Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние психотропного препарата ТС-2153 на поведение и экспрессию генов серотониновой системы и нейротрофического фактора мозга мышей, генетически предрасположенных к нейропатологии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние психотропного препарата ТС-2153 на поведение и экспрессию генов серотониновой системы и нейротрофического фактора мозга мышей, генетически предрасположенных к нейропатологии"

На правах рукописи

КУЛИКОВА ЕЛИЗАВЕТА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЛИЯНИЕ ПСИХОТРОПНОГО ПРЕПАРАТА ТС-2153 НА ПОВЕДЕНИЕ И ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ СЕРОТОНИНОВОЙ СИСТЕМЫ И НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА МОЗГА МЫШЕЙ, ГЕНЕТИЧЕСКИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННЫХ К НЕЙРОПАТОЛОГИИ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

4 ДЕК 2014

005556142

Новосибирск - 2014

005556142

Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институте цитологии и генетики» СО РАН, г.Новосибирск.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Попова Нина Константиновна

Официальные оппоненты: Колпаков Аркадий Ростиславович,

доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО НГМУ Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры фармакологии, клинической фармакологии и доказательной медицины

Лавриненко Валентина Александровна, кандидат биологических наук, доцент, ФГАОУ ВО ННИГУ (НГУ), профессор кафедры физиология

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Москва

Защита диссертации состоится «.¿0у> 2014 г. в 10.00 часов на

заседании диссертационного совета по защите диссертаций (Д 001.014.01) на соискание ученой степени кандидата биологических паук в ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН в конференц-зале института по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН и на сайте www.physiol.ru/diss/.

Автореферат разослан «<£Г>> Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н.

// 2014 г.

Бузуева И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Депрессия - это тяжелое психическое заболевание. Известно, что 26% женщин и 12% мужчин в развитых странах страдают депрессией. По данным Всемирной Организации Здравоохранения к 2.030 году этот недуг займет второе место среди заболеваний, связанных с потерей трудоспособности (Lam, Мок, 2008). Депрессия характеризуется нарушением баланса позитивных и негативных эмоций. Предполагают, что причиной депрессивной симптоматики является нарушения медиаторных систем мозга. Особое внимание отводится снижению функции серотониновой (5-НТ) системы (Maes, Meitzer, 1995; Van Praag, 2004). Главным доказательством участия 5-НТ системы является то, что антидепрессанты увеличивают концентрацию 5-НТ в мозге (Korte-Bouws et. al., 1996; Smolders et al., 2008; Qu et al, 2009).

Антидепрессанты - это группа лекарств, подавляющих симптомы депрессии. Большинство клинически эффективных антидепрессантов классифицируют по структуре и механизму действия на ингибиторы фермента разрушения 5-НТ - моноаминоксидазы А (МАОА) (Shih, Thompson, 1999) и транспортера 5-НТ (Lesch, 2004). Последние делятся на трициклические антидепрессанты, такие как имипрамин, и селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, такие как флуоксетин. Эти соединения увеличивают концентрацию 5-НТ в синаптической щели, блокируя либо его разрушение, либо обратный захват.

К сожалению, все известные на сегодняшний день антидепрессанты имеют множество недостатков. Большинство из них могут в первые дни приема вызывать негативный эффект, обостряя депрессию. Это связано с активацией 5-HT,A ауторецепторов, тормозящих импульсную активность 5-НТ нейронов в мозге. При чрезмерно длительном приеме препаратов происходит снижение мРНК и уровней ключевых белков серотониновой системы (Moret, Briley, 1992; Pineyro, Blier, 1999; Mirza et al., 2007). Еще одним недостатком антидепрессантов является необходимость принимать их в течение нескольких недель или даже месяцев для достижения терапевтического эффекта (Willner, 1990; Nestler et al. 2002). Это связано со временем, необходимым для снижения уровня белка и мРНК 5-НТ1А ауторецепторов (Blier, de Montigny, 1994), а также с длительной адаптацией и изменениями в нейротрофических путях, связанных с активацией нейротрофического фактора мозга BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor), участвующего в процессах выживания и роста нейронов (Duman, 1998). Прием препаратов может привести к возникновению различных побочных эффектов, ухудшающих самочувствие и качество жизни пациентов. Эти данные объясняют, почему около 20-40% больных являются устойчивыми к антидепрессантам.

Поэтому поиск новых антидепрессантов является крайне актуальной задачей. В Новосибирском институте органической химии СО РАН было синтезировано соединение 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-

амин гидрохлорид (ТС-2153) — синтетический аналог варацина, входящий в семейство бензопентатиепинов. Синтезированное вещество ТС-2153 имеет низкую токсичность (LD5O>1000 мг/кг) и обладает анксиолитическим и антиконвульсивным действиями (Khomenko, et al., 2009; 2011). Потенциальные психотропные свойства этого соединения вызывают существенный интерес.

Ключевой проблемой при исследовании механизма действия известных и поиска новых антидепрессантов является выбор адекватной экспериментальной модели. В последние годы особое внимание уделяется генетическим моделям. Это связано с тем, что генетические факторы составляют от 40 до 70% риска появления депрессии. В Институте цитологии и генетики СО РАН содержатся линии мышей, отличающиеся по предрасположенности к наследственной каталепсии. Каталепсия — это гипертрофированная реакция замирания. Животное или человек в состоянии каталепсии не способны менять приданную им неудобную позу в течение длительного времени (Карманова, 1964; Klemm, 1989). У человека каталепсия часто наблюдается при серьезных нарушениях функций центральной нервной системы, таких как депрессия и шизофрения (Колпаков, 1990; Singerman, Raheja, 1994). На базе двух родительских линий - некаталептической AKR (0% каталептиков) и каталептической СВА (50% каталептиков) были созданы уникальные каталептические линии мышей: конгенная AKR линия М76С (AKR.CBA-D13Mit76) и ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy). Линия М76С была получена переносом главного локуса каталепсии из генома мышей линии СВА в геном AKR. Было показано, что 50% животных этой линий проявляют каталепсию, также мыши линии М76С характеризуются плохой обучаемостью в тесте Морриса и повышенной агрессивностью (Kulikov et al., 2008а; Кондаурова и др., 2010; Kulikov et al., 2014). Линия мышей ASC была получена путем селекции на предрасположенность к наследственной каталепсии. Около 75% животных этой линии проявляют каталепсию. Мыши линии ASC характеризуются множественными депрессивноподобными нарушениями поведения (Базовкина и др., 2005, Кондаурова и др., 2007; Дубровина и др., 2008; Тихонова и др., 2010). Хроническое введение классических антидепрессантов (флуоксетина и имипрамина) и однократное введение BDNF подавляют выраженность каталепсии у мышей этой линии (Тихонова и др., 2006; 2009а; 2009b).

Описанные особенности этих линий мышей, дают основание считать их, и прежде всего линию ASC, перспективными моделями для исследования участия 5-НТ системы и нейротрофического фактора мозга BDNF в механизмах наследственной нейропатологии, а также в механизмах действия психотропных препаратов.

Целью данной работы было изучение влияния препарата ТС-2153 (8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепина-6-амина гидрохлорида) на поведение, серотониновую систему и нейротрофический фактор мозга (BDNF) мышей, генетически предрасположенных к нейропатологии.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологические особенности строения мозга у мышей с различной предрасположенностью к каталепсии;

2. Исследовать влияние препарата ТС-2153 на двигательную и исследовательскую активности, а также на тревожность и выраженность каталепсии;

3. Изучить возможности коррекции депрессивноподобного поведения у мышей линии ASC с помощью препарата ТС-2153;

4. Сопоставить поведенческие эффекты классических антидепрессантов (флуоксетина и имипрамина) и ТС-2153 у мышей с генетической предрасположенностью к каталепсии;

5. Исследовать участие серотониновой системы (генов 5-HT,a рецептора, фермента МАОА, ТПГ-2 и транспортера серотонина) в механизме действия препарата ТС-2153;

6. Изучить влияние препарата ТС-2153 на уровень мРНК гена нейротрофического фактора мозга BDNF и гена одного из его транскрипционных факторов CREB (цАМФ-зависимый транскрипционный фактор).

Научная новизна. В нашей работе впервые показано, что

1) препарат ТС-2153 обладает антидепрессантными и антикаталептическими эффектами;

2) ТС-2153 снижает экспрессию генов, кодирующих 5-НТ]Л рецептор и МАОА, в среднем мозге;

3) ТС-2153 увеличивает экспрессию гена, кодирующего BDNF, в гиппокампе;

4) ТС-2153 не оказывает негативных побочных эффектов, таких как снижение двигательной и исследовательской активностей и увеличение тревожности, в отличие от классических антидепрессантов, флуоксетина и имипрамина;

5) мыши с наследственной предрасположенностью к каталепсии характеризуются меньшим размером гипофиза, чем некаталептические;

6) депрессивноподобная линия мышей ASC характеризуется меньшими размерами гипофиза, стриатума, мозолистого тела и промежуточного мозга по сравнению с родительскими линиями и линией AKR.CBA-D13Mit76.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Основным вкладом этого исследования в изучение механизмов возникновения депрессии и способов ее коррекции является то, что были описаны эффекты соединения ТС-2153, такие как антидепрессантный и антикаталептический. Это соединение в средних дозах не оказывает видимых побочных эффектов на двигательную, исследовательскую активности и тревожность. Показано участие серотониновой системы и нейротрофического фактора мозга BDNF в механизме действия этого потенциального антидепрессанта. Обнаруженная связь морфологических изменений мозга и состояния каталепсии является

еще одним доводом в пользу использования линий мышей ASC и AKR.CBA-D13Mit76 как экспериментальных моделей психопатологии. Полученные данные используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук Новосибирского Государственного Университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Препарат ТС-2153 обладает антидепрессантными и антикаталептическими эффектами без видимых побочных эффектов на двигательную и исследовательскую активности, а также на тревожность у мышей линий СВА, ASC и AKR.CBA-D13Mit76;

2. Обнаружена связь морфологических изменений в мозге с наследственной предрасположенностью к каталепсии;

3. Животные линии ASC характеризуются уменьшением некоторых структур мозга по сравнению с родительскими линиями СВА, AKR и AKR. СВ A-D 13 М it76;

4. Серотониновая система и нейротрофический фактор мозга BDNF участвуют в механизме действия препарата ТС-2153.

