Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гипотермии на электрическую активность срезов мозга гибернирующих и гомеотермных животных

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние гипотермии на электрическую активность срезов мозга гибернирующих и гомеотермных животных"

,;ГЗ Ой 2 7 ОКТ 1998

На правах рукописи

Емец Олег Николаевич

ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ СРЕЗОВ МОЗГА ГИБЕРНИРУЮЩИХ И ГОМЕОТЕРМНЫХ ЖИВОТНЫХ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино- 1998

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН и Институте биофизики клетки РАН (г. Пущино, Московская обл.)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Буданцев А.Ю. доктор биологических наук Пахотин П.И.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Годухин О.В. кандидат биологических наук Накипова О.В.

Ведущая организация:

Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г.Москва)

Защита состоится " \ 993 г в часов на

заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская обл., г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 200.22.0 кандидат биологических наук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование толерантности тканей мозга млекопитающих к холоду актуально для решения задач фундаментальной и практической медицины, а также для изучения механизмов зимней спячки. Известно, что ткани зимнеспящих животных обладают уникальной устойчивостью к повреждающим факторам различной природы {Шмидт, /961; Калабухов, 1985; Lyman, 1982 и др.). Во время гибернации, ткани мозга, участвуя в организации и регуляции процессов зимней спячки, сами могут охлаждаться до 0°С и ниже без патологических последствий. В то же время, существуют большие методические трудности при изучении гибернации в условиях in vivo. В связи с этим, представляется важным изучение параметров гипотермической устойчивости тканей и клеток мозга зимнеспящих в условиях in vitro, поскольку при этом можно определить пределы их адаптивных возможностей. Результаты исследований в этом направлении могут иметь значение для фундаментальной науки, биотехнологии, а также для таких областей медицины, как трансплантология и гипотермическая хирургия. Исследования срезов мозга зимнеспящих могут позволить найти подходы к усовершенствованию методов инкубации in vitro препаратов мозга, что очень важно для решения целого ряда фундаментальных нейробиологических и биофизических задач.

Основной целью диссертационной работы является поиск функциональных характеристик срезов мозга (параметров электрогенеза), которые отражают способность тканей мозга гибернирующих и гомеотермных животных адаптироваться к действию глубокой гипотермии.

Задачи исследования.

1. Исследовать принципиальную возможность восстановления электрической активности в срезах мозга гибернирующих и гомеотермных животных в постпрепарационный период в условиях глубокой гипотермии.

2. Определить предельное значение температуры, которое критично для выживания срезов гиппокампа суслика в условиях гипотермии без предварительного "восстановления" после приготовления в теплой инкубационной среде (31°С).

3. Изучить действие растворов ликвора мозга и суперфузатов, полученных при инкубации срезов гиппокампа сусликов, на функциональные характеристики срезов мозга гомеотермных животных и факультативных гибернаторов.

4. Исследовать динамику и низкотемпературные пороги электрогенеза в срезах гиппокампа гибернирующих и гомеотермных животных при градуальном циклическом изменении температуры.

5. Исследовать влияние ингибитора циклооксигеназной активности -индометацина, на динамику электрофизиологических характеристик срезов гиппокампа морских свинок при циклическом изменении температуры.

Научная новизна исследования.

1. Впервые показано, что срезы гиппокампа зимнеспящих животных, в отличие от препаратов гомеотермных животных (морская свинка), обладают способностью к восстановлению электрогенеза в условиях глубокой гипотермии (4-6°С).

2. Выявлена критическая температура гипотермического воздействия (4°С), ниже которой способность срезов гиппокампа зимнеспящих к восстановлению электрогенеза резко нарушается.

3. В срезах гиппокампа гибернирующих сусликов показано адаптивное изменение амплитуды пВПСП в условиях глубокой гипотермии.

4. Впервые показаны различия в низкотемпературных порогах электрогенеза в срезах гиппокампа облигатных гибернаторов и гомеотермных животных при циклическом изменении температуры среды инкубации.

