Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние острого стресса и липополисахарида на серотониновую систему мозга и поведение мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние острого стресса и липополисахарида на серотониновую систему мозга и поведение мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии"

На правах рукописи

БАЖЕНОВА Екатерина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО СТРЕССА И ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НА СЕРОТОНИНОВУЮ СИСТЕМУ МОЗГА И ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НАСЛЕДСТВЕННОЙ

КАТАЛЕПСИИ

03.03.01 - Физиология

Автореферат

диссертации на сонскание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ДЕК 2013

Новосибирск 2013

005543291

Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Федерального государственного бюджетного учреждения наука «Институт цитологии и генетики» СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: доктор биологических наук

Куликов Александр Викторович

ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН

г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

заведующая лабораторией

Идова Галина Вениаминовна

ФГБУ НИИ физиологии и фундаментальной

медицины СО РАМН

г. Новосибирск

кандидат биологических наук

старший научный сотрудник

Алехина Татьяна Алексеевна

ФГБУН Институт цитологии и генетики СО РАН

г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Защита диссертации состоится 2013 г. в на заседании

диссертационного совета Д 001.014.01 при ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН по адресу: г. Новосибирск, ул. акад. Тимакова, 4.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 630117, г. Новосибирск, а.я. 237, ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН, диссертационный совет. Телефакс 383-3359556, эл. почта dissoyetffiphysiol.ru. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ ФФМ» СО РАМН.

Автореферат разослан «ЛЛ» /¿¿¡.е^/иИ 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Бузуева И И

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время исследование взаимодействия между серотонином мозга (5-гидрокситриптамин, 5-НТ), гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой (ГГНС) и иммунной системой в механизме психопатологии является важной проблемой в психонейроиммунологии. Существует большое количество доказательств взаимодействия между этими системами (Weigent, Blalock, 1995; Dunn et al., 2005; Uhlig, Kallus, 2005; Ziemssen, Kern, 2007). Психические расстройства часто сопровождаются нарушениями в иммунной системе (Perry, 2004; Zunszain et al., 2011; Onore et al., 2012), в то время как стрессы, воспаление и активация иммунной системы увеличивают риск развития психопатологии (Porter et al., 2004; Irwin, Miller, 2007; Anisman et al., 2008; Miller, 2010; Kelley, Dantzer, 2011; Leonard, Maes, 2012).

Для активации неспецифического иммунитета наиболее часто применяют введение бактериального эндотоксина (липополисахарид, ЛПС) (Kent et al., 1992; Dunn, 1992; Anisman et al., 2008). Введение ЛПС приводит к увеличению концентраций IL-lp, IL-6 и TNF-a. Именно IL-ip, IL-6 и TNF-a вызывают болезненное состояние (sickness) и депрессивноподобное поведение: гипертермию, гипокинезию, гипофагию, гипералгезию, сниженный интерес к исследованию окружающей среды, снижение либидо, увеличение времени сна, снижение мотивации и когнитивных функций (Kent et al., 1992; Dantzer et al., 2001; Larson, Dunn, 2001). ЛПС также активирует 5-НТ систему мозга (Dunn, Wang, 1995; Dunn, 2006), которая вовлечена в регуляцию многих форм поведения (Lucki, 1998; Popova, 2006).

Эмоциональный стресс является естественной и адаптивной реакцией млекопитающих на различные угрожающие стимулы внешней среды, например, на появление хищника. При опасности происходит изменение в поведении, активация ГГНС, секреция глюкокортикоидов, увеличение экспрессии генов раннего реагирования в нейронах мозга, изменение метаболизма моноаминов в мозге (Pacak, Palkovits, 2001). Важную роль в реакции на эмоциональный стресс играет 5-НТ система мозга (Науменко, 1971; Chaouloff et al., 1999). Полагают, что именно стресс являться пусковым механизмом развития психопатологии у чувствительных к стрессу особей (Anisman et al., 2008).

Другой важной и актуальной проблемой современной физиологии является изучение взаимодействия генотипа с факторами окружающей среды в развитии тяжелых психических расстройств (De Maio et al., 2005; Caspi, Moffitt, 2006). Наиболее важными факторами являются эмоциональный стресс и активация иммунной системы, вызванная инфекций. Имеющиеся данные о влиянии эмоционального стресса и активации иммунной системы на метаболизм 5-НТ в мозге были получены преимущественно на крысах (Tanaka et al., 1983; Kirby et al., 1997; Dunn, 2006; Mo et al., 2008). Однако эти авторы не исследовали вклад генетических факторов в реакции 5-НТ системы мозга на стресс и введение ЛПС.