Апробация результатов. Полученные результаты были представлены и обсуждены на 3 всероссийских и 3 международных конференциях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных (1) и международных (3) журналах, 6 тезисов на всероссийских (3) и на международных конференциях (3).

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (226 источников). Работа изложена на 82 страницах, содержит 16 оригинальных рисунков и 6 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовались мыши некаталептической линии AK.R/J и каталептических линий: CBA/Lac, ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy) и AKR.CBA-D13Mit76 (M76C). Животные содержались в стандартных условиях вивария ИЦиГ СО РАН. Все эксперименты были проведены в соответствии с российскими и зарубежными нормами гуманного обращения с животными.

Препараты

Все препараты вводили в объеме 0.1 мл на 10 г веса, Животным контрольной группы вводили соответствующий растворитель в том же объеме.

В работе использовали соединение ТС-2153 в виде соли гидрохлорида 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-амина. Было использовано два способа разведения препарата и два способа его введения. В первом ТС-2153 смешивали с каплей растворителя ТВИН-80, а затем доводили до нужного объема дистиллированной водой. Полученный раствор вводили в

желудок (per os) с помощью специального зонда. Во втором ТС-2153 разводили в 17% ДМСО и вводили внутрибрюшинно. При per os введении эксперименты проводили на мышах линии ASC, использовали дозы 10, 20, 40 мг/кг веса для острого введения (1-2 дня) и 10 мг/кг веса для хронического (12-13 дней - для поведенческих тестов и 16 дней - для исследования экспрессии генов). При внутрибрюшинном введении эксперименты проводили на мышах линий AKR, СВА и М76С, использовали дозу 20 мг/кг веса для острого введения.

Клинически эффективные антидепрессанты флуоксетин и имипрамин (Sigma, USA), растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг мышам линий AKR, СВА и М76С .

Поведенческие тесты

Все поведенческие характеристики в тестах «открытое поле» (Kulikov et al., 2008), «предрасположенность к щипковой каталепсии» (Kulikov et al., 1993), «приподнятый крестообразный лабиринт» (Popova, Kulikov, 1986) и «принудительное плавание» (Kulikov et al., 2010) оценивали по стандартным методикам. Поведение животных автоматически регистрировали при помощи цифровой видеокамеры, соединенной с компьютером, и анализировали, используя компьютерную программу EthoStudio (Kulikov et al., 2008).

Магнитно-резонансная томография

Для исследования морфологических различий в размерах мозга у животных in vivo мы использовали горизонтальный томограф с напряженностью магнитного поля 11.7 Тесла (Bruker, BioSpec 117/16 USR, Германия). Изображения головного мозга получали в трех проекциях: аксиальной, коронарной и сагиттальной. Интересующие структуры измеряли с помощью программного обеспечения ROI.

Определение уровня экспрессии генов, кодирующих белки 5HTia-рецептор, МАОА, триптофангидроксилазу-2 (ТГТГ-2), транспортер 5-НТ, нейротрофический фактор мозга BDNF и транскрипционный фактор CREB {Htrla, Маоа, Tph2, Slc6a4, Bdnf и СгеЫ, соответственно), проводили при помощи количественного метода ОТ-ПЦР (Kulikov, Naumenko et al., 2005; Науменко, Куликов, 2006).

Статистическая обработка

Число животных-каталептиков представляли как процентное отношение от общего числа животных в каждой экспериментальной группе и сравнивали с помощью двухстороннего точного критерия Фишера. Общий объем мозга (мм3) и площади мозга (мм2) представлены как М±т и проанализированы с помощью ковариационного анализа ANOVA, где ковариантой выступала масса животных. Значения, полученные при сравнении поведенческих эффектов препаратов (ТС-2153, флуоксетина и имипрамина) у мышей разных линий в тестах «открытое поле», «принудительное плавание» и «приподнятый крестообразный лабиринт», представлены как М±т и проанализированы с помощью двухфакторного анализа ANOVA. Все остальные полученные результаты представлены как

М±т и проанализированы с помощью однофакторного анализа ANOVA. Для сравнения различий между отдельными экспериментальными группами был использован post-hoc LSD тест Фишера. Предварительно данные были проверены на принадлежность крайних вариант к совокупности, выбраковка осуществлялась по критерию Диксона (Закс, 1976).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические особенности мозга мышей, генетически предрасположенных к патологическому поведению

Проведенные исследования показали ассоциацию между предрасположенностью к наследственной каталепсии и морфологическими изменениями в мозге. Размер гипофиза мышей каталептических линии (ASC, СВА и М76С) был достоверно меньше, чем у некаталептической линии мышей AKR (F3 34 = 9.07, р<0.001). Это говорит о возможных изменениях в центральной нейроэндокринной регуляции.