5. Впервые показано, что суперфузат, полученный при инкубации срезов гиппокампа сусликов, и ликвор мозга этих животных способны

значительно повышать функциональную устойчивость срезов мозга гомеотермных животных и факультативных гибернаторов.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты дополняют существующие данные о гипотермической устойчивости тканей мозга млекопитающих животных в условиях in vitro. Новые данные проведенного исследования позволяют расширить имеющиеся представления об адаптивных изменениях электрогенеза в такой важной для регуляции механизмов зимней спячки структуре, как гиппокамп. Изучение динамики нейрональной активности в срезах после инкубации их при 4-6°С, без предварительного восстановления при 31°С, дало возможность получить новые данные о способности ткани мозга зимнеспящих восстанавливаться после травмы в условиях глубокой гипотермии, что может быть использовано в развитии теоретических представлений о механизмах устойчивости нервной ткани к неблагоприятным условиям.

Результаты Hauiiix исследований действия ликвора мозга и суперфузата от срезов гиппокампа сусликов на срезы мозга морских свинок и хомяков показали, что существует принципиальная возможность "перенесения" ряда важных свойств препаратов зимнеспящих животных (гипотермической и функциональной устойчивости) на препараты гомеотермных животных и факультативных гибернаторов. Полученные результаты имеют теоретическую и практическую значимость для медицины. Они могут найти применение в трансплантологии и при консервации органов и тканей.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Срезы мозга зимнеспящих, в отличие от препаратов гомеотермных животных (морская свинка), обладают способностью к восстановлению электрогенеза в условиях глубокой гипотермии (4-6°С).

• Существуют различия в значениях низкотемпературных порогов электрогенеза в срезах мозга гомеотермных и зимнеспящих животных при циклическом изменении температуры среды инкубации.

• Суперфузат, полученный при инкубации срезов гиппокампа сусликов, а также ликвор мозга этих животных способны значительно повышать функциональную устойчивость срезов мозга факультативных гибернаторов - хомяков и гомеотермных животных - морских свинок.

• Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 1, И и Ш-й конференциях молодых ученых (Пущино, 1996-98гг.), научной конференции Института биофизики клетки РАН (1997), Ш-й международной конференции стран СНГ по функциональной нейроморфологии (Санкт-Петербург, 1997), конференции IBRO (Newcastle, 1996), конференции ISN/ASN (Boston, 1997), на 8-м международном симпозиуме по нейротравме и нейрологическим заболеваниям (New Orleans, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 121 странице и состоит из: «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов», трех глав описания результатов экспериментов, «Обсуждения результатов» и «Выводов». Работа содержит 31 рисунок и 1 таблицу. Список цитируемой литературы содержйт218 наименований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Экспериментальные животные.

Исследования проводили на четырех группах животных: 1) гибернирующих, 2) бодрствующих якутских сусликах Citellus undulatus, 3) морских свинках, 4) хомяках Mesocricetus auratus, которые не впадали в спячку. Непосредственно перед каждым экспериментом производили измерения температуры тела животного, а после процедуры изоляции также измеряли температуру мозга.

2.2 Объекты исследования.

В качестве объектов исследования нами были выбраны срезы гиппокампа и септальной области переднего мозга - структур лимбической системы, которые сохраняют нейрональную активность у гибернирующих животных (Strumwasser, 1959; Штарк, 1970). 4

Из изолированных структур мозга с помощью микротома МНТ-84 (Буданцев, ¡985) изготавливали срезы, которые затем инкубировали в растворе Рингера-Кребса, содержащем бикарбонатный буфер, насыщенный карбогеном (95% 02, 5% С02) по стандартной методике (Отмахов, 1987).

2.3 Электрофизиологические методы.

Электрофизиологические методы включали в себя регистрацию синаптически вызванных популяционных ответов и спонтанной нейрональной активности.

С помощью биполярных вольфрамовых электродов стимулировали афферентные пути гиппокампа - коллатерали Шаффера (Рис.1, А).

Рис.1 Схематическое изображение срезов двух структур мозга, использованных в экспериментах: А - срез гиппокампа; Б - срез септальной области переднего мозга. Обозначения: CAI и САЗ - поля гиппокампа; КШ - коллатерали Шаффера; ЗФ - зубчатая фасция; СЭ - стимулирующие биполярные электроды; ПП -перфорирующий путь; ФФ - фимбрия-форникс; ЭК - энторинальная кора; MC -медиальное септальное ядро; ЛС - латеральное септальное ядро; ПК - передняя комиссура; ХЯ - хвостатое ядро; МТ - мозолистое тело; ДБ - диагональная связка Брока; МЭ - микроэлектрод.