Каталепсия (животный гипноз, мнимая смерть, тоническая неподвижность) — это состояние, при котором животное или человек не может совершать произвольные движения (впадают в ступор) и сохраняют приданную им неудобную позу в течение длительного времени (Dixon, 1998). В гипертрофированной форме каталепсия и кататония являются синдромами тяжелых нарушений нервной системы (Sanberg et al., 1988; Caroff et al., 2000; Lee, 2007,2010; Weder et al., 2008; Daniels, 2009; Paparrigopoulos et al., 2009).

У мышей была выявлена так называемая «щипковая» каталепсия (pinch-induced catalepsy), которая вызывается щипками кожи животного в области загривка (Amir et al., 1981; Omstein, Amir, 1981). Были выявлены существенные межлинейные различия в предрасположенности к каталепсии (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Из 10

исследованных линий мышей высокая выраженность к каталепсии была обнаружена только у мышей пинии СВА (54% каталептиков). Недавно была определена локализация главного гена предрасположенности к каталепсии в дистальном фрагменте хромосомы 13 (59-70 сМ) мыши (Куликов и др., 2003; Kondaurova et al., 2006; Kulikov et al., 2008). В результате переноса данного фрагмента хромосомы 13 от каталептической линии СВА в геном некаталептической линии AKR была получена конгенная линия AKR.CBA-D13Mit76 (D13) (около 50% каталептиков).

Показано участие 5-НТ системы мозга в регуляции наследственной каталепсии у мышей. Так, у мышей инбредной линии СВА, характеризующихся высокой генетической предрасположенностью к щипковой каталепсии, повышена активность ключевого фермента биосинтеза 5-НТ триптофангидроксилазы-2 (ТПГ-2) и снижена плотность 5-НТ2А серотониновых рецепторов в стриатуме (Kulikov et al., 1995; Popova, Kulikov, 1995). Введение ингибиторов ТПГ-2 снижало выраженность каталепсии у мышей (Popova, Kulikov, 1995).

Иммунная система также вовлечена в механизм наследственной каталепсии. У линии мышей ASC, полученной в результате селекции на высокую предрасположенность к каталепсии, обнаружена низкая способность животных отвечать на Т - зависимый антиген - эритроциты барана (Альперина и др., 2007). А недавно нашими коллегами было обнаружено, что введение ЛПС вызывает реакцию замирания у линий мышей DBA/2 и C57BL/6, которые являются устойчивыми к щипковой каталепсии (Базовкина, Куликов, 2009).

Следовательно, наследственная каталепсия является удобной моделью для изучения взаимодействия 5-НТ, эндокринной и иммунной систем, а также роли генотипа и различных видов стресса в развитии нарушений нервной системы и поведения. Поэтому выяснение закономерностей влияния эмоционального стресса и активации иммунной системы на выраженность поведения и 5-НТ систему мозга мышей с наследственными различиями в предрасположенности к каталепсии, несомненно, является актуальным.

Целью данной работы являлось исследование ассоциации наследственной каталепсии с выраженностью поведения и метаболизма 5-НТ мозга при воздействии острого эмоционального стресса и активации иммунной системы бактериальным липополисахаридом (ЛПС). В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность половой мотивации у самцов мышей некаталептической линии AKR и каталептических линий СВА и D13;

2) Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей некаталептической пинии AKR и каталептических линий СВА и D13;

3) Сравнить влияние острого стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей линий AKR, СВА и D13;

4) Сравнить влияние острого стресса на экспрессию гена c-Fos в мозге у мышей линий AKRh D13;

5) Оценить влияние острого стресса на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей линий AKR, СВА и D13;

6) Изучить влияние ЛПС на выраженность каталепсии у мышей линий AKR, СВА и D13;

7) Оценить влияние ЛПС на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей линий AKR, СВА и D13.

Научная новизна. В настоящей работе впервые были получены доказательства ассоциации наследственной предрасположенности к каталепсии с вызванными эмоциональным стрессом и введением ЛПС изменениями в поведении и метаболизме 5-НТ в мозге:

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. В работе использовались мыши некаталептической линии AKR/J, каталептических линий CBA/Lac и AKR.CBA-D13Mit76 (D13). Линия D13 была получена переносом фрагмента хромосомы 13, сцепленным с геном каталепсии, из генома линии СВА в геном пинии AKR (Kulikov et al., 2008). Линии мышей AKR, СВА и D13 поддерживается в Институте цитологии и генетики СО РАН инбридингом брат-сестра в течение 55, 55 и 20 поколений, соответственно.