Было показано, что самым маленьким гипофизом обладает линия мышей ASC, характеризующаяся наибольшим процентом каталептиков и депрессивноподобными нарушениями поведения. Помимо этого у этой линии было обнаружено резкое уменьшение стриатума (F3>34 = 4.59, р<0.01), промежуточного мозга (F3j34 = 4.88, р<0.01) и мозолистого тела (F3 33 = 8.21, р<0.001). Подобные изменения в разной степени наблюдаются у пациентов, страдающих депрессией и шизофренией (Han et al., 2013; Macmaster et al., 2013). При депрессии наблюдается также резкое уменьшение размеров гиппокампа (Schweitzer et al., 2001), однако в нашей работе мы не обнаружили различий ни в этой структуре (F3>34 = 2.823, р>0.05), ни в размерах среднего мозга (F3>33 = 0.8) у исследованных групп (Рис.1). Возможно, что обнаруженные морфологические изменения в мозге у этих мышей связаны специфически с предрасположенностью к каталепсии, однако в настоящее время нет работ, посвященных влиянию каталепсии на морфологические изменения мозга у людей. Ранее было показано, что введение в мозг BDNF приводит к исчезновению каталепсии у мышей ASC и СВА (Тихонова и др., 2009b; Naumenko et al., 2012; Tikhonova et al., 2012). Поскольку известно, что BDNF участвует в нейрогенезе, то эти данные являются косвенным доказательством того, что каталепсия связана с нейродегенеративными процессами в мозге.

Рис.1. Размеры структур мозга у мышей, с генетической предрасположенностью к каталепсии: каталептиков - СВА, ASC и М76С; не каталептиков - AKR. Размеры структур представлены в процентах от общей площади мозга на соответствующем срезе.

п=8-11; # р<0.05, ## р<0.01 по сравнению с AKR;* р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001 по сравнению с ASC.

В то же время нами не было обнаружено существенных различий по объему (F3,зз=2.13, р>0.05) и площади мозга (аксиальный, коронарный и сагиттальный срезы) (F3i33< 1) у исследованных линий.

Влияние ТС-2153 на выраженность предрасположенности к «щипковой» каталепсии у мышей линии ASC

В данном исследовании было обнаружено, что ТС-2153 достоверно уменьшал процент каталептиков (р<0.01, р<0.001, дозы 20 и 40 мг/кг, соответственно) и время каталептического замирания (F3i69 = 4.10, pO.OOl) у мышей ASC уже при однократном введении (Рис.2). В то же время, однократное введение классических антидепрессантов имипрамина (Тихонова и др., 2006) или флуоксетииа (Тихонова и др., 2009а) в дозах 20 мг/кг не оказывало антикаталептического действия на мышей ASC. Полученный результат свидетельствует о том, что антикаталептическая активность ТС-2153 выше, чем у классических антидепрессантов.

[ЁЭ контроль f ! 10 мг/кг Г~71 20 ш!., 40 мг/кг |

S

i

о 10

g:

*** i

Рис.2. Изменение процента каталептиков и продолжительности каталепсии у мышей линии ASC после острого введения различных доз ТС-2153 (10, 20, 40 мг/кг) и контроля.

п=14-29; *р<0.05, ***р<0.001 относительно контрольной группы.

При хроническом введении ТС-2153 (10 мг/кг, 12 дней) также достоверно уменьшал процент каталептиков (р<0.05) и продолжительность каталепсии (Fi>28 = 6.60, р<0.05) у мышей линии ASC (Рис.3). Внутрибрюшинное введение классических антидепрессантов флуоксетина (Тихонова и др., 2009а) и имипрамина (Тихонова и др., 2006) (20 мг/кг, 14 дней) оказывало схожий антикаталептический эффект.

Следовательно, высокие дозы препарата ТС-2153 эффективны для подавления каталепсии при однократном введении, тогда как более низкие дозы препарата эффективны при хроническом введении. Одна из основных проблем современных психотропных препаратов является необходимость их применения в течение длительного периода времени для получения терапевтического эффекта (Nestler et al., 2002), а способность ТС-2153 оказывать антикаталептический эффект, как при остром, так и при хроническом введении, говорит о высокой эффективности этого препарата.

; □ контроль ШЭ Ю мг/кг:

=Г 20 £

с

I50

® 40 Л

5

se

| те

Рис.3. Изменение процента каталептиков и продолжительности каталепсии у мышей линии ASC после хронического введения ТС-2153 (10 мг/кг). п=14-30;* р<0.05.