В ответ на прямоугольные импульсы (0,2 мс; 0,1 Гц; 50-150 мкА) из пирамидного слоя с помощью вольфрамового микроэлектрода (2-3 МОм) регистрировали популяционные ответы. Сигнал сначала поступал на усилитель, откуда подавался на компьютер IBM PC 280. Затем, с помощью специальной программы РОРН (автор Деев A.A.), производили усреднение полевых потенциалов по 10-и ответам, следовавшим с интервалом 10 секунд. Вызванные популяционные ответы в поле CAI

5

гиппокампа имеют хорошо изученные стандартные компоненты (Andersen et al., 1971; Alger et al, 1984), что важно для количественного и качественного анализа: низко амплитудный потенциал волокон, популяционный возбуждающий поетеинаптический потенциал (пВПСП) и высоко амплитудный популяционный спайк (ПС). Важными характеристиками ПС являются - амплитуда и латентный период (ЛП). Они отражают состояние нейронов в срезе, скорость проведения по афферентным путям, синхронность разряда популяции нейронов участвующих в ответе, а также позволяют оценить общий объем жизнеспособных клеток. Измерения амплитуды ПС производили от базовой линии до максимума отрицательной волны ПС. Базовую линию определяла программа компьютера, ЛП измерялся от артефакта стимула до отрицательного пика ПС (Рис.2).

Рис.2 Измерение стандартных компонентов спайка. Запись популяционного ответа из пирамидного слоя поля CAI гиппокампа при стимуляции коллатералей Шаффера. Обозначения: АС - артефакт стимула; ЛП - латентный период ответа.

По этим данным, строили графики, нормированные относительно стабильных значений амплитуды и ЛП ПС, что позволяло сравнить динамику восстановления активности в разных срезах. В ряде экспериментов строили графики отражающие динамику амплитуды и ЛП ПС в зависимости от изменения температуры среды (нормировали относительно значений при 31°С в контроле). Разброс значений на всех графиках определяли по среднему квадратичному отклонению.

На срезах септальной области переднего мозга внеклеточно регистрировали спонтанную активность нейронов в медиальном и латеральном ядрах (Рис. 1, Б).

л

2.4 Методы температурного воздействия.

В экспериментах использовалась электрофизиологическая установка с камерой погружного типа. Для регуляции температуры в рабочей камере применяли блок элементов Пельтье. Использовали различные режимы гипотермического воздействия как в проточной камере, так и при длительном хранении срезов в холодильнике (см. Результаты).

После записи контрольных ответов в стандартных условиях (31°С) температуру в рабочей камере градуально циклически изменяли (на 1° каждые 3-5 мин.) в диапазоне 31-12°С (в ряде экспериментов 31-7°С), при этом с интервалом в 1° регистрировали ПО из поля СА1 гиппокампа.

2.5 Метод оптической микроскопии.

Срезы на различных этапах экспериментов фиксировали в формалине и обезвоживали в возрастающих концентрациях этанола и ацетоне при комнатной температуре. Блоки ткани заключали в смолу JB-4 (Electron Microscopy Sci. Inc., USA), и приготавливали срезы на микротоме LKB-III. Окрашивание проводили метиленовым синим. Серийные срезы, толщиной 3-4 мкм, изготавливали через 50 мкм в поперечной плоскости исходного блока. Полученные срезы анализировали и фотографировали на микроскопе МБИ-15 (ЛОМО) при объективах х40 (0,65) и х20 (0,40). Для съемки использовали пленку Микрат-300.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование возможности посттравматического восстановления электрической активности в срезах мозга в условиях глубокой гипотермии.

В экспериментах использовались срезы мозга как бодрствующих сусликов, с температурой мозга 37°С, так и глубокоспящих (не выше 7°С). Для сравнения в аналогичных условиях тестировали активность срезов мозга морских свинок и содержавшихся в теплом помещении, не впадавших в спячку хомяков Mesocricetus auratus.

3.1.1 Электрофизиологические данные. Сразу после приготовления, срезы помещали в бюксы с охлажденным, насыщенным карбогеном

7

раствором (4-6°С) без протока среды, и хранили в холодильнике при этой же температуре. Тестирование электрической активности осуществляли в стандартных условиях при температуре 31°С в инкубационной камере. Было выбрано два режима воздействия гипотермией: первую группу срезов тестировали после нахождения в гипотермии в течение 2 часов (п=10 для каждого вида животных), вторую группу срезов тестировали после хранения в условиях гипотермии в течение 24 часов (п=8).

