Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние сократительной активности на физиологические и морфологические характеристики гладкомышечных клеток семявыносящего протока морских свинок

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние сократительной активности на физиологические и морфологические характеристики гладкомышечных клеток семявыносящего протока морских свинок"

РГ6 од

? З^заЙский" ордена трудового красного ЗНАМЕНИ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи НИЗАМОВ РУСТЭМ САИДОВИЧ

УДК 612.73.821,

ВЛИЯНИЕ СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛАДКОМ ЫШЕЧ И ЫХ КЛЕТОК СЕЛ1ЯВЫНОСЯЩЕГО ПРОТОКА МОРСКИХ СВИНОК

03. 00. 13—физиология человека и животных

Автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1994

Работа выполнена в Казанском государственном медицинском институте им. С. В. Курашопа.

Научный руководитель: заслуженный деятель науки Республики Татарстан, доктор медицинских наук, профессор ПОЛЕТАЕВ Г. И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских паук,

профессор ВОЛКОВ Е. М.

кандидат биологических наук, доцент ХИРУГ С. С.

Ведущее учреждение: Московски!'! государственный университет им. И. В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится „ " мая !9£4 г. в ш часов

на заседании специализированного Совета К' 113.19.02 в Казанском государственном педагогическом институте: 420021, г. Казань, ул. Межлаука, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослав „

¿1 - апреля 1394 г.

Учец.ый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

МАКАЛЕЕВ И. Ш.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Фенотип гладкомышечных клеток (ГМК) формируется генетической программой и поддерживается в дифференцированном состоянии нервной и гуморальной системами организма. Нарушение нервного и гормонального воздействия вызывает структурно функциональную перестройку мышцы с возникновением гиперчувствитедьности и переходом ультраотруктуры от сократительного фенотипа к синтетическому (Camley-Cambel J. 1979., Шуба Ы. Ф. 1988). Возникшая гиперчувствительность и . ультраструктурная модуляция фенотипа ГЫК являются обратимыми. Гиперчувствительность снижается реиннерЕацией, введением экстрактов нервной ткани и электростимуляцией. В этих условиях наблюдается восстановление сократительного фенотипа ГМК (Bur-nstoct G. 1987). Сокращение мышцы является необходимым моментом, в процессах восстанавливающих постденервационные изменения. В них сложно разграничить влияние факторов, стимулирующих сокращение от прямого воздействия сокращения на восстановление денервационных. изменений.

/однако существует способ стимулирования сокращена ГЫК без Использования нейрональных воздействий и электростимуляции. ГМК способны сокраиатся в ответ на механическое растягивание (Орлов P.O. 1977. , Lafin Д. 1988. , Ostroumoff А. 1876. Sparks Н. v, 1964). Растягивание деформирует клеточную мембрану, увеличивает поступление Са из внешней среды, а также способствует высвобождению Са из внутриклеточных депо. Характер сокращения определяется способом растяжения. Быстрое динамическое растягивание возбуждает фазные сокращения, вызываемые поступлением - Са через "быстрые" Са-каналы и высвобождением

• - 3 -

Са из внутриклеточных источников (Щуба М, Ф. 1988). Медленное или статическое растягивание индуцирует тоническое сокращение, обусловленное исключительно поступлением Са из внеклеточной среды через "медленные" каналы (М1£Ьга Б. К. 1988).

Воздействие мышечного сокращения, вызванного растягиванием, на посгденервационные изменения до сих пор подробно не изучены. В связи с тем, что полное устранение влияния регуля-торных систем организма на гладкие мышцы достигается в орга-нотипической культуре, представляет интерес исследовать физиологические и морфологические механизмы изменения фенотипа ГМК в состоянии долговременной денервации и влияние на эти процессы мышечных сокращений, стимулированных растягиванием.

Дель'и задачи исследования. Целью настоящей работы было иследование влияния сокращения, стимулированного растяжением на физиологические и морфологические характеристики гладкомы-шечных клеток в органотипической культуре. Для достижении этой цели были поставлены следующе задачи:

1. Провести сравнительное исследование физиологических и морфологических свойств гладких мышц семявиносящего протока морских свинок с их изменениями в течении органотгашческо-го культивирования, сопоставляя механизмы потенциалаависимо-го и рецепторуправляемого возбуждения сокращения, свойства фазного и тонического компонентов сокращения и оценить их в связи с изменениями в ультраструктуре. содержании сократительных белков, пролиферации и миграции клеток.

2. Изучить влияние экстрактов нервной ткани и собственной сократительной активности, стимулированной статическим и периодическим растягиванием, на морфологические и физиологические характеристики эксплантатов гладких мышц в долговре-

менном органотилическом культивировании—

Научная новизна: Впервые показано, что морфологическая модуляция фенотипа ГШ от сократительного к синтегичес'сому проходит через стадию промежуточного фэнотипа, развитиз которого коррелирует с состоянием межлеточных контактен и завершается пролиферацией и миграцией клеток. Продольной статическое растягивание способствует сохранению сокрадаеюно-го фенотипа в продольном слое мышц, но не в циркулярном. При этом задерживается миграция ГМК, но не эпителиальных и фибро-бластоподобных клеток.

Впервые показано, что изменения потенциалзависимюг механизмов сокращения происходят одновременно с модуляцией фенотипа вплоть до распада эксплантата на одиночные клетки на 33-36 сутки культивирования. В то же время рецепторуправляе-мые сокращения после максимума гиперчувствительности на 9 сутки резко уменьшаются до минимального уровня, при котором сокращения осуществляются другими механизмами.

Впервые показано, что сократительная активность, стимулированная статическим растягиванием в течении 9 и 15 сут, также как и экстракты симпатической нервной системы, препятствуют возникновению постденервационной гиперчувствительности и*смене механизмов регуляции сокращения.

Впервые показано, что эксплантаты адаптируются к периодическому растягиванию в течении 9 сут увеличением силы сокращения и усилением гиперчувствительности.

, впервые показано, что в интактных ГМК норадреналин вызывает фазное сокращение с небольшим тоническим последействием, при этом блокирование фазного сокращения иохимбиком, позволяет полностью проявится силе тонического сокращения, равном по-

ловине фазного. В контрольном гиперчувствительном эксплантате фазное сокращение снижается в 5,2Б раз. В тоже время у эксплантатов, культивированных с периодическим растягиванием фазное сокращение не изменяется, оно остается равным фазному сокращению интактных мышц. При этом способность к тоническому сокращению во всех вариантах остается на одном уровне, равном половине фазного сокращения интактных мышц.

Положения выносимые на защиту.

1. Денервация и бездействие гладких мышц ведут к физиологическим и морфологическим изменениям фенотипа с переходом ультраструктуры клеток от сократительного фенотипа к синтетическому с потерей межклеточных контактов. Изменения коррелируют со снижением потенциалаависимых механизмов сокращения. При этом возникает гиперчувствительность со снижением фазного сокращения и последующим резким уменьшением рецепторуправ-ляемого сокращения.

2. Сократительная активность,.стимулированная статическим и периодическим растягиванием, также как и экстракты ганглиев вегетативной нервной системы, эффективно препятствуют, возникновению лостденервационных изменений и поддерживают фенотип ГМК е дифференцированном состоянии.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на III Всесоюзном совещании ''Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1990); Vi; Всесоюзном симпозиуме "(Еиаиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1931); XIV Конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 1992).

Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 15 работ. .

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 174 страниц состоит из введения, обзора .литературы, объекта и методов-исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, еыводоз, списка литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 16 таблицами. Список литературы включает 346 наименований, из них 277 - иностранны: авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работу проводили на органотипкческих и клеточных культурах, а также на интактних гладких мышцах се-мявыносящего протока (СП) морских свинок. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Органотипическое культивирование проводили в пластиковых чашках Петри на подставках в миниэксика-торах собственной конструкции. В стерильных условиях из простатической части СП морских свинок вырезали полоски длиной 4 мм и диаметром сечения 0,75 мм. К концам полосок привязывали капроновые нити и пропускали в отверстия в основании стенок чашек. К ниткам привязывали стеклянные отягощения весом по 40 мг. Под подвязанный эксплантат подводили покровное стекло покрытое трехмерным, коллагеновым гелем. Рядом с опытным помещали контрольный эксплантат без отягощений. Трехмерный гель готовили смешиванием 7,5 мл уксуснокислого коллагена (2-4 мг/ мл), 1 мл десятикратной среды ДНЕМ, 1 мл сыворотки эмбрионов коров и 0,5 мл 0,2 Н ИаОН. Питательную среду добавляли в чайку Петри так, чтобы образовался вогнутый мениск и вершина геля возвышалась над уровнем среды, но смачивалась капиллярным слоем жидкости. В работе использовали питательную среду, состоящую из 90£ среды ДМЕМ, 10 7. сыворотки эмбрионов коров, 0,8 ед/мл инсулина, 10 мМ ГЕПЕС, 0,85 г/л бикарбоната натрия,

100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Чашку Петри переносили в миниэкеикатор и ставили на подставку, отягощения свешивалась вниз и статически растягивали эксплантат. Миниэкеикатор заполняли газовой смесью из 60% кислорода, 35% азота и 5% углекислого газа и инкубировали 30-36 сут, меняя питательную среду и газовую смесь через каждые 3 сут.