Влияние ТС-2153 на поведение мышей линии ASC в тесте «принудительное плавание»

тест «принудительное плавание» (тест Порсолта) является классическим для определения эффективности клинических антидепрессантов. Однократное введение ТС-2153 снижало время неподвижности (F12s= 5.80, р<0.05) (Рис.4) в этом тесте у мышей линии ASC. Таким образом, ТС-2153 оказывает антидепрессантный эффект.

i t контроль ................10 МГ/КГ :

° 100 ■ т

I гч

0 80- г

1 -+1

аз во -

g

ф ilige

Рис.4. Влияние ТС-2153 на время неподвижности в тесте «принудительное

плавание».

п=15; * р<0.05.

Влияние ТС-2153 на двигательную активность, исследовательскую активность и тревожность в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт»

Для изучения двигательной и исследовательской активности используют тест «открытое поле». Острое и хроническое введения ТС-2153 не повлияли на двигательную (Рз,7о = 2.73; Р^ = 3.45, р>0.05, соответственно) и исследовательскую (Ря,7о = 1.51; Р12« = 1.76, р>0.05, соответственно) активности у мышей линии АЯС (Табл.1; Табл.2).

Основными тестами для оценки тревожности являются тест «открытое поле», где показателем анксиолитической активности является увеличение времени, проведенного в центре поля, и «приподнятый крестообразный лабиринт», где показателем является увеличение времени, проведенного в открытых рукавах (КНеЛегтеБ, 2005; Са1аЬгезе, 2008). Ни острое, ни хроническое введение ТС-2153 не оказали влияния на время, проведенное в открытых рукавах (Р1>25 = 0.12, Р|>27 = 0.07, соответственно) (Табл.3). Однако высокая доза (40 мг/кг) ТС-2153 при остром введении достоверно снижала время в центре поля (Рз,7о = 3.04, р<0.05). Тогда как дозы 10 и 20 мг/кг при остром и доза 10 мг/кг при хроническом введении не оказали влияния на этот показатель (Ри8 = 2.22, р>0.05) (Табл.1; Табл.2). Увеличение тревожности при остром введении антидепрессантов - частое явление в клинике и может быть спровоцировано даже средней дозой препарата (Вп-кей е1 а!., 2011).

Таблица 1. Влияние острого введения ТС-2153 (10, 20, 40 мг/кг) на двигательную и исследовательскую активности, а также тревожность в тесте «открытое поле» у мышей линии ASC. ___

Исследуемые параметры контроль 10 мг/кг 20 мг/кг 40 мг/кг F p

Путь, см 785.7i37.89 911,2±48.84 842.5i70.89 679.0±65,36 F.i.70 = 2.73 p>0.05

Число вертикальных стоек 13.8±1.98 12.7±2.02 18.0±3.36 10.2±1.98 F3.7o= 1.51 p>0.05

Время, проведенное в центре поля, % 14.2±1.81 17.2±1.б1 11.Ш.58 8.3±2.50 * FJ,65 = 3.04 p<0.05

п=14-30; *р<0.05 относительно контрольной группы. Таблица 2. Влияние хронического введения ТС-2153 (10 мг/кг) на двигательную и исследовательскую активности, а также тревожность в тесте

Исследуемые параметры контроль ТС-2153 F P

Путь, см 653.5 ±58.18 796.3 ±50.13 FU8 = 3.45 p>0.05

Число вертикальных стоек 4.6 ±0.94 6.9 ± 1.48 F i,28= 2.22 p>0.05

Врем, проведенное в центре поля, % 17.8 ±4.68 9.8 ±2.51 Fus =1.76 p>0.05

п=15.

Таблица 3. Влияние острого и хронического введений ТС-2153 (10 мг/кг) на поведение мышей линии ASC в тесте «приподнятый крестообразный

Воздействие Время в открытых рукавах (%) Значимость

Контроль ТС-2153

Острое введение 31.5 ±8.99 35.8 ±7.88 Fus =0.12

Хроническое введение ( 10 дней) 2.4 ± 1.69 3.1 ± 1.95 FI,27=0.07

п=13-15.

Сравнение влияния на поведение препарата ТС-2153 и классических антидепрессантов, ингибиторов обратного захвата серотонина, флуоксетинаи имипрамина

Не было обнаружено различий в поведении животных при введении им физиологического раствора или 17% ДМСО ни по одному из исследованных параметров в ниже приведенных тестах. В связи с этим, эти группы были объединены в одну контрольную группу.

