Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетический анализ перевиваемых клеточных линий, чувствительных к вирусу иммунодефицита человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетический анализ перевиваемых клеточных линий, чувствительных к вирусу иммунодефицита человека"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

/

На правах рукописи УДК 576. 316. 7: 578. 23: 578. 24: 578. 828. 6

ГЛУХОВА Любовь Адамовна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К ВИРУСУ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА

03.00. 25 клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1992

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии Института вирусологии РАМН и в лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: кандидат биологических наук' С.,Е. МАМАЕВА,

доктор биологических наук А. А. КУЩ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук М. Н. МЕДВЕДЕВА, кандидат биологических наук Г. Г. ПОЛЯНСКАЯ

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт гриппа РАШ

Защита состоится ^¿У 4 /р*_ 1992 Г.

в часов на заседании специализщюванного совета Д. 002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: • 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий -пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан

1992 Г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Л. Н. ПИСАРЕВА

)

"-'1 -

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современного здравоохранения является диагностика и лечение синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), который вызывается вирусом иммунодефицита человека (ВКЧ). Для решения теоретичес-<их и практических вопросов, связанных с ВКЧ-инфекцией, используются клеточные линии, чувствительные к ВИЧ. С помощью клеток, инфицированных ВКЧ in vitro, изучают закономерности репликации ВИЧ и экспрессии вирусных геноЕ. На основе инфицированных клеток разработаны первые диагностические тест-систе- . мы, не потерявшие значение и в насе время. Клетки, чувствительные к ВИЧ, необходимы также для химиотералевтических исследований по поиску новых противовирусных препаратов. Однако в процессе культивирования клетки могут изменять или терять свои свойства, что обусловливает необходимость постоянного контроля их стабильности. Надежным способом контроля стабильности и изменчивости клеточных линий является анализ их хромосомного состава

С другой стороны, серьезным препятствием при работе с клеточными линиями являются широко распространившиеся случаи контаминации культур, смеиивания клеток (Kelson-Rees et al., 1981; Satya-Prakash et al., 1981). Наркологический анализ клеточных линий совместно с методом геномной дактилоскопии (ДНК-фингерпрингинга) позволяют идентифицировать клетки нетолько на уровне вида; но обеспечивают их внутривидовую идентификацию.

Цитогенетическая характеристика больсикства клеточных линий, чувствительных к БИЧ, не проводилась. В связи с этим очевидна необходимость кариологического анализа клеточных линий, используемых в различных лабораториях для .изучения и размножения ВИЧ.

В большинстве клеточных культур ВИЧ репродуцируется с проявлением цитопатического действия (ЦШО (Koyanagi et al. , 1985; Harada et al. , 1985). Однако в доступной нам литературе отсутствуют работы по анализу действия ВИЧ на хромосомы клеток in vitro. Данные по действию ВИЧ на хромосомы клеток in vivo немногочисленны и нередко противоречивы (Kosmo et al. , 1987; Botti et al. , 1988; Beverstock et al. , 1990). Поэтому актуаль-

ным является изучение влияния ВИЧ на хромосомы клеток высокочувствительных линий человека.

Настоящая работа выполнялась как фрагмент исследований, входящих в тему "Разработка иммуноцитогенетических критериев оценки лкмфобластоидных линий человека, пригодных для выделения изолятов и крупномасштабной наработки вирусов иммунодефицита человека", поддержанную грантом Совета по проблеме СПИД РАМН (грант N64). Проведенные исследования являются частью общих плановых тем Института вирусологии N 01.87.0045916, N 01.87.0045882, а также частью работы по Программе ГКНТ "Геном человека" Института цитологии РАН.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось цитогенетическое изучение клеточных линий и клонов, имеющих различную чувствительность к ВИЧ, а также изучение действия ВИЧ на хромосомы человека in vitro.

Для достижения указанной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Получение кариотипов и ДНК-фингерпринтингов клеточных линий, чувствительных к ВИЧ

2. Онтогенетический анализ клеточных линий, имеющих различную чувствительность к ВИЧ, с помощью G-, С- 'И Ag- методов дифференциальной окраски хромосом, гибридизации in situ на специфические центромерние области хромосом и приемов кариотипирования.

3. Сравнительный кариологический анализ клонов линии U-937, имеющих различную чувствительность к ВИЧ.

4._ Изучение мутагенного действия БИЧ на хромосомы высокочувствительных линий МГ-4 и Jurkat tat.

Научная новизна работы. В результате изучения 23 вариантов 9 клеточных линий, чувствительных к ВИЧ, показана принципиальная возможность применения выявленных маркерных хромосом для внутривидовой идентификации клеточных линий, наиболее используемых при работе с ВИЧ. Впервые проведен детальный анализ кариотипов Т-клеточных линий МГ-4, Jurkat tat, СЕМ и моноцито-идной линии U-937 с использованием методов дифференциальной окраски, гибридизации in situ и обобщенного реконструированного кариотипа. Установлено, что' основные хромосомные повревде-

ния клеточных линий, чувствительных к БИЧ затрагивают сайты локализации генов клеточного деления и клеточной ди£ференци-ровки. Выявлены хромосомные нарушения в высокочувствительном клоне U937 /16, отличающие его от клонов с низкой и средней чувствительностью. Уточнен район локализации гена рецептора СД4. В линии U-937 он локализуется в районе 12рИ-12. Впервые показано, что ВИЧ-инфекция in vitro оказывает различное действие на хромосомы • двух высокочувствительных линий МГ-4 и Jurkat tat. Обнаружено, что максимальное число аберраций хро- . мосом в инфицированных клетках Jurkat tat совпадает по времени с максимальным выявлением белков ВИЧ. Показан неслучайный характер распределения разрывов хромосом в культуре клеток Jurkat tat, инфицированной ВИЧ (штамм BRU).