Воздействия. Были проведены 2 экспериментальные серии. В первой серии в качестве острого эмоционального стресса использовали рестрикцию (1 час). Рестрикция представляет собой ограничение подвижности животного при помещении его в рестрикционный пенал (Buynitsky, Mostofsky, 2009). Контрольных животных в пеналы не помещали, а оставляли в домашних клетках. Первая экспериментальная серия состояла из 5 отдельных опытов. Так после окончания действия одночасовой рестрикции животных: 1) тестировали на половую мотивацию; 2) тестировали на каталепсию; 3) проводили забор крови для определения уровня кортикостерона; 4) декашггировали сразу для определения содержания 5-НТ и его основного метаболита 5-ГИУК в мозге; 5) декапитировали через 1 ч для определения c-Fos эксперессии в мозге.

Во второй серии для активации неспецифического иммунного ответа использовали ЛПС. ЛПС (Escherichia coli 055:В5; Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) разводили в физиологическом растворе и вводили лабораторным животным внутрибрюшинно в дозах 50 и 200 мкг/кг. Через 3 ч животных тестировали на каталепсию или декапитировали.

Тест «перегородка» проводился в клетке (29 х 15 х 10 см), разделенной на два отсека прозрачной перфорированной перегородкой, через которую могут происходить обонятельные и визуальные контакты между животными. За один день до теста самца помещали в один из отсеков экспериментальной клетки для адаптации животного к новым условиям содержания. После 5-минутной адаптации к условиям тестирования в течение 10 мин регистрировали спонтанную активность самца у перегородки с пустым отсеком. Затем в соседний отсек помещали рецептивную самку линии ICR (3-4 мес.) на 10 мин. Регистрировали время активного исследования самцом перегородки (основной показатель) и количество подходов к ней (дополнительный показатель, отражающий двигательную активность).

Для стимуляции эструса каждой самке вводили внутрибрюшинно 15 UI человеческого гонадотропина (Profasi, "Serono", Италия), разведенного в физиологическом растворе, в объеме 0.15 мл за 1 сут до тестирования, рецептивность самки подтверждали вагинальным мазком в день теста.

Каталепсию измеряли по разработанной ранее в лаборатории нейрогенетики поведения Инстшута цитологии и генетики СО РАН методике (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Животное вынимали из клетки и в течение 5-8 с мягко (чтобы не вызвать боли) сдавливали кожу загривка и помещали на разновысокие перекладины (карандаши), расположенные на высоте 60 см от поверхности стола. Расстояние между верхней и нижней перекладинами составляло 5 см, а угол - 45°. Затем мышь осторожно отпускали и измеряли время неподвижности (пока животное не начинало активно двигаться). Тест считался положительным, если период, в течение которого мышь сохраняла приданное ей неестественное положение, был не менее 20 с. Время ограничивали 120 с, после чего животное возвращали в клетку. Каждый из последовательных 10 тестов проводили с интервалом 1-2 мин. Животное, демонстрирующее 3 положительных теста из 10, рассматривалось как каталептик. Время

ассоциированного с наследственной каталепсией, способствует улучшению проявления половой мотивации, которое снижено у родительской линии АКБ.. Было обнаружено угнетение половой мотивации у стрессированных мышей линии СВА, что согласуются с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории (Амстиславская, 2004,2009).

V///. пустой отсек (контроль) ШМ пустой отсек (стресс)

самка (контроль) Ц самка (стресс)

Рис.2. Влияние острого эмоционального стресса на время у перегородки у самцов мышей линий AKR, СВА uD13.

# р<0,05 по сравнению с СВА контроль при предъявлении рецептивной самки; *** р<0,001 по сравнению с пустым отсеком стресс; +++ р<0,001 по сравнению с пустым отсеком контроль; @@@р<0,001 по сравнению с AKR контроль при предъявлении рецептивной самки.