В тесте «принудительное плавание» были обнаружены достоверные различия по времени неподвижности (Р3159 = 11.16, р<0.001). ТС-2153 уменьшал время неподвижности у мышей линий АКЯ (р<0.05) и М76С (р<0.05). Флуоксетин уменьшал время неподвижности у мышей всех исследуемых линий - АКБ. (р<0.01), СВА (р<0.05), М76С (р<0.01). Имипрамин снижал время неподвижности только у одной линии М76С (р<0.001). Таким образом, мы показали, что ТС-2153 оказывает выраженный антидепрессантный эффект в тесте «принудительное плавание», соизмеримый с действием клинически эффективных антидепрессантов. Наблюдаемые межлинейные различия в действии ТС-2153 на поведение

мышей в тесте «принудительное плавание» согласуются с отмеченным многими авторами влиянием генотипа на эффекты антидепрессантов (Cervo et al., 2005; Kulikov et al, 2011) (Рис.5).

Несмотря на то, что флуоксетин оказывал антидепрессантный эффект на все три линии, он имел ряд негативных побочных эффектов, таких как: снижение двигательной и исследовательской активности («открытое поле»), повышение тревожности («открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт») (Рис.6; Рис.7). Имипрамин подавлял двигательную и исследовательскую активности у М76С в тесте «открытое поле» (Рис.6). Препарат ТС-2153, в отличие от классических антидепрессантов, не проявлял негативных побочных эффектов на поведение. Более того, было обнаружено, что ТС-2153 увеличивает двигательную активность («открытое поле») и снижает тревожность («приподнятый крестообразный лабиринт») у мышей AKR (Рис.6; Рис.7).

В данном исследовании также было показано, что мыши линии М76С более чувствительны к действию антидепрессантов, чем животные линии СВА. Селекция, проводимая при создании линий М76С и ASC, привела к изменениям поведения в используемых тестах по сравнению с родительскими линиями. Известно, что эффекты антидепрессантов слабее проявляются на «нормальных» добровольцах, чем на депрессивных пациентах (Willner, 1990). Высокую чувствительность каталептических линий ASC и М76С к антидепрессантам можно рассматривать как еще одно доказательство связи наследственной каталепсии с механизмами депрессии.

I I контроль fet IТС-2153 r v-l Флуоксетин I :....... Имипрамин

AKR СВА М76С

Рис.5. Влияние острого введения ТС-2153, имипрамина и флуоксетина в дозе 20 мг/кг на время неподвижности в тесте «принудительное плавание». п=7-22; * р<0.05, ** р<0.01, *** р<0.001 по сравнению с контрольными животными этой же линии.

контроль К::>?;1 ТС-2153 8 ) флуоксетин ^ имипрамин

14001290

£

".1000-§

= 800-

АКР СВА

55-,

50-

45-

О 40-

XI 35-

X

л 1 30-

5 25-

20-

о 15-

о

Т 10-

5-

0-

|

АКР! СВА

АКР СВА

Рис.6. Влияние острого введения ТС-2153, имипрамина и флуоксетина в дозе 20 мг/кг на пройденный путь, количество вертикальных стоек и на время, проведенное в центре, в тесте «открытое поле».

р<0.001 по сравнению с контрольными

п=12-21; * р<0.05, ** р<0.01, животными этой же линии.

45

>*

О. 40 X

3 35 I-

3 зо а.

£ "

2»

1 15 а ю

5 О

Ш

I I контроль ЕЭ ТС-2153 I 'I флуоксетин Г >;-'! имипрамин

АКР СВА М76С

Рис.7. Влияние острого введения ТС-2153, имипрамина и флуоксетина в дозе 20 мг/кг на время, проведенное в открытых рукавах, в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт».

п=7-26; * р<0.05 по сравнению с контрольными животными этой же линии.

Участие серотониновой системы в механизме действия препарата ТС-2153

В данном исследовании было показано, что хроническое введение соединения ТС-2153 (16 дней) не повлияло на экспрессию генов, кодирующих ТПГ-2 (ТрИ2) (Р1>16 = 1.69, р>0.05) и 5-НТ транспортер (81с6а4) 16 = 0.76) в среднем мозге (Рис.8). В то же время, препарат оказал значительный эффект на экспрессию других ключевых генов 5-НТ системы -5-НТ,А рецептора (Н1г1а) (Р,,16 = 17.6, р<0.001) и МАОА (Маоа) (Р,,16 = 19.5, р<0.001) в среднем мозге, однако не повлиял на экспрессию этих генов в коре

(Б, 16 = 0.11 для Шг1а и Р,>16 = 1.07, р>0.05 для Маоа) и гиппокампе (Р, 16 = 0.003 для #Г/7я и Риб = 2.68, р>0.05 для Маоа) (Рис.8). Снижение экспрессии гена 5-НТ,а рецептора в телах 5-НТ нейронов говорит о влиянии соединения ТС-2153 на ауторецепторы этих нейронов. Подобная картина снижения уровня мРНК и белка 5-НТ,А ауторецепторов наблюдается при хроническом введении классических антидепрессантов (ВПег, de Моп%пу, 1994), а также при действии анксиолитиков буспиронового ряда (Вау^г е1 а1., 2009) и агонистов 5НТ1Д рецептора (Ророуа е! а1., 2010).

