hibernating ground squirrels. J. of Thermal Biology, 1996, V.21, No.5/6, p.297-304

23. Pakhotin P.I. The stabilization phenomena of spindle-like activity generation in thalamic nuclei under stimulation of mammillo-thalamic tract. 13th BRA Meeting, 1996, p. 231, New Castle, UK

24. Pakhotin P.I. O.N.Yemets, T.N.Pashovkin The influence of hypothermia on the restoration of neural activity of brain slices from hibernating and nonhibernating mammals after preparation, 13th BRA Meeting, 1996,

p. 161, New Castle, UK

25. Пахотин П.И.. Пахотина И.Д., Андреев A.A., Павлик Л.Л. Увеличение структурно-функциональной стабильности срезов гиппокамна после краткой предобработки ингибиторами циклооксигеназ. Материалы 3-й международной конференции по функциональной нейроморфологии, "Колосовские чтения -97", 1997, с.70, г.Санкт-ГТетербург

26. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Пахотин П.И., Мухтасимова Н.Ф., Мошков Д.А. Индукция и длительное сохранение долговременной потенциации электрических ответов маутнеровских нейронов золотой рыбки во фрагментах продолговатого мозга, инкубированных in vitro, Цитология, 1997, т.39, 7, 541-545

27. Pakhotin P.I., Pakhotina I.D. and Andreev A.A. Functional stability of hippocampal slices after treatment with cyclooxygenase inhibitors. NeuroReport, 1997, V.8, No 7, 1755-1759

28. Емец O.H., Воронков B.H., Пашовкин Т.Н., Пахотин П.И. Срезы гиппокампа активных и глубоко спящих сусликов Citellus undulatus способны восстанавливать нейронную активность после травматического шока в условиях глубокой гипотермии, Вопросы криобиологии, 1997, принято в печать.

29. Пахотин П.И., Павлик Л.Л., Пахотина И.Д., Андреев A.A. Структурно-функциональная стабильность срезов гиппокампа после краткой обработки ингибиторами циклооксигеназ, Морфология, 1998, т. 13, №1, принято в печать.

Нем. л. 2,i>

Тираж IQQ Зам.! /5в/

Типография МЭИ. Кргнпока.мрчсппая, 1.4.