Практическая значимость исследований. Полученные кариоти-пические характеристики клеточных линий, чувствительных к ВИЧ, являются надежными параметрами для идентификации линий в коллекциях клеточных культур. Описание кариотипов изучаемых линий вошло в "Каталог перевиваемых клеточных линий, чувствительных к инфицированию вирусами иммунодефицита человека". Особое значение эти данные имеют для производственных подразделений, задача которых состоит в длительном крупномасштабном культивировании чувствительных к ВИЧ клеток для получения антигена ВИЧ, используемого в диагностических тест-системах. •

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной научной конференции "Генетика соматических клеток в культуре" (Звенигород, 1989), на конкурсе молодых ученых Института вирусологии РАМН ( Москва,1989), на международных конференциях по СПИДу в США (1990) и в Италии (1991).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 6 работ.

Структура и объем работы. Диссератция состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, собственных результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на lift страницах машинописного текста, включая 36 рисунков и 12 таблиц. Список литературы насчитываетназваний работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе были использованы девять Т-клеточных линий, а также одна моноцитоидная линия .. U-937 и ее клоны. Клетки культивировали на среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы в присутствии 5% С0а. Клеточные линии в различное время были доставлены в коллекцию Института вирусологии РАМН из научных учреждений, перечисленных в табл. 1.

Инфицирование клеток линий МТ-4 и Jurkat tat ВИЧ-1 (цггамм BRU) проводили по стандартной методике (Asjo et al. , 1987).

Определение чувствительности к ВИЧ клеточных линий МТ-4, Jurkat tat, СЕМ, U-937 проводили, определяя ЦПД вируса в клетках, которое оценивали по их жизнеспособности после заражения ВИЧ-1 на 7 сутки. Жизнеспособность клеток определяли после окраски 0,4% раствором трипанового синего. Окрашенные клетки считали нежизнеспособными. Чувствительность клеточных линий к БИЧ оценивали также по способности репродуцироваться в них различных штаммов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а также Ï2 вирусных изолятов, полученных в Институте вирусологии в группе СПИД под руководс- • твом к. м. н. Д. Н. Носика.

Выявление белков ВИЧ в инфицированных' клетках линий КГГ-4 и Jurkat tat осуществляли с помощью моноклональных антител к белкам ВИЧ р24, р17 и gp41 методом непрямой иммунофлюоресцен-ции (Paunels et al., 1987). В качестве отрицательного контроля служили неинфицированные клетки МТ-4 и Jurkat-tat, а также клетки гепатокарциномы человека PLC-PRF5.

Препараты метафазных хромосом готовили по общепринятой методике (Heneen, 1976). Гипотоническую обработку клеток проводили раствором, состоящим из равных частей 0,55% раствора хлористого калия и 1% раствора цитрата натрия. Фиксацию хромосом осуществляли смесью метанол-уксусная кислота (3:1), трижды добавляя новые порции. Окрашивание хромосом проводили несколь- ' кими способами. Для рутинного окрашивания использовали 1Z раствор Гимза (Merk) на фосфатном буфере (рН-6,8).;Дифференциальное окрашйвание хромосом на G-диски проводили с помощью модифицированного метода Сибрайт (Seabrlght, 1971). С-диски на хромосомах выявляли с помощью метода Самнера (Sumner/ 1972), в модификации Леликовой и Цветковой (Леликова, Цветкова, 1976). Активные ядрышковые организаторы определяли по методу Хоуэлла

и Блзк (Howell,"Black, 1980).

Для подсчета модального числа хромосом каждой линии анализировали по 100 метафазных пластинок, которые имели цитоплазму, что _ сводило до минимума возможность потери хромосом. Число клеток с разной плоидностью определяли при анализе 1000 метафазных пластинок. Для полной идентификации маркерных хромосом и построения реконструированного кариотипа был использован метод, разработанный Мамаевой с соавторами (Мамаева, 1934; Литвинчук, 1986). После полной идентификации всех маркерных-хромосом, целые маркерные хромосомы или их фрагменты располагали на месте тех нормальных хромосом, из которых они происходили. Результаты реконструкции кариотипов отдельных клеток суммировали и получали обобщенный реконструированный кариотип (ОРК) клеточной линии.

Идентификацию клеточных линий с помощью ДНК-фингерпринтин-га осуществляли по методике, описанной Рыскоеым и соавторами (Рысков и др. , 1988). В качестве меченой пробы- использовали ДНК фагового вектора М13, содержащего вставку тр18. ДНК фраг-ментировали с помощью рестриктаз BspRl и Hinfl. Различие между ДНК-фингерпринтингами 2-х линий определяли в процентах (процент различия - ПР). ПР вычисляли как число различающихся фрагментов в двух линиях, разделенное на общее число фрагментов обеих клеточных линий и умноженное на 100 (Gilbert et al., 1990). ПР рассчитывали только для BspRl' фрагментов.