Можно предположить, что антикаталептический и антидепрессантный эффекты ТС-2153 связаны с увеличением концентрации 5-НТ в тканях мозга, которое возникает как результат уменьшения количества 5-ЬГГ1А-ауторецепторов, блокирующих импульсную активность 5-НТ нейрона, и фермента разрушения 5-НТ - МАОА.

I I контроль шшз ТС-2153

Ъ 1 I

ïsl

X о >s

<1> С Ï

ш о 5

S.Ï I

H tria

rh*

Маоа

rb

Г+1

+

£ I 1

• Ç s

IH"

Slc6a4 средний мозг

гиппокамп средний мозг

Tph2 средний мозг

гиппокамп средний мозг

Рис.8. Влияние хронического введения ТС-2153 на уровень мРНК генов Tph2 и Scl6a4 в среднем мозге и генов Htrla и Маоа в среднем мозге, коре и гиппокампе. Уровень мРНК генов Tph2, Scl6a4, Htrla и Маоа в исследуемых структурах был рассчитан как количество копий на 100 копий мРНК гена Polr2a.

п=8-9; *** р<0.001 относительно контрольной группы.

Влияние ТС-2153 на экспрессию генов нейротрофического фактора мозга BDNF и его транскрипционного фактора CREB

В данной работе было показано, что ТС-2153 увеличивает уровень мРНК нейротрофического фактора мозга BDNF, кодируемого геном Bdnf, в гиппокампе (Fi,is = 4.81, р<0.05) у мышей линии ASC, но не было обнаружено изменений по экспрессии данного гена в других исследованных структурах (Рис.9). Клинически эффективные антидепрессанты также увеличивают уровень мРНК гена Bdnf в гиппокампе, где наблюдается наибольшая концентрация этого нейротрофического фактора (Pandey et al.,

2010). В то же время, ТС-2153 не повлиял на экспрессию гена СгеЫ, который кодирует транскрипционный фактор С11ЕВ, ни в одной из исследованных структур мозга (Рис.9). Тот факт, что не было обнаружено изменений в экспрессии гена СгеЫ говорит о возможности увеличения экспрессии ЕЮ№ за счет другого транскрипционного фактора.

] контроль 1_I тс-2152 ;

Bc/nf

fe

ti

корз гиплокамп средний мозг

ih

СгеЫ

fe

корз гиппокамп средний мозг

Рис.9. Влияние хронического введения ТС-2153 (10 мг/кг) на уровень мРНК генов Bdnf и СгеЫ во фронтальной коре, гиппокампе и среднем мозге. Уровень мРНК генов Bdnf и СгеЫ в исследуемых структурах был рассчитан как количество копий на 100 копий мРНК гена Polr2a. п=8-9; * р<0.05 относительно контрольной группы.

Заключение

Таким образом, в данной работе была обнаружена связь морфологических изменений в мозге с наследственной предрасположенностью к каталепсии, а также с депрессивноподобным поведением. Обнаружены антикаталептический и антидепрессантный эффекты соединения ТС-2153 без видимых негативных побочных действий. В то же время было показано, что антидепрессантный эффект препарата зависит от генотипа. Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимальной при остром введении является доза 20 мг/кг, а при хроническом введении достаточно дозы 10 мг/кг. Обнаруженные после введения ТС-2153 изменения поведения животных, а также изменения экспрессии генов в мозге можно считать доказательством способности ТС-2153 проходить гематоэнцефалический барьер.

Влияние ТС-2153 на 5-НТ систему головного мозга и на экспрессию гена нейротрофического фактора мозга ВООТ, его антикаталептический и антидепрессантный эффекты, а также ранее показанные антиконвульсивный эффект и низкая токсичность (КЬошепко е1 а1, 2009), в сочетании с отсутствием влияния на двигательную активность, исследовательскую активность и тревожность, говорит о его психотропных свойствах и указывают на высокую эффективность.

выводы

1. Методом магнитно-резонансной томографии у мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии были выявлены различия в размерах некоторых структур мозга (гипофиз, промежуточный мозг, стриатум, мозолистое тело), при неизменном общем объеме мозга у этих животных.

2. Мыши конгенной линии AKR.CB A-D13 Mit76, генетически предрасположенные к каталепсии, характеризуются повышенной чувствительностью к действию антидепрессантов (имипрамин, флуоксетин, ТС-2153).

3. Выявлено существенное антидепрессантное действие ТС-2153 на мышей линий ASC, AKR и AKR.CBA-D13MU76.

4. Выявлено существенное дозозависимое антикаталептическое действие ТС-2153 на мышей линии ASC.

5. Хроническое введение препарата ТС-2153 (10.0 мг/кг) оказывает антикаталептический эффект, но не оказывает влияния на двигательную активность, исследовательскую активность, тревожность в тесте «открытое поле» и тревожность в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» у мышей линии ASC.

6. В отличие от флуоксетина и имипрамина препарат ТС-2153 (10.0 и 20.0 мг/кг) не понижает двигательную и исследовательскую активности и не увеличивает тревожность у исследованных животных.