Однако рестрикция, по-видимому, не влияла на выраженность половой мотивации у самцов с преобладанием генотипа AKR (AKR и D13). В настоящее время наряду с данными об угнетающем влиянии стресса на половую систему самцов все больше накапливается сведений о зависимости этих изменений от генотипа (Chaouloff, 1999)В нашем исследовании мы подтвердили участие генотипа в механизме угнетающего влияния эмоционального стресса на половую мотивацию. В то же время, мы не обнаружили участия фрагмента хромосомы 13 мыши в механизмах снижения половой мотивации на острый эмоциональный стресс.

Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и СВА. В

чрезмерно выраженной форме, каталепсия ассоциирована с тяжелыми неврологическими и психическими расстройствами. Механизм каталепсии и влияние стресса на ее развитие остаются неясными. Существует только несколько работ по влиянию стрессовых стимулов на проявление фармакологической каталепсии, однако они достаточно противоречивы (Bhattacharya, Ghosh, 1982; Antelman et al, 1991; Antelman et al, 1992). У мышей каталепсию можно вызвать с помощью щипков кожи загривка (щипковая каталепсия) (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981). Эта модель является весьма интересной, так как сам щипок представляет собой легкий эмоциональный стресс (Куликов и др., 1989). Если предположить, что генотип одних животных чувствителен к щигтку, а у других нет, то можно считать, что животные с чувствительным генотипом к

выводы

1. Наследственная предрасположенность к щипковой каталепсии у мышей линий СВА и D13 ассоциирована с повышенной чувствительностью к эмоциональному стрессу, активации иммунной системы и с повышением метаболизма 5-НТ в мозге.

2. Острый эмоциональный стресс не влияет на половую мотивацию самцов линий мышей AKR и D13, но подавляет ее у линии СВА.

3. Рестрикция вызывала более сильное увеличение уровня кортикостерона в плазме крови у линий AKR и D13 по сравнению с животными линии СВА.

4. Острый эмоциональный стресс значительно облегчает возникновение каталепсии у каталептических линий мышей СВА и D13, но не у животных некаталептической минии AKR.

5. Рестрикция увеличивает метаболизм 5-НТ (отношение 5-ГИУК/5-НТ) в среднем мозге у каталептических линий мышей СВА и D13, но не у некаталептической линии AKR.

6. Введение ЛПС значительно облегчает возникновение каталепсии у каталептических линий мышей СВА и D13 по сравнению с некаталептической линией AKR.

7. Введение ЛПС увеличивает метаболизм 5-НТ (отношение 5-ГИУК/5-НТ) в среднем мозге и стриатуме у пинии мышей каталептических пиний СВА и D13, но не у некаталептической линии AKR.

СПИСОК РАБОТ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тихонова М.А., Баженова Е.Ю., Базовкина Д.В., Попова Н.К. Влияние хронического введения имипрамина на поведение мышей конгенных линий AKR и AKR.CBA-D13Mit76, различающихся дистальным фрагментом хромосомы 13 // ЖВНД. 2010. Т.60(5). С. 588-595.

2. Баженова Е.Ю., Куликов А.В., Тихонова М.А., Цыбко А.С., Попова Н.К. Влияние стресса на уровень кортикостерона, экспрессию гена c-Fos и обмен серотонина в мозге у мышей с генетической предрасположенногетью к каталепсии // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2012. Т.98(9). С. 1070-1078.

3. Tikhonova М.А., Kulikov A.V., Bazovkina D.V., Kulikova E.A., Tsybko A.S., Bazhenova E.Yu., Naumenko V.S., Akulov A.E., Moshkin M.P., Popova N.K. Hereditary catalepsy in mice is associated with the brain dysmorphology and altered stress response // Behav. Brain Res., 2013. V. 243. P. 53-60.

4. Bazhenova E.Yu., Kulikov A.V., Tikhonova M.A., Bazovkina D.V., Fursenko D.V., Popova N.K. On the association between lipopolysacharide induced catalepsy and serotonin metabolism in the brain of mice genetically different in the predisposition to catalepsy // Pharmacol. Biochem. Behav., 2013. V. 111. P. 71-75.

5. Баженова ЕЛО. Вклад дистального фрагмента хромосомы 13 в регуляцию чувствительности каталепсии, полового мотивационного и социального поведения к действию имипрамина у мышей конгенных линий AKR/J и AKR.CBA-D13Mit76. Материалы XI.VIII Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2010, С. 19.

6. Баженова Е.Ю. Влияние острого эмоционального стресса на половую мотивацию и уровень моноаминов в мозге у мышей с высокой наследственной предрасположенностью к каталепсии. Материалы XLIX Международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2011, С. 5.

