Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деконтаминация культуры клеток ППК-66б от персистирующего вируса классической чумы свиней и стабилизация свойств полученных клонов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Деконтаминация культуры клеток ППК-66б от персистирующего вируса классической чумы свиней и стабилизация свойств полученных клонов"

На правах рукописи

УДК 619: 616. 98: 57а 831. 2: 636. 4

?ГБ ОД

ЧЕРМАШЕНЦЕВА Наталья Анатольевна

: О ЕВ 1995

ДЕКОНТАМИНАЦИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ППК-ббб ОТ ПЕРСИСТИРУШЕГО ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ И СТАБИЛИЗАЦИЯ СВОЙСТВ ПОЛУЧЕННЫХ КЛОНОВ

03.00.06. - вирусология

Авторефер а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров - 1996

работа выполнена ео Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители:

- доктор ветеринарных наук,.профессор[д. Е КУРНОСОВ |

- кандидат биологических наук С. Г. ЮРКОВ

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор ДЬЖОНОВ Л.П. (ВИЭВ),

- "кандидат биологических наук БАЛЫШЕВА В.И. (ВНИИВВиМ).

Ведущая организация: ВНИИ защиты животных.

1-

ол

Защита состоится "29 " февраля 19Й6 г. - в. 12 часов на заседании диссертационного совета 3-120.61. ф. . во Всероссийском научно-исследовательском институте Еетеринарнсй- "вирусологии и микробиологии по адресу: 501120, г. Покров Еладимирскей. обл. , ВНИ-ИЕВиМ. ' * "

''С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВШШВЕиМ.

Автореферат разослан " января 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Г. П. ФЕДОРОВ

i. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Б последнее время большое значение приобрела проблема контаминации культур клеток вируса}.« в связи с их широки:.! использованием как для научных исследовании в области вирусологии, так и в биотехнологии для производства различных вакцин и диагностических препарзтоз (А. Я. Самуйленко, 1990; В. Н. Тарасов, 1979; 1991; А. М Prince, В. Kfcrowits, 1989).

Электронно;,жкроскспическое исследование культур клеток раз-■ личного происхождения свидетельстует о том, что некснтаминирован-ные первичные и перевиваемые линии клеток в лабораторной практике встречается коаине редко ( Г. А. Худя кое . 1980; VL С. Малахова, В. Б. Макаосв. 19ь5; 1990; Э. Г. Симонова и др. . 1992; У. Holland et. 1980).

(

вирусная контаминация создает серьезные препятствия в музейной работе с изолятами и штаммами Еирусой, в получении антисывороток, искажает результаты серологической идентификации Еирусов, а такле мо.гйт служить причиной невозможности получения искомых вирусных продуктов с высокой удельной активностью (М. С. Малахова, В. В. МакароЕ, 1990).

Выявлена вирусная контаминация целого ряда вакцинных препаратов, когда в качестве субстратов для получения вируссодерзкашего материала использовали переистентно-контаминированные культуры клеток (В. Г. Добротворцеза, Е К Миловидова, 1981; Ф. Феннер и др. , 1977; Г.Г.Миллер, I960), поэтому в числе основных критериев стандартизации биологических систем по L. Hayflick (1970) важнейшим является отсутствие вирусов-контаминантов..

Перевиваемые культуры клеток свиного происхождения часто бывают контаминированы вирусом классической чумы свиней (КЧС)

i* ^ а Сеогеев. 1976; М. De C3si.ro, 1964; 1973; L. Ribeiro 6t ai. , 1971; Н. Laude, 1978; 1980; j. hfcuse et al. , 1933).

Г' orpnTf npoÖJIiМОЙ СТОЛКНУЛИСЬ И 0Т9Ч6СТВ0ККЫ9 ИССЛ9Д0ЕатеЛИ E "бласти ветеринарной вирусологии и микробиологии, когда во БНИИВ-ЕпМ из перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи t ПГГЗС) был DuTTomiu ЕЫСОКОТеХНОЛОГИЧНЫЙ КЛОН КЛ9Т0К ППН-566 ИМвЮШИЙ значите ЛЬ НЫ11 прслисератиЕный потенциал, адаптированный к росту в суспензионных условиях и обладавший ¿ллрокпм спектром чувствительности к вирусам различных таксономических групп. однако, как ггг,тано2Ил колл^ктие исследователей, контаминирован персистир уюишм °ирусом. ИД" кт ИФИцпров ЗННЬ!М как э.т т ~ н у i i р о е ан н ый вирус КЧС 1 И. 'l1. Вишняков и др. . 1983; В. Б. Нуриннов, 1933).

TTojrt ;г задачи исследований. Целью наших исследований явля-

лась декснтаминация переЕИЕаемой культуры клеток почки эмбоиона свиньи (ППК-ббб) от персистируюшего вируса.

В этой связи необходимо было решить следующие задачи:

~ изучить биологи'ксул'э свойства Еируса-контачшязнта культуры клеток ППК-ббб;

_ разработать модель персистенции вируса-контаминанта е перевиваемой культуре клеток почки поросенка (.РК-15) и изыскать пути ее декокта.1,шнации от персистирушего Еируса КЧС;

- определить эффективность Физико-химических воздействий на элиминацию Еируса-конташнанта из культуры клеток ППК-ббб;

- разработать способ и схему деконтаминаши;

; - оптимизировать услоеия клонирования контаминированной культуры клеток ППК-ббб с целью деконтаминаши;

- получить клоны клеток, свободные от персистирующего вируса

, КЧС;

- изучить и стабилизировать культурально-морфологическиа и

биологические свойства клонированных клеточных популяций, полученных из культуры клеток ППК-боо^

- адаптировать полученный монсслойный вариант клона культуры клеток ППК-556< свободного от вируса КЧС, к суспензионному выра~ щиванию;

- определить чувствительность клоное клеток ППК-ббб, свободных от персистирущего Еируса КЧС, к Еирусной репродукции.