В срезах мозга морских свинок и хомяков при обоих режимах гипотермии нам не удалось обнаружить ни спонтанной, ни вызванной активности за период тестирования более 3-х часов.

В то же время, в срезах гиппокампа гибернирующих сусликов независимо от времени содержания в гипотермии электрическая активность появлялась уже в первом тесте (на второй минуте) после помещения в стандартные условия инкубации (Рис.3, Б).

40 «

Время (MMMJTbO

Время (минуты)

1

Рис.3 Динамика восстановления популяционной активности в поле CAI срезов гиппокампа бодрствующих (А) и гибернирующих (Б) сусликов, хранившихся в течение 2 часов (кривая 1) и 24 часов (кривая 2) сразу после приготовления в условиях глубокой гипотермии (4-6°С). 1 - динамика амплитуды ПС; 2 -динамика латентных периодов ПС.

Динамика восстановления ПО в срезах, содержавшихся в условиях гипотермии, принципиально отличалась от динамики ответов в только что приготовленных срезах (Рис.4). Амплитуда ответов уже в первых тестах достигала 50% (2 часа) и 80-90% (24 часа) относительно уровня 90-й минуты инкубации. Затем наблюдалась их постепенная стабилизация.

При тех же режимах гипотермии (2 и 24 часа, 4-6"С) были проведены исследования на срезах гиппокампа бодрствующих сусликов. Принципиальных различий в способности восстанавливать нейронную активность в срезах гиппокампа у бодрствующих (А) и глубокоспящих

Рис.4 Динамика восстановления популяционной активности в поле CAI срезов гиппокампа гибернирующих сусликов и морских свинок сразу после приготовления при инкубировании в стандартных условиях (31°С). А - динамика амплитуды ПС, Б - динамика латентных периодов ПС. Обозначения: суслики; ♦ ♦ морские свинки.

Ранее было показано, что в стандартных условиях инкубации существуют различия в скорости выхода из посттравматического шока между срезами мозга зимнеспящих и незимнеспящих животных (Pakhotin et ai, 1990, 1993). В этих работах было также установлено, что "восстановленные" в теплой среде срезы мозга гибернаторов способны до 7-9 суток сохранять способность к электрогенезу при периодическом хранении в условиях глубокой гипотермии, тогда как срезы гомеотермов сохраняли способность к генерации активности в аналогичных условиях не более одних суток.

В данной работе нами выявлено еще одно принципиальное свойство срезов мозга гибернаторов - они способны восстанавливать электрогенез в посттравматический период в условиях глубокой гипотермии.

Кромке того, впервые удалось установить предельное значение температуры гипотермической инкубации срезов в постпрепарационный период. Ниже 4°С электрическая активность в срезах либо значительно ухудшалась, либо становилась неустойчивой. В последнем случае наблюдались колебания и быстрое нарастание амплитуды ПС, значения которой за 25 минуте тестирования могли достигать 300% и более от начального уровня, причем абсолютная величина амплитуды ПС была значительно больше, чем у срезов, инкубированных при 6°С. При дальнейшей инкубации амплитуда ПС продолжала расти и затем наступало резкое ухудшение или исчезновение ответов.

Описанные выше изменения параметров полевых ответов отмечаются в срезах гиппокампа с нарушенными тормозными процессами (Баязитов, Клещевншов, 1998). Возможно, в нашем случае, действие гипотермии (4°С) приводит к нарушениям в работе прежде всего тормозных нейронов, поскольку именно они крайне чувствительны к повреждающим воздействиям (Отмахов, 1987). 3.1.2 Данные оптической микроскопии.

В срезах гиппокампа сусликов после 24 часов хранения в гипотермии (4-6°С) не было обнаружено существенных морфологических нарушений, кроме некоторого незначительного набухания клеток, тогда как в срезах морских свинок уже после 2-х часов гипотермии после резки наблюдается картина полной деструкции ткани.

3.2 Влияние циклического изменения температуры на характеристики популяционных ответов из поля CAI гиппокампа в срезах гибернирующих и гомеотермных животных.

После записи контрольных ответов в стандартных условиях (31°С) температуру в рабочей камере градуально циклически изменяли (см. Методы).