7. Баженова Е.Ю., Тихонова М.А., Цыбко А.С., Куликов А.В. Влияние острого стресса на уровень кортикостерона в плазме крови, экспрессию гена c-Fos и на метаболизм серотонина в мозге у линий мышей AKR и AKR.CBA-D 13Mit76, различающихся дистальным фрагментом хромосомы 13. Тезисы докладов VII Сибирского съезда физиологов, Красноярск, 2012, С. 29.

8. Bazhenova E.Yu., Tikhonova М.А, Tsybko A.S., Kulikov A.V. Effects of acute stress or endotoxin (LPS) on the 5-HT metabolism in the midbrain in the mice differing in high hereditary predisposition to catalepsy. International Summer School «Neurogenetics, Unraveling behaviorand brain mechanisms using modern technologies», Zvenigorod, 2012, P. 5.

9. Bazhenova E.Yu., Tikhonova M.A, Tsybko A.S., Kulikov A.V. Effects of acute stress on sexual motivation and the 5-HT metabolism in the brain in the mice with high hereditaiy predisposition to catalepsy. The VIII International interdisciplinary congress «Neuroscience for Medicine and Psychology», Sudak, Crimea, Ukraine, 2012, P. 72.

Подписано к печати 15.11.13г. Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 68

Отпечатано на полиграфической базе ИЦиГ СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баженова, Екатерина Юрьевна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук

На правах рукописи

04201454126

БАЖЕНОВА ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО СТРЕССА И ЛИПОПОЛИСАХАРИДА НА СЕРОТОНИНОВУЮ СИСТЕМУ МОЗГА И ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К НАСЛЕДСТВЕННОЙ КАТАЛЕПСИИ

(03.03.01-физиология по биологическим наукам)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.В. Куликов

Новосибирск 2013

Список используемых сокращений.......................................................................4

Введение..........................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы. Взаимодействие 5-НТ системы мозга, ГГНС и иммунной системы в регуляции поведения..........................................................................10

1.1. Анатомия и биохимия 5-НТ системы мозга...................... ..................................10

1.2. Взаимодействие между 5-НТ системой мозга и ГГНС.........................................14

1.3. Взаимодействие между 5-НТсистемой мозга и иммунной системой........................17

1.4. Участие 5-НТ системы мозга в регуляции полового поведения и каталепсии.............24

1.5. Наследственная каталепсия у мышей, как модель взаимодействия 5-НТ системы

мозга, ГГНС и иммунной системы......................................................................29

Глава 2. Материалы и методы.............................................................................32

2.1. Животные и воздействия.............................................................................32

2.2. Тест «перегородка»...................................................................................33

2.3. Тест на каталепсию.....................................................................................34

2.4. Определение уровня кортикостерона.............................................................34

2.5. Выделение РНК и ОТ-ПЦР..........................................................................35

2.6. Определение уровней 5-НТ и 5-ГИУК в мозге..................................................36

2.7. Статистическая обработка............................................................................36

Глава 3. Результаты.......................................................................................37

3.1. Влияние острого эмоционального стресса на половое мотивационное поведение, выраженность каталепсии, уровень кортикостерона, экспрессию гена с-Боб, и метаболизм 5-НТ в мозге у мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии...........................................................................................................37

3.1.1. Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность полового мотивационного поведения у самцов мышей конгенной линии Б13 и родительских линий АКИиСВА..................................................................................................37

3.1.2. Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии Э13 и родительских линий АК11 и СВА................................39

3.1.3. Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей конгенной линии Б13 и родительских линий АК11 и СВА...........40

3.1.4. Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень экспрессии гена с-Роэ в мозге у мышей конгенной линии Б13 и родительской линии АКЯ.....................42

3.1.5. Сравнение действия острого эмоционального стресса на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей конгенной линии ШЗ и родительских линий АКЯ и СВА................................43

3.2. Эффекты ЛПС на выраженность каталепсии и метаболизм 5-НТ в мозге у мышей,

различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии.............................46

3.2.1. Сравнение эффектов ЛПС на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии Б13 и родительских линий АКК и СВА ..............................................................46

3.2.2. Сравнение эффектов ЛПС на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей конгенной линии

Б13 и родительских линий АКЯ и СВА...............................................................47

Глава 4. Обсуждение результатов........................................................................51

Выводы........................................................................................................57

Список цитируемой литературы.........................................................................58