Научная новизна, локазана возможность эффективной д^кснтами-нацип перевиваемых культур клеток свиного происхождения от персистирущего в них пест ив прус а.

paoработай и апробирован способ дэконтаминации от интерку-ptiu^unpn виригла К^С пер*°"в?*мсй культуры кл°ток пст1ки эмбриона свиньи.

i <

Впервые получены стабильные клоны перевиваемой культуры клеток почки эмбриона свиньи [ППК-ббб), свободные от контаминанта-вируса КЧС.

Выявлена возможность дифференциации некоторых штаммов Еируса •КЧС in vitro ка основе различия иммунобиологических и культураль-ных свойств.

_ Охарактеризованы и оценены вирусрепродуцируюшие свойства но-еых клонов культуры . клеток ППК-ббб, деконтаминировачных от персистирущего пестивируса.

Практическая" значимость. Полученные деконтаминиро Еанные от вируса КЧС культуры клеток ППК-ббб рекомендованы для использования в биотехнологии. Разработаны и используются в практической работе "Методические рекомендации по поддержанию и хранению клоное перевиваемой культуры клеток ППК-ббб, свободных от вирус а-контаминанта • КЧС", утвержденные директором ЕНИИВВиМ 11.12.1991г. - ........

Разработан и включен в соответствующий каталог паспорт Не деконтампнированную от Еируса КЧС культуру клеток ППК-ббб,, включенную в коллекцию клеточных линий ЕШШЕБиМ.

Полученные декснтаминированные от Еируса КЧС клоны культур& клеток ГШК-ббб рекомендованы для использования е биотехнологии. Основные положения диссеотапнснной оаботы. выносимые на за-

ШИТУ:

1. Экспериментально-теоретическое обоснование необходимое^ и эффективности деконтаминации перевиваемых культур клеток сеино гп происхождения от персистирурсшего п^стиЕируса.

2. Способ деконтаминации перевиваемой культуры клето ППК-боб от персистируюшего в не;! вируса КЧС и получение клоков свободных от вируса-контаминанта.

з'. Стабилизация культуральных, морфологических и кариологи ческих свойств деконтаминироЕанных клоное ППК-ббб.

Дппробация работы. Материалы диссертации доложены на научнь конференциях ЕНИИВЕиМ (1956-1994) и на заседаниях ученого сове1 ЕНИИЕЕиМ (1986-1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научных рг

боты.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изле жена на 190 страницах машинописного текста и состоит из введени:

обзоса литературы,' собственных исследований, обсуждения результ; >

тов, выводов, практических предложений, списка литературы и 3' приложений. Работа иллюстрирована 33 таблицами и 25 рисункам Список литературы включает 322 наименования, в том числе 122 от чественных и 200 иностранных источников.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ С. 1. Матепиалы и методы В настоящей оассте представлены результаты исследований, проведенных в лаборатории культур клеток Всероссийского науч-нс-исследсвательскогс института ветеринарной Еирусологии и микробиологии в 1985-1991 гг. пои выполнении научно-исследовательской т°мы; Указание с. 1-1-5с "Разработка отечественных питательных лр-)тт. гтсп,-,и* линии к 1^ток для крупномасштабного производства

■ .тгаоатов"

?1ультуры клеток: перевиваемые культуры клеток почки эмбриона "и^^* ' '"> "^^-^с^чкз ( РУ.-15 ПКПО), тестикул

поросенка ; ШП), печки сибирского горного козерога IПСГК":, почки сайги ПС:. сердца оленя 1 СО:, легких оленя 1ЛО), пот1ки эмбриона лося ПЭЛ), почки теленка МЛЕЮ, пеки кошки I Ре), карциномы шейки матки человека НеЬа); лейкоцитсЕ крови свиньи IЛС), лейкоцитов крови кролика 1 ЛК), тестикулярнсй ткани ягнят iТН), почки юи^о < —ш' I курниьГь р"ср"сластов ; К'**:

Питательные среды Игла ¡/ЕМ с 2-5;; сыеосотки крови теленка; 0,5.'; ГЛЛ на солевом растЕсре Хеккоа с 5-10%. сыворотки крови ягненка; 0.1% ГЛА на солевом растворе Зрла с.5-10% аутслогичной сыворотки крови свиньи; " 0,25% 2ТМ на солевом растворе Зрла с 5-101 сыворотки кроЕи крупного рогатого скота, телят, свиней; 0,5% ФГМ да солевом растворе Эрла с 10% сьшоротки крови крупного рогатого окота, телят и свиней.

В работе также использовали различные растворы, реагенты и приборы.

Еирусы: Еирулентный вирус КЧС, штамм "Ши-Мынь", в виде де-

I

фибринированной кроЕи больной сеиньи и нативного клеточного ли-зата культурального варианта, 11 пасса* в культуре клеток РК-15,

тито 5.5 iç ЛЛ50'мл и 5,5 Is ККЙЛ50.'мл, соответственно; сухая и натпвная культуральная вирусвакилна ЛК-ЕНИИЕЕнМ протиЕ КЧС, титр i.5-5,5 içj ИмДзо/мл; вирус болезни Ауески ( EA'j, штамм Phylavia, ».и пассаж в культуре клетск вирус рпнотсахеита кошек t РТК) штамм "М-1", 1-й пассаж в культур® клеток Fe: гирус везикулярного стоматита свиней t ECO), urrasiM "Индиана", 4-й пассазс в культуре ■j-jtût'^u; рк—15; Еирус диареи крупного рогатого °штамм "'Орегон 1С1—й пассак в культуре клетск EUT* внпус паоагричпа-З I , штамм "мЕА-1/?'?т, 30-й пассат. е культуре клетск ЕПТ* еи-рус болезни Ньюкасла iEH), штамм "Ла-Сота", 4-й пассагк в курини1Х эмбрионах.

iTTTïиыу. тодсеинкп кручн^н ~елои »|cir>r»r\Tj -~5-зо ур Е

ppn^û ^ wûmancic* кролики 1-3, и***1- oq

массой 60-80 г. Развивающиеся куриные эмбрионы гЮ-суточные). 1

Быоашивание и клонирование культуры клетск ППК-666. Стационарное культивирование культур клеток осуществляли методом последовательных пересевоЕ по общепринятой методике.

