Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование в органотипической культуре ткани уровня нейротрофических факторов в цереброспинальной жидкости при эпилепсии
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Исследование в органотипической культуре ткани уровня нейротрофических факторов в цереброспинальной жидкости при эпилепсии"
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ имени И. П. ПАВЛОВА
На правах рукописи
ЛОДЫНО Мария Иосифовна
ИССЛЕДОВАНИЕ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНИ УРОВНЯ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ЭПИЛЕПСИИ
Специальность 03.00.53 - Физиология человека и животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
И Б
Санкт-Петербург 1995
Работа выполнена е лаборатории физиологии рецепции Института физиологии им.И.П.Павлова РАН
Научный руководитель - заведующий лабораторией физиологии рецепции Института физиологии им. И. П. Павлова, доктор биологических наук Г. Н. Акоев.
Научный консультант - заведующий отделением нейрохирургии детского возраста Российского научно-исследовательского нейрохирургического института им.проф.А. Л.Поленова МЗ РФ, доктор медицинских наук С. Л. Яцук.
Официальные оппоненты:
1. Профессор, доктор биологических наук С. А. Дамбинова (Институт
мозга человека РАН)
2. Доктор биологических наук В. Т. Шуваев (Институт физиологии
им. И. П.Павлова РАН)
Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный Университет
Защита состоится "/'/" а/^САА 1995 года в ас.
на заседании Специализированного совета К 002.38.01 Института Физиологии им.И.П.Павлова по адресу: 199034, С.-Петербург, наб. Макарова, е.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им.И.П.Павлова РАН.
Автореферат разослан " ijj'__• i"___1995 г.
Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук
¿¡¿•■ML. Э. А. Конза
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РА50ТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
В настоящее время тожество нейрофизиологических исследований посвящено нейротрофичсским факторам (НТО) (Oppenheim, 1991; Korschinß, 1993) - низкомолскулярным белкам, которые необходимы для выживания и дифференцировки нейронов во время эмбриогенеза и для поддержания морфофункциональных свойств зрелых клеток (Lo-vi-Montalcinl, 1987). Наиболее изученными являются факторы, составляющие семейство нейротрофинов - фактор роста нервов (ФРН), производный из мозга нейротрофический фактор (ПМНТФ) и нейротро-фины-3, -4 (НТ-3, -4), -а также факторы роста фибробластов (ФРФ), цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ). Эти факторы очищены до гомогенного состояния, определена их структура, выявлены рецепторы, исследуются механизмы, обеспечивающие взаимодействие с компетентными клетками.
Зависимость развивавшихся нейронов от НТО снижается при становлении электрических свойств их мембран (Johnson, Kolke, Franklin, 1992). Известно также, что вышивание нейронов в ранний период постнатального развития во многом зависит от афферентного потока (Castren, Zafra, Thoenen et al., 1992). Действительно, уровень электрической активности определяет такие свойства нейрона, как синтез нейромедиатороа (Ip, Zigmond, 1984), экспрессия рецепторов к ним (Zißmond, Bowers, 1981), скорость и направление роста нейритов (Cofian, Kater, 1986), формирование синаптических контактов (Archer et al., 1982). Причем, сами нейромедиаторы могут стимулировать или ингибировать пролиферацию и дифференцировку клеток посредством активации разных путей сигнальной транедукции (Lauder, 1993). Вероятно, существует взаимосвязь медду механизмами действия НТО .и метаболическими процессами, которые запускаются при повышении нейрональной активности (Castren, Thocnen, Lind-holra, 1991; Johnson, Kolke, Franklin, 1992).
При низкой электрической активности нарушается развитие нейронов (Brostrom, Brost,rom, 1990), вместе с тем, повышенная нейро-напьная активность может приводить к повреждениям в нервной системе (Coyle, Pattfarcken, 1993). Так, чрезмерное выделение глута-мата, который является одним из основных возбуждающих медиаторов в центральной нервной системе (ЦНС), обуславливает гипервозбудимость нейронов, инициации и распространение эпилептической актив-
ности (McNaaara, 1994). Метаболические нарушения в нейронах, связанные с эпилептической активностью, приводят к их гибели и реактивному глиоэу в эпилептосенных структурах мозга, в первую очередь - в гиппокампе (Olney, 1984, McNamara, 1994). В то se время, нейроны и астроциты гиппокампа являются основными источниками НТФ в ЦНС (Zafra, Lindholm, Castren. 19Э2). Недавние исследования показали, что повышенная трансмиссия возбуждающих медиаторов в гиппокампе может оказывать влияние на уровень экспрессии генов ФРН, ПМНТФ (Gwag, Springer, 1993)'. Высказываются предположения об участии НТФ в адаптивных процессах, об их роли в обеспечении пластичности нейронов (Lin, Levltan, 1991). Большинство исследований свидетельствуют о стимуляции экспрессии иРНК к ПМНТФ, ФРН, ФРФ в ткани мозга при усилении нейрональной активности (Zafra, Hcngerer, LelbrocH et al., 1990; Wolak, V/ebb, HJelmeland et al.. 1991; Birren, Verdi, Anderson, 1992; Duglcti-DJordJevlc, Tocco et al., 1992 ).