Список используемых сокращений

5-НТ (5-hydroxytryptamine) - 5-гидрокситриптамин/ серотонин 5-ГИУК - 5-гидроксииндолуксусная кислота

CNTF (ciliary neurotropic factor) - мерцательный нейротропный фактор

ERK (extracellular signal-related kinase) - киназа, регулируемая внеклеточным сигналом

GDF (growth differentiating factor) - ростовой фактор дифференциации

gp 130 (glycoprotein 130) - гликопротеин 130

Hsp (heat-shock protein) - белок теплового шока

I16st (interleukin-6 signal transducer) - сигнальный трансдуктор интерлейкина-6 IL-6 (Interleukin-6) - интерлейкин 6

iNOS (inducible nitric oxide synthase) - индуцибильная синтаза оксида азота LIF (leukaemia inhibitory factor) - фактор ингибирования лейкемии МАРК (mitogen-activated protein kinase) - митоген-активируемая киназа OSM (oncostatin M) - онкостатин M

QTL (Quantative trait locus) - локус количественных признаков

STAT (signal transducer and activator of transcription) - передатчик внутриклеточного

сигнала и активатор транскрипции

TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухоли

АКТГ - адренокортикотропный гормон

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система

ГР - глюкокортикоидные рецепторы

ИДО - индоламин-2,3-диоксигеназа

ИФА- иммуноферментный анализ

КРГ - кортикотропин-рилизинг-гормон

ЛПС- липополисахарад

МАО А - моноаминоксидазой А

MP - минералокортикоидные рецепторы

п.н. - пар нуклеотидный остаток

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТПГ- триптофангидроксилаза

Введение

Актуальность проблемы

В настоящее время исследование взаимодействия между 5-HT системой мозга, ГГНС и иммунной системой в механизме психопатологии является важной проблемой в психонейроиммунологии. Существует большое количество доказательств взаимодействия между этими системами (Weigent, Blalock, 1995; Dunn et al., 2005; Uhlig, Kallus, 2005; Ziemssen, Kern, 2007). Психические расстройства сопровождаются нарушениями в иммунной системе (Perry, 2004; Zunszain et al., 2011; Onore et al., 2012), в то время как стрессы, воспаление и активация иммунной системы увеличивают риск развития психопатологии (Porter et al., 2004; Irwin, Miller, 2007; Anisman et al., 2008; Miller, 2010; Kelley, Dantzer, 2011; Leonard, Maes, 2012).

Для активации неспецифического иммунитета наиболее часто применяют введение бактериального эндотоксина (липополисахарид, ЛПС) (Kent et al., 1992; Dunn, 1992; Anisman et al., 2008). Введение ЛПС приводит к увеличению концентраций IL-lp, IL-6 и TNF-a. Именно IL-ф, IL-6 и TNF-a вызывают болезненное состояние (sickness) и депрессивноподобное поведение: гипертермию, гипокинезию, гипофагию, гипералгезию, сниженный интерес к исследованию окружающей среды, снижение либидо, увеличение времени сна, снижение мотивации и когнитивных функций (Kent et al., 1992; Dantzer et al., 2001; Larson, Dunn, 2001). ЛПС также активирует 5-НТ систему мозга (Dunn, Wang, 1995; Dunn, 2006), которая вовлечена в регуляцию многих форм поведения (Lucki, 1998; Popova, 2006).

Эмоциональный стресс является естественной и адаптивной реакцией млекопитающих на различные угрожающие стимулы внешней среды, например, на появление хищника. При опасности происходит изменение в поведении, активация ГГНС, секреция глюкокортикоидов, увеличение экспрессии генов раннего реагирования в нейронах мозга, изменение метаболизма моноаминов в мозге (Pacak, Palkovits, 2001). Важную роль в реакции на эмоциональный стресс играет 5-НТ система мозга (Науменко, 1971; Chaouloff et al., 1999). Полагают, что именно стресс являться пусковым механизмом развития психопатологии у чувствительных к стрессу особей (Anisman et al., 2008).

Другой важной и актуальной проблемой современной физиологии является изучение взаимодействия генотипа с факторами окружающей среды в развитии тяжелых психических расстройств (De Maio et al., 2005; Caspi, Moffitt, 2006). Наиболее важными факторами являются эмоциональный стресс и активация иммунной системы, вызванная инфекций. Имеющиеся данные о влиянии эмоционального стресса и активации иммунной системы на метаболизм 5-НТ в мозге были получены преимущественно на крысах (Tanaka

et al, 1983; Kirby et al., 1997; Dunn, 2006; Mo et al., 2008). Однако эти авторы не исследовали вклад генетических факторов в реакции 5-HT системы мозга на стресс и введение ЛПС.