Метод гибридации in situ использовали для уточнения происхождения ряда маркерных хромосом, а также для локализации уникального гена СД4-рецептора в линии U-937. С'целью уточнения происхождения маркеров линий МТ-4 и U-93? использовали зонды альфа-сателлитной ДНК, полученные в лаборатории общей цитогенетики от к. б. н. Т. Г. Цветковой из Всесоюзного Медико -Научного Генетического Центра (ВМНГЦ): зонд HRS 185, специфичный для центромерных областей хромосом 14 и 22, зонд HRS 187, специфичный для центромеры хромосомы 11, зонд HRS 180, специфичный для центромеры хромосомы 6. Для локализации гена СД4 рецептора в клетках линии U-937 был использован зонд ДНК СД4, любезно предоставленный В. В. Зверевым, Институт вирусных препаратов, Москва, РАМН. Гибридизацию in situ проводили по

- б -

стандартному методу (Harper et al. , 1981) с некоторыми модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Кариотипическая идентификация и jpiK-фингерпринтинг клеточных линий, -чувствительных к ВИЧ. Было проведено кариологи-ческое изучение 23 вариантов 9 клеточных линий, полученных из разных лабораторий мира и наиболее часто используемых для накопления и изучения ВИЧ.

Кариологические характеристики и источники получения клеточных линий приведены в табл. 1.

Сравнительный анализ модальных чисел хромосом, числа и структуры маркеров, а также сопоставление полученных данных с имеющимися в литературе (Somalainen et al., 1980; Савельева, 1988; Shipley et al. , 1988) позволили установить, что линии U-. 937, Molt-4, Molt-3 и Jurkat являются истинными.

Варианты линии U-937 имели сходные модальные числа хромосом 61-63, состав и число маркеров. Происхождение маркерных хромосом было следующим: Ml-t(l;18), M2-i6q, M3-del(3), M4« t(3;8), M5-illq, М5-Ц11;?), M?-t( 16; ?), M8-t( 11; ?), МЭ-del (11), M10-t(19; NOR), Mll-l21q, M12-t( 1;6; 12), M13-t(9;15), M14 -t(10;11), M15-t(8; 22), M16-t( 13; 21), M17-t(5; 16), M18-del(l) M19-del(l), M20-del(2), M21-t(17;N0R), M22-del(13), M23-del(7), Среди аутосом отсутствовали 1 и 11 хромосомы, которые входили в состав маркеров, а также одна из половых хромосом - Y.

При сравнении двух вариантов линии Jurkat и Jurkat' tat (со встроенным геном tat) были выявлены одинаковые модальные числа - 47 хромосом. В обоих вариантах обнаружен общий маркер del(2)(p23), в то время как в линии Jurkat tat отсутствовал маркер, имевшийся в линии Jurkat - del (Y). Отличие этих вариантов состоит также в различном числе копий 20 и 21 хромосом. В линии Jurkat наблюдается трисомия по 20, а в линии Jurkat tat - по 21 хромосомам.

Два варианта линии Molt-4 имели модальные числа 04-95 и 97 хромосом, числа маркеров 4 и 6 в первом и втором вариантах, соответственно. Два маркера (6q- и 7р+), которые являются общими для этих вариантов, выявлены в варианте линии Kfolt-4, ка-

Таблица 1.

Характеристики перевиваемых клеточных линий, используемых в работе с ВИЧ

Линия Источник Модальное Число Окончательная клеток получения число маркеров интерпретация

хромосом линии

и-937а (а) 63 24 и-9 37

1/-9376 (а) 61 21 и-937

и-937 (0) 63 23 и-937

и-937^ (в) 62 23 и-937 .

МТ-4 (а) 83 6 МТ-4

МТ-4 (б) 83 6 МТ-4

МТ-4 (Д) 84-85 7 МТ-4

^гкаЬ Ьа1 (в) • 47 1 ,1игкаЪ tat

]игкаЬ (г) 2 ,]игкаЬ

СЕМ (а) 47 12 ' Мата1*а

СЕМ (в) 47 4 ' СЕМ

СЕМ tat (в) 80 16 СЕМ ЪаЬ

Н-9а (а) 46 - Нитап (?)

Н-96 (а) 47 12 Катала

Н-9 (б) • 68 28 Н-9

Н-9 (в) 78 • 34 Н-9

НиЬ-78 (а) 71 33 НиЪт78

НиЬ-78 (в) 46 • Нитап (?)

Ни1-102 (а) 69 30 ниь-юг

Мои-З (в) 44-45 - Нитап (?)

Мо^-З (г) 98 4 МэН-З

МзК:-4 (а) 97 6 Мэ1Ь-4

МоИ:-4 (б) 94-95 4 Мэ1Ь-4

(а) - Институт вирусологии РАМН, Москва

(б) - Центр генной инженерии и биотехнологии, Гавана, Куба

(в) - Каролинский институт, отдел вирусологии, Стокгольм, Швеция

(г)-- Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

(д) - Институт эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи,

Мэсква

риотип которой опубликован ранее (Suomalainen et al. , 1980). Все нормальные хромосомы, в основном, представлены 3-4 копиями.

При анализе двух вариантов линии Molt-З, один вариант имел маркеры, совпадающие с маркерами линии Molt-4. По данным каталога перевиваемых клеточных линий и гибридом (АТСС, 1985), линии Molt-З и Molt-4 являются двумя клонами, полученными изначально от одного пациента. Следовательно, их кариотипы могли иметь общие маркеры. Таким образом, только вариант линии Molt-3, имеющий маркеры линии Molt-4, является верным, в то время как другой вариант линии Molt-4, содержащий в кариЪтипе 44-45 хромосом, является ошибочным.