Еезопорныи способ культиЕироЕания изучали в 0,5 л вращающихся флаконах при 100 об/час и биологическом ферментере с 5-литроЕой емкостью, оснащенного необходимыми контрольно-измерительными приборами.

Клонирование культуры клеток ППК-666 проводили методом предельных разЕе'дении по Б. И. ГаЕрилову ( 1963).

Жизнеспособность клеток определяли методом витального окраши-. вания 0,5%-ным водным раствором трипаноЕой сини.

Иммунологические и цитологические методы. Исследования проводили совместно с кандидатами ветеринарных наук В. В. Куринновым и ' В. И. ЧермашенцеЕым, и кандидатом биологических наук а Ю. Смысловой.

Иммунологические свойства монослойного варианта культуры кле-

/

тек. ППК-556 и производных от нее клоное клеток 114 и 191, свободных от вируса КЧС, изучали на неиммунных поросятах. ■ С этой целью поросятам вводили внутримышечно по 2 мл концентрированного клеточке- культуральнсго лизата. содержащего'17,5-20,5 млн клеток, и через 2 недели проводили контоольное заражение эпизоотическим вирусом КЧС. штамм "Ши-Мынь", е дозе 1000С1 ЛЛуо/мл.

Для определения титров антител, нейтрализующих вирус КЧС. е п^сле^"^ с/'-'чх сыворотка^ креви использовали реакцию нейтрализации 1 ~Н: на культуре РК-15 (Р^^ТВ) под^пбио г,гтт,°°чную

о " 1/отгу тт^тт^ОЬ»»^/ 'гуоос^ит^а*/ ИМ) |уипт> ТТСУ^^О ' Т^ туг»0 цг\ П™ ЦУ"01

( Т^ЦиТ ■{— ' "ут[0>Т1 гу д утт^гл рСЮи-уТТ^Т» иЛт^фГ^О^"'? О Г ТТ т

т,"КЦИ"ии'"т,0 2ГрУ"а ДН°реИ КР0 СЫЕСрСТ0г1НЫ\(И ЕР'\Т птлсрпдили е У,тЛЬТТГГ>С1 ''11

Морфологические исследования культуры клетск ШК-ббб и клонов ППК-114 и ППК-191 проводили после фиксации клеток в жидкости Буз-на и окраски гематоксилин-эозином. Препараты метафазных хромосом получали общепринятым методом. Культуру клетск инкубировали в среде с колхицином и снимали со стекла, обрабатывали гипотоническим 0,075 ¡.1 раствором КС1 в суспензии, фиксировали смесью метанола с ледяной уксусной кислотой (3:1) и наносили на поверхность предметных стекол. Хромосомы окрашивали 2%-ным водным раствором Гимза. Затем исследовали распределение клеток по числу хро-"моссм и регистрировали хромосомные аберрации. Анализировали 50 метацаз в каждом варианте опыта и определяли модальный класс клеток и интервал изменчивости числа хромосом.

Выделение, идентификация и количественные исследования вируса КЧС и других вирусов. Обнаружение и титрование вируса КЧС осуществляли, в различных культурах.клеток (РК-15, ЛС, ТЯ, ПС, ПСГК). на сеиньях и кроликах.'

В культурах клеток Еыделение. идентификацию и титроЕзние различных по вирулентности штаммов и изолятое Еируса КЧС проводили при псмовш ишунаалуоресцентного метола согласно "Методическим указаниям по иммуносрлуоресцентнсй диагностике КЧС" (1984), а так-:ке ".Методическим рекомендациям по обнаружению, идентификации и титрованию вируса КЧС е культуре лейкоцитов крови свиней-доноров" V БНШЕЕиМ. 1-388).

Выделение и титрование лаппнизировакных штаммов вируса КЧС рто р^'одц^зу по методике. описаннои в 19'/'4 году Ч 0. Уа&'^^Г".

пс^ца ц титсоЕз^кне пяти Ш1тсгатсгаккых еисусое 1^слазни лгг^пс^г рчн^трах^ита кошек везикулярного стоматита свии^й парагрипп?.-:? и болезни Ньюкасла) осуществляли в мокослойньк культурах клеток ПИК-1141Д) и соответствующих оптимальных репродуктивных системах ч КФ, ' Ге, РК-15, ЕПТ, КЗ) по общепринятой методике с использованием цитопатического зедекта исследуемых вирусов.

Методы электронномикроскопического исследования. Злектронно-микроскспическое изучение препаратов культу клетск, Еируса-кон-таминанта КЧС осуществляли методом ультратонких срезоЕ при участии кандидатов биологических наук М. С. ¿¡алаховсй и Э. Г. Симоновой. Срезы толщиной 200 А готоеили на ультратоые ЛКБ-880 1 А, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали под электронным микроскопом .;ЕКМ00 при инструментальном увеличении ст 2 тыс. до 40 тыс.

Методы статистического анализа результатов исследований. Для расчетов в количественных методах использовали определение средних значений, среднеквадратичных отклонений и метод Стьюдента, • при полуколичественных - частотный анализ и определение модального значения величины. Обработку полученных экспериментальных дан- '

/

ных осуществляли методами, вариационнои статистики, исходя иг уровня значимости ?'.0,05 I И. П. Ашмарин, А. А. Воробьев, 1962; Е. ЯГублер, 1978; Г. Ф. Лакин, 1УЙО).