В условиях циклического изменения температуры, определяли

низкотемпературные пороги генерации популяционных ответов (НТП) -предельные значения температуры, ниже которой не регистрируются ответы на стимуляцию (Horowitz et al., ¡987). При сравнении были выявлены достоверные различия в значениях НТП у гибернирующих и гомеотермных животных.

Популяционная активность в гиппокампальных срезах морских свинок не регистрировалась уже при 21-18°С. В срезах мозга бодрствующих сусликов в этом диапазоне температур она составляла около 50% от исходной, и полностью исчезала при 13-12°С. У обоих экспериментальных групп значения амплитуды ПС и пВПСП при снижении температуры уменьшались равномерно и переставали регистрироваться при одном и том же значении температуры. Подобная закономерность изменения ответов обнаружена и у части препаратов гибернирующих сусликов, как правило, во второй половине баута спячки (накануне пробуждения).

В то же время, у сусликов, готовящихся войти в состояние оцепенения и у животных в начале баута спячки была выявлена качественно иная динамика стандартных компонентов популяционных ответов в срезах гиппокампа. Было установлено, что ПС исчезает при ~12°С (то же значение, что и для бодрствующих сусликов). Однако, на фоне снижающейся амплитуды ПС, динамика пВПСП была положительной - амплитуда пВПСП постепенно нарастала, достигая максимума (около 140%, при 12°С) и этот компонент ответа продолжал регистрироваться, по крайней мере до ~7°С. При последующем разогреве наблюдалось не значительное колебание величины пВПСП около нового уровня, который был достигнут в ходе охлаждения.

Таким образом, установлено, что НТП для пВПСП у гибернирующих животных находится в диапазоне температур, гораздо более низких, чем у бодрствующих сусликов.

Следующая часть работы была посвящена исследованию

температурной зависимости синаптически вызванных ответов из срезов

И

гиппокампа морских свинок, обработанных на стадии резки ингибитором циклооксигеназ - индометацином (3 мин, 45 мкМ, Sigma). Ранее было показано, что в срезах гиппокампа гомеотермных животных, после обработки ингибиторами циклооксигеназ, значительно сокращается период восстановления после резки и увеличивается устойчивость к длительному действию глубокой гипотермии (Pakhotin et al., 1997). Предполагается, что именно в период приготовления срезов кроме острых последствий травмы избыточно образуются продукты циклооксигеназной активности, запускающие ряд отставленных цитотоксических событий, ограничивающих функциональную стабильность препаратов. Срезы мозга гибернаторов более устойчивы к повреждающим воздействиям, возможно, вследствие образования эндогенных регуляторов, стабилизирующих ионный гомеостаз.

Также как и у части срезов гиппокампа гибернирующих сусликов, в срезах гиппокампа морских свинок, предобработанных индометацином, НТП для пВПСП был значительно ниже (15-16°С) чем НТП для популяционных спайков (18-21°С). Можно предположить, что повышение устойчивости пВПСП к низкой температуре является коррелятом гипотермической резистентности ткани мозга.

Предобработка индометацином срезов гиппокампа морской свинки позволила проводить длительные эксперименты в течение 2-х суток, что невозможно на срезах, приготовленных по стандартной методике. Была выявлена зависимость динамики пВПСП ответов из поля CAI в предобработанных срезах гиппокампа морских свинок как от количества температурных циклов в ходе одного эксперимента, так и от длительного непрерывного действия глубокой гипотермии (1 сутки при 6°С). Несколько раз циклически снижая и поднимая температуру, мы обнаружили "эффект суммации" действия гипотермии на величину пВПСП. Он состоит в увеличении пВПСП, от цикла к циклу. Кривые, описывающие этот процесс (для срезов, подвергавшихся действию гипотермии в течение 24 часов), имеют характерную форму - при снижении температуры, вплоть до диапазона значений НТП для ПС, 12

величина пВПСП значительно не изменяется (в пределах 5-10%), зато при разогреве, она начинает расти (на 37-43%), достигая максимума при 3 ГС. В новом цикле, происходит то же самое.

Выраженность этого эффекта зависела от продолжительности и глубины охлаждения. Так, если кратковременное снижение температуры до 16°С вызывало рост пВПСП на -15% в двух циклах, то длительное содержание среза в глубокой гипотермии (6°С) давало при тех же условиях 81% прироста пВПСП.