Режим фазного сокращения гладких мышц создавали в специальном устройстве собственной конструкции. В системе растягивания к эксплантатам привязывали отягощения из намагниченного железа весом по 10 мг. Коллагеновый гель заменяли на чистое покровное стекло. Чашку Петри заполняли средой и распределяли вдоль бортов так, чтобы образовался вогнутый мениск. Уровень среды достигал не более четверти высоты эксплантата и окружал его капиллярным слоем. Миниэкеикатор ставили на край платформы, под которой с помощью электродвигателя дви-гаися магнит. Он притягивал металлические отягощения и растягивал эксплантат. Растягивание прекращалось, когда магнит двигался дальше и эксплантат произвольно сокращался. При повторном подходе магнита один ра? в 9 мин цикл растягивание -сокращение повторялся. .; •. ,

Для анализа влияния нейротрофичэских факторов контрольные, не растянутые эксплантаты культивировали яа плоском код-лагеновом геле с экстрактами иг вегетативной (верхний шейный ганглий - ВШГ) и периферической нервной системы (отревки се-далидаого нерва - СН).: Методика состоит в следующем: У 14 морских , свинок извлекали Е411Г и отрезки СЕ Гомогенезировали (3000 об/мин) 5 мин И отделяли экстракт центрифугированием. В экстрактах определяли белок по Лоури и растворяли в питательной среде в конечной концентрации 100.мкг/мл. Среду с

" 8 т

экстрактами добавляли в начале культивирования и во время смэны среды на 3 и 6 сутки.

Для клеточного культивирования эпителиальные (ЭК) и фиб-робластоподобные клетки (ФБЛ) получали миграцией из эксплантатов. В первые 3 сут ЭК и ФБЛ выселяясь из слизистого слоя и поверхностной соединительной ткани на кэллагеновую подложку. Затем убирали эксплантат и монослой клеток испстьзовали для работы. Для получения ГМК ткань СП очищали от слизистого слоя и адвенткции, нарезали на кусочки и валивали диссоциирующей смесью, состоящей из коллагеназы - 2 мг/мл, бычьего сывороточного альбумина - 2 мг/мл, ингибитора трипсина из соевых бобов - 0,5 мг/мл и ДНКааы - Я мг/мл на буфере Дуль-бекко без Ca и Mg. Инкубировали 2 часа при 37е С с перемеши ванием. Пипетировали и полученную клеточную езвэсь отделяли тройным центрифугированием. Клетки ресуспендировали в среде и'сеяли на стекла с плотностью 10D00G кл/мл. Для исследования фено.типа ГМК эксплантаты вплоть до 33 сут культивирования диссоциировали на одиночные клетки вышеописанным методом. ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Сократительные характеристики препаратов регистрировали в изометрическом розкиме модифицированным методом одиночного сахарозного мостика с помощью механо-элегогрического преобразователя оригинальной конструкции. Измеряемый препарат вводили в камеру сахарозного мостика и растягивали за нитки. После стабилизации препарата с нагрузкой, равной 1 г, в течении 30 мин, добавляли тестируемые вещества (KCL, НА, ПРЗ, ИХВ, мёзатон, клонидин и ацетилхолин) и измеряли амплитуду одиночного сокращения. Электрические сигналы с механотрона 6MXLC регистрировались на двулосеьом графопостроителе НЗОб. Силу сокращения рассчитывали исходя из ампли-

туды сокращения ис формуле

F - A L / Р

где F - сила сокращения в Н/м^юЗ д - амплитуда сокращения на графике в мм, L - длина препарата, Р -, плотность ткани. Устанавливали порог чувствительности (ПЧ) препарата на действие минимальных концентраций медиатора з мкМ/л. Определяли максимальный сократительный ответ (МСО) препаратов в НЛ^.на действие насыщающих концентраций агонистОв. Строили графики концентрации - эффект, по ним определяли значение кажущейся

константы диссоциации (ЕДГ ) в мкМ/л, чкслэнко равную кон-

i

центрации агониста, вызываторго 50Х ответ ог максимального.

Для определения чклада тонического и фазного компонентов в сократительный ответ действие НА измеряли в присутствии празозина С ПРЗ j и иохимбина (ИХМ). Препараты инкубировали с тестируемой концентрацией антагониста в течении 30 мин. Затем в присутствии антагониста проверялось действие воарос-таюсих концентраций КД. Процедура повторялась с каждой из исследованных концентраций антагониста (от 1 нМ до 0,1 мМ), с огмывом, не менее 60 мин. 'Для блокирования возможного нейрот нального захвата катехоламина, препараты преинкубировали с 0,01 мМ/л аскорбиновой кислотой и ответы регистрировали в ее присутствии. По амплитудам механических ответов построили графики доза-эффект и определяли процентное блокирование селективными антагонистами сократимость препаратов. Бее результаты измерений обрабатывались статистическим анализом. , МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ. Для ультраструктурного анализа использовали интактные ткани, эксплантаты со статическим растягиванием и контрольные эксплантаты, культивированные в течении месяца. Через каждые 3 сут отбирали по 4 эксплантата.

Фиксировали 4,5 часа при 4еС в смеси из 2 7. параформальдеги-. да и 2,Б % глутарового альдегида на 0,1 М кокадилатном буфере. Постфиксировали в 1% 0з0/+ 1 час при 4" С. После обезвоживания в спиртах и окиси пропилена ткани заключали в Эйси 812. Срезы готовили на ультратоме KB-8800, окрашивали урачи.шцета-том и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе ЭМ-200 и ЕМ-100 ЕХ

МЕТОДЫ ИШУНСГИСТОХИМКИ. Покровные стекла с клетками о? клеточных и органных культур различного возроста фиксировали метанолом. ЭК идентифицировали моноклональными антителами (МКАТ) к цитокератинам N8 и Н4. МКАТ определяли перокс/даза-антипероксидазным методом. ГМК и ФБЛ идентифицировали поли-клональными антителами (ПКАГ) к мышечным и немышечным формам миозина из гладких мышц иммунофлуоресцентным методом. Препараты исследовали люминесцентным микроскопом ЛСМАМ Ш. МЕТОДЫ РАДИОАВТОГРАФ!®. Пролиферацию клеток еемявыносящего протока при миграции из эксплантата анализировали методом радиоавтографии с помощью меченного тритием тимидина. На 3, 12, 24 и 30 сут в чашки с культурами добавляли среду с тимидином в конечной концёнтрацяи 0,2 МБк/мл для суточной инкубации. Радиоавтографы-готовили общепринятым методом (Епифанова O.K. 197?). На препаратах подсчитывали индекс меченных ядер (ИМЯ), равный количеству клеток с мечйшыми ядрами в процентах от общего числа клеток.'

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1, Морфологические изменения ГМК При органотилическом культивировании на поверхности трехмерного коллагенового геля, более полно сохранялось диф-

ференцировакные свойства тканей. Эксплантаты имели естественную опору, были окружены газовой смесью и питательные вещества поступали к ним свободной диффузией. В начале культивирования эксплантаты раслаблялись, затем к 6-9 сут у них повышалась чувствительность к механическим воздействиям и к 18-21 сут все контрольные эксплантаты максимально сжимались.

УЛЬТРАСТРУКТУРА ГМК. Электронно-микроасопические исследования показали, что ингактные ГМК СП имеют ультраструктуру сократительного типа. Клетки вытянутой формы с центрально расположенным ядром с одним-двумя умеренно активными ядрышками. Вся толщ клетки заполнена органоидами сократительного аппарата (ОСА), толстыми к тонкими миофиламентами и связанными с ними плотными тельцами. В ГМК 3 сут культур появлялись первые ультраструктурные изменения. Ядрышко из умеренно активного становилось хромонемным высокоактивным с увеличенной гранулярной и фибриллярной зоной. Но рибосомы и шероховатый акдоплааматический ретикулюм - органоиды белоксинтезирувдэго аппарата (ОБА) появлялись только на 9 сут. Это свидетельствует о необходимости в клетке предварительного синтеза и накопления предпзственников рибосом перед их массированным появлением. В течении одного месяца культивирования происходил медленный переход фенотипа от сократительного к синтетическому через промежуточную стадию. Постепенно уменьшалось количество ОСА и возрастало масса ОБА. На 24 сут синтетический фено-? тип начинал преобладать." над сократительным. Размеры клеток увеличивались, расширялись межклеточные пространства. Десмо-сомоподобные контакты отделялись друг от друга их количество уменьшалось. Отмечалось прямая коррелящя между увеличением ОБА и снижением количества межлеточных контактов. Но в зкс-

плантатах даю на 30 сут наблюдалось многообразие ГМК по со держанию миозинов, выявляемых ПКАТ. В основной массе ГЫК бег миозинов встречались клетки со средним и большим содержанием сократительных белков. В ГЫК со средним содержанием миозинов сокращалась не вся' клетка, а только зоны с миофиламентами. Концевые участки без миозинов оставались расслабленными.

ПРОЛИФЕРАЦИЯ И НИТРАЦИЯ КЛЕТОК. ГМК локализованные на краю эксплантата наиболее быстро модулировали фенотип и к 1824 сут мигрировали на подложку* Мигрировавшая ГМК находилась в синтетическом фенотипе. На ее поверхности образовывались сооочкообразные микроворсинки, которые возникали при отделении клеток друг от друга, на месте деомосомоподобных структур. Миграция клеток зэеисило от способности эксплантатов сохранять тканевые свойства. Интенсивность миграции клеток была прямо пропорциональна площади контакта ткани со средой, обратно пропорционально возрасту животного донора ткачей и величине эксплантата Первыми мигрировали ЗК и ФБЛ на 2-3 сут. ЭК идентифицировались МКАТ к цитокератинам N8 и Иммиграции предшествовало-деление исходной ЭК в слизистом слое и дочерняя клетка выселялась в зону роста. Пролиферация ЗК в первые 9 сут составляла 19,63 - 8,09 %, на 12-16 сут резко снижалась до 4,16 ± 1,6 7. и оставалось на этом уровне до конца культивирования. В зоне роста ЗК мигрировали, делились а к 9 сут образовывали около эсплантата монослий клеток. В результате миграция ЗК приостанавливалась и пролиферация е слизистом слое снижалась до базальногс уровня.

ФБЛ идентифицировали ПКАТ к немыгсечным формам миозина. ФБЛ в СП располагались на поверхности ткани, ь мишечнкх слоях они отсутствовали. ФБЛ распластывались на поьерхности экс-

плантата и интенсивно делились. ИМЯ, в первые 6 сут колебался от 32,28 ± 2,7 ДО 40 ± 11,29 X, к 9 сут снижался до 14,2 ± 4,94 X и повышался на 15 сут ДО 62,5 ± 3,59 X. ФБЛ непрерывно мигрировали в вону роста и заполняли.подложку.

ГМК идентифицировали ПКАТ к гладкомышечному миозину. ИМЯ в эксплантате в первые 6 сут колебалось от 12,67 ±1,04 до 15,11 ¿ 4,71 на 9 сут снижалось до .1,34 + 0,29 7. и оставалось на низком уровне до конца культивирования.

Б экспериментах с продольным статическим растягиванием ГМК сохраняли сократительный. фенотип в продольном,слое мышц до 24 сут. В циркулярном слое ГМК переходили к промежуточно-, му фенотипу на 9 сут, также как и ГМК в контрольных эксплантатах. Растягивание эксплантатов задерживало миграцию ГМК, но не ЭК и ФБЛ. Эти результаты указывают, что сократительная активность ГМК, стимулированная статическим растягиванием, поддерживает морфологию ГМК в диффэренцированном состоянии.

2. Физиологические свойства ГМК в интактных мышцах

и в органотийической культуре '

В интактных гладких мышцах потенциалзависимое сокращение на хлористый калий (KCl) вызывало доэо-независимое фазное сокраш/эние силой 9,75 ± 3,77 H/m2.1Q5. Норадреналин (НА) стимулировал рецепторуправляемое дозо-зависимое фазное сокращение (6,74 ±0,8 НЛ12.105). Адреномиметик мезатон возбуждал сокращение сильнее (11,4 ± 2,74 Н/м^ю'), чем адреноб-локатор клофеллин (2,47 ± 0,33) и ацетилхолин (4,35 .'£ 0,73).

В начале культивирования эксплантаты гладких мышц находились в состоянии шокового переживания и постепенно к 6-9 сут адаптировались к условиям культивирования. Эксплантаты

на 6 сут отвечали на действие KCl наибольшим МСО (12,03 -2;35), который достоверно не отличался от МСО интактных тканей/ Сила сокращения на KCl прогрессирующе снижалась до полного прекращения на 36 сут, ко времени окончательного разрушения тканевой структуры эксплантата. Но достоверное отличие от силы сокращения интактных мышц на?тупа/ю на 24 сут, когда а ГМК начинали преобладать признаки синтетического фенотипа. Корреляция между уменьшением МСО на воздействие KCl и степенью модуляции фенотипа ГМК свидетельствует, что снижение силы сокращения зависит больше от уменьшения количества миофиламентов и нарушения межклеточных контактов, чем от изменения потенциалзависимых Ca каналов. Сила сокращения эи-шзантатоз на НА к 6 сут культивирования приобретала дозо-за-висимую форму с достоверным понижением ПЧ и ЕД^0 , но ИЗО не отличался от МСО интактных мышц. На 9 сут- максимально увеличивался сократительный ответ (188,83 ± 23,0 7.) со снижением ПЧ (39,12 ± 9,'51 Z) и *ЕД50 (28,97 ± 7,67 X) от выявленных показателей интактных полосок. Эти изменения отличались с высокой достоверностью (Р<0,01). График доза-отзет сдвигался влево от графика сокращения интактных полосок.. Эти данные свидетельствуют, что на 9 сут культивирования эксплантаты становятся гиперчувствительными как и при денервации.

Спустя 12 сут от начала культивирования наступал резкий спад сократительной активности контрольных эксплантатов. JjCO снижался до 27,89 £ 7,79 % от данных интактных мышц и на 16,17 ± 4,2 % от показателей 9 сут эксплантатов. До 30 сут культивирования сократительный ответ на НА оставался на одинаково низком уровне. Сила сокращения совпадала с сокращением 24 сут эксплантатов на KCl, когда происходила массирован-

- 1Б -

ная модуляция ГИК. Следовательно о 12 сут происходит переход механизмов сокращения с рецепторуправляемого на потеяциалва-висиыыЯ. ■

3. Влияние экстрактов нервнойткани на сократительные свойства эксплантатов.

Эксплантаты СП, культивированные в течении 6 сут в присутствии экстрактов верхнего шейного ганглия (ВШГ) имели одинаковые с интактными гладкими мышцами МСО (111,72 ± 49,11 7., Р>0,1), ПЧ (69,84 + 23,95 X, Р>0,05). Эти данные достоверно не отличались от данных полученных при анализе контрольных, гиперчувствительных эксплантатов, культивированных без экстрактор. Однако, сравнивая всю форму графика ¡поза-ответ с кривыми, полученными при анализе тех же величин у интактных полосок и контрольных эксплантатов следует заключить, что график больше соответствует данным от интактных тканей. Учитывая, что ткани, культивированные с экстрактами имеют ЕД больше, чем у гиперчувствительных . эксплантатов (186,88 ± 23,91 %, Р<0,05) и меньше, чем у интактных полосок (64,14 ± 6,93 X, Р<0,01), можно предположить, что наличие экстрактов ВШГ в питательной среде, достоверно снижает гиперчувотвитель-ность эксплантатов, в тоже время это снижение не достигает уровня интактных мышц, вероятно, в виду недостаточного количества экстрактов. Эти данные подтверждают наличие в экстрактах симпатических ганглиев гипотетических нейротрофических веществ, поддерживающих дифференцированный фенотип ГМК.

Эксплантаты, культивированные с экстрактами седалищного нерва снижали силу сокращения. МСО составляет 16,73 ± 7,87 7. (Р<0,001) от показателей интактных полосок и 8,56 + 4,28 %

(Р<0,01) от контрольных эксплантатов. Эти данные свидетельствуют, что в экстрактах СН отсутствуют нейротрофические вещвс-тва для ГЫК, ноимеются вещества, угнетахвдэ сократительную активность гладких мышц в культуре,

Таким образом, гиперчувсгЕительность эксплантатов действительно аналогична денервационной и ее развитие блокируется нейротрофическим. влиянием экстрактов вегетативной нервной системы, но не периферической.

.4. Влияние статического растягивания на сократительные свойства эксплантатов Эксплантаты подвергшиеся статическому растягиванию на 9 сут культивирования имели сократительные свойства достоверно не отличающиеся от свойств интаотных мышц. ПЧ равнялся 67,64 i 20,48 X (Р>0,05), ЕД50 - 78.97 ± 16,13 X, (Р>0,05), ИЗО -121,22 t 33,98 X, (Р>0,05). В тоже время ПЧ (172,9 ± 62,34 X, Р > 0,05) И ШО (65,94 ± 18,48 X, Р > 0,05) не отличались от значений выявленных у контрольных эксплантатов. Только достоверная разница между ЕД^0 (Р<0,05) позволяет отнести эксплантаты, культивированные с статическим растягиванием к одной статистической совокупности с интактными полосками. Сократите льные свойства эксплантатов, культивированных с постоянным растягиванием совпадали со свойствами эксплантатов, культивированными с экстрактами ВШГ. Вероятно гипотетические неяро-трофические факторы, оказывают на фенотип ГМК такое лв воздействие, как и собственная сократительная активность.

Сходство сократительных характеристик растянутых эксплантатов с свойствами свежевыделенных тканей особенно проявлялись на 1Ь сут культивирования. МСО (74,48 i 25,96 X) и ПЧ (76,42 i 22,47 X) составли неотличимую совокупность с по-

казателями, полученными при исследовании интактных полосок (Р > 0,05). Только ЕД (51,01 ± 12,42 X) достоверно -меньше (Р<0,001) и совпадало с данными не растянутых эксплантатов (55,15 ± 10,9 X, Р>0,05). Это, вероятно, связано с уменьшением МСО и с небольшим увеличением ПЧ. Падение 1Ю0 отражается кз графике перегибом кривой на высоких концентрациях НА, хотя низкие и средние дозы вызывают сокращение похожее на сокращение интактных полосок.

Изложенные факты позволяют предположить, что статическое растягивание стимулирует функционирование ГШ-эксплантатов СП в виде тонического сокращения, препятствует возникновению постденервациоиных изменений и способствует поддержанию дифференцированного состояния ГМК в течении 15 сут.

5. Влияние периодического растягивания на сократительные свойеааа эксплантатов ГМК в мышечной стенке СП способны совершать медленные фазные перистальтические сокращения или быстрые фазные сокращения при выбросе семенной' жидкости. Периодическое растягивание эксплантатов в органотилической культуре с частотой одно движение в 9 мин моделирует фазное еокрадание. Эксплантаты с периодическим растягиванием , на 9 сут^культивирования достоверно имели более сильный ШО (191,4 £ 4,01 X), меньший ОТ (43,14 ± 18,28 X) и ЕД5о (40,63 1 7,86 ¿), чем те же показатели е интактных мышцах.Эти дашные^гсрвпадаот, с показателями? полученными при анализе гиперчувствительных эксплантатов. Периодическое .растягивание эксплантатов стимулирует большую силу сокращения, чем статическое. МСО препаратов с периодическим растягиванием составляло 157,9 ± 3,37 X от МСО эксп-

лантатов со статическим растягиванием. Учитывая достоверное уменьшение ЕД^ до 51,44 ± 9,95 7. (Р < 0,05) можно считать, что периодическое растягивание достоверно увеличивает силу сокращения и усиливает гилерчтзствитедьность.

Повышение гиперчувствительности к силы сокращения являются ответом на периодическое растягивание. Подобно тому как электростимуляция высокими частотами меняет фенотип скелетной мышцы от "медленной" * к "быстрой", так и глагкиа мышцы адаптируются к периодическому растягиванию увеличением силы сокращения и повышением гиперчувстЕительности.

6. Изменения фазного и тонического сокращения гладких мыпц Опыты показали, что одиночное сокращение гладких мышц СП на НА состояло из фазного сокращения, быстрого расслабления и завершалось медленным затухающим тоническим напряжением. Для определения фазного и тонического сокращения использовали селективные блокатсры ¿^ и о/?н адренорецепторов (оЦ-АР, и о/2Н-АР), празоаин (ПРЗ) и иохимбкн (ИХБ). Применение НА с ПРЗ блокировало -АР и сокращения обуславливались активацией „Н-АР, которые вызывали тонические и медленные фазные сокращения. Действие НА о ИХБ блокировало Ы.2Я-№ и возникали быстрые фазные сокращения инициированные о( ^-АР.

В интактных.гладких мышцах свойства фазного сокращения ЖО (121,37 ± 17,06 7.). Ш (131,44 + 17,73 7.) и ЕД (95,02 + 4,73 %) не отличались от данных общего сокращения (Р>0. 05). МСО тонического сокращения достоверно меньше общего и фазного сокращения (51,8 ± 6,09%). График доза-ответ смещена вправо и вниз. Общий сократительный отиет не является суммой пол-

ного фазного и тонического сокращения...Он больше соответствует фазному компоненту. График одиночного сокращения свиде-

ж

тельствует об участии тонического компонента в общем сокращении, который снижает силу фазного сокращения.

Эксплантаты СП в срганотипической культуре находились в состоянии денервации и функционального . бездействия. У них резко снижалось сила фазного сокращение до 19,3 ± 4,27 7. от силы общего сокращения (Р<0,01). При этом тоническое сокращение было вдвое меньше общего сокращения (44,55 ± 5,33%. и не отличалось от тонического сокращения• интактных мышц. Сила фазного сокращения, несомненно, уменьшилась в следствии функционального бездействия, вероятно, за счет снижения активности оЦ-АР. Увеличение относительной доли тонического сокращен ния, возможно, возникало в силу увеличения доли<^2Н-АР. Сила обшего сокращения гиперчувствительного эксплантата было больше суммы фазного и тонического сокращения (165,42 ± 20,7 %, Р<0,02). Е гиперчувствительном эксплантате, вероятно, существуют механизмы активации сокращения, которые не выявляются ИХБ и ПРЗ индуцированным блокированием -адренорецепторов. Полученные данные свидетельствуют, что в гиперчувствительном эксплантате'уменьшается сила фазного сокращение и возрастает относительная доля тонического 'сокращения.

Периодическое растягивание, как было показано выше, усиливает гиперчувствительность и силу сокращения эксплантатов. Эксплантаты, культивированные с периодическим растягиванием в течении 9 сут, имели фазное сокращение достоверно совпадающее с силой общего, сокращения гиперчувствительного эксплантата (95,74 ± 15,43 %) и фазного сокращения иктактной мышцы (119,9 £ 19,32 %., Р>0,1). Несомненно, периодическое растяги-

вание стимулирует фазное сокращение культивированного эксплантата через активацию (/^-АР. Тоническое сокращение составляло половину общего сокращения и соответствует тоническому сокращению культивируемых эксплантатов и интактных тканей. Следовательно, периодическое растягивание эксплантатов в течении 9 сут поддерживает фазное сокращение и ее соотношение с тоническим сокращением на уровне интактных тканей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В органотипической культуре гладких мыац семявыносящего протока морских свинок происходят физиологические и морфологические изменения, аналогичные денэрвационным. Сократительная активность гладкомышечных эксплантатов, стимулированная статическим или периодическим растягиванием, также как и экстракты симпатической нервной системы, препятствует возникновению постденервационных изменений и эффективно поддерживает фенотип гладкомыиечых клеток а дифферецированном состоянии.

ВЫВОДЫ

1. В органотипической культуре семявыносящего протока морских свинок.наблюдается модуляция фенотипа гладкомышечных клеток от сократительного к синтетическому через промежуточную стадию. Сократительная активность ГЫК, стимулированная продольным статическим растягиванием, способствует сохранению ультраструктуры сократительного фенотипа в продольном слое мышц, но не в циркулярном.

2. В органотипической культуре происходит миграция клеток, интенсивность которой пропорциональна потере тканевых свойств эксплантата. Сократительная активность эксплантатов,

стимулированная растягиванием, задерживает миграцию гладко-мышечных, но не эпителиальных и фибробластоподобных клеток.

-3. В органотипической культуре после пика гиперчувствительности происходит смена механизмов регуляции сокращения с рецепторуправляемого на потенциалэаЕисямый. При этом наблада-ются коррелятивные взаимоотношения между снижением силы по-тенциалзависимых сокращений, прогрессирующей модуляцией фенотипа и потерей межклеточных контактов.