Однако, механизмы нейротрофической регуляции морфофункцио-нальных свойств нейронов при эпилепсии исследованы недостаточно, имеются противоречивые данные о роли некоторых НТФ в осуществлении компенсаторных процессов в нервной ткани при эпилептической активности (Gall, Bonk, Isackson. 1991; Sofroniew, Cooper. Svend-senetal.. 1991). Следовательно, очевидна актуальность исследования проблемы, связанной с определением роли НТФ при эпилепсии. Представляется важным поиск общих закономерностей нейротрофичес-кой регуляции, поддержания и восстановления свойств нейронов при повреядахицих воздействиях, вызванных нейротоксическим действием высоких концентраций возбуждающих медиаторов.
Внутреннюю среду ЦНС составляет цереброспинальная жидкость (ЦШ (Эйнштейн, 1938). Состав ЦСЯ отражает обмен веществ мозга (Вартанян, Балабанов, 1978; Варташн, Клементьев, Петров, 1984; Макаров, 1984,- 1992). Изменения в составе ЦСЖ возможно выявить, используя биологический метод тестирования ЦСЯ в оргадатипической культуре нервной ткани (Буравлев, Вепринцев, Викторов и др., 1977). 8 культуре ткани создаются условия для строго дозированного изменения состава среды,, вне зависимости от влияний гуморальных и других факторов в целостном организме. Исследование нейрот-рофической активности ЦСЯ пациентов с диагнозом эпилепсия в культуре нервной ткани имеет ватное значение, поскольку позволяет вы-
явить участие отдельных НТФ в процессах, протекающих 8 гогооном мозге при эпилепсии, проследить изменения нейротрофических свойств ЦСЖ в динамике, на разных стадиях патологии (Чалисова, Акоео, Яцук и др., 1993; Людыно, 1993).
Для изучения патогенетических механизмов эпилепсии и компенсаторных процессов, развиаающихся в нервной ткани в ответ на повреждало воздействия возбуждающих медиаторов, разработаны модели эпилептегеноза in vivo - на яизотных, и In vitro - с использованием переживающих срезов и культур фрагментов гиппокампа и нео-кортекса. (Franck. 1991; Favaron, Manev, fiiialand, 1993). Применение экспериментальной модели эпилептогенеза с использованием сочетаемых культур гиппокампа и спинальных гаяглиео позволяет выявить возможное участие НТФ в компенсаторных процессах, исследовать эффекты выделяемого в культурапьнуп среду НТФ о заданных экспериментальных условиях САкооп, Чалисова, Людьно, и др., 1995; Akoev, Ctiallsova. Ludino, et al., 1995).
С помощью таких подходов возможно исследовать различные аспекты эпилептогенеза и выявить метаболические изменения, происходящие в нервной системе при судорожной активности.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Исследозать участие НТО в регуляции мор|вфункциональныя свойств нейронов при эпилептической активности, используя метод биотестирования цереброспинальной яидкости больных эпилепсией s органотипической культуре спинальных ганглиев и модель экспериментального эпилептогенеза в сочетанной культура гиппокампа и спинальных ганглиев.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Исследовать в культуре спинальных ганглиев куриных эмбрионов нейротрофические свойства ЦСЖ больных эпилепсией.
2. Идентифицировать фактор, определяющий нейротрофические свойства ЦС2 больных эпилепсией, используя метод иммунохимическо-го анализа.
3. С помощь*) метода сочетанного культивирования фрагментов гиппокампа новороаденных крыс и спинальных ганглкеэ куриных эмбрионов, разработать модель для выявления связи между повышенной электрической активностью нейронов гиппокампа, вызванной введением о среду эпилептиформных агентов ( вератридина и КС1) и уровнем НГв в культуральмой среде.
- (j -
4. Используя иммунохимический метод, определить, какие НТФ выделяются в сроду нейронами гиппокампа при соэдействии вератри-дина и KCl, и оказывает влияние на развитие эксплантатов спинальных ганглиев.
5. Используя оргачотипичсскую культуру спинальных ганглиев в качество тест-системы для выявления ни'фит-стимулирующей активности, исследовать изменение уровня НТФ в ЦСЖ больных эпилепсией и культуральиой среде при экспериментальном эпилептогенезе. как одно из проявлений компенсаторных механизмов, направленных на реализацию регенерационных сюзможкэстей нейронов при повреждении.