2. 2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ^сслэдоезн!*® пвр^виЕаэмых культур клеток свиного происхождения по фактору пестивируснси ко н т а мз 1 ч а П1! \ \

гг^тгп ь* ^ IКОт IVе1 С Т^ ИТ ^ЛЬ40 ЕП0У^Ра"рСДУТГ'РУКгттсЧ1 ОИС'л ттСТЛ411"! ^

вирусу КчС - кснтамиканту культуры клеток ППК-ббб осуществляли

гттгт.з»(. '^рэз^^'^л^нсгс и параллельного тнтрсв°чня вирус^од^р^зш^^о

'б но мате риала ;г. '-т/о ;свиньи, кролики; .и т уюгс I различные

культуры клеток;. При изучении чувствительности различных

к

тест-объектов попользовали: вирус-коктаминант ППК-ббб (лизат клеток монослойксго варианта культуры, выращенной с сывороткой крови свиней СБИВ), вакцинный итамм "ЛК-ВНИИВВиМ", вакцинный штамм "К", вирулентный штамм "Ши-Мьшь". '• '

Вирус УЛС титроЕЗли в первичных культурах клеток ТЯ, ЛС и ЛК, а также в перевиваемых культурах клеток РК-15, ПКПС, ПСГК, СК, ПС, ПТП. При исследовании методом флуоресцирующих антител (МФА; иятактных клеток культуры ППК-ббб обнаружили специфическую флуоресценцию антигена.вируса КЧС в цитоплазме клеток. В культураль-нсй тест-системе РК-15, иннокулированной лизатом концентрата клеток культуры ППК-ббб, также выявляли специфическую флуоресценцию цитоплазмы (при исследовании МФА). Параллельное электронномик-рсскопическое изучение ультраструктуры этих клеток выявило четкую, сопоставимую цитопатическую картину с.локализацией вирионов контамиканта ео внутриклеточных везикулах и вакуолях.

Исследования показали, что наибольшую чувствительность к

персистентнсму кснтаминанту ППК-ббб, наряду ос свиньями, проявляли культуры свиных клеток гемспсзтического и почечного происхождения I ЛС. РК-15 и ПКПО). Среднечувствительнсй оказалась культура клеток ПОГК. Культуры клеток кроличьего происхождения (ЛК и СК), а тагае культура ПО. оказались полностью резистентны},ш к вирусу-контаминанту ППК-ббб. 3 культуре клеток ПТП методом иммуноф-туор^центнсго анализа оснару^зн пестивирусныи кснтамикякт В организме кролика Енрус-кснтаминант ППК-ббб не репродуцировался, что характеризует данный вирус как не сбладзисщип свойством лапп-чизирс^анчссти

т та из умения иммуно с и" ло г иче с ких свойств г^^тивирус^^^о кон-тгминанта культуры клеток ППК-ббб кэиммунным к Еирусу КЧС подсвинкам вводили клеточнс-культуральныи лизат мснослойного и суспензионного вариантов ППК-ббб, культивируемых с 107. сыеоротки крови свиней СБИВ или сборных сывороток крови е дозе 33,0 млн клеток, 0,33 млн клеток, 15.0 млн клеток соответственно. Спустя 3 недели после введения лизата культуры клеток ППК-ббб определили титр ЕКАт в сыворотке крсЕИ свиней: 3,30+0,31; 4,50+0,43; 1.20+0,28 1с? . соответственно.

Установили, что главным фактором, регулирующим уровень накопления вируса КЧС - контаминанта ППК-ббб являются специфические антитела Сборные сыворотки крови свиней, крупного рогатого скота и овец обладали Еируснейграяизующей активностью в 100 , 90 и 40% случаев, соответственно. Процент инфицированных клеток вирусом КЧС также зависел от наличия или отсутствия в питательной среде ВНАт и от способа культивирования.

Наиболее чувствительной тест-системой для постановки РНФБ оказались культура ЛС и штамм "Ши-Мынь", а также вирус-контами-нант ППК-ббб, который по сбоим характеристикам при постановке

Даккой реакции соответствовал штамму ''—'*.

Исследования по изучению влияния фитогемаггютинина Р, интерферона, температурного Фактора на инфекционную активность Еируса КЧС-контаминанта культуры клеток ППК-ббб, а такж изучение его репродуктивных характеристик в ряде клеточных культур позволяли дифференцировать штаммы Еируса КЧС не прибегая к постановке био-ярссы. Результаты дифференциации штаммов и изолятов вируса КЧС отражены в таблице.

Таблица

тг^гтугол^игтгтс1цт'а 1 р( У1С-го различных по патогеннссти штаммов __и о ^'Ч^ов вируса КЧС_

Стаммч } Степень

■ л. ^ ^ л. * ч ..

I

1 и 1:3 с л? ы |п£1 пгак~ ¡. ! кости для ' КЧ'"1 {сеинлЙ Кг1! г»т> КРТ | КРТ! КРТ | И'Г I ФГА кр. | Тя I иС \ | Туг 1 Т56 1 ! .!

,! \ 1 1 КТ^ПТГГ»-1УПиФО— 1 » • 1 1 |.микакт КЧС | азирулэнт. I + 1 1 { + 1 - ! + - + +

1 1 лК" £}И'1ИВВиМ авирулент. | + - | +| - + + 1 + 1

1 1 ¡К (АСЕ) ¡аЕирудент, | - : 1 + | - | - + 1 - 1

\ ¡Гудзон 1 низкоеи~ рулекг. + 1 + 1 1 - | - | + > 1 <

|Ши-Мынь | « вкрулент. | + 1 - - 1 - + ! |

Примечание: + (-) - наличие или отсутствие признака для данного штамма вируса;

- культурально-репродуктиЕНЫй тест на культурах клеток сеиного (се).кроличьего (кр) происхождения; почки сайги СПС); тестикул ягнят (ТЯ);

- тест на интерферон;

'1ГА - тест на фитогемагглетгинин Р; . - *

Тзб - температурный тест.