Как одну из характерных особенностей динамики пВПСП следует отметить то, что величина, на которую увеличивается пВПСП в ходе одного цикла - AS3|° (значение взято при ЗГС), зависит от количества последних. Так, если в ходе первого цикла величина AS3Í° для срезов тестированных в первый день эксперимента, составляла около 5%, то в ходе второго она увеличилась на 10%. Аналогичные изменения величины AS3i° наблюдались и на второй день тестов (Табл.1).

Табл.1 Динамика пВПСП ответов из поля CAI срезов гиппокампа морских свинок (индометацин + гипотермия).

Дни Циклы AS31° (%)

1 1 5±3

2 10±4

2 1 37±5

2 44± 5

3.3 Исследование влияния ликвора мозга и суперфузата срезов гиппокампа сусликов на срезы мозга гомеотермных животных и факультативных гибернаторов.

В этой серии экспериментов была поставлена задача установить, существуют ли специфические эндогенные факторы, повышающие устойчивость срезов мозга суслика к действию низких температур, а также могут ли эти факторы действовать на препараты гомеотермных

животных. В опытах использовали суперфузат, собранный после многократного пропускания рабочего раствора (250-500 мл) через инкубационную камеру, в которой находились переживающие срезы гиппокампа суслика. Собранный суперфузат использовался на всех стадиях приготовления срезов, а также при работе в проточной камере и хранении в гипотермических условиях (6°С) срезов мозга гомеотермных животных - морских свинок и факультативных гибернаторов - хомяков.

Было проведено исследование динамики восстановления нейронной активности после приготовления срезов гиппокампа морской свинки. Обнаружено, что использование в качестве среды инкубации суперфузата, приводит к значительному ускорению восстановления амплитуды ПС. Если в контрольных срезах первые ответы появлялись на ~15-й мин, то при инкубации в суперфузате это происходило значительно раньше (-2-3 мин), а полное восстановление ответа наблюдалось к 45-50 мин. (65-75 мин. в контроле).

При использовании суперфузата в качестве среды инкубации для срезов мозга морских свинок и хомяков в условиях гипотермии (6°С), было обнаружено, что препараты были способны генерировать синаптически вызванные ответы и спонтанную активность на вторые и даже на третьи сутки после приготовления, хотя в последнем случае наблюдались нарушения структуры срезов и отмечалась деградация ответов. ПС регистрировались практически сразу после перемещения среза из гипотермии в стандартные условия инкубации (31°С), а полная стабилизация ответа происходила к 10 мин. В то же время, в контрольных срезах, активность отсутствовала.

В следующей серии экспериментов производили обработку срезов гиппокампа морских свинок ликвором мозга, как спящих, так и бодрствующих сусликов. Ликвор, собранный от одного животного (1-1,5 мл) разводили в 200 мл раствора Рингера-Кребса и применяли на стадии приготовления среза. Были зарегистрированы эффекты, аналогичные вышеописанным - указанная предобработка ускоряла постшавматическое восстановление нейронной активности в срезах, а 14

так же позволяла длительное время хранить срезы в условиях глубокой гипотермии.

Внеклеточно регистрируя спонтанную активность нейронов срезов медиального и латеральных ядер септального комплекса мозга морских свинок, установили, что указанная предобработка позволяет срезам сохранять способность генерировать активность на 3-й сутки после приготовления. В контрольных срезах спонтанная активность отсутствовала.

Использование суперфузатов и ликвора мозга морских свинок и хомяков, в аналогичных условиях, не привело к ускорению посттравматического восстановления электрической активности и увеличению длительности функциональной стабильности срезов.

Таким образом, можно предположить, что в ткани мозга гибернирующих животных содержатся эндогенные регуляторы, которые могут воздействовать и на функциональные характеристики срезов мозга гомеотермных животных и факультативных гибернаторов.

Выводы

1. Показано, что срезы гиппокампа зимнеспящих животных, в отличие от препаратов гомеотермных, обладают способностью к восстановлению электрогенеза в условиях глубокой гипотермии (4-6°С).

2. Выявлена критическая температура гипотермического воздействия (4°С), ниже которой репаративные способности срезов ткани мозга in vitro, выделенных из зимнеспящих животных, резко нарушаются.

3. Циклическое изменение температуры (охлаждение и разогрев) среды инкубации срезов гиппокампа морских свинок приводит к существенным нарушениям вызванной активности, что, очевидно, связано с отсутствием адаптивных механизмов к условиям гипотермии у гомеотермных животных.