НАУЧНАЯ НОЕИЗНА
При исследовании нейротрпфнческих ссойств ЦСЖ неврологических больных впервые показано:
1. ЦСЖ больных с эпилепсией оказывает нейрит-стимулирующее действие на эксплантаты спинальных ганглиев при тестировании проб ЦСХ в органотипической культуре ткани.
2. Выявлено, что нейрит-стимулирующие свойства ЦСЯ больных эпилг.псией в значительной степени определяется присутствием ФРН.
3. Показана возможность исследования уровня НТФ и их идентификация при экспериментальном эпилептогенезе in vitro, с использованием метода сочетанного культивирования фрагментов гиппокампа. новорожденных крыс и спинальных ганглиев куриных эмбрионов.
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ '
Представленные экспериментальные данные вносят вклад в исследование проблемы нейротрофической регуляции и поддержания свойств нейронов при повреждающих воздействиях, вызванных процессами, протекающими в нервной ткани при эпилептической активности. Полученные результаты свидетельствуют об участии НТФ в компенсаторных процессах в головном мозге при эпилепсии.
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Результаты исследования выявили возможность использования метода биотестировачия ЦСЖ в культуре спинальных ганглиев для оценки состояния больного эпилепсией и прогнозирования течения заболевания, а также в качестве дополнительного теста при диагностике неврологических заболеваний, сопровождающихся суаорожным синдромом.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Экспериментальный материал, представленный в диссертации,
доложен на III Всесоюзной конференции по нейронаукам, Киев, 1990; на Всероссийской научной конференции "Детская неврологическая ин-валидизация. Пути преодоления". Самара, 1993; на научной конференции "Актуальные вопросы клинической диагностики", Санкт-Петербург, 1993; на заседании Всероссийского Общества анатомов, гистологов, эмбриологов , Санкт-Петербург, 1994; на Международном симпозиуме "Физиолого-биохинические основы жизнедеятельности мозга", Санкт-Петербург, 1991; на иеклабораторном заседании Института физиологии им.И.П.Павлова РАН 13 января 1995 г; на заседании Международной зимней школы молодых ученых по нейробиологии "Современные достижения в изучении метаболизма мозга", Санкт-Петербург, 1995.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для решения поставленных в работе задач применялись методики культивирования нервной ткани, методы морфометрического, гистологического, электрофизиологического, иммунохимического исследования. В качестве экспериментальных животных использовались 10-12-дневные куриные эмбрионы и 3-4 и 7-9-днеонке крысы.
Культивирование осуществляли по методу вращающихся пробирок с применением коллагеновых подложек. Покровные стекла с прикрепленными к ним эксплантатами вносили в пробирки, содержащие 1,5-2 мл питательной среда, плотно закрытые пробирки помещали во вращающийся барабан аппарата для культивирования тканей, установленного в термостате при температуре 36,8°С.
При использовании метода сочетанных культур на покровные стекла помев!али эксплантаты из различных структур (спинальные ганглии на уровне пояснично-крссцового отдела спинного мозга куриных эмбрионов, и фрагменты гиппокампа крысят) на расстоянии 3 им друг от друга.
Для исследования нейротрофических свойств ЦСЖ получали посредством лшбальной пункции. При тестировании ЦСЖ в культуре ткани пробы добавляли в культуральную среду в разведении 1:10, 1:5 В качество контрольных служили эксплантаты, развивавшиеся в среде без добавления ЦСЖ, поскольку в экспериментах по тестированию ЦСЖ интактных животных (кошки, крысы) в культуре ткани, а такте при исследовании ЦСЖ больных, у которых отсутствовал активный патологический процесс d ЦНС (с диагнозом спинномозговая грыжа), но било выявлено влияния ЦСЖ на развитие эксплантатов.
В модели экспериментального эпилептогенеза определяли влияние деполяризующих веществ - вератридина (агониста Na-каналов) и KCl - на уровень НТФ в среде при сочетанном культивировании спи-нальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов и фрагментов гиппокампа 3-4- и 7-9-дневных крыс. Предварительно исследовали эффекты действия вератридина и KCl на развитие эксплантатов спи-нальных ганглиев, развивавшихся в сочетанной с фрагментами гиппокампа культуре, при введении этих веществ в среду в различных концентрациях: 1) вератридин (Sißma): 30 нМ; SO нМ; 100 нМ; 2) KCl: 0.5 мМ. 1 ыМ, 5 ыМ, 30 мМ. Выбирали оптимальные концентрации препаратов, при которых выявлялся нейрит-стимулирующий эффект в отношении чувствительных нейронов ганглиев и не наблюдалось токсического действия, выражавшегося в угнетении развития эксплантатов. Эксплантаты спинальных ганглиев, развивавшиеся в сочетанной с фрагментами гиппокампа культуре в среде без добавления деполяризующих веществ, считались контрольными.