КРТ

ИФ

Поиск пестивирусной контаминации осуществляли в культурах РК-15, ПКПС, ПСТК, IEEE-2, ПТП, ПЭЛ, .10, СО, ПС. СК при помощи методики прямой иммунофлуоресценции. Контаминацию установили е культурах ÍEP.S-2 и ПТП. При использовании иммунных сыЕорстск против КЧО '.титр ЕНАт 3-9 lego) Еысская нейтрализующая способность отмечалась как с тест-вирусом КЧС, так и пестпвирусными контами-< пактами ППН-655 и IER5-2. что подтверждает их полнее антигенное соответствие Еирусу КЧС. Низкая нейтрализующая активность КЧС-иммунной сывсрстки (2 logs' претив пестивируснсго контаминанта культуры ПТП и высокая нейтрализующая активность сыворотки против туарег нрс [ 'У Ic£¿>j с этим же коктампнантом, указывают на знти-^лии^пр вируса диареи и контаминанта культуры ПТП.

! i

2.2.2: Разработка способа деконтаминации культуры

клеток ППК-ббб от персистируюшего вируса КЧС Одним из методов изучения персистируюшей инфекции культур клеток явилось моделирование персистентнсй инфекции в перевиваемой линии РК-15. Зля иноицирования использовали штаммы "Ши-Мынь" и "ЛК-ЕШИВЕиМ", а также вирус-контамииант клеточной линии ППК-ббб. Е качестве деконтаминируюших факторов использовали инкубацию инфицированных культур клеток при пониженных С 34°О и повышенных (40°С) температурах, а также обработку монсслоя клеток интерфероном (100 ЕД/мл), нейтрализующими антителами против КЧС (5-6000 ЕНЕ/мл), химиопрепаратом А-24 (100 мкг/мл), фитогемагглю-тининсм (50-100 мкг/мл), актиномицином Л (0,1 мкг/мл), а также методику клонирования.

Еирус КЧС-конта^инант на протяжении 14 месяцев существования Ш в системе вирус КЧС - РК-15 показал себя как клеточно-ассоци-ированный вирус, так как титр вируса-контаминанта ППК-ббб вс

внеклеточной культуральной жидкости не превышал 1,5-2 I? ККИДЬТКмл, что в iüG-lCOü раз меньше титра вируса непосредственно в инфицированных клетках. 1

Эффективными способами снижения репродукции персистирующего вируса КЧС на модели дИК РК-15 и перспективными для деконтамина-ции культуры клеток сказались клонирование, обработка химиопрепа-ратсм А-2-1 в концентрации 100 мкг/мл. интерсреронсм 1100 ЕД/мл), а так:ке попользован:"^ высоких * 1*255 и *сле^) доз впруси^йтралнзую— тих актитал

Для декснтаминацнн клеточной линии ППК-ббб от персистпруюшего з ней пестпвируса использовали производные этилендиачина i препарат А-24: и этиленимика (препарат Е-Юб) в возрастающих концентрациях ; 50, 100, 200 мкг/мл) и при различных условиях реакции (.длительность инкубации от 0 до уб часов, температура инкубации от 4°С до 37°С). Установили, что оба препарата (А-24, Е-106) в инактивирушей дозе 100 мкг/мл, независимо от времени внесения, отрицательно влияли на жизнеспособность клеток. 'Обработка посевного материала химиопрепаратами приводила к полной утрате клетками способности к адгезии, а их добавление в монослойную культуру индуцировало прогрессирующие дегенеративные изменения, приводящие к быстрому разрушению клеточного пласта, гибели и преждевременному отслоению клеток. Одно- и дгукратное внесение препаратов в культуру клеток е дозах 50 и 25 мкг/мл полного вирулицидного действия не оказывало.

Для дальнейшей работы по деконтаминации требовалось использование сыворотки крови сеиньи с высоким титром ВНАт к вирусу КЧС. С этой целью разработали высокоэффективную и экономически целесообразную схему гипериммунизации свиней, позволяющую в течение одного месяца получать стандартные моноспецифические сыворотки

/

- м - I

крови СЕПнеи о титрами ЕНЛт 13 и солее. без отхода свиней и выбраковки биопрепаратов. Принципиальным отличием схемы яеилссь .:огданпе КЧО-инсекции у неиммунных свинеи с последующим контролированием процесса болезни при помощи патогенетической и симптоматической терапии. Лечение больных КЧС .частных фармакологическими препаратами t антипротеазы, гдюксксртиксстерсиды. витамины, антибиотики I приводило е 1Ü0X случаев , к выздоровлению подсвинков в течение ¿-4-х суток после начала лечения.

Полученные данные послужили основой для деконтаминаиин культуры клеток ППК-cto от пеотпвнруснсго кснтаминанта с помощью методов клонирования и нейтрализации внеклеточного вируса ВНЛт ги-пернммукнсп сыворотки.

Первоначально клетки ППК-бсб поддерживали безопорнам способом ' £0-£5 пассажей в среде с Юл, гипериммуннсй сыворотки крови свинеи, содержащей в высоких титра:? '>3 ies2<' антитела прстиЕ Еируса КЧС. Затем после 2-3 пассажей культивирования в условиях монсслоя в среде, также содержащей ЕНАт в'Еирусу КЧС, проводили выделение клонов методом предельных разведений. Клетки Еысевали в культу-ральные микрспанели или микрочашки. При пслучении клоков клетки поддерживали в питательных средах, с повышенным i20%) содержанием сыворотки крови свиней, телят, KFC, а также в кондиционированных среда:?. Колонии переносили е микрочашки и пенициллиновые флаконы и культивировали е смеси кондиционированной и ростовой среды в атмосфере с содержанием CQg и температуре 37°С до формирования мснсслся. Полученную, культуру повторно реклонирогали. Клонированные культуры поддерживали методом последовательных пересевов с пересадкой клеток 2-3 раза 'в неделю.