Каталепсия (животный гипноз, мнимая смерть, тоническая неподвижность) - это состояние, при котором животное или человек не может совершать произвольные движения (впадают в ступор) и сохраняют приданную им неудобную позу в течение длительного времени (Dixon, 1998). В гипертрофированной форме каталепсия и кататония являются синдромами тяжелых нарушений нервной системы (Sanberg et al., 1988; Caroff et al., 2000; Lee, 2007, 2010; Weder et al., 2008; Daniels, 2009; Paparrigopoulos et al., 2009).

У мышей была выявлена так называемая «щипковая» каталепсия (pinch-induced catalepsy), которая вызывается щипками кожи животного в области загривка (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981). Были выявлены существенные межлинейные различия в предрасположенности к каталепсии (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Из 10 исследованных линий мышей высокая выраженность к каталепсии была обнаружена только у мышей линии СВА (54% каталептиков). Недавно была определена локализация главного гена предрасположенности к каталепсии в дистальном фрагменте хромосомы 13 (59-70 сМ) мыши (Куликов и др., 2003; Kondaurova et al., 2006; Kulikov et al., 2008). В результате переноса данного фрагмента хромосомы 13 от каталептической линии СВА в геном некаталептической линии AKR была получена конгенная линия AKR.CBA-D13Mit76 (D13) (около 50% каталептиков).

Показано участие 5-НТ системы мозга в регуляции наследственной каталепсии у мышей. Так, у мышей инбредной линии СВА, характеризующихся высокой генетической предрасположенностью к щипковой каталепсии, повышена активность ключевого фермента биосинтеза 5-НТ ТПГ-2 и снижена плотность 5-НТгд серотониновых рецепторов в стриатуме (Kulikov et al., 1995a,b; Popova, Kulikov, 1995). Введение ингибиторов ТПГ-2 снижало выраженность каталепсии у мышей (Popova, Kulikov, 1995).

Иммунная система также вовлечена в механизм наследственной каталепсии. У линии мышей ASC, полученной в результате селекции на высокую предрасположенность к каталепсии, обнаружена низкая способность животных отвечать на Т - зависимый антиген - эритроциты барана (Альперина и др., 2007). А недавно нашими коллегами было обнаружено, что введение ЛПС вызывает реакцию замирания у линий мышей DBA/2 и C57BL/6, которые являются устойчивыми к щипковой каталепсии (Базовкина, Куликов, 2009).

Следовательно, наследственная каталепсия является удобной моделью для изучения взаимодействия 5-НТ, эндокринной и иммунной систем, а также роли генотипа и

различных видов стресса в развитии нарушений нервной системы и поведения. Поэтому выяснение закономерностей влияния эмоционального стресса и активации иммунной системы на выраженность поведения и 5-НТ систему мозга мышей с наследственными различиями в предрасположенности к каталепсии, несомненно, является актуальным.

Целью данной работы являлось исследование ассоциации наследственной каталепсии с выраженностью поведения и метаболизма 5-НТ мозга при воздействии острого эмоционального стресса и активации иммунной системы бактериальным липополисахаридом (ЛПС).

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность половой мотивации у самцов мышей некаталептической линии АКК. и каталептических линий СВА и 013;

2. Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей некаталептической линии АКК и каталептических линий СВА и Е)13;

3. Сравнить влияние острого стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей линий АКК, СВАи013;

4. Сравнить влияние острого стресса на экспрессию гена с-Роэ в мозге у мышей линий АКЯ и Э13;

5. Оценить влияние острого стресса на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей линий АКИ., СВА и Б13;

6. Изучить влияние ЛПС на выраженность каталепсии у мышей линий АКЫ, СВА и Б13;

7. Оценить влияние ЛПС на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей линий АКЯ, СВА и Б13.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые были получены доказательства ассоциации наследственной предрасположенности к каталепсии с вызванными эмоциональным стрессом и введением ЛПС изменениями в поведении и метаболизме 5-НТ в мозге:

1. Острый эмоциональный стресс (рестрикция) вызывал более выраженный каталептогенный эффект у мышей каталептических линий СВА и 013 по сравнению с некаталептической линией АКЯ.