Линия МТ-4 имела сходный кариотип во всех анализируемых вариантах, полученных из разных источников. Она представляет собой клеточную популяцию с гипотетраплоидным числом хромосом равным 83 -85. 3 трех вариантах линии KfT-4 присутствует 6 общих маркеров. Третий вариант линии KfT-4 (д) характеризуется дополнительным маркером Ktf-il7q и наличием редких перестроек практически в 607. клеток. Происхождение б общих маркерных хромосом следующее:. Ml-t( 2; 14), M2-l7q, M3-del(9), M4-17q, №-del (17), Ш - микрохромосома.

Все варианты линии СЕМ имели значительные кариотипические различия. Первый вариант линии СЕМ(а) имел хромосомные маркеры B-клеточной линии Namalwa (Савельева, 1988). С помощью С-ок-раски был выявлен типичный для клеток Namalwa маркер, который имеет удвоенный гетерохроматиновый блок (Родова, 1983). Второй вариант линии СЕМ (в) имел кариотип с модальным классом 47 хромосом и 4-мя маркерами: m-t(8;10), M2-(8;9), M3-del(9), M4-del(8). Третий вариант линии СЕМ - СЕМ tat имел модальное число хромосом 80 и содержал те же 4 маркера, что и СЕМ (в), но в 2-х копиях. Таким образом, общность маркеров в клетках двух вариантов линии СЕМ позволяет заключить, что оба варианта линии СЕМ, содержащие как 47 хромосом, так и 80, являются-истинными. Однако, линия СЕМ tat представляет собой полилло'иди-зированный вариант исходной линии СЕМ с .последующая элиминацией как нормальных, так и маркерных -хромосом в ходе эволюции.

По данным литературы линия Н-9 является анеуплоидной

(Popovic et al., 1984). Клетки варианта H-9a(a) содержали нормальный диплоидный набор хромосом (2n=46,XX). Очевидно, что он является ошибочным. Второй вариант этой линии Н-9б(а) содержал маркеры Namalwa. Два других варианта имели различные модальные классы: 68 и 78 хромосом и различное число маркеров (28 и 34, соответственно). Оба анеуплоидных варианта линии Н-9 имели 20 общих маркеров.

Варианты линии Hut-78 также различались, т. к. в одном случае кариотип был диплоидным и содержал 46 хромосом, а в другом - 71 хромосому и 33 маркера. Четырнадцать из этих маркеров были идентичными с маркерами двух вариантов линии Н-9 с модальными числами хромосом 68 и 78. На основании этих данных можно заключить, что линии Н-9 и Hut-78 имеют общее происхождение.

При сравнении клонов Hut-78 и Hut-102, оказалось, что .они имеют 60% обших маркеров, что является естественным явление^ для клонов, полученных от одного пациента (Gazdar et al., 1980).

Для подтверждения результатов идентификации клеточных линий, чувствительных, к ВИЧ, помимо кариологического анализа использовали ДНК-фингерпринтинг (Gilbert et al. , 1990). Полученные данные показали, что только линии Н-9 и Hut-78, а также клоны одной линии U-937 и U-937/16, которые служили контролем, имели практически идентичные картины гибридизации. Другие клеточные линии имели специфические картины полос гибридизации. По данным литературы (Gilbert et al., 1990) известно, что для клеточных линий, имеющих общее происхождение, прбцент различия их ДНК-фингепринтингов составляет 0-3%, тогда как для неродственных клеточных линий он достигает 47-100%. Из табл. 2 видно, что линии U-937 и U -937/16 имеют ПР-2%, линии Hut-78 и Н-9 -37.. Другие исследуемые линии имели проценты различия, характерные для неродственных клеточных линий - от 58 до 86%.

Таким образом, ДНК-фингерпринтинг подтвердил результаты идентификации клеточных линий, полученные с помощью кариологического анализа

В целом, сопоставляя данные кариологического изучения и

Таблица 2

Различия в ВзрИ фрагментах ДНК мезду ВИЧ-чувствительными клеточными линиями в X

Линии МТ-4 .Jurkat tat СЕМ Н-9 Hut-78 U-937

Jurkat tat 80

СЕМ 72 70

Н-9 68 86 84

Hut-78 72 83 81 3

U-937 82 86 . 58 72 76

U-937/16 80 84 60 73 78

2

ДНК-фингерпринтинга клеточных линий, чувствительных к ВИЧ и полученных из разных лабораторий мира, можно констатировать, что из 23 проанализированных вариантов 18 являются истинными, тогда как 5 - ошибочно идентифицированными.

Кариологический анализ клеточных линий и клонов, имеющих различную чувствительность к ВИЧ. Далее был проведен детальный онтогенетический анализ структуры кариотипов клеточных линий и клонов, имеющих различную чувствительность к ВИЧ. Из 4-х. проанализированных клеточных линий МТ-4, СЕМ, Jurkat tat и U-937, наиболее чувствительной была линия KiT-4, менее чувствительной бьша линия Jurkat tat, среднюю чувствительность имела линия СЕМ и наименее чувствительной была линия li-937.