Уровень НТФ в культуральной среде оценивали по степени роста нейритов как тест-системы для выявления нейротрофических свойств содержащихся в среде веществ (Чалисова, Мелькишев, Акоев и др., 1991). Рост нейритов в культуре ткани исследовался прижизненно с помощью светового микроскопа, а также на гистологических препаратах, окрашенных метиленовым синим, гематоксилин-эозином и с применением импрегнации серебром по Бильшо'вскому-Гросс. Для количественной оценки влияния тестируемых веществ на рост нейритов применяли морфоыетрический метод. Учитывая неоднородность морфологической картины эксплантатов, с целью унификации конечных показателей степени роста нейритов для.ее оценки использовали относительный критерий - индекс площади (ИП). Интенсивность роста эксплантатов оценивали по величине ИП. который рассчитывается как отношение площади всего эксплантата, включая периферическую зону роста, к исходной площади ганглия. За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки микроскопа (сторона квадрата при увеличении 3,5x10 равнялась 150 мкм). Контрольное значение ИП принималось равным 100%. В каждой экспериментальной серии за "п" принимали количество эксплантатов, развивавшихся в культуральной среде при добавлении тестируемого вещества. Статистическая обработка производилась с использованием t-критерия Стъюдента.
С целью оценки Функционального состояния эксплантатов спи-
нальных ганглиев куриных эмбрионов, изучали уровень спонтанной активности нейронов в различные сроки культивирования (от 24 ч. до 5 суток). Опыты проводили в термостатированной (35 - 36"С) камере. Спонтанную импульсную активность нейронов отводили экстрак-леточно с помощью платинозого электрода и регистрировали на кинопленку с экрана катодного осциллографа С1-18, используя фоторегистратор ФОР-2.
Для идентификации НТФ в культуральмой средс использовали антитола к ФРН. Предварительно исследовали влияние 4>РН на раззитие эксплантатов в условиях конкретного эксперимента с целью определения эффективных концентраций действия СРН и соответствугких концентраций антител. Тестируемые вещества вводили в культураль-ную среду в концентрациях: 1) ФРН - 20 нг/мл, 40 нг/мл, 80 нг/мл; 2) антитела к ФРН - 400 нг/мл, 800 нг/мл. 1600 нг/мл. Влияние ФРН на развитие эксплантатов спинальных ганглиев и активность антител к ФРН оценивали через 3-5 суток культивирования, используя морфо-метрический метод.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты светооптического исследования с использованием методов специфической окраски нервной ткани, а также данные оценки функционального состояния эксплантатов посредством метода внеклеточной регистрации спонтанной активности, показали, что при культивировании спинальных ганглиео 10-12-дневных куриных эмбрионов имели место морфофизиологичсские процессы, характерные для их нормального развития в условиях целостного организма. Так, в эксплантатах спинальных ганглиев на 3-й сутки культивирования выделялись две основные зоны. Центральная зона зкеплгнтатов состояла из немигрирующих дифференцирующихся нейробластоп. Множество отростков, пролиферирующих клсток-сателлитов и фибробластоподобных клеток Формировали периферическую зону роста. В ганглиях после их выделения из организма и в эксплантатах на 1-е сутки инкубации спонтанная электрическая активность отсутствовала. Через 2-3 суток появлялись редкие одиночные, низкоамплитудные спонтанные потенциалы. Частота спонтанной активности на 4 - 5 сути культивирования в среднем была равна 0, 50 * 0,34 имп/с.
В органотипической культуре спинальных ганглиеп куриных эмбрионов исследовали нейротрофические свойства ЦСЖ при заболеваниях
ЦНС у детей. Было протестировано 67 проб ЦСЖ.
Из всех групп исследованных заболеваний наиболее устойчиво проявлялся эффект стимуляции развития эксплантатов при добавлении в среду ЦСЖ пациентов с эпилепсией. ЦСЖ больных с диагнозом эпилепсия в 96*. случаев оказывала стимулирующий эффект. Среднее значение индекса площади (ИП) экспериментальных эксплантатов бьшо на 68.2 ± 1.236 (п - 220, Р<0,05) выше среднего значения ИЛ контрольных эксплантатов (п » 36), развивавшихся в среде без добавления ЦСЖ.
Выявлены различия показателей ИП в группах больных разного возраста, с разными продолжительностью заболевания, частотой судорожных припадков, этиологией заболевания.
В трех возрастных группах - 1) до 5 лет; 2) от 5 до 10 лет; 3) от 10 до 15 лет - средние значения ИП экспериментальных экс-птантатов были выше среднего контрольного значения на 95,0 ± 9,8% (п - 18, Р<0,05), 72,3 ± г.П (п - 54, Р<0,05), 65,1 i 1,6% (п -117, Р<0,02).
