Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение, стабилизация и биологические свойства культур клеток тканей диких животных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение, стабилизация и биологические свойства культур клеток тканей диких животных"

УДК: 619:573.6:578

На правах рукописи

/

Филатов Алексей Владимирович

Получение, стабилизация и биологические свойства культур клеток тканей диких животных

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Покров - 2008

003458951

Работа выполнена в Государственной научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Юрков Сергей Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Ночевный Виктор Тимофеевич

кандидат биологических наук Балашова Елена Алексеевна

Ведущая организация: ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» МСХ РФ

Защита состоится 22 января 2009 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 601120, г. Покров Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (49243)62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 'Ю декабря 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Савукова В.Я.

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы

Развитие методов получения, культивирования и хранения культур клеток различных типов обусловило их широкое применение при изучении биологии клетки в генетике, вирусологии и биотехнологии.

В последнее время в клеточной биотехнологии отчетливо прослеживается тенденция нарастания роли перевиваемых линий клеток, созданы крупные банки и национальные коллекции аттестованных клеточных культур. Тем не менее, в каждом конкретном случае необходим обоснованный выбор клеточных систем определенного типа, наиболее отвечающего целям и задачам планируемого эксперимента.

Несмотря на достигнутые успехи, связанные с применением перевиваемых линий клеток, для ряда вирусных инфекций не найдены адекватные стандартные биологические модели изучения и накопления вируса in vitro (вирус геморрагической болезни кроликов, вирус артрита-энцефалита коз) (Бакулов И.А. и др., 1992; Жестерев В.И. и др., 1997; Mselli-Lakhal L. et al., 1999).

В связи с этим проблема поиска новых пермиссивных к вирусам стабильных клеточных систем различного видового и тканевого происхождения, несомненно, является актуальной (Новохатский A.C., 1990).

Успешный опыт использования при производстве вакцин перевиваемых линий клеток почки сайги ПС (Вишняков И.Ф., 1994; Анисимова Л.И. и др., 1998), клеток почки африканской зеленой мартышки VERO (Шафеева P.C. и др., 1994; Фомин К.Ю. и др., 1995) и CV-1 (Вишняков И.Ф. и др., 1997) свидетельствует, что ткани диких животных - перспективный источник получения новых клеточных систем.

Цель и задачи исследований

Цель - получение новых стабильных линий клеток тканей диких животных, изучение их биологических свойств и определение возможности использования в вирусологии и биотехнологии.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

\

/

1. Изучить цитоморфологические и ростовые характеристики субкультур клеток диких животных средней полосы России, имеющихся в музее ГНУ ВНИИВВиМ.

2. Получить стабильные культуры клеток из наиболее перспективных субкультур клеток диких животных и изучить их биологические свойства.

3. Исследовать чувствительность данных линий клеток к ряду вирусов -возбудителей опасных болезней с/х животных.

4. Установить видовую принадлежность расплодок клеточных культур из ткани почки сибирского горного козерога, имеющихся в музее культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ.

5. Клонировать клетки ПСГК и изучить биологические свойства отобранных клонов. Получить биотехнологичные штаммы клеток и провести аттестацию по основным показателям.

Научная новизна результатов

1. Получена и охарактеризована новая линия клеток из тканей легкого эмбриона благородного оленя Cervus elaphus ЛЭО-Об.

2. Получена и охарактеризована новая культура из тканей кожи эмбриона лося Alces alces КЭЛ/07.

3. Установлена первичная контаминация культуры клеток почки сибирского горного козерога клетками свиного происхождения на уровне первых 16 пассажей и все сублинии ПСГК, поступившие из различных научных учреждений в музей культур клеток ГНУ ВНИИВВиМ, в видовом отношении относятся к Sus scrofa.

4. Получен и охарактеризован новый клон перевиваемых свиных гетеро-плоидных клеток ПСГК-60/cl, относящийся по видовому происхождению к Sus scrofa.

Практическая значимость работы

1. Паспортизированы новые культуры клеток ЛЭО-Об и КЭЛ/07, полученные из тканей диких животных, а так же клонапьная линия клеток ПСГК-60/с1. Созданный криобанк полученных и стабилизированных культур клеток обеспечит дальнейшие долгосрочные исследования.

2. Культура клеток ЛЭО-Об рекомендована для научно-исследовательской и диагностической работы с вирусом артрита-энцефалита коз.

3. Клональная линия ПСГК-60/cl рекомендована и с успехом применяется в качестве клеточного субстрата в научно-исследовательской и производственной работе и при получении вакцинных препаратов против блютанга, болезни Тешена и классической чумы свиней.

4. Разработанные и утвержденные (20.06.08) методические рекомендации регламентируют поддержание и хранение полученных новых культур клеток тканей диких животных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Культуральная, цитоморфологическая, кариотипическая характеристика и чувствительность к вирусам культуры клеток легкого эмбриона благородного оленя Cervus elaphus ЛЭО-Об.

2. Культуральная, цитоморфологическая, кариотипическая характеристика и чувствительность к вирусам культуры клеток кожи эмбриона лося Alces alces КЭЛ/07.

3. Культуральная, цитоморфологическая, кариотипическая характеристика и чувствительность к вирусам клональной линии перевиваемых свиных ге-тероплоидных клеток Sus scrofa ПСГК-60/cl.

Апробация и публикация результатов исследований

Основные положения диссертационной работы отражены в итоговых отчетах ГНУ ВНИИВВиМ за 2005-2007 гг. по теме Россельхозакадемии 08.01.03.06 "Поддержание и развитие коллекции клеточных культур для научных исследований, диагностики и биотехнологии противовирусных препаратов". Материалы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2005-2007 гг.), а также на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных» в ГНУ ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (Москва, 2006 г.). По теме диссертации опубликовано 5 статей, из них две статьи в журналах, определенных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах, иллюстрирована 18 рисунками, 3 таблицами и дополнена приложениями. Список литературы включает 229 источников, из которых 130 - отечественные.

Личный вклад

Основная часть диссертационной работы выполнена автором самостоятельно. Изучение чувствительности полученных культур клеток к вирусам различных таксономических групп проведено совместно с сотрудниками ГНУ ВНИИВВиМ, за что автор выражает искреннюю благодарность В.И. Балыше-вой, Т.Ф. Горшковой, Н.И. Закутскому, Л.Д. Конаковой, А.А. Шишковой, А.А. Стрижакову, А.Ю. Чичикину, И.Ю. Волковой, М.В. Болтовой, Е.А. Румянцевой, М.Б. Новиковой, О.М. Стрижаковой, В.М. Лыска, А.В. Луницину, О.В. Белун.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

Культуры клеток. В работе использованы субкультуры клеток, выделенные из тканей диких животных средней полосы РФ: почки дикого кабана (ПