Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль кальциевой сигнальной системы в механизмахэлектрогенеза сокращений гладкомышечных клетокворотной вены зрелых морских свинок при действии гистамина

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль кальциевой сигнальной системы в механизмахэлектрогенеза сокращений гладкомышечных клетокворотной вены зрелых морских свинок при действии гистамина"

О 8 ЯНВ 2004

Аверин Эдуард Михайлович

Роль кальциевой сигнальной системы в механизмах электрогенеза сокращений гладкомышечных клеток воротной вены зрелых морских свинок при действии гистамина

03.00.13 - физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Омск - 2003

ли-

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Омской государственной медицинской академии

'чныи руководитель:

доктор медицинских наук профессор А.Г. Патюков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор В.А. Демидов

доктор биологических наук профессор В.Д. Пьянов

Ведущая организация -

Институт физиологии СО РАМН

Защита состоится «

/Г»

2003 г. в

9

часов на

заседании диссертационного совета ДМ 212.247.07 в Тюменском государственном университете, по адресу: 625043, г. Тюмень, ул. Пирогова,

Д.З.

Автореферат разослан « 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного.совета, доктор биологических наук, профессор

Е.А. Чирятьев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гладкие мышцы обеспечивают формирование сосудистого тонуса, сохранение объёма полых органов (мочевыводя-щей системы, органов желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей и матки), а также перистальтику органов системы пищеварения. В данном направлении широко проводятся научные исследования морфологами, физиологами, биохимиками, фармакологами и другими специалистами.

В настоящее время наиболее полно изучены электрофизиологические и сократительные свойства гладкомышечной ткани пищеварительной, мочеполовой и в меньшей степени сосудистой системы [П.Г. Богач, 1974; К.В. Казарян, 1987; Т. Tomita, 1981 и др.].

Исследованиями [П.И. Сизов, B.C. Яснецов, 1985; Н.И. Маркевич и др., 1989; М.Ф. Шуба, A.B. Жолос, JI.B. Байдан, 1989 и др.] установлено, что электрофизиологические и сократительные свойства гладкомышеч-ных клеток (ГМК), их восприимчивость к физиологически активным веществам весьма вариабельны. Выявлены разнообразие параметров мембранного потенциала, потенциалов действия, сократительных реакций ГМК, выраженность и направленность влияния на них гуморальных веществ и нейромедиаторов. Обнаружены различия в транспорте ионов через клеточную мембрану, механизмах электрогенеза, электромеханического и фармакомеханического сопряжения [К.В. Казарян, 1987, 1990, 1998; M.B. Waxman, 1994; S. Torihashi, 1999; L. Xue, 2000; A.V. Zholos, 2000 и др.].

Вместе с тем, до сих пор недостаточно изучена роль элементов кальциевой сигнальной системы в механизмах функционирования ГМК сосудов и действия на них гистамина, ионов никеля, кадмия, ванадата натрия, кофеина и гепарина, а также роль кальциевых каналов цитоплазматической мембраны, хотя это имеет, несомненно, большое научно-практическое значение. Поэтому нами выполнены исследования в этом направлении.

Цель исследования. Изучить роль кальциевой сигнальной системы в механизмах действия физиологически активных веществ на гладкомы-шечные клетки воротной вены зрелых морских свинок.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить роль кальциевых каналов, Са-АТФазы цитоплазматической мембраны, внутриклеточного кальция в генезе электрической и сократительной активности ГМК воротной вены морских свинок.

2. Установить эффекты ионов никеля, кадмия, ванадата натрия, гепарина, кофеина на электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены зрелых морских свинок.

3. Исследовать роль кальциевой сигнальной системы в механизмах реализации эффектов гистамина на электрические й сократительные свойства ГМК воротной вены зрелых морских свинок.

Научная новизна. Впервые изучено влияние гистамина, ионов никеля, кадмия, ванадата натрия, гепарина и кофеина на электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены морских свинок. Выяснена роль кальциевых каналов цитоплазматической мембраны ГМК в механизме влияния этих веществ на указанные свойства. Установлены' основные механизмы электромеханического и фармакомеханического сопряжения ГМК в описанных процессах. Проведённые исследования существенно расширяют знания о функциях ГМК в формировании тонуса сосудов, а следовательно, в регуляции системного и регионарного кровотока.

Практическая ценность. Выполненная работа является фундаментальным исследованием. Вместе с тем, она имеет и практическое значение. Полученные данные раскрывают механизмы электромеханического и фармакомеханического сопряжения гладкомышечных клеток воротной вены под действием гистамина. Наши исследования дают возможные пути применения вышеперечисленных веществ в медицинской практике, расширяют и углубляют знания о процессах, происходящих в организме. Результаты исследования могут быть использованы в учебном процессе кафедр физиологии, патофизиологии, фармакологии, медицинской практике, дальнейшей научно-исследовательской работе.

Основные положения работы, выносимые на защиту:

1. Гистамин оказывает возбуждающее влияние на электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены.

2. Ионы никеля тормозят электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены, что связано с блокадой Т - кальциевых каналов

3. Ионы кадмия угнетают электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены, что связано с блокадой Ь - кальциевых каналов.

4. Ванадат натрия подавляет электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены, блокируя Са-АТФазу.

5. Гепарин тормозит электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены, так как является антагонистом цитоплазматического кальция.

6. Кофеин снижает электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены, путём высвобождения ионов кальция из мест секвестрации.

7. Действие гистамина на фоне ионов никеля, кадмия, ванадата натрия, гепарина и кофеина на электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены связано с активацией компонентов кальциевой сигнальной системы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях Омского отделения Российского физиологического общества им. И.П.

Павлова в 2000, 2001,2002,2003 годах, на 18 съезде физиологов России (Казань, 2001), на 3 съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), региональной научно-практической конференции (Томск, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы (335 источников, из них 205 зарубежных). Материалы диссертации изложены на 179 листах компьютерного текста. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 34 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 145 зрелых (12-18 месяцев) морских свинках (самцах), массой 500-700 граммов. Животные забивались в одно и тоже время (10-11 часов утра). После вскрытия брюшной полости выделялась воротная вена и помещалась в специальную препаровальную ванночку, заполненную нормальным раствором Кребса. Вена имела вид цилиндрической мышечной трубочки, длиной 12-14 мм, диаметром - 3-5 мм. В средней слое воротной вены выделяют два слоя ГМК (продольный и циркулярный). Препаровка производилась под бинокулярной лупой МБС-2 в нормальном растворе Кребса, комнатной температуры, который неоднократно менялся. Воротная вена с помощью булавок слегка растягивалась и прикреплялась к поверхности препаровальной ванночки. Микрохирургическими инструментами с её поверхности удалялись жировая ткань и серозная оболочка. На концы воротной вены накладывались лигатуры из тонких шёлковых нитей. Готовые препараты ГМК использовались в опыте.

В исследованиях применялся нормальный раствор Кребса, который имел следующий состав в ммоль/л: №С1-133; МаНС03-16,3; КС1-5,0; ЫаН2Р04-1,38; СаС12-2,8; М^-ОИ; глюкоза-7,38.

Раствор Кребса готовился на бидистиллированной воде из маточных растворов непосредственно перед опытом. Показатель рН его при температуре 20°С находился в пределах 7,3-7,4.

Изотонический раствор сахарозы готовился на деионизированной воде, в которой растворялось 108,8 г/л химически чистого препарата. Удельное сопротивление его, измеренное по методу Кольрауша, было не менее 105 Ом/см.

Из исследуемых веществ готовились растворы, определённой концентрации, которые добавлялись к раствору Кребса и применялись в опыте. Использовались реактивы фирм "Реахим", "Реанал", "Фармахим".

В исследованиях был использован метод двойного сахарозного мостика, который позволял одновременно регистрировать электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены морских свинок. Этот метод наиболее адекватен цели и задачам работы. Кроме того, он удобен для изучения влияния ФАВ и других веществ на ГМК.

В специальной камере гладкомышечный препарат в двух участках омывался изотоническим раствором сахарозы, имевшем высокое удельное сопротивление (104-105 Ом/см2). В то же время между этими участками мышечные клетки находились в нормальном растворе Кребса. Один конец препарата помещался в изотонический раствор KCl, что деполяризовало мембраны клеток до нулевого потенциала и значительно понижало их сопротивление. В раствор хлористого калия и раствор Кребса помещались отводящие электроды. Благодаря изолирующему действию раствора сахарозы между отводящими электродами возникала разность потенциалов, близкая к истинной величине мембранного потенциала ГМК. Это давало возможность регистрировать изменения мембранного потенциала, потенциала действия и электротонического потенциала ГМК в течение нескольких часов. Изолирующий поток раствора сахарозы между тестирующей и раздражающей секциями позволял воздействовать на ГМК поляризующим током различной силы и длительности, что было необходимо для изучения возбудимости, электрической проводимости и вызванной активности ГМК.

Применённая в наших исследованиях камера двойного сахарозного мостика схематически аналогична камере Бергера и Барра. Она давала возможность одновременно с потенциалами действия регистрировать сократительную активность ГМК. С целью использования различных по размерам гладкомышечных препаратов, удобства работы, точности исследований, в её конструкцию нами были внесены изменения.

Камера в нашей модификации изготовлена из оргстекла и была представлена 4 секциями, которые вставлялись в открытую коробку, цилиндрической формы. Ширина тестирующей части камеры составляла 1,0 мм, сахарозных секций 3,0 мм. В тестирующей секции мышечный препарат омывался нормальным раствором Кребса. Температура его поддерживалась постоянной (37°С) с помощью теплообменника и ультротермостата УТ-15. Измерение температуры в тестирующей секции проводилось при помощи электротермометра. Скорость потока тестирующего раствора или раствора Кребса была постоянной и равнялась 2 мл/мин. В сахарозных секциях препарат омывался изотоническим раствором сахарозы со скоростью потока 2 мл/мин. Между секциями камеры располагались резиновые перегородки, отверстия в которых по диаметру были чуть меньше толщины препарата. '

Гладкомышечный препарат воротной вены протягивался через отверстия в секциях. Один конец его при помощи нити крепился к стенке кали-

евой секции, другой соединялся с подвижным анодом механотрона 6МХ2Б. Сигнал с механотрона поступал на один из входов осциллографа CI-74 и на один из спаренных самопишущих потенциометров КСП-4. Дозированное натяжение гладкомышечных препаратов осуществлялось с помощью специального микроманипулятора.

Для регистрации электрической активности ГМК использовались не-поляризующиеся хлорсеребрянные электроды, расположенные в тестирующей секции и в секции с раствором хлористого калия. Отведенный от ГМК электрический сигнал поступал на вход дифференциального усилителя, который обладал входным сопротивлением 10"12 Ом, чувствительностью к току 10"13 мкА, малой чувствительностью к наводкам и синфазным помехам. Усиленный сигнал подавался на другой вход осциллографа CI-74 и второй потенциометр КСП-4. С первым осциллографом был соединен другой осциллограф CI-69, обурудованный фоторегистратором собственной конструкции. Раздражение ГМК производилось прямоугольными импульсами постоянного тока продолжительностью 3 с при помощи универсального электростимулятора ЭСУ-2. На раздражающие электроды поляризующий ток подавался с выхода изолирующего блока через сопротивление фиксации тока(1 МОм).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Приготовленный гладкомышечный препарат помещали в экспериментальную камеру. Затем после подключения потоков омывающих растворов измеряли мембранный потенциал гладкомышечных клеток (ГМК) воротной вены морских свинок путём деполяризации его дистального участка изотоническим раствором KCl. Он составлял 32,45 ±2,15 мВ.

В 56-70 % случаев с первых минут эксперимента регистрировалась спонтанная электрическая активность ГМК сосудов. Она имела вид медленных волн (MB), продолжительностью 14,53 ± 1,56 с и амплитудой 6,28 ± 0,57 мВ.

Быстрые пиковые изменения мембранного потенциала (спайки) возникали на вершине медленной волны с частотой 0,52 ± 0,06 Гц. Амплитуда их составляла 4,36 ± 0,63 мВ. В 80 % случаев им предшествовали одиночные низкоамплитудные препотенциалы. Спайковая активность сопровождалась увеличением напряжения ГМК воротной вены. Отдельные сокращения имели фазный характер, силой 340,0 ± 30,0 мкН. В результате суммации развивались тонические сокращения ГМК. Продолжительность сократительного ответа составляла 16,10 ± 1,11 с. Постепенно, через 715 минут, частота медленных волн, а также частота и амплитуда быстрых спайковых потенциалов на их вершине стабилизировались.

В дальнейшем на изолированный гладкомышечный препарат воротной вены действовали поляризующим электрическим током продолжительностью 3 секунды. При этом в ГМК в соответствии с полярностью раздражающего тока под катодом возникал катэлектротонический, а под анодом - анэлектротонический потенциал. Сопротивление мембраны измерялось по изменению величины анэлектротонов.

Отмечалась линейная зависимость между силой раздражения и амплитудой электротонических потенциалов. Увеличение силы гиперполяри-зующего тока приводило к росту амплитуды аюл с ктр ото н и чес кого ответа ГМК. При раздражении спонтанноактивных ГМК постоянным электрическим током установлено, что гиперполяризующий ток средней и большей силы угнетает спонтанную электрическую и сократительную активность. Даже относительно слабый деполяризующий ток (0,04 - 0,08 мкА) вызывал уменьшение мембранного потенциала ГМК на 0,5 мВ.

При увеличении силы раздражающего тока до 0,24 - 0,40 мкА происходило усиление деполяризации мембраны клеток и появление препотен-циала в начальном сегменте катэлектротонического потенциала. Его амплитуда зависела от силы поляризующего тока.

Необходимо отметить, что ток пороговой величины 0,42 ± 0,05 мкА вызывал генерацию потенциалов действия пикового характера. При увеличении деполяризующего тока количество спайков на КЭТ незначительно возрастало. Деполяризующий ток силой (1,8 - 3,2 мкА) на КЭТ вызывал генерацию 1 - 2 дополнительных высокоамплитудных простых пиковых потенциалов действия. Амплитуда потенциалов действия, вызванная деполяризующим током пороговой силы, составляла 6,40 ± 0,80 мВ, с частотой спайковой активности 1,20 ± 0,05 Гц.

После генерации потенциалов действия наблюдалось явление овершу-та. Они сопровождались следовой гиперполяризацией мембраны длительностью 1 - 2 с. Эти потенциалы действия обеспечивали сокращение, которое совпадало с началом фазы деполяризации. Амплитуда и продолжительность сократительного ответа находились в прямой зависимости от величины, длительности медленной волны и количества быстрых осцил-ляций на ней. При этом амплитуда сократительного ответа составляла 380,0 ± 30,0 мкН, а продолжительность - 12,25 ± 1,35 с.

ВЛИЯНИЕ ГИСТАМИНА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ И СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ВОРОТНОЙ ВЕНЫ ЗРЕЛЫХ МОРСКИХ СВИНОК

Нами исследовано влияние гистамина на ГМК в концентрациях 10"5-10"3 М. Наиболее выраженные показатели обнаружены на 1 -й минуте дей-

ствня, поэтому эти данные и приводятся. В дальнейшем они постепенно уменьшались и не выявлялись. Исходными данными служили показатели электрической и сократительной активности ГМК в нормальном растворе Кребса, с которыми сравнивались полученные результаты.

При действии гистамина в концентрации 10'3 М на спонтанно активные ГМК воротной вены мембранный потенциал уменьшался до 26,55 ± 2,73 мВ (р<0,05), увеличивались амплитуда и продолжительность МВ соответственно до 12,46 ± 1,01 мВ (р<0,05) и 28,40 ±2,09 с (р<0,05), частота и амплитуда спайков на МВ соответственно до 0,86 ± 0,03 Гц (р<0,05) и 6,61 ± 0,24 мВ (р<0,05), сила и продолжительность сократительного ответа соответственно до 646,0 ± 30,0 мкН (р<0,05) и 30,01 ± 1,23 с (р<0,05).

Гистамин в концентрации 10"3 М на фоне действия деполяризующего тока повышал частоту и амплитуду спайков на КЭТ соответственно до 2,58 ± 0,13 Гц (р<0,05) и 8,09 ± 0,26 мВ (р<0,05), уменьшал сопротивление мембраны на 42,47 % (р<0,05), увеличивал силу и продолжительность сократительного ответа соответственно до 720,0 ± 40,0 мкН (р<0,05) и 16,12 ±0,36 с (р<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что гистамин оказывает дозозависимое стимулирующее влияние на ГМК, максимально проявляющееся при увеличении его концентрации.

ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ И СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ВОРОТНОЙ ВЕНЫ ЗРЕЛЫХ МОРСКИХ СВИНОК

Многими исследователями [Bolton Т.В., 1991; Ito К., 1991; Sturek, М., 1986 и др.] установлено, что ионы кальция играют важную роль в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц различных органов. Ими показано, что ионы никеля и кадмия блокируют Т- и L - кальциевые каналы. Поэтому мы применили их в своих исследованиях. В литературе нам не встретилось работ, характеризующих действие этих веществ на ГМК воротной вены. В связи с этим мы выполнили серию опытов по выяснению данного влияния.

Влияние ионов никеля на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии ионов никеля в концентрации 10 3 М на спонтанно активные ГМК воротной вены мембранный потенциал практически не изменялся и составлял 35,18 ± 3,56 мВ (р>0,05), но уменьшались амплитуда и

продолжительность МВ соответственно до 5,46 ± 1,18 мВ (р>0,05) и 13,32 ± 1,21 с (р>0,05). При этом наблюдалось полное угнетение генерации спайков, ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Никель в концентрации 10"3 М на фоне действия деполяризующего тока увеличивал сопротивление мембраны на45,0 % (р<0,05). При этом отмечалось исчезновение спайковой активности, ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что никель тормозит электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены, что обусловлено блокадой никелем их Т-кальциевых каналов.

Влияние ионов кадмия на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии ионов кадмия в концентрации 10~3 М на спонтанно активные ГМК отмечалось уменьшение мембранного потенциала до 17,72 ± 0,04 мВ (р>0,05), амплитуды и продолжительности МВ соответственно до 2,44 ± 0,05 мВ (р>0,05) и 9,52 ± 0,04 с (р>0,05). При этом наблюдались полное угнетение генерации спайков на МВ и прекращение сократительного ответа.

Кадмий в концентрации 10"3 М на фоне действия деполяризующего тока полностью угнетал генерацию ПД и сократительные реакции, повышал сопротивление мембраны на 25,0 % (р<0,05).

Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что кадмий тормозит электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены, что обусловлено блокадой кадмием их Ь-кальциевых каналов.

ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КОМПОНЕНТОВ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ И СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ВОРОТНОЙ ВЕНЫ ЗРЕЛЫХ МОРСКИХ СВИНОК

В результате активации кальциевых каналов цитоплазматической мембраны ГМК и последующего поступления кальция в цитозоль, а также вследствие взаимодействия некоторых агонистов с хеморецепторами мембраны может происходить высвобождение кальция из депо [8от1уо А.Р. 1982, 1987, 1988 и др.]. До настоящего времени механизмы реализации секвестированного кальция окончательно не выяснены, поэтому их изу-

чение представляет несомненный теоретический и практический интерес. В связи с этим нами исследовано влияние на электрические и сократительные свойства ГМК ряда веществ, в частности ванадата натрия, гепарина и кофеина, изменяющих содержание ионов кальция в цитозоле.

Влияние ванадата натрия на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

Под влиянием ванадата натрия в концентрации 10"3 М мембранный потенциал спонтанно активных ГМК составлял 20,95 ± 1,40 мВ (р>0,05), уменьшалась амплитуда МВ до 5,43 ± 0,87 мВ (р>0,05) и увеличивалась их продолжительность соответственно до 17,90 ± 1,13 с (р>0,05). При этом отмечались полное угнетение генерации спайков на МВ и прекращение сократительного ответа.

Ванадат натрия в концентрации 10"3 М на фоне действия деполяризующего тока угнетал генерацию ПД и сократительные реакции, повышал сопротивление мембраны на 21,3 %(р<0,05).

Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что ванадат натрия оказывает тормозящее влияние на спонтанную, вызванную биоэлектрическую и сократительную активность ГМК воротной вены, так как является специфическим блокатором Са-АТФазы сарколеммы и саркоплазматической сети ГМК.

Влияние гепарина на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

Под влиянием гепарина в концентрации 1000 ед./мл. раствора Кребса в спонтанно активных ГМК восстанавливались мембранный потенциал до 30,37 ± 1,94 мВ (р>0,05), амплитуда и продолжительность МВ соответственно до 6,36 ± 0,09 мВ (р>0,05) и 14,31 ± 0,06 с (р>0,05). При этом отмечались полное угнетение генерации спайков на МВ и прекращение сократительного ответа.

Гепарин в концентрации 1000 ед./мл. р-ра Кребса на фоне действия деполяризующего тока полностью угнетал генерацию спайков и сократительные реакции, но понижал сопротивление мембраны на 16,4 % (р<0,05).

При дальнейшем действии гепарина в концентрации 1000 ед./мл. р-ра Кребса наблюдались постепенное восстановление частоты, амплитуды спайковой активности и сокращений небольшой силы фазно-тоническо-го характера.

На основании полученных данных можно заключить, что гепарин в дозе 500 - 1000 ед./мл. р-ра Кребса вызывает в начале возбуждающее, а затем тормозящее влияние. Это объясняется тем, что гепарин является антагонистом цитоплазматического кальция.

Влияние кофеина на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

Под влиянием кофеина в концентрации 10"3 М мембранный потенциал спонтанно активных ГМК составлял 18,96 ± 0,29 мВ (р>0,05). Амплитуда и продолжительность МВ уменьшались соответственно до 3,83 ± 0,11 мВ (р>0,05) и11,57± 0,67 с (р>0,05). При этом отмечались полное угнетение генерации спайков на МВ и прекращение сократительного ответа.

Кофеин в концентрации 10"3 М на фоне действия деполяризующего тока полностью угнетал генерацию ПД, сократительные реакции и повышал сопротивление мембраны на 19,8 % (р<0,05).

Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что кофеин дозозависимо угнетает электрическую и сократительную активность ГМК. Это связано с высвобождением ионов кальция из мест секвестрации.

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ГИСТАМИНА НА ЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ И

СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ВОРОТНОЙ ВЕНЫ ЗРЕЛЫХ МОРСКИХ СВИНОК

Для выяснения механизма действия гистамина на электрическую и сократительную активность ГМК были выполнены эксперименты по изучению его влияния на фоне блокады Са- каналов цитоплазматической мембраны и компонентов кальциевой сигнальной системы никелем, кадмием, ванадатом натрия, гепарином и кофеином. Исследование проводилось в растворах концентрации 10'3 М, в которых сравниваемые во времени показатели были наиболее выраженными.

Влияние гистамина на фоне ионов никеля на электрические

и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии гистамина в комплексе с ионами никеля в концентрации 10~3 М на спонтанно активные ГМК мембранный потенциал составлял 33,68 ± 2,83 мВ (р<0,05). При этом снижались амплитуда и продолжительность МВ соответственно до 5,58 ± 0,96 мВ(р<0,05)и 13,82± 1,15 с (р<0,05), наблюдались угнетение спайковой активности и ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Гистамин в комплексе с ионами никеля в концентрации Ю-3 М на фоне действия деполяризующего тока вызывал исчезновение спайковой активности (р<0,05), увеличение сопротивления мембраны на 19,6 % (р<0,05), ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Влияние гистаминана фоне ионов кадмия на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии гистамина в комплексе с ионами кадмия в концентрации О-3 М на спонтанно активные ГМК мембранный потенциал составлял 8,43 ± 0,05 мВ (р<0,05). При этом снижались амплитуда и продолжи-ельность МВ соответственно до 3,47 ± 0,04 мВ (р<0,05) и 11,65 ± 0,05 с р<0,05), наблюдались угнетение спайковой активности и ослабление силы ,о полного прекращения сократительного ответа. Гистамин в комплексе с ионами кадмия в концентрации 10~3 М на фоне ,ействия деполяризующего тока вызывал исчезновение спайковой актив-ости (р<0,05), увеличение сопротивления мембраны на 23,2 % (р<0,05), слабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Влияние гистамина на фоне ванадата натрия на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии гистамина в комплексе с ванадатом натрия в концентрами 10~3 М на спонтанно активные ГМК мембранный потенциал состав-ял 23,42 ± 0,20 мВ (р<0,05). При этом снижались амплитуда и продолжительность МВ соответственно до 6,55 ± 0,09 мВ (р<0,05) и 18,07 ± ,46 с (р<0,05), наблюдались угнетение спайковой активности и ослабле-ие силы до полного прекращения сократительного ответа. Гистамин в комплексе с ванадатом натрия в концентрации 10~3 М на юне действия деполяризующего тока вызывал исчезновение спайковой ктивности (р<0,05), увеличение сопротивления мембраны на 15,8 % э<0,05), ослабление силы до полного прекращения сократительного от-ета.

Влияние гистамина на фоне гепарина на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии гистамина в комплексе с гепарином в концентрации 0~3 М на спонтанно активные ГМК мембранный потенциал составлял 1,52 ± 0,09 мВ (р<0,05). При этом увеличивалась амплитуда МВ, но умень-[алась их продолжительность соответственно до 7,03 ± 0,11 мВ (р<0,05) 15,24 ± 0,34 с (р<0,05), наблюдались угнетение спайковой активности и слабление силы до полного прекращения сократительного ответа. Гистамин в комплексе с гепарином в концентрации 10"г' М на фоне дей-гвия деполяризующего тока вызывал исчезновение спайковой активно-ги, ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа ><0,05), но уменьшение сопротивления мембраны на 15,7 % (р<0,05).

Влияние гистамина на фоне кофеина на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены

При действии гистамина в комплексе с кофеином в концентрации 10 3 М на спонтанно активные ГМК мембранный потенциал составлял 19,24 ± 0,43 мВ (р<0,05). При этом снижались амплитуда и продолжительность МВ соответственно до 4,24 ± 0,09 мВ (р<0,05) и 12,22 ± 0,21 с (р<0,05), наблюдались угнетение спайковой активности и ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Гистамин в комплексе с кофеином в концентрации 10~3 М на фоне действия деполяризующего тока вызывал исчезновение спайковой активности (р<0,05), увеличение сопротивления мембраны на 18,0 % (р<0,05), ослабление силы до полного прекращения сократительного ответа.

Итак, полученные результаты свидетельствуют о том, что никель, кадмий, ванадат натрия, гепарин и кофеин угнетают стимулирующее влияние гистамина на электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены. На основании собственных исследований и литературных данных [ВислобоковА.И., 1995; Костерин С.А., 1990;КостюкП.Г, 1982; Кулагин К.В., 1994 и др.] можно сделать заключение, что основополагающим в механизмах регуляции действия гистамина на ГМК является кальциевая сигнальная система (Т- и Ь-кальциевые каналы, Са-АТФаза, ци-топлазматической кальций), обеспечивающая электрические и сократительные свойства ГМК воротной вены зрелых морских свинок.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что для ГМК воротной вены зрелых морских свинок характерна спонтанная электрическая и сократительная активность в виде медленных волн и спайков на их гребне. Они относительно правильной синусоидальной формы с преобладанием фазы реполяризации, имеют' более высокую частоту, чем МВ ГМК пищеварительного канала, однако количество спайков на них меньше. Возникающие при этом сократительные реакции являются фазно-то-ническими.

Мы полагаем, что спонтанная активность в ГМК воротной вены объясняется наличием в них пейсмекерных клеток, на что указывают литературные данные [Баскаков М.Б., 1994; 2екег Е., 1982 и др.] и результаты собственных исследований.

В результате раздражения ГМК поляризующим электрическим током под катодом возникал катэлектротонический, а под анодом - анэлектро-тонический потенциал.

При этом мембрана ГМК воротной вены обладает выпрямительными свойствами. При одинаковой силе раздражающего тока амплитуда катэ-лектротонических потенциалов была меньше анэлектротонических. Это свидетельствует о нелинейной зависимости величины амплитуды катэ-лектротонических потенциалов от силы тока. Относительно слабый деполяризующий ток вызывал выраженное уменьшение мембранного потенциала ГМК. Умеренное усиление раздражающего тока сопровождалось увеличением деполяризации мембраны, появлением препотенциа-лов в начальном сегменте катэлектротонического потенциала. Амплитуда его зависела от силы поляризующего тока. Раздражение пороговой величины вызывало генерацию потенциалов действия пикового характера.

Увеличение деполяризующего тока способствовало возрастанию количества спайков наКЭТ. По нашему мнению, это объясняется хорошим электротоническим проведением по ГМК, что способствует возбуждению большего количества мышечных клеток и одновременному их сокращению. Гиперполяризующий ток средней силы угнетал спонтанную электрическую, сократительную активность и снижал возбудимость ГМК.

По данным ряда авторов [Кучеренко Н.Е., Блюм Я.Б., 1986; Hume J.R., Harvey R.D., 1991; Sergeant G.P., 2001] в ПИК сосудов, как и в других органах, имеется тесная связь между процессами электрогенеза и сокращениями. Пассивная деполяризация (как и медленные волны) не вызывает заметного напряжения воротной вены. Механизмом, запускающим сокращение ГМК, являются пиковые ПД, расслабление начинается после их угасания. Сократительные ответы ГМК воротной вены носят смешанный фазно-тонический характер. Фазные сокращения возникают при генерации спайков на MB и КЭТ, тонические - при деполяризации ГМК раствором хлористого калия или воздействии ФАВ. По нашему мнению, сокращения ГМК связаны с поступлением Са2+через потенциалзависи-мые быстрые и медленные Ca - каналы мембран; а также с активацией СаМ и Ca - СаМ - зависимым фосфоршшрованием сократительных белков ГМК.

Воздействие физиологически активных соединений на ГМК опосредуется через сложную цепь ряда процессов [Васильев В.Ю., 1987; Комиссаров И.В., 1986; Медведев М.А., 1989; Schubert R., 1996 и др.]. Первым из них является взаимодействие ФАВ с рецепторами, специфичными для каждого из них. Затем происходят конформационные изменения макромолекул рецепторов и мембраны клеток, фосфорилирование или цефосфорилирование ионных каналов мембраны. В дальнейшем включается цепь вторичных посредников (цАМФ, цГМФ, 2,4 - диацилглице-рол), сопровождающаяся изменением проницаемости рецептивного поля мембраны, в результате возникают те или иные сдвиги в электрических и ;ократительных реакциях ГМК.

В настоящее время установлено [Никашин A.B. и др, 1999; Göcer F. et а., 1994 и др.], что эффекты конкретных физиологически активных соединений зависят от особенностей рецепторного аппарата мембраны, функционирования комплексов рецептор - канал, самих ионных каналов, механизмов электромеханического и фармакомеханического сопряжения. Поэтому, влияние каждого ФАВ на различные ГМК отличается полиморфизмом.

Задачей нашей работы было изучение влияния и механизмов действия гистамина на биоэлектрические и сократительные свойства ГМК воротной вены. На основании собственных исследований можно заключить, что гистамин вызывает однонаправленные дозозависимые изменения спонтанной, вызванной электрической и сократительной активности ГМК, которые сопровождаются деполяризацией мембраны, увеличением амплитуды медленной волны, её продолжительности, повышением частоты генерации спайков и силы сократительных ответов. Причём гистамин оказывает на все показатели выраженное действие. Мы полагаем, что повышение электрической и сократительной активности ГМК под влиянием гистамина связано с активацией соответствующих рецепторов цитоплаз-матической мембраны.

Ряд авторов утверждает [Сергеев П.В., 1987; Bolton Т.В., 1981; Patel N.M., 1980; Yang J., 1983 и др.], что гистамин оказывает влияние на ГМК различных органов через Н,- и Н2- гистаминовые рецепторы. Вазодилата-торное действие его обусловлено активацией Н2-, а вазоконстрикторное - Н - гистаминорецепторов. Основываясь на сопоставлении полученных нами результатов с данными литературы [Казарян К.В., 1990; Gomez М., 1997 и др.], можно сделать заключение, что гистамин и на ГМК воротной вены воздействует через Н^гистаминовые рецепторы. Его влияние на ГМК сосуда проявлялось деполяризацией мембраны клеток, уменьшением её сопротивления, усилением спайковой и сократительной активности. Эти явления объясняются повышением натриевой и кальциевой проводимости мембраны. Фазные сокращения и ПД обусловлены быстрыми Ca - каналами. Стимулирующие влияние гистамина проявляется при весьма малых концентрациях, что свидетельствует о высокой плотности гистаминорецепторов на мембране ГМК воротной вены.

Концепция о наличии в мембране ГМК нескольких типов каналов предположительно объясняет полученные эффекты от возбуждения физиологически активных соединений. Воздействие их на хеморецепторы ведёт к изменению проницаемости хемовозбудимой части мембраны. В результате происходит её деполяризация и открытие потенциалзависимых каналов, что сопровождается прогрессирующим увеличением частоты генерации ПД, вызванных функционированием быстрых потенциалзависимых Т-кальциевых каналов, которые в дальнейшем инактивируются.

Медленные потенциалзависимые L-кальциевые каналы не способны к шактивации, поэтому вход кальция в миоплазму клеток продолжается Ю максимумадеполяризации, вызванной ФАВ. Вероятно, что поступле-ше ионов кальция через быстрые потенциалзависимые Ca - каналы со-тровождается фазным сокращением, которое после прекращения генерации ПД переходит в тоническое, связанное со входом кальция через по-генциалзависимые медленные неинактивирующиеся Ca - каналы.

Авторами установлено [Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., 1987,1990 и ф.], что основным структурным элементом клетки, обеспечивающим юсприятие и передачу внеклеточных импульсов в ГМК, является цитоп-]азматическая мембрана и её рецепторный аппарат. Рецепторы цитоплаз-латической мембраны, чувствительные к ФАВ, способны связывать со-угветствующие лиганды и активировать эффекторные системы. Данные троцессы сопровождаются изменением ионной проницаемости цитоп-шматической мембраны, электрических и сократительных реакций ГМК. Лоэтому при исследовании ионообменных процессов, протекающих в ¡озбудимых мембранах, в последние годы широко используется метод 5локирования ионных каналов. В опытах на различных гладких мышцах гасто производится блокирование Ca - каналов, регулирующих генера-щю ПД и возникновение различных сократительных реакций.

Выясняя механизмы действия гистамина на электрические и сократи-ельные свойства ГМК воротной вены, мы применили ионы никеля, кадмия, ванадат натрия, гепарин и кофеин, которые по данным многих авто-юв [Феденко Е.П, 1983; Endo M., 1975; Gotton K.D., 1996; Kong I.D., !000; Silverman S.K., 1996 и др.], являются блокаторами Ca - каналов и юмпонентов кальциевой сигнальной системы. В литературе мы не встрепли работ, посвященных действию этих веществ на ГМК воротной вены, юэтому изучили их влияние на ГМК данного сосуда.

Нашими исследованиями установлено, что никель не изменял величи-[ы МП, уменьшал амплитуду и продолжительность MB, вызывал повы-цение сопротивления мембраны, угнетал электрические и сократитель-[ые свойства ГМК. Торможение процессов генерации ПД и сокращений ia фоне ионов никеля на ГМК воротной вены сопровождалось исчезно-;ением спайков на плато КЭТ. Эффект его действия наступал быстро и [родолжался в течение значительного времени. Таким образом, анализ юлученных данных свидетельствует о том, что никель тормозит элект-адческую и сократительную активность ГМК, блокируя низкопороговые 1ыстрои »активирующиеся Т-кальциевые каналы [Вислобоков А.И., 1995 [ др.]. При этом он не влияет на пассивную проводимость мембраны для ¡ругих потенциалобразующих ионов.

Исследование влияния ионов кадмия на ГМК воротной вены показало, то величина МП ГМК не изменялась, отмечалось увеличение сопротив-

ления мембраны. Вместе с тем, кадмий дозозависимо угнетал их электрическую и сократительную активность. При этом снижались частота спай-ков, сила сопутствующих сократительных реакций. Необходимо отметить, что ионы кадмия оказывали менее выраженное угнетающее влияние не ГМК воротной вены по сравнению с ионами никеля. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что кадмий тормозит электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены. На основании полученных нами результатов и литературных данных [Костюк П.Г.. 1982; Шуба М.Ф., 1981] можно заключить, что влияние кадмия на ГМК воротной вены обусловлено блокадой их L-кальциевых каналов.

Как уже указывалось, в регуляции проницаемости различных ионных каналов сарколеммы ГМК важная роль принадлежит ионам кальция, депонированным в мембранных везикулах и элементах саркоплазматичес-кого ретикулума, а также Са-АТФазе, являющихся компонентами кальциевой сигнальной систему. На эту систему оказывают влияние ванадат натрия, гепарин и кофеин.

Ванадат натрия - специфический блокатор Са-АТФазы сарколеммы и саркоплазматической сети ГМК [Костерин С.А., 1990 и др.] вызывал повышение сопротивления мембраны ГМК, не изменял величины мембранного потенциала, но уменьшал амплитуду MB и увеличивал их продолжительность При этом отмечались полное угнетение генерации спайков на MB и прекращение сократительного ответа. Эти изменения пассивных электрофизиологических и сократительных свойств ГМК являются следствием избыточного накопления ионизированного кальция в цитозоле. В результате этого происходит истощение запасов макроэргических фосфатов (АТФ, КрФ), инактивациии Na/K-АТФазы, накопление в цитозоле натрия и снижение концентрации ионов калия. Одновременно нарушаются механизмы фосфорилирования как потенциалзависимых, так и по-тенциалнезависимых ионных каналов. Торможение ПД ГМК воротной вены на фоне ваданата натрия обусловлено не только чрезмерным накоплением кальция в миоплазме и полной инактивацией каналов кальциевого входящего тока, но и торможением процессов активации всех каналов, зависящих от процессов фосфорилирования. Возрастание длительности сократительных реакций ГМК и первоначальное повышение их базаль-ного тонуса, объясняется избытком ионов кальция в миоплазме при одновременном снижении скорости их выведения и реаккумуляции в депо. Прогрессирующее снижение силы сокращений и тонуса связано с уменьшением запасов макроэргических фосфатов в клетках. Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует о том, что ванадат натрия оказывает тормозящее влияние на спонтанную, вызванную биоэлектрическую и сократительную активность ГМК воротной вены.

Гепарин является антагонистом цитоплазматического кальция [Вог-mann J., Hamill О.Р. and Sakmann В., 1987 и др.]. Нашими исследованиями

тановлено, что под влиянием гепарина уменьшались мембранный по-нциал, амплитуда и продолжительность MB. При этом отмечались поле угнетение генерации спайков на MB и прекращение сократительного вета. При дальнейшем действии гепарина наблюдались постепенное сстановление частоты, амплитуды спайковой активности и сокраще-й небольшой силы фазно-тонического характера. Не исключено, что может ингибировать активность инозитолтрифосфата. Деполяризация лишение сопротивления мембраны ГМК на фоне гепарина могут быть гдствием увеличения натриевой проводимости мембраны в результате чзывания внутриклеточных ионов кальция. Постепенное восстановле-е параметров ПД и сокращений ГМК, спайков может быть связано с зрушением гепарина в клетках.

Затем мы изучили влияние кофеина на биоэлектрические и сократи-ibiibie свойства ГМК воротной вены зрелых морских свинок. Исследо-вдями [LiuC.Y., 1996; Prakah Y.S., 1996 идр.] установлено, что кофеин эсобствует высвобождению ионов кальция из мест секвестрации и то-ческому сокращению ГМК. Результаты наших опытов показывают, что феин вызывал увеличение сопротивления мембраны ГМК воротной 1Ы. Это можно объяснить высвобождением небольшого количества тонированного кальция, связыванием его с кальмодулином и потенци-эванием комплексом Са-СаМ механизмов активации каналов входящего са. Подавляющее действие кофеина сопровождалось уменьшением ам-итуды и продолжительности MB, угнетением генерации спайков на MB рекращением сократительного ответа. Некоторые авторы [Kongl.D. et 2000; Silverman S.K. et a., 1996] объясняют их прямым блокирующим -шнием кофеина на потенциалзависимые кальциевые мембраны, а таких кальцийзависимой инактивацией. Известно, что метилксантины шулируют синтез цАМФ. Поэтому нельзя исключить и значительного зышения уровня цАМФ в ГМК на фоне кофеина, при котором он будет иывать ингибирующее воздействие на потенциалзависимые кальцие-е каналы. Таким образом, анализ полученных данных свидетельствует ом, что кофеин дозозависимо угнетает электрическую и сократитель-о активность ГМК.

"истамин, применённый на фоне блокады Са - каналов никелем, кад-ем, ванадатом натрия, гепарином и кофеином, не оказывал возбужда-jero действия на электрическую и сократительную активность ГМК ютной вены. Это связано с тем, что никель является специфическим жатором Т-кальциевых каналов, а влияние кадмия на ГМК воротной [ы обусловлено блокадой их L-кальциевых каналов. При'действии ваша натрия стимуляция поступления кальция в клетки гистамином придет к его более быстрому накоплению в цитозоле и последующим тор-зным эффектам. Гистамин на фоне действия гепарина в конечном ито-ie вызывал возбуждения и сокращения ГМК, т.к. угнетал активность

вторичных посредников - инозитолтрифосфата и 2,4 - диацилглицерола. Значительное повышение уровня цАМФ в ГМК на фоне кофеина, при котором он будет оказывать ингибирующее воздействие на потенциалза-висимые кальциевые каналы, может объяснить снижение эффектов гис-тамина.

Итак, полученные результаты указывают на то, что ионы никеля, кадмия, ванадат натрия, гепарин и кофеин угнетают стимулирующее влияние гистамина на электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены. На основании собственных исследований и литературных данных [Данилова В.М. и др., 1986; Орлов P.C., 1981 и др.] можно сделать заключение, что основополагающим в механизмах регуляции действия гистамина на ГМК являются компоненты кальциевой сигнальной системы: Т- и L-кальциевые каналы, Са-АТФаза, цитоплазматический кальций, обеспечивающие электрические и сократительные свойства ГМК.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о ведущей роли кальциевой сигнальной системы в механизмах возбуждения и сокращения ГМК воротной вены зрелых морских свинок. Воротная вена, обладая электрической и сократительной активностью, способствует току крови к печени, имеющей огромное значение в организме.

ВЫВОДЫ

1. Гистамин оказывает возбуждающее влияние на электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены. Его эффект обусловлен активацией Н] - гистаминовых рецепторов.

2. Ионы никеля угнетают электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены, блокируя Т-кальциевые каналы.

3. Ионы кадмия подавляют электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены. Тормозной эффект связан с блокадой L-каль-циевых каналов.

4. Ванадат натрия угнетает электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены. Его тормозной эффект связан с возрастанием количества кальция в цитозоле и инактивацией Ca - каналов.

5. Гепарин тормозит электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены, т.к. является антагонистом цитоплазматического кальция.

6. Кофеин подавляет электрическую и сократительную активность ГМК воротной вены, что объясняется накоплением цАМФ.

7. На фоне действия ионов никеля, кадмия, ванадата натрия, гепарина и кофеина стимулирующее влияние гистамина на биоэлектрические и сократительные свойства ГМК подавляются в результате нарушения взаимодействия элементов кальциевой сигнальной системы.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Особенности механизмов электромеханического сопряжения глад-комышечных клеток в процессе постнатального онтогенеза. // Материалы XVIII съезда физиологов России. - Казань, 2001. - С. 186 (соавторы: А.Г. Патюков, Д.Ф. Лукьяненко, A.IO. Комаров, O.A. Савченко).

Роль аденилатциклазного и фосфоинозитольного сигнальных механизмов в процессах возбудимости и сокращений гладкомышечных клеток. // Актуальные проблемы биохимии патологических процессов. -Омский научный вестник, выпуск21,2002. -С. 60-62. (соавторы: А.Г. Патюков, Д.Ф. Лукьяненко, А.Ю. Комаров, O.A. Савченко). Роль кальциевой сигнальной системы в механизмах электрогенеза и чувствительности гладкомышечных клеток к физиологически активным веществам. // Актуальные проблемы биохимии патологических процессов. - Омский научный вестник, выпуск 21, 2002. - С. 70-72. (соавторы: А.Г. Патюков, Д.Ф. Лукьяненко, Л.И. Сукач). Влияние гепарина на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены зрелых морских свинок. //Материалы III Конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». -Москва, 2004. - В печати (соавтор: O.A. Савченко). Влияние кофеина на электрические и сократительные свойства гладкомышечных клеток воротной вены зрелых морских свинок. // Материалы III Конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2004. - В печати.