2. 5-НТ система среднего мозга у мышей каталептических линий более чувствительна к эмоциональному стрессу по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии.

3. Введение ЛПС вызывало более выраженный каталептогенный эффект у мышей каталептических линий СВА и Б13 по сравнению с некаталептической линией АК11.

4. 5-НТ система среднего мозга и стриатума у мышей каталептических линий более чувствительна к ЛПС по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии.

Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Основным вкладом данного исследования в изучении взаимодействия нервной, иммунной и эндокринной систем в механизме психопатологии является экспериментальное доказательство тесного взаимодействия 5-НТ системы (нервная система), ЛПС (иммунная система) и эмоционального стресса (ГГНС) в механизме такого наследственного нарушения поведения как каталепсия. Была показана научно-практическая ценность наследственной каталепсии у мышей уникальной конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 (D13) как модели для изучения генетической предрасположенности к психопатологиям, ассоциированным со стрессом и нарушениями в иммунной системе. Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Острый эмоциональный стресс усиливает выраженность наследственной каталепсии.

2. Усиление каталепсии, вызванное стрессом, сопровождается увеличением обмена 5-НТ в среднем мозге у предрасположенных к каталепсии мышей.

3. ЛПС оказывает выраженный каталептогенный эффект. Интенсивность вызванной ЛПС каталепсии более выражена у мышей с наследственной предрасположенностью к каталепсии.

4. ЛПС усиливает метаболизм 5-НТ в среднем мозге и стриатуме у предрасположенных к каталепсии мышей, но не у устойчивых к каталепсии животных.

5. Выявлена ассоциация между реакциями наследственной каталепсией на эмоциональный стресс и на введение ЛПС. Показана важная роль 5-НТ системы мозга в механизме этой ассоциации.

Апробация результатов. Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLVIII и XLIX Международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010, 2011), VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012), VIII International interdisciplinary congress «Neuroscience for Medicine and Psychology» (Sudak, 2012), International Summer School

«Neurogenetics. Unraveling behaviorand brain mechanisms using modern technologies» (Zvenigorod, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных (2) и международных (2) журналах, 5 тезисов на всероссийских и международных конференциях.

Соавторство и благодарности. Автор выражает глубокую признательность к.б.н. М.А. Тихоновой (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в освоении поведенческих тестов, метода количественного ОТ-ПЦР и определения уровня кортикостерона ИФА, к.б.н. Д.В. Базовкиной (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в проведении тестов на каталепсию и А.С. Цыбко (лаборатория нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН) за помощь в освоении и совместную работу по ВЭЖХ.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (307 источников). Работа изложена на 82 страницах, содержит 11 оригинальных рисунков и 3 таблицы.

Глава 1. Обзор литературы Взаимодействие 5-НТ системы мозга, ГГНС и иммунной системы

в регуляции поведения 1.1 Анатомия и биохимия 5-НТ системы мозга

Медиатор головного мозга серотонин, (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) (Рис.1) является одной из самых древних сигнальных молекул. Он обнаружен у одноклеточных эукариот парамеций и тетрагимен, где он мог модулировать плавание и рост. 5-НТ рецепторы обнаружены у разнообразных организмов по эволюционному древу, от планарии, нематоды и плодовой мушки дрозофилы до человека (Nichols, Nichols, 2008).

nh2

4

^ Л з

У

n

н

Рис.1. Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-НТ) (Nichols, Nichols, 2008).

5-НТ система мозга представляет собой совокупность нейронов, способных синтезировать и использовать 5-НТ в качестве основного медиатора. Тела 5-НТ нейронов у млекопитающих локализованы в ядрах шва среднего мозга и организуются в 9 кластеров- В1-В9, которые по расположению, направлению проекций и по времени появления в онтогенезе разделяются на две группы: переднюю и заднюю (Рис. 2) (Попова и др., 1978; Jacobs, Azmitia, 1992).

Заднюю группу составляют 4 кластера (В1 - В4), которые организуются в 3 ядра: п. raphe pallidus (В1 и В4), п. raphe obscurus (В2) и п. raphe magnus (ВЗ). 5-НТ нейроны, локализованные в задней группе кластеров, проецируются в продолговатый и спинной мозг. Важнейшей функцией нисходящей 5-НТ системы является регуляция активности мотонейронов спинного мозга и поведенческих стереотипов, таких как рефлекс мокрой собаки (wet dog shake; Jacobs, Fomal, 1995).

5-НТ нейроны передней г