4. Срезы гиппокампа зимнеспящих животных (активных и гибернирующих) сохраняют способность к электрогенезу после циклического изменения температуры инкубационной среды без существенного нарушения характеристик вызванных ответов.

5. В срезах гиппокампа гибернирующих сусликов показано адаптивное изменение амплитуды пВПСП в условиях глубокой гипотермии.

6. Достоверно показаны различия в низкотемпературных порогах электрогенеза в срезах мозга гомеотермных и зимнеспящих животных при циклическом изменении температуры среды инкубации.

7. Применение индометацина на стадии приготовления срезов морской свинки приводило к существенному изменению их свойств: а) они были способны генерировать нейронную активность после продолжительного хранения в условиях гипотермии; б) изменялись значения низкотемпературного порога электрогенеза.

8. Установлено, что ликвор мозга, а также суперфузат, полученный при проточной инкубации срезов гиппокампа сусликов, способны значительно повышать гипотермическую и функциональную устойчивость срезов мозга гомеотермных животных и факультативных гибернаторов.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Pakhotin P.I., Yemets O.N., Voronkov V.N., Pashovkin T.N. The influence of hypothermia on the restoration of neural activity of brain slices from hibernating ground squirrels. J. therm. Biol., 1996, Vol.21, No.5/6, p.297-304.

2. Yemets O.N., Pashovkin T.N., Pakhotin P.I. The influence of sub-zero hypothermia on the restoration the activity of hippocampal slices from hibernating and nonhibernating mammals after preparation. Brain Res. Assoc. Abstr., 1996, Vol.13, p.84.

3. Емец O.H. Срезы гиппокампа гибернирующих сусликов восстанавливают нейронную активность в глубокой гипотермии в посттравматический период. Тез. докл. I научн. конф. мол. уч. Пущино, 1996, с.34.

4. Yemets O.N., Bondarenko V.A., Budantsev A.Yu., Pakhotina I.D.,Pakhotin P.I. The influence of indomethacine on functional stability of guinea-pig hippocampal slices upon cyclic temperature changes. J. Neurochem., 1997, Vol.69, Suppl., S176.

5. Емец O.H., Воронков B.H., Пашовкин Т.Н., Пахотин П.И. Морфо-функциональный анализ срезов мозга зимнеспящих и незимнеспящих млекопитающих в условиях гипотермии в посттравматический период. Сб. тез. III Междунар. конф. стран СНГ по функциональной нейроморфологии. Санкт-Петербург, 1997, с.33.

6. Емец О.Н. Температурная зависимость характеристик популяционных ответов из поля CAI гиппокампальных срезов якутских сусликов и морских свинок. Сборн. трудов II открытой научн. конф. мол. уч., Пущино. 1997, с.118-122.

7. Емец О.Н. Влияние снижения температуры инкубационной среды на популяционные ответы срезов гиппокампа морской свинки и бодрствующего якутского суслика. Тез. докл. II открытой научн. конф. мол. уч., Пущино, 1997, с.135-136.

8. Емец О.Н. Влияние околонулевой гипотермии на срезы мозга хомяков Mesocricetus auratus. Тез. докл. II открытой научн. конф. мол. уч., Пущино, 1997, с. 136.

9. Yemets О., Bondarenko V., Pakhotina I.,Pakhotin P. The influence of indomethacine on functional stability of guinea-pig hippocampal slices upon cyclic temperature changes. Abstr. 8th International Symposium on Stroke, Neurotrauma, and Other Neurological Diseases, New Orleans, LA, 1997, p.52.

10. Емец O.H., Воронков B.H., Пашовкин Т.Н., Пахотин П.И. Срезы гиппокампа бодрствующих и глубокоспящих сусликов Citellus undulatus одинаково способны восстанавливать нейронную активность после травматического шока в условиях околонулевой гипотермии. Проблемы криобиологии, 1998, №1, стр.24-29.

11. Емец О.Н., Пахотин П.И. Исследование влияния суперфузата и ликвора мозга гибернаторов на гиппокампальные срезы гомеотермных животных. Тез. докл. III конф. мол. уч., Пущино, 1998, стр.149.

12. Емец О.Н. Влияние циклического изменения температуры на характеристики популяционных ответов гибернаторов и гомеотермных животных. Тез. докл. III конф. мол. уч., Пущино, 1998, стр.183.

Типография МЭИ. Краспокрзарменная, 13,