Жизнеспособные клоны, прошедшие 10 и солее пассажей, контролировали на отсутствие вируса-контаминанта КЧС методом иммунофлу-

сресиенцпи. При культивировании с сывороткой крови овине:!, содержащей в высоких титрах антитела против КЧС', получено 104 .жизнеспособных клена, из них только два tlid и 191) оказались свс~ ссдны?.1и от в иг ус а контаминанта КЧС. Тшатель ныл контроль на отсутствие вируса-контаминанта КЧС проводили в течение 40 пассажей и подтвердили ко миссис нными испытаниями.

'2.2. лав?кт*онстпкя и стабилизация свойств клониоо-ванну:: неточных популяций, полученных из культуры клеток ШК-бсб и свободных от персистирующего вируса КЧС Ííopsc динамику формирования монослоя культур клеток ППК-114(Д) и ППЕ-iyi' Л) издали на разных уровнях пассажей, отдельных циклах культивирования. Установили, что в сопоставимые сроки выращивания клетки ГШК-i 14(Д) и ППК-19'lí Д) характеризовались одинаковой морфологией и проявляли равные ростовые свойства. Монсслой культур Формировали однородные мелкие эпителиоподссные клетки полигональной Фермы, местами растущие е деэ слоя. Клетки имели округлые ядра с крупнозернистой структурой и 1-2 ядрышкам!. Е цитоплазме часто обнаруживали вакуоли различных размеров. Родительская культура ПШ-ббб имела аналогичную морфологию. Кариологическими исследованиями установили, что размах варьирования числа хромосом Е клетках ППК-114(Д) варьирует от 54 до 60, модальный класс 57%, в клетках ППК-19КД) варьирует от 53 до 57, модальный класс 60Z.

Маркерные хромосомы - дополнительный большой метацентрик с измененной 6 - сегментацией длинного плеча, метацентрик с "с разрывом" - характерные для исходной родительской линии ППК-ббб.'

Еноеь полученные клоны культивировали в среде 0,25% ФГМ с добавлением 7-8% сыворотки крови; телят. Затем провели адаптацию к культивированию в отечественной питательной среде с добавлением

более дешевых ростоеых компонентов - сывороток крови КРС и свиней. При изучении ростоеых свойств клонов клеток ППК-114 и ППК-191 установили, что при коэффициенте пересева 1:2 -1:4 мо-нсслси формируется на 2-3 сутки, а индекс пролиферации варьировал в пределах 3,8-4,0. Сроки переживания культур клеток зависели от клона, температуры, характеристик питательной среды и составили от у до 16 суток. Урожай клеток клона ППК-114(Л) составил' 32.S±i.54. клена ППК-19КД) - 32,2511,34 млн клеток е литровом матрасе. ЛеконтаминирсЕанкые культуры на разных уровнях пассажей 110-70; и 3-х циклах культивирования сохранили присущие им трсфи-M^nL-ттс, nQf-i^Qüt-jCi г; t^^-jjojTQpjjTjaQ^TT^ свойства что свидетельст°ует 4v стабильности. После хранения в 2С1дком азоте (минус 196 С) и температуре минус 70°С культуры клеток ППК-114( Л) иППК-1911'Д) восстанавливав исходные ростовые и морфологические свойства за £-3 последовательных пассака.

Адаптацию к глубинному способу выращивания проводили в 0,5 л вращающихся флаконах и 5 л ферментере фирмы "NBS". Безопорное культивирование клеток ППК-1141Д) и ППК-191(Л) осществляли в среде 0,5% ФГМ на растворе Эрла с дсбавлением 0,06% глутачина и 10% сыворотки крови КРС в периодических суспензионных культурах с частичной (отъемно-долиЕным методом) или полной (методом центри-фугороЕания) сменой среды при соблюдении значений параметров жизнеобеспечения, ранее разработанных исследователями ВНИИВВиМ для культуры клеток ППК-ббб. Процесс адаптации для клона ППК-19КД) проходил за 5-6 пассажей. Культура клеток ППК-114(Д) обладала меньшей способностью роста в суспензии. При посевной концентрации 220-250 тыс. кл/'мл в первом пассаже культура клеток ППК-19КД) давала на 2-3 сутки культивирования 1,5-2-кратный прирост, в пятом пассаже при посевной концентрации 250-300 тыс.кл/мл 2,5-3-кратный

прирост.

ЯекснтаминироЕакяую культуру клеток протестировали на отсутствие туморогенной активности по методике, предложенной МапсЦег. Гс1еу (1959). Установили, что клетки перевиваемой линии ППК-114( Д) туморогеиными свойствами не обладают.

2. 2. 4. Изучение Еирусрепродуцируюших свойств культуры ППК-666 и клонов, свободных от персистпруюшего ЕИруса КЧС

Вновь полученные клоны культур клеток резистентны к вирусу

КЧС.

В опытах по изучению репродукции шггопатогенных вирусов в мо-нослсинси культуре ППК-114(Д) после первых 3-х "слепых" последовательных пассажей титры вирусов составили: БА - 7,25+0,14; РТ -5,0+0.20; ВСО - 6,50+0,09 ТЕД /мл. Репродукция вирусов парагриппа и болезни Ньюкасла отсутствовала.

Дополнительные исследования по изучению иммунобиологических свойств показали, что у 1001 свиней однократное введение экспериментальных серий натиЕНЫх клеточно-культуральных лизатов мо-нослойного варианта культуры клеток ППК-ббб, содержащих вирус КЧС-контаминант в дозе 2,5-4,5 ККИД5(Умл, индуцируют устойчивость в вирулентному вирусу на 21 сутки после иммунизации.

Исследования показали, что в 2 мл (1 млн кл.) неразведенного клеточно-культурального лизата культуры клеток ППК-ббб содержится 31600 ШД или 3160 ИмД , то есть 10 инфекционных 50%-ных доз вируса соответствуют одной иммунизирующей дозе. ПестиЕирусный контачинант не обладал патогенными свойствами, что подтверждено , отсутствием реакции у зараженных свиней й течение 5 последовательных пассачсей.

Установлена высокая иммуногеннаэ активность пэрепетирующего впруоа-кентампнанта - титр БНЛт у свинеи на 21 день после иммунизации достигает 1.7 los .

Б Ь! Е о л ь;

1. Изучен персистирующии пестиЕируоныи контаминант культуры клеток ППК-ссс. который идентифицирован как вирус классической чумы свиней и обладает следующими свойствами: термслабилен, не лачинизирсван, репродуцируется в свиных клетках гемопоэтическсго и почечного происхождения >,ЛС, РК-15. ПКПС, ПСТК), устойчив к действию азитегемагглютинина ?, чувствителен к действию Еируснеит-рализуюшнх антител, обладает высокой иммуногенксй активностью и апатогенек для свинеи.

' 2. Получены из перснстентно-кснтаминпрованной линии ППК-ббб клоны клеток, ППК-ГШд) и Ш?'-1у1(Д), свободные от вируса классической чумы сЕинеи методом клонирования в присутствии специфических вируснейтрализующих антител.

:. Методом цитогенетического анализа клоны ППК-114С Д) и ПИК-19i f Д) идентифицированы как клеточные линии свиного происхо-дения, производные от исходной культуры клеток ППК-ббб.

4. Стабилизированы цитоморфологические, кариологические и культуральные свойства клонов ППК-114СД) и ППК-19КД) на протяжении 60-70 пассажей в стандартных условиях культивирования.

5. Разработан режим культивирования монослойных вариантов культур клеток клонов 114 и Ш е стационарных и'роллерных условиях: индекс пролиферации 3,8-4,0.

б.. Монослойный вариант клеток клона ППК-Ш(Д) адаптирован к суспензионному культивированию в отечественной среде 0,5% <1ГМ на солевом растворе Эрла с добавлением 107, сыворотки крови крупного

[

\ -19- .

рогатого скота и С.05% глутамика: к 5-му суспензионному пассажу отмечен трехкратный прирост клеток с конечной плотностью 1.2г0,3 млн кл/мл и жизнеспособностью до 90-97%.

7. Клетки переЕИнаемой линии ППК-114(Л) ту>юрогенностью не обладают.

3. Установлено, что клеточная система ППК-114(Д) является чувствительной для питопатогенных вирусов: болезни Ауески, ринот-рахеита кошек, везикулярного стоматита свиней. Титры вирусов в деконтаминированкой культуре составили: ЕА - 7.25+0.14; РТ -5.0+0.20; БОС - 5.5+0,09 ТПД /мл.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Деконтаминиреванные. стабилизированные и паспортизирован-

(

ные клоны клеток ППК-1ШД) и ППК-19К Д), имеющие широкий спектр чувствительности к вирусам различных таксономических групп (БА, ВСС, РТ) и используемые е НИР и изготовлении экспериментальных серий вакцин. Разработаны "Методические рекомендации по поддержанию и хранению клонов клеток ШЖ-566, свободных от контаминанта вируса классической чумы свиней", утвержденные директором ВНИИВ-ЕиМ 11.12. 91г. и создан банк посевного материала деконтаминиро-ванных культур (30 ампул с концентрацией 5-10 млн клеток заложены в жидкий азот (минус 196 С).

2. Способ деконтаминации перевиваемой культуры клеток свиного происхождения от персистирующего в ней вируса классической чумы свиней.

3. Схема дифференциации некоторых штаммов вируса классической чумы свиней.

ОпПСОК НАУЧНЫХ РАъОТ, ОБУБЛИКОгАЕНЫл ПО МАТЕРИАЛАМ ЯИССЕРТАДИИ

1. Исследование некоторых культур клеток по фактору пестиви-оуснои контаминации и их чувствительности к вирусу классической чумы свиней / Б. И. Чермашенцев, Е А. Чермашенцева, Б В Зуав 0. А. Витина, А. Е. Курносов /У Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВЕиМ, Покров, 1990.-С. 55-57. '

2. Чермашенцева Н. А. , Курноссн А. Ч. . Чермашенцев Б. И Изучение сиологических сеоисте пестивируса-кон^аминанта культурч клеток ППК-ссб //Вопросы Еетеринарной Еирусслогии, микробиологии и ячизеотологии: Тез. докл. науч. коко БНИИББнМ. Покров -С. 120-152.

3. Чермашенцева Е А. Клонирование перевиваемой лиини клеток

I (

ППК-656 с целью стандартизации пс фактору вирусной контаминации //' Вопросы Еетеринарной Еирусологии. микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИЕБиМ, Покров. 1990.- С. 132-133.

4. Чермашенцева Е А., Смыслова Е Ю. Морфологическое и карио-лсгическое изучение клонированных клеточных линий ППК-ббб, свободных от Еируса-конгашнанта классической чумы сЕиней // // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ЕНИИВВиМ, Покров, 1990.- С. 134-135.

5. Чермашенцев В. И., Чермашенцева а А., Рудсбельский Э..В. Способ получения сыворотки к Еирусу классической чумы свиней // Еспросы ветеринарной вирусблогии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 1990.- С. 166-169.

6. Разработка схем получения гипериммунных сывороток свиней для диагностики и профилактики классической чумы свиней / В. И. Чермашенцев, Е А. Чермашенцева, Э. В. Рудобельскйй, Г. А. Сафонов

/' Научные основы технологии промышл. производства вет.биспрепара-тсв: Тэг. докл. 4-И Есессюз. конф. !í, 1991. - С. 36-37.