Количественные цитогенетические характеристики клеточных линий МТ-4, Jurkat tat, , СЕМ и U-937 включали определение модального класса хромосом, его процентного содержания, интервала изменчивости по числу хромосом и уровня полиплоидии. Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что .линии Jurkat tat и СЕМ являются околодиплоидными, U-937 - околотрип-лоидной, МГ-4 - околотетраплоидной. Уровень полиплоидии' во всех исследованных клетках невысок и меняется незначительно (от 0,2 до 2,5Х) за исключением линии Jurkat tat, где он достигает большей величины 7.4Z. Как видно из таблицы, все 4 ли-

нии имели четко выраженные модальные числа хромосом, ограниченные интервалом изменчивости. Это совпадает с результатами последних лет, которые показали, что существование клеток in vitro сопряжено с гораздо менее выраженной численной гетерогенностью, чем это считалось ранее, а изменчивость числа хромосом ограничена небольшими пределами (Chen et al. , 1983; Мамаева, 1984; Литвинчук, 1986).

Таблица 3

Количественные кариологические характеристики линий, имеюших различную чувствительность к ВИЧ

Линии Модальное Интервал Доля Доля

число изменчивости клеток с полиплоидных

хромосом числа модальным клеток

хромосом числом в X на

хромосом 1000

в 7. на клеток

100 клеток

КГ-4 83 80-85 50 0,2

Jurkat

tat 47 45-48 . 65 7.4

СЕМ 47 46-48 80 2,5

U-937 63 60-64 49 1,4

Для полной идентификации маркеров в линиях МТ-4 и Jurkat tat помимо дифференциального окрашивания на G-, С- и Ag-окраски, использовали также метод гибридизации in situ для выявления' специфических центромерных районов хромосом б, 11, 14 и 21.

После определения происхождения всех маркерных хромосом 4 -х изученных линий стало возможным провести реконструкцию их кариотипов, а также выявить "горячие" точки хромосом. .

Анализ реконструированных кариотипов показал, что для всех изучаемых клеточных линий, кроме Jurkat tat обнаруженные нуллисомии (9 хромосома в линии СЕЫ; 1,11 - в линии U-937) или моносомии (8,10 хромосомы.в линии СЕМ; 3,9,10,13,16,21 - а ли-

нии U-937) не были истинными. Материал этих хромосом входил в состав маркеров, и этим обеспечивалась, как минимум диплоид-ность по этим хромосомам, а следовательно и диплоидность по всем аутосомам (рис.1).

Проведенный анализ реконструированных кариотипов клеток каждой из исследуемых линий позволил установить, что популяции клеток линий СЕМ, МТ-4, Jurkat tat и U-937 являются сбалансированными. Например, в линии U-937, несмотря на большое количество маркеров и присутствие в одной популяции нескольких ка-риотипически различных клонов, хромосомный состав клеток сбалансирован за счет взаимодополняющих корреляций нормальных и маркерных хромосом.

В линии Jurkat tat, где наблюдается моносомия по фрагменту- 2р23 - pter, доля полиплоидных клеток выше, чем в других проанализированных линиях. Остальные Т-клеточные линии, чувствительные к ВИЧ, являются гипотетраплоидными (МГ-4, СЕМ tat, Н-9, Hut-78, Hut-102) (табл.1). Моноцитоидная линия U-937 имеет околотриплоидный набор хромосом. Таким образом, можно констатировать выраженную тенденцию к полиплойдизации большей части изученных клеточных линий, чувствительных к ВИЧ.

При идентификации маркеров в линиях МГ-4, СЕМ, Jurkat tat и U-937 было локализовано 50 точек разрывов на хромосомах. Один разрыв по локусу 9р24 является общим для линий СЕМ и U-937. Остальные точки разрывов были индивидуальными для каждой линии.

Так,- в линии ИГ-4 в локусе, который дважды задействован в хромосомных перестройках, расположены гены, играющие важную роль в Т-клеточной дифференцировке (альфа и дельта цепей Т-клеточного рецептора (HGM 10, 1989) и принимающие участие в проявлении специфических функций Т-клеток. Два разрыва с участием локусов 17р11 и 17ql2 затрагивают сайты локализации онкогенов v-erb-b2 и v-erb-a. Экспрессия этих онкогенов в результате данных хромосомных нарушений может характеризовать особенности злокачественной трансформации клеток МГ-4. В линии МГ-4 происходит также разрыв хромосомы 9 в локусе q22. Это является специфическим событием при Т-клеточных неоплазиях (Hecht et al. , 1986). - ' '

Ii

titt Üffi'to1

iv —III—Ii—I--^

•I—Mi"

ti—а 41-,7-

9 И ■ И

-----ff,--

» » 4 «

H

-» л-ti

•I n in ¥ *

m an an m in m

II и и »

IHK ■ ■ 0 ■

It Й n

-ла-

•IUI)

A

Б

Рис.1. Кариотип клетки и-937, '2п=63, XX, 22 маркера (А) •и обобщенный реконструированный кариотип линии Ц-937 (Б). Сплошной линией в ОРК обведены хромосомы, реконструированные из маркеров.

В линии Jurkat tat при образовании делеции короткого плеча хромосомы 2 по локусу 2р23 место разрыва проходит по сайту локализации протоонкогена N-myc (2р22-24). Этот онкоген экс-прессируется при Т-клеточных неоплазиях (Smith et al. , 1986).

В линии СЕЫ три точки разрыва приходятся на 9 хромосому. Нарушения с участием 9 хромосомы довольно частое событие при Т -клеточных лейкозах и лимфомах. Остальные три точки разрывов в этой линии находятся на 8 и 10 хромосомах. В локусе, где произошел разрыв 10 хромосомы, локализуется ген рецептора интерлей-кина 2. Экспрессия этого гена влияет на регуляцию пролиферации клеточных популяций.