При исследовании зависимости нейрит-стимулирующих свойств ЦСЖ больных эпилепсией от продолжительности заболевания обнаружены достоверные отличия показателей ИП в группах больных с продолжительностью заболевания до 5 лет и более 5 лет. Средние значения ИП эксплантатов были выше контрольного значения на 62,8 ± 2, \% (п - 54, Р<0.05) и на 6S,8 ± 2,2% (п - 90, Р<0,05), соответственно.
Выявлены различия показателей ИП при тестировании ЦСЖ больных эпилепсией с разной частотой припадков. В группе пациентов с редкой частотой припадков (несколько раз в год) значение среднего ИП эксплантатов было на 45 i 3,956 (п - 18, Р<0,05) выше среднего контрольного значения ИП. При частоте припадков 1 - 8 раз в месяц средний ИП экспериментальных эксплантатов на 112 ± 3.31 (п « 36, Р<0,05) превышал средний ИП контрольных эксплантатов. При тестировании ЦСЖ пациентов с частыми приступами (1-10 раз в сутки) ИП экспериментальных эксплантатов на 65,1 t i,2% (n - 126, Р<0,05) был выше контрольного значения ИП.
Выявлены достоверные различия средних ИП в группах пациентов с разной этиологией заболевания. Среднее значение ИП экспериментальных эксплантатов было выше среднего контрольного значения ИП при эпилепсии, возникшей как следствие родовой травмы, на 61,3 * 2,0% (п » 03. Р<0,05), в группе больных с эпилепсией воспалитель-
ной этиологии - на 67.5 * 1.2% (п - 72, Р<0,05), при эпилепсии травматической этиологии (постнатальная черепно-мозговая травма) - на 58,3 ± 2,5% (п - 54. РС0.05).
Пробы ЦСЯ одной из групп больных тестировали в культуре ткани при заборе ликвора на разных стадиях заболевания. У 8-ми больных эпилепсией пробы ЦС1 исследовались в послеоперационный период (операцию производили по поводу удаления очага эпилептической активности) , при этом в 6-ти случаях ЦСХ не оказывала влияния на развитие эксплантатов. У 4-х больных из этой группы пробы ЦСЖ брались до и после хирургической операции. Пробы ЦСЯ этих больных до операции оказывали стимулирующее действие на развитие эксплантатов. Средние значения ИП экспериментальных эксплантатов были выше контрольных значений ИП на 30 ± 1,8% (п » 9). 50 ± 2,1% (п » 10). 80 ± 2,7% (п - 10) и 30 1 1,45Ь (п - И); (Р<0.05). соответственно. При тестировании ЦСЯ этих асе больных после операции ИП эксплантатов снижался до уровня контроля.
С целью идентификации факторов, определяющих стимуляции роста нейритов чувствительных нейронов, з культуральную среду наряду с ЦСЖ больных эпилепсией добавляли антитела к ФРН в концентрации 800 нг/мл. Эффект стимуляции роста эксплантатов при добавлении в культуральную среду ЦСИ больных эпилепсией в значительной степени (на 40%) подавлялся антителами к ФРН.
Использованная в работе сочетанная культура фрагментов гип-покампа новорожденных крыс и спинальных ганглиев куриных эмбрионов явилась моделью для выявления влияния эпилептогенных веществ (вератридина, КС1) на выделение НТФ в культуральную среду. Тест-системой для выявления нейротрофических влияний служили эксплантаты спинальных ганглиев.
При добавлении в среду к сочетанным культурам гиппокамла 3-4-дневных крыс и спинальных ганглиев куриных эмбрионов вератридина в концентрации 90 нМ наблюдали эффект стимуляции роста нейритов чувствительных нейронов спинальных ганглиев. Средний ИП эксплантатов спинальных ганглиев, развивавшихся в сочетанной культуре при добавлении в среду вератридина на 42.2 ± ТЛИ (п = 45, Р<0.05) был выше среднего ИП контрольных ганглиев (п = 36). Введение в среду вератридина в концентрации 30 нМ не оказывало влияния на развитие спинальных ганглиев при тех же условиях. При добавлении в культуральную среду вератридина о концентрации ЮО
нМ наблюдали ипгибируюций эффект в отношении чувствительных нейронов спинальных ганглиев.
Подтверждением того, что нейрит-стимулирующий эффект в отношении спинальных ганглиев был обусловлен действием НТФ, выделяющихся в среду при воздействии вератридина на гиппокамп, явились следующие результаты: средние значения ИП эксплантатов спинальных ганглиев куриных эмбрионов, развивавшихся в условиях органотипи-ческой культуры без эксплантатов гиппокампа, в контроле и при добавлении в среду вератридина в концентрации 90 нМ достоверно не отличались. При оценке морфометричсским методом развития фрагментов гиппокампа, культивируемых без спннапьных ганглиев, показано, что вератридин не оказывал влияние на рост эксплантатов гиппокампа. Не было выявлено эффекта влияния со стороны эксплантатов гиппокампа на развитие ганглиев. Однако, при добавлении вератридина (90 нМ) в среду к сочетанным культурам ИЛ эксплантатов спинальных ганглиев достоверно увеличивался по сравнению с контрольным ИГ1.