.7. Разработка системы контроля активности :кивсй и инактиЕ.чро-ванной культурадьных Еакцин из аттенуированкого штамма ЛК-ЕНЙИВ-ЕиМ против классической чумы свиней / В. И. Чермашенцев, Г. A. Caco- , нов. Чермашениева Н. А. , Т. А. Калинина // Совершенствование мэтодое гос к^нтосля препаратов: Тез докл. Всессюз. конф. hi. , 1991. -0.51-53.

3. Чувствительность клонов Д-114 и 5-191 перевиваемой культуры клеток ППК-ббб к вирусам классической и африканской чумы свиней / \ ""рчапрнц—а. В. 3 Куринное В И. Чермашенцев, 3. В. Рудс-бельскип. В. A. Мни1анин // Еспрссы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. кснш. ВНИИВЕиМ. ПскрсЕ, 1992. - С. 37. '

v 9. Елияние различных условий культивирования на накопление вакцинного Еируса классической чумы свиней в культуре клеток / В. Г. Еитин, В. И. Чермашенцев". Э. В. Рудссельский, Е А. Леонтьева, Л. Е. ШеЕченкс, Н. А. 7-!ермашенцеЕа// Вопросы-Еетеринарнсй Еирусоло-гии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ВРЖВВиМ, ПокроЕ, 1992.- С. 121-127.

10. Чермашенцева Н. А., Чермашенцев В. И. . Леконта;,сшация перевиваемой культуры клеток ППК-ббб от персистируюшего Еируса классической чумы свиней /7 Вопросы гетеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВЕиМ. Покров, 1992. - С. 125-127.

11. Стандартизация клонов еублинии ППК-ббб по фактору контаминации вирусом классической чумы свиней / Е А. Чермашекцева, В. В. Куриннов, В. И. Чермашенцев, Э. В. Рудобельский, В. А. Мишанин, А.'ЕКурносов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и

эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ЕНИИЕЕиМ, покров. 1992. 0.127-123.

12. Чермашенцева Е А. . Стрельцов Л. , Чеомашенцев В' И. Р°ч родукция цитспатогенных еируоов в перевиваемой культуре клефо ШШ-Д-114 // Вопросы ветеринаркой вирусологии, микробиологии эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. БНИИЕЕиМ, Покров. . 1992. С. 131-132.

'3. ^омашенц^ва Н. А * Курносов 'V Е Изучение сло^сб^ост клеток клоноб ППК-Я 111 и ППК-д 191 к безспсо-нсму способу выращи роипа / / ЕопрССЬ! ВетерИНаГНОЙ вирусологии микробиологии и зп'/со стслогки: Тез. докл. науч. коне. БНИКББиМ, Покров, 1992. - С. 236.

• ^ ^ермасенцева Н. Изучение стабильности и оцеч1'*0 рос^^^ ^с счет в клонов клеток. ° 3000 от вируса-конф^мннэчф° кла^^и ческой чумы свиней //' Еопросы Еетеринарной вирусологии. микробио логии и ' эпизоотологии: Тез. докл. науч. конф. ЕНИИЕЕиМ, Покров 1992. - С. 237-288.

15. Биологические свойства гируса классической чумы свиней хронически инфицирующего культуру клеток / В. В. Куриннов, И. Ф. Вии няков. Л Л ЧерятникоЕ. Е А. Чермашенцева, А. Д. Петрзчев, Л. Я. Олей кик, С. Г. ЯркоЕ /7 Актуальные вопросы Еетеринарной вирусологии Тез. докл. науч. конф. ВНИИВЕиМ. - Покрои, 1995.- С. 5-6.

16. Сравнительное цитогенетическое изучение нескольких кле точных линий свиного происхождения с различной чувствительность к вирусу классической чумы свиней / С. А. Витина, С. Д. Кушнир Е Ю. Смыслова, Е А. Чермашенцева, С. Г. Юрков // Актуальные вопрос ветеринарной вирусологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВЕиМ. - Покров 1995.- С. б.

17. Чермашенцева Е А., Еитин Е Г. , Чермашенцев Е И. Дифферен циация некоторых штаммов вируса классической чумы свиней // Акту

альные вопросы Еэтеринарной вирусологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИ-ИЕЕиМ. ~ Покосе, - С. 2.

18. Чермаиенцева Е А. , Еитин В. Г. , Чермашенцез Е И. Культура свиных макроаагов как модель при изучении иммунитета против классической чумы свиней /'/ Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВЕиЕ - ПокроЕ, 1955.- С. 73.

19. Чермашенцева Е А. , Еитин В. Г. , Чермашенцев В. И. Феномен антителсзавпсимого усиления КЧС-иншекции // Актуальные вопросы вэт^ринагчои вирусологии: Тез. докл. науч. ксно. ЕНИИБЕиМ. - Пскрсв, 1995 - 0. г'3-74

20. Оценка некоторых биологических свойств штаммоЕ вируса болезни Луески / Е. Я. йестерев. В. Л. Ошанин, Р. Е. Кошелева, В. И. Еалы-дева, Н. Л. Чермашенцева, С. Г. ¡Оркое, Н. Б. Исакова // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Тез. докл. науч. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995,- С. 131-132.

21. Накопление вируса КЧС в культуре лейкоцитоЕ сЕИней / С. Г. ЮркоЕ, Б. К. Чермашенцев, А. Е Курносов, В. В. Куриннов, Е А. Чермашенцева, В. А. Мишанин //' Вирусные болезни с.-х. .тавотных: Тез. докл. Всерсс. науч. -прак. конф. - Владимир, 1уу5. - С. 33.

22. Суспензионные культуры клеток жиеотных е ветеринарной вирусологии / А. Е Курносое, С. Г. Юрков, Б. Е Опарин, С. Е Гаврилов, С. А. Витина, Е А. Чермашенцева /V Вирусные болезни с.-х. животных: Тез. докл. Всерос. науч. -прак. конф. - Владимир, 1995. - С. 103.