Кариотип клеток линии U-937 отличается многочисленными и сложными перестройками хромосом, затрагивающими места локализации онкогенов и фрагильных сайтов. Из 31 локуса разрывов хромосом в линии U-937 8 приходятся на фрагильные сайты и 8 -на онкогены. Причины, обусловливавшие появление такого большого числа маркеров в этой линии, не ясны. Однако тот факт, что

8 точек разрывов на хромосомах совпадают с местами локализации фрагильных сайтов, свидетельствует о неслучайном действии индуцирующего их фактора С другой стороны, 8 точек разрывов, приходящиеся на места локализации онкогенов, могут свидетельствовать о событиях, связанных с пролиферацией и малигнизацией этих клеток.

В образование маркеров преимущественно вовлекался материал 1,3,6,11 и 13 хромосом. Причем 11 хромосома имела 5 точек разрывов. Делеция длинного плеча хромосомы 11, а также транслокация короткого плеча хромосомы 16, которые наблюдаются в кариотипе линии U-937, описаны как постоянные для опухолей мо-ноцитоидного происхождения (Maserati et al. ,1990; Mltelman, 1991).

• В настоящее время многие исследователи придерживаются мнения, что эффективность заражения СД4-положительных клеток зависит от экспрессии гена СД4-рецептора (Popoviс et al., 1984; Maddon et al. , 1986; Asjo et al., 1987). Район 12pl2-pter, в котором картирован ген СД4 на нормальных клетках человека (Kozbor et al., 1986) и район 12pll-pl2 для этого гена, который картирован нами на линии U-937 (рис.2), не затронут перестройками ни в одной из проанализированных линий.

При анализе и сравнении кариотипов клонов линии U-937, имеющих различную чувствительность к ВИЧ, оказалось, что структуры кариотипов клонов, имеющих одинаковую чувствительность к ВИЧ, сходны. Так, низкочувствительные исходная линия U -937 и клон U-937/4 имели по 21-23 маркера, причем их структура была одинаковой. Среднечувствительные клоны U-937/1 и U-937 /2 содержали 15-16 маркерных хромосом со сходным происхождением. При сравнении кариотипов высокочувствительного клона U-937 /16 и низкочувствительной исходной линии U-937 было показано, что отличие этих линий заключается в возникновении нового маркера М23 в клоне U-937/16. Этот маркер возник вследствие транслокации материала маркера Ml на маркер М16. В результате этих хромосомных нарушений фрагмент хромосомы 18 в локусе q21 переместился на 22 хромосому в локусе ql3. В локусе 18q21 локализован онкоген yes-1, а в локусе 22ql2-13 - онкоген c-sis. Совмещение этих онкогенов при такой транслокации может привес-

4 л

~ p

< V

» fl . » f,

Рис.2. Локализация уникального гена СД4 в ло-кусе 12р11-12 в клетках линии U-937

ти *к еще большим отклонениям в регуляции клеточного деления изучаемых клеток. В этом аспекте интересным является факт участия клеточных генов регуляции пролиферации в репликации ВИЧ (Friedman et al. , 1985; Ileana et al. , 1991).

Таким образом, детальный анализ кариотипов клеточных линий, имеющих различную чувствительность к ВИЧ, позволяет заключить, что возникновение хромосомных нарушений связано либо с пролиферативными свойствами клеток, либо может определять принадлежность их к Т-клеточному или моноцитоидному происхождению. В то же время пока не установлены какие-либо специфические повреждения хромосом, однозначно определяющие их чувствительность к ВИЧ. Что касается клонов линии U-937, то исходя из фактов, что клоны, имеющие сходную чувствительность к ВИЧ, содержали практически одинаковые структуры кариотипов, а также опираясь на литературные данные (Попова, 1989), можно предположить, что кариотипические отличия в высокочувствительном клоне U-937/1б, которые отличают ее от клеток U-937, могут служить одним из возможных факторов, определяющих повышенную чувствительность этих клеток к ВИЧ.

Изучение действия ВИЧ на хромосомы высокочувствительных клеточных линий МТ-4 и Jurkat tat. При определении хромосомных нарушений в клетках линий МТ4 и jurkat tat в разные сроки инфекции ВИЧ-1 (штамм BRU) параллельно проводили визуализацию ЦПД вируса и тестирование клеток на наличие вируса по белкам ВИЧ р24, р17, ет>41.

Клетки высокочувствительных линий МТ-4 и Jurkat tat по-разному проявляют ЦПД при действии на них ВИЧ. Период инфекции для клеток МТ-4 составляет в среднем 8-10 дней и заканчивается полной гибелью клеток без образования синцитиев. Клетки Jurkat tat вскоре после заражения вирусом образуют синцитии, которые в течение инфекции увеличиваются в размерах, становясь нежизнеспособными. Причем клетки линии Jurkat tat при заражении ВИЧ могут проявлять как одно- так и двухфазный типы инфекции.

Изучение действия ВИЧ на хромосомы клеток МГ-4 и Jurkat tat показало способность ВИЧ вызывать • достоверное увеличение числа клеток с хромосомными аберрациями только в клетках Jurkat tat (табл. 4). Причем процент клеток с хромосомными нарушениями достигал своей максимальной величины на 7-11 дни при однофазной инфекции и на 5 день при двухфазной инфекции.

Для инфицированных линий МТ-4 и Jurkat tat характерна сходная экспрессия белков р17 и gp41 ВИЧ с пиком (>60Х светящихся клеток) на 7-9 дни при однофазной инфекции. При двухфазной инфекции в линии Jurkat tat первый' максимум накопления этих же белков был на 5 день, второй пик наблюдался на 15 день инфекции (Kushch et al. ,1991). Следовательно, максимальное число аберраций наблюдалось в дни максимального накопления белков ВИЧ ' •

Анализ количества полиплоидов показал, что для линий МГ-4 и Jurkat-tat характерны различные закономерности изменения числа полиплоидов в процессе инфекции ВИЧ Содержание полиплоидов в клетках МТ-4 не меняется в течение инфекции, тогда как в клетках линии Jurkat tat максимальное число полиплоидов наблюдалось в дни максимального накопления белков ВИЧ при однофазной инфекции. Аналогичная картина наблюдалась для линии Jurkat tat в случае двухфазной инфекции, где максимум клеток с полиплоидным набором хромосом приходился на 5 и 15 дни. Следу- _ ет заметить, что в эти же дни при одно- и двухфазной инфекциях наблюдалось наибольшее число синцитиев, которые отличались максимальными размерами. Очевидно, таким образом, что рост числа полиплоидов коррелирует с образованием синцитев в попу-

Таблица 4

Влияние ЮТ-инфекшга на число хромосомных аберраций в клетках линий МТ-4 и Jurkat tat

Линия Контроль Дни после инфекции

2 3 5 7 9 11 13- 15 17

мх-ч jürkattat юднораз-ная инфекция) Jürkattat (двухфазная инфекция; 7,0*1,47 8,0*1.6 9,0*1,7 9,0*1,7 14,0*2,0 15,3*2,1 6,0*1,4 16,0*2,1 20,0*2,3 5,3*1,3 17,7*2,2 21,3*2,4 5,0*1,3 22,3*2,4 13,0*1,9 7.0*1,5 28,0*2,6 9,0*1,7 18,0*2,2 9,0*1,7 10,3*1,8 8,0*1,6 10,0*1,7 7.0*1.5 9,3*1,7 8,3*1,6

г» - различие между контролем и опытом достоверно с вероятностью Р^О.О!

ляции инфицированных клеток Jurkat tat. Количество хромосом в отдельных полиплоидных клетках линии Jurkat tat достигает до 300 хромосом и больше. При однофазной инфекции в гигантских полиплоидах линии Jurkat tat наблюдалась пульверизация хромосом. Иная картина изменения уровня полиплоидии отмечена в линии МТ-4, где клеток с полиплоидным набором хромосом практически нет и в течение инфекции они не появляются. Это связано с тем, что клетки этой линии погибают без образования синцити-ев.

Анализ типов хромосомных нарушений при ВИЧ-инфекции показал, что во всех вариантах опыта чаще всего встречаются клетки с хроматидными разрывами и пробелами,- в меньшей степени - с хромосомными разрывами. Кроме того, репродукция ВИЧ в клетках линии Jurkat tat вызывает такие повреждения, как хроматидные обмены с образованием три- и тетрарадиалов. В 'начальные дни инфекции обнаружено увеличение числа клеток, в которых происходит сближение хроматид в определенных'локусах. В течение инфекции в данных локусах нередко происходят разрывы с образованием хромосомных фрагментов (рис.3).

Изучение локализации точек разрывов на 6-окрашенных хромосомах в клетках линии Jurkat tat показало, что некоторые районы хромосом избирательно поражаются при заражении клеток ВИЧ. Такими специфическими местами разрывов хромосом быж области 1рЗб, lq42, 3q21, 5q31 и 14q22. Анализ районов, в которых произошли неслучайные разрывы хромосом при заражении ВИЧ клеток культуры Jurkat tat показал, что 4 локуса из 5 совпадают с местами локализации фрагильных сайтов, которые представляют собой области повышенной ломкости хромосом. Всего в клетках Jurkat tat, инфицированных ВИЧ, было установлено 44 локуса с неслучайными и случайными разрывами хромосом. Среди них 27 точек (61%) совпадают с районами локализации фрагильных сайтов, как общих так и редких. По-видимому, это результат сильного мутагенного действия ВИЧ или продуктов его метаболизма на геном клеток линии Jurkat tat.

Неслучайные разрывы в локусах 1рЗб, lq42 'и 5q31 могут происходить после.сближения хроматид по этим локусам. Возмож- _ но, такое сближение хроматид под действием ВИЧ приводит к на-

1-й-Mr

чЧ 'V- 4

■ ■ А - Б

Рис. 3. Сближение хроматид в определенных локусах

(А) и последующие хромосомные разрывы в этих районах (Б) в клетках линии Jurkat tat под действием ВИЧ

рушению их исходной структуры, в результате чего такие участки становятся более ломкими. К тому же в этих локусах находятся районы локализации фрагильных сайтов. По-видимому, появление большого числа разрывов в этих локусах можно связать с этими двумя событиями.

Таким образом, исследования по действию ВИЧ на Q-окрашенные хромосомы в клетках линии Jurkat tat показали, что существуют локусы, по которым происходят неслучайные разрывы хромосом в клетках in vitro. Фрагильные сайты являются предпочтительными местами ломки хромосом под действием ВИЧ. Это согласуется с данными, полученными при изучении действия вируса клещевого энцефалита (КЗ) на клетки линии RH (Попова, 1989). Но если в инфицированных клетках RH совпадение районов, по которым произошли разрывы с локализацией фрагильных сайтов составляет 36,7 %, то в случае ВИЧ - 61,3%. Очевидно, что ВИЧ вызывает больший мутагенный эффект, чем вирус КЭ. Насколько выявленные неслучайные точки разрывов в клетках линии Jurkat tat при действии ВИЧ являются общими для других ВИЧ-инфицированных клеточных линий, покажут дальнейшие исследования, так как среди двух проанализированных высокочувствительных клеточных линий МТ-4 и Jurkat tat результат мутагенного действия ВИЧ на их хромосомы оказался разным.

ВЫВОДЫ

1. В результате цитогенетического изучения 23 вариантов 9 -ти клеточных линий, чувствительных к ВИЧ, было показано, что

5 вариантов 4-х линий были ошибочно идентифицированы. Впервые описаны кариотипы 5 клеточных линий, широко используемых для изучения ВИЧ; МТ-4, СЕМ, Н-9, Hut-78, Hut-102.

2. Установлено, что кариотипы линий Н-9, Hut-78 и Hut-102 имеют 14 общих маркеров, что свидетельствует о принадлежности клеток этих линий одному индивидууму.

3. Большинство клеточных линий, чувствительных к ВИЧ, имеют выраженную тенденцию к полиплоидизации. Линии МГ-4, Н-9, СЕМ tat, Hut-78, Hut-102, Molt-3, Molt-4 имеют гипотетраплоид-ный набор хромосом, линия U-937 - околотриплоидный.

4. Цитогенетический анализ клеточных линий с разной чувствительностью к ВИЧ показал, что структура кариотипа не определяет чувствительность клеток к ВИЧ в линиях, полученных от разных индивидуумов., Основные хромосомные повреждения затрагивают гены, участвующие в клеточном делении й характеризуют принадлежность линии к Т-клеточному или моноцитоидному происхождению.

5. Сравнительный цитогенетический анализ клонов линии U -937, имеющих различную чувствительность к ВИЧ показал, что клоны, имеющие сходную чувствительность к ВИЧ имеют практически одинаковую структуру кариотипа' Кариотипическим отличием высокочувствительного клона U-937/16 от исходной низкочувствительной линии U-937 является транслокация, приводящая к совмещению двух онкогенов yes-1 и c-sis.

6. Высокочувствительные линии МГ-4 и Jurkat tat, инфицированные ВИЧ, показали различия в цитопатическом действии вируса, а также в количественных и качественных характеристиках хромосомных аберраций, индуцированных ВИЧ. Образование синци-тиев, увеличение числа клеток с полиплоидным набором и аберрациями хромосом в клетках линии Jurkat tat и отсутствие этих изменений в линии МТ-4 свидетельствует о различных механизмах действия ВИЧ на клетки этих линий.

7. Сопоставление динамики числа хромосомных аберраций и накопления белков ВИЧ в инфицированных клетках линии . Jurkat tat показало, что наибольшее число аберраций наблюдалось в дни максимального содержания в этих клетках белков ВИЧ.

8. Впервые . выявлено мутагенное действие ВИЧ на Хромосомы

чувствительных'клеток, инфицированных in vitro, проявляющееся в достоверном увеличении числа клеток с аберрациями. Показан неслучайный характер распределения разрывов хромосом в клетках линии Jurkat tat, инфицированной ВИЧ. Преимущественно поражались локусы 1рЗб, lq42, 3q21, 5q31, 14q22. Отмечено совпадение 61% • разрывов с районами повышенной ломкости хромосом - фра-гильными сайтами.

' СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глухова Л. А. , Корнеева М. И. , Киселева И. А. , Мамаева С. Е., Кущ А. А. Кариология клеточных линий, чувствительных к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ). - Тез. Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре. - М. , 1989, с. 112-113.

2. Glukhova L. А. , Kushch А. А. , Korneeva М. N. , Kiseljeva I.A. , Mamaeva S. Е. Cytogenetic analysis of HIV-susceptible human cell lines. - Tesis 6 International Conference on AIDS, USA, Abstract Book, 1990, v. 2, p. 315.

3. Kushch A. A. , Glukhova L. A. , Shumay E. P. , Mamaeva S. E. , ■ NossikD. N., Kalnina L. B., Grabovskaya I.L. , Tugizov Sh. M. , Asjo B. Cytogenetic analysis of human cells infected with human immunodeficiency virus in vitro. - Tesis 7 International Conference on AIDS, Florence 16-21 June, Abstract Book, 1991, v. 1, p. 128.

4. Глухова JL A. , Мамаева С. E., Кущ А. А. Связь неслучайных хромосомных нарушений с сайтами локализации онкогенов в ВИЧ-чувствительной клеточной линии U-937 и ее клонах. - Тез. докл. на Втором Всесоюзном Симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии, Москва, 1991, с. 52.

5. Glukhova L. А. , Kiseleva I. А., Korneeva М. N. , NossikD. N. , Kushch А. А., Mamaeva' S. Е. , Asjo В. Karyologlcal approach to the identification of true cell lines susceptible to the human immunodeficiency virus (HIV). - Biomedical Science, 1991, v. 2, p. 293-297. •

6. Грабовская И. Л., Глухова JL А. , Цветкова Т. Г. , Кравец И. А,. Мамаева С. Е., Кущ А. А. Использование метода гибридизации in situ для идентификации хромосомных перестроек при кариоти-пировании клеточных.линий. - Цитология, 1992, N7. '