Эффект стимуляции роста эксплантатов спинальных ганглиев, наблюдаемый при добавлении в среду к сочетанным культурам вератридина (90 нМ), был сравним с эффектом ФРН (40 нг/мл) на развитие органотипически;: культур спинальных ганглиев. При добавлении в среду к сочетанным культурам антител к ФРН (600 нг/мл) эффект вератридина подавлялся, средний ИП экспериментальных эксплантатов достоверно не отличался от среднего значения ИП контрольных эксплантатов. Эти результаты явились подтверждением того, что вследствие действия вератридина на эксплантаты гиппокампа в куль-туральную среду выделялся ФРН.
При добавлении в среду к сочетанным культурам фрагментов гиппокампа новорожденных крыс и спинальных ганглиев куриных эмбрионов KCl получены следующие результаты:
В сочетанной культуре спинальных ганглиев и фрагментов гиппокампа 3-4-дневных крыс наблюдали эффект стимуляции развития эксплантатов спинальных ганглиев при добавлении в среду KCl в концентрациях 0,5 мМ; 1 мМ. ИП эксплантатов ганглиев были достоверно (Р<0, 05) выше контрольных значений ИП на 38,8 ± 24,0% (п » 11) и 119, 4 * 11,03t (n - 9) соответственно. KCl в концентрации 5 мМ оказывал ингибиругисс влияние, ИП эксплантатов был ниже контрольного значения на 67,2 ± В, 435 (п ' 9. Р<0,05). ИП эксплантатов спинальных ганглиев, развивавшихся в сочетанной с фрагментами
гиппокампа 7-9-дневных крысят культуре при добавлении KCl в концентрациях 1 мМ и 5 иМ превышали контрольное значение ИП на 184,4 í 20.4% (п - 7. Р<0,05) и 188,9 ± 24,4% (п - 9. Р<0,05). К Ci в концентрации 10 мМ оказывал ингибирущее действие на рост нейритов чувствительных нейронов спинальных ганглиев. ИП был ниже контрольного значения на 55,6 t 18,0% (п - 9, Р<0.05). KCl оказывал нейрит-стимулирующее действие и непосредственно на эксплантаты спинальных ганглиев, развивавшиеся в органотипической культуре без эксплантатов гиппокампа. хотя эффект был менее выражен.
В целях идентификации факторов, выделяющихся в среду вследствие действия KCl на эксплантаты гиппокампа, использовали антитела к ФРН. Оказалось, что стимулирующее действие KCl не обусловлено влиянием ФРН, как в случае с вератридином, поскольку антитола к ФРН в концентрации 800 нг/мл не подавляли стимулирующий эффект.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Повышение уровня ИТФ в ЦСЖ больных эпилепсией и культураль-ной среде при экспериментальном эпилептогенезе обусловлено, вероятно, тем, что вследствие повышенной нейрональной активности запускаются компенсаторные механизмы, направленные на поддержание свойств нейронов и способствующие их выживанию. Одним из таких механизмов является усиление синтеза и высвобождения НТФ. Результаты наших исследований согласуются с данными других авторов, которые свидетельствуют об активации синтеза НТФ в нейронах при усилении афферентного потока ( Gwag, Springer, 1993).
Результаты, полученные при идентификации фактора, определяющего нейрит-стимулиругацие свойства ЦСЖ больных эпилепсией, свидетельствуют а значительной роли ФРН при этом виде патологии. Это подтверждается данными о том, что концентрация ФРН, ПМНТФ в головном мозге, а также уровень экспрессии рецепторов к ним, повышается посла воздействий эпилептифоршых факторов, вызывающих эпилептическую активность нейронов (Zafra, Hengerer, Le Ibrock et al., 1990: BIrren, Verdi, Anderson, 1992; Favaron, 1993). Возможность выявления нейрит-стимулирующего эффекта ЦСЯ, добавляемой в среду к органотипическим культурам спинальных ганглиев ÎO-12-дневных куриных эмбрионов обусловлена тем, что в этот период эмбриогенеза в нейронах спинальных ганглиев эспрессируется наиболее высокий уровень высокоаффинных рецепторов к ФРН ( Rotirer,
- H -
Barde, 19S2), который коррелирует с интенсивностью роста отростков (Heuer, Fatemle-Nalnle, Wheeler, 19Э0).
При эпилептической активности нейронов происходит накопление глутамата в экстраклеточнсм пространство в концентрациях, способных вызвать нейротоксический аффект ( Siman, Baudry, Lynch et al., 1984; Mattson. 1983; ColUngridße, 1992; Coyle, Puttfarcken, 1993). Было показано, что OPH может активировать ферменты анти-оксидантной защиты (Frim, Uhler, Short et al., 1993), способствуя угнетении процесса накопления в клетке свободных радикалов, который обуславливает цитотоксическое действие глутамата. С другой стороны, при воздействии глутамата на квисквалатные рецепторы, а также при активации метаботропных глутаматных рецепторов запускается каскад реакций, приводящих к активации протеинкиназы-С (Mattson, 1988), которая связана с регуляцией процессов развития и синалтической пластичности (Benowltz. 1987). В то eg время, активация протеинкиназы-С является необходимой для осуществления эффектов ФРН, обеспечивающих дифференцировку и рост отростков нервных клеток (Herman, Schulz. Claude. 1991).
Как известно, под влияиием эпилептизированной структуры коз-га происходит естественная активация антюпилептической системы (Kryzhanovsky, 1986; Крыжановский, 1980), при этом выделяется эндогенные физиологически активные вещества, которые оказывает антиэпилептические эффекты (Tortella, Long. 1988; Tortella, Long. 1988a, Крыжановский, Шандра, Годлевский и др., 1992). Вместе с тем, одним из эффектов ОРИ является повышение порога генерации потенциала действия (Aguayo, White, 1392). Следовательно, нельзя исключить, что НТФ принимают участие в осуществлении функций антиэпилептической системы в мозге, обеспечивая компенсаторные процессы, направленные на подаераание морфофункциональных свойств сохранившихся нейронов.
Результаты, полученные при использовании модели экспериментального эпилептогенеза. подтворздаат предположения об участии HTî в компенсаторных процессах, разпиващихся при эпилептической активности (Zafra, Hengerer. Leibrock, et al., 1990; Birren, Verdi, Anderson, 1992; Favaron, töanov, RlEhland, et, al., 1993; Frlm, Uhler, Short, et al., 1933). Использованный в нашей модели де-попярнзующий агент - вератридин - вызывал повышение уровня ФРН в культуральной среде при добавлении к сочетанным культурам гиппо-
кампа и спинальных ганглиев. При этом стимуляция синтеза НТФ может быть связана с повьшением концентрации в межклеточном пространстве (вследствие деполяризации гиппокампальных нейронов) ионов К+, активирующих метаболизм нейронов и астроцитов гиппокампа (Diaz-Nido, Montoro, Lopez-Barneo et al., 1993), которые, как известно, служат основным источником НТФ в ЦНС (Franck, Roberts, Patterson et al.. 1991).
Значительная стимуляция развития эксплантатов спинальных ганглиев куриных эмбрионов, развивавшихся в сочетанной с фрагментами гиппокампа культуре, при добавлении в среду КС1, вероятно также вызвана выделением НТФ в культуральнув среду. Однако, о нашей модели нейрит-стимулирующий эффект в отношении чувствительных нейронов ганглиев не был обусловлен действием ФРН. Возможно, в процесс регуляции роста нейритов вовлечены другие НТФ . поскольку известно, что в клетках гиппокампа помимо ФРН синтезируются пс-новной ФРС, ПМНТО, НТ-3, ИТ-4 ( Zafra, Hengerer, Lelbrock, et al., 1990: Patterson. Grover. Bothwell et al.. J99J; Riva. Gale, Graham et al., 1991; Zafra, Lindliolm, Castren et al., 3992).
Таким образом," в модели экспериментального эпилептогенеза введение деполяризующих веществ в среду к сочетанным культурам фрагментов гиппокампа и спинальных ганглиев вызывает нейрит-сти-мулируший эффект в отношении нейронов спинальных ганглиев, что вероятно обусловлено повышением уровня НТФ в культуральной среде вследствие активации компенсаторных процессов, направленных на поддержание свойств нейронов и предохранение их от позреядаицих воздействий, имеющих место при эпилептической активности.
ВЫВОДЫ
1. Цереброспинальная жидкость детей с диагнозом эпилепсия стимулирует рост отростков чувствительных нейронов спинальных ганглиев 10-12-днезных куриных эмбрионов в органотипической культуре ткани.
2. Иммунохимическим методом выявлено, что нейрит-стимулирую-щее действие цереброспинальной жидкости больнйх эпилепсией в от^ ношении чувствительных нейронов спинальных ганглиев куриных эмбрионов в значительной степени (на iO%) определяется действием фактора роста нервов.
3. Добавление деполяризующих веществ (вератридин, КС1) в
среду к сочетанным культурам Фрагментов гиппокампа новорожденных крыс и спинапьных ганглиев куриных эмбрионов вызывает стимуляцию роста нейритов чувствительных нейронов спинальныд ганглиев. /
4. Эффект стимуляции роста нейритов чувствительных нейронов ошнальных ганглиев, выявляемый при добавлении зератридина в среду к сочетанным культурам фрагментов гиппокампа новорожденных крыс и спинапьных ганглиев куриных эмбрионов, блокируется антителами к фактору роста нервов.
5. При добавлении KCl в среду наблюдается значительное увеличение зоны роста эксплантатов спинапьных ганглиев, развивавшихся в сочетанной с фрагментами гиппокампа культуре; антитела к Фактору роста нервов не подавляют стимулирующего эффекта.
6. Исследование клинического материала (биотестирование цереброспинальной жидкости больных эпилепсией) и применение модели экспериментальной эпилепсии in vitro позволили показать, что вследствие процессов, имеющих место в центральной нервной системе при эпилептической активности нейронов, усиливается синтез и высвобождение нейротрофических факторов, действие которых направлено на активацию компенсаторных механизмов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Чалисова Н. И., Мелькишев В. Ф., Акоев Г.Н., Людыно М.И., Куренкова Т.О. Нейрит-стимулирующее действие пролактина на орга-нотипическую культуру чувствительных нейронов //Цитология, 19S1, Т.33, N 2, с.29 - 31.
2. Чалисова Н. И., Акоев Г. Н., Яцук С. Л., Людыно М. И. Исследование нейрит-стимулируодей активности цереброспинальной жидкости при заболеваниях ЦНС у детей //Тез. докл. конФ. "Детская неврологическая инвапидизация.Пути преодоления", Самара. 1993.
3. Людыно М.И. Исследование нейрит-стимулирующей активности цереброспинальной «идкости при эпилепсии //Тез. докл. конф. "Актуальные вопроси клинической диагностики", С.-Петербург, 1993.
4. AkoevG. N., BabuK.S., Challsova N. I., Ludino M. I. The cerebrospinal fluid from patients »Ith prolactinoma promotes neu-rite grout« of sensory neurons //NeuroReport, 1993, N 4, pp.405 -400.
5. Чалисова H. И., Людыно M. И., Яцук С.Л. Исследование ней-ротрофической активности в биологических жидкостях организма
//Иорбология, 1993, N 7-8, с. 56-57.
6. Лавров В. В., Чалисова Н. И.. Людыно М. И. Нейрит-стимулиру-ющая активность спинномозговой жидкости кошек в норме и при экспериментальном неврозе /Лез.конф. "Клинический и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации", М, 1993.
7. Чалисова Н. И., Людыно М. И. Выделение фактора роста нервов в сочетанной культуре гиппокампа и атональных ганглиев при действии вератридина //Тез.докл. II Нейрогистологнческой конференции, посвященной памяти чл. -корр.АН СССР и АМН СССР Н. Г.Колосова "Ко-лосовские чтения-94", Санкт-Петербург. 1994, с. 74.
8. Акоев Г.Н.. Чалисова Н.И., Людыно М.П., Яцук С.Л. Влияние цереброспинальной «идкости больных эпилепсией на рост нейритов в культуре спинальных ганглиев курн.чых эмбрионов /Лез. докл. Меяду-нар.симпоз. "Физиологс-биохимические основы жизнедеятельности мозга", 22-24 июня 1994, Санкт-Петербург. - с. .
9. Акоев Г. И., Чалисова Н. И., Яцук С. Л., Людыно М. И. Стимулирующее влияние цереброспинальной жидкости больных эпилепсией на рост нейритов чувствительных нейронов в культуре ткани //Физиология человека, 1995, т. 21, N 4, с.
10. Акоев Г. Н., Чалисова Н. И., Людыно М. И., Терентьев Д. А., Романюк А. В. Влияние вератридина на выделение нейротрофических факторов в культуре нервной ткани //Физиологический журнал - в печати.
11. Akoev G. N.. Challsova N. I., LudinoM.I., Terent'ev D. A., Yatsuk S.L., Romanjuk A. V. Epileptiform activity Increases the level of nerve growth factor In cerebrospinal fluid of patients with epilepsy and in hlppocampai neurons In tissue culture //fieu-rosclence, in press.
- Людыно, Мария Иосифовна
- кандидата биологических наук
- Санкт-Петербург, 1995
- ВАК 03.00.13
- Влияние сократительной активности на физиологические и морфологические характеристики гладкомышечных клеток семявыносящего протока морских свинок
- Взаимодействие моноаминергических систем мозга, эндокринной системы с ликвором, содержащим нейроспецифические антитела
- Научное обоснование и разработка способов стимуляции кроветворения у животных при применении ликвора, оптических излучений и их сочетаний
- Фолдинг рекомбинантных нейротрофических факторов человека
- Механизм регуляции роста нейритов в органотипической культуре спинальных ганглиев