7. Выявлено влияние хронически вводимого ТС-2153 на экспрессию в среднем мозге ключевых генов, кодирующих белки серотониновой системы: снижение экспрессии гена Htrla, кодирующего 5-HTiA-рецептор, и гена Маоа, кодирующего основной фермент разрушения серотонина МАОА.

8. При хроническом введении ТС-2153 обнаружено увеличение в гиппокампе уровня мРНК гена Bdnf, кодирующего нейротрофический фактор мозга BDNF, но не гена СгеЫ, кодирующего цАМФ-зависимый транскрипционный фактор CREB.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕФЕРИРУЕМЫХ ЖУРНАЛАХ ИЗ СПИСКА ВАК

1. Куликов, A.B. Влияние нового психотропного препарата гидрохлорида 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепин-6-амина на экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм и рецепцию медиатора серотонина, в головном мозге мышей / A.B. Куликов, М.А. Тихонова, Е.А. Куликова, Т.М. Хоменко, Д.В. Корчагина, К.П. Волчо, Н.Ф. Салахутдинов, Н.К. Попова // Мол. Биол. — 2011. — Т. 45. — № 2. — С. 282-288.

2. Kulikov, A.V. A new synthetic varacin analogue, 8-(trifluoromethyl)-l,2,3,4,5-benzopentathiepin-6-amine hydrochloride (TC-2153), decreased hereditary catalepsy and increased the BDNF gene expression in the hippocampus in mice / A.V. Kulikov, M.A. Tikhonova, E.A. Kulikova, K.P. Volcho, T.M. Khomenko, N.F. Salakhutdinov, N.K. Popova // Psychopharmacology (Berl). — 2012. —Vol.221. — № 3. — P. 469-478.

3. Tikhonova, M.A. Hereditary catalepsy in mice is associated with the brain dysmorphology and altered stress response / M.A. Tikhonova, A.V. Kulikov, D.V. Bazovkina, E.A. Kulikova, A.S. Tsybko, E.Y. Bazhenova, V.S. Naumenko, A.E. Akulov, M.P. Moshkin, N.K. Popova // Behav. Brain Res. —2013,—Vol.243. —P. 53-60.

4. Kulikov, A.V. Antidepressant activity of 8-(trifluoromethyl)-l,2,3,4,5-benzopentathiepin-6-amine hydrochloride (TC-2153): comparison with classical antidepressants / A.V. Kulikov, M.A. Tikhonova, E.A. Kulikova, K.P. Volcho, T.M. Khomenko, N.F. Salakhutdinov, N.K. Popova // Lett Drug Des Discov. — 2014. — Vol.11. — №. 2. — P. 169-173.

ТЕЗИСЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ В СБОРНИКАХ КОНФЕРЕНЦИЙ.

1. Куликова, Е.А. Влияние нового психотропного препарата гидрохлорида 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепина-6-амина на экспрессию генов серотониновой системы в головном мозге мышей линии ASC / Е.А. Куликова // XLVIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». — 2011. — Новосибирск.

2. Куликов, А.В. Участие генов, кодирующих метаболизм и рецепцию серотонина, в молекулярном механизме действия нового психотропного препарата гидрохлорида 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепина-6-амина / А.В. Куликов, М.А. Тихонова, Е.А. Куликова, К.П. Волчо, Н.Ф. Салахутдинов, Н.К. Попова // II международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика и биоинформатика». — 2011. — Новосибирск.

3. Куликова, Е.А. Влияние нового психотропного препарата гидрохлорида 8-(трифторметил)-1,2,3,4,5-бензопентатиепина-6-амина на поведение и экспрессию генов BDNF и CREB в головном мозге мышей линии ASC / Е.А. Куликова // 50-ая юбилейная Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». — 2012. — Новосибирск.

4. Kulikova, Е.А. Effect of 8-(trifluoromethyl)-l,2,3,4,5-benzopentatiepin-6-amine-hydrochloride (TC-2153) on behavior and the BDNF gene expression in the mouse brain / E.A. Kulikova // International Summer School: "Neurogenetics. Unraveling behavior and brain mechanisms using modem technologies". — 2012. — Zvenigorod.

5. Kulikova, E.A. Hereditary catalepsy in mice is associated with brain dysmorphology / E.A. Kulikova, M.A. Tikhonova, A.V. Kulikov // FENS Featured Regional Meeting. — 2013. — Prague.

6. Kulikova, E.A. Antidepressant activity of new psychotic drug 8-(trifluoromethyl)-l,2,3,4,5-benzopentatiepin-6-amine hydrochloride (TC-2153) in comparison with classical antidepressants / E.A. Kulikova, M.A. Tikhonova, A.V. Kulikov, N.K. Popova // FENS Featured Meeting. — 2014. — Milan.

Подписано в печать 18.11.2014 Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1,25 Объем 20 стр. Тираж 110 зкз. Заказ № 211

Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ru