4. Статическое растягивание эксплантатов, так же как и добавление экстрактов ганглиев симпатической нервной системы, препятствует возникновению постденервационной гиперчувстви-. тельности и смене механизмов регуляции сокращения.

5. В ингактных гладких мышцах фззный кошонент сокращения, соответствует общему сокращению. Тонический компонент, полностью проявляется при блокировании фазного сокращения и составляет половину общего сокращения. В органотипической культуре фазный компонент сокращения резко снижается, а тонический не изменяется.

6. В органотипической культуре эксплантаты адаптируются к периодическому растягиванию увеличением силы сокращения и усилением гиперчувствительности. При этом фазный компонент сокращения и его соотношения с тоническим сокращением сохраняется на уровне интактной мышцы.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Низамов Р. С. Миниэксикатор-чашка с притертой крышкой для культивирования клеток и тканей // Лаб. дело. 1990. N2. С. 75-76.

2. Низамов P.C. Органотипическое культивирование тканей на поверхности трехмерного коллагенового геля // Тез. III Все-

союз. совещ. Культивирование кдоток животных и человека. Цу-щино. И: 1990. С. 40-41/

3. Низамов Р. с., Ахмедаянов P. X Устройство для растягивания образца мышечной ткани // Щжорететная справка N 5C20G72/14 . (063024) от 15.07.91. ЕЮШГО.

4. Низамов Р. С., Ахмедаянов P. X Устройство для периодического растягивания мышечных эксплантатов в органотмпичмкой культуре // Физиол. журн. ССОР. 1991. Т. 77. N8. С. 163-136.

5. Низамов Р. С., Ахмедаянов P. X , Байбиков Р. С. Изометрическое растягивание нормализует сократительные характеристики эксплантатов семявыносящэго протока в органотипической культуре // Тез. YI Веесовз. симп. Физиология медиаторов Периферический синапс. Казань. 1991. С. 76.

6. Низамов Р. С., Ахмедзянов P. X , Еайбиков Р. С. Динамическое растягивание усиливает гиперчувствительность эксплантатов се-мявыносящего протока морских свинок в органотипической культуре // Тез. YI Всесоюз.симп. Физиология-медиаторов Периферический синапс. Казань. 1991. С. 74-75.

7. Низамов Р. С., Ахмедзянов P. X Модуляция фенотипа гладко-мышечных клеток препятствует фагоцитированию чужеродными макрофагами // Тез.I Съезда иммунологов и аллергологов Чувашии.

. Нарйо-практические аспекты современной иммунологии и аллергологии. Чебоксары. 1991. С. 29.

8. Низамов. Р. С. Ультраструктура гладкомышечных клеток при растягивании в органотипической культуре // Тез. XIY Конфер. по электронной микроскопии. Черноголовка. Ы. 1992. С. 147.

9. Петров C.B., Райхлин Н.Т., Низамов P.C. Светооптическая и ультраструктурная иммуногистохимия Н4-антигеяа - общего мар- • кера эпителиальных клеток // Билл, экг.пер. биол. и мед. 1992.

Т. ИЗ. N5. С. 534-535.

10. Низамов Р. С. , Исламов Р. Р. , Шамеутдинов Н. Ш. , Штров 0. В., Ахмедзянов Р. X. Карбоангидраза - маркер клеточных типов в культуре клеток семявыносящего протока морских свинок // Бюлл. экспер. Сиол. и мед. 1992. Т. ИЗ. N 6. С. 631-632.

11. Низамов Р. С., Байбиков Р. С., Арефьев И. А., Ахмедзянов Р. X. Влияние экстрактов нервной ткани и статического растягивания на гиперчувствительность эксплантатов семявыносящего протока морских свинок в органотипической культуре // Деп. в ВИНИТИ N 95-В93 от 15. 01.93. Реф. опубл.: РЖ физиология, 1923. N 8. Публ. 8М1243.

12. Низамов Р. С., Ахмедзянов Р. X , Байбиков Р. С., Арефьев И. А. Гиперчувствительность семявыносящего протока морских свинок в органотипической культуре, при статическом растягивании // Физ ии л. журн. им. И. М. Сеченева 1993. Т. 79. N2. С. 97-102.

13. Низамов Р. С., Байбиков Р. С., Ахмедзянов Р. X , АрефьеЕ И. А. Фазное сокращение семявыносящего протока морской свинки в органотипической культуре при его периодическом растягивании // Физиол. журн. им. И. Ы. Сеченева 1993. N3. С.73-790.

14. Низамов P.C., Ахмедзянов Р.X. Ультраструктура глздкомы-шечных клеток при статическом растягивании // Физиол. журн. им. ИМ.Сеченева. 19<?3. Т.79. N4. С. 36-42.

15. Низамов Р. С., Калаков Р. Р. Влияние растягивания на пролит; Ферацию клеток семявыносящего проюка морских свинок в органотипической культуре // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1993. Т. 114. N 7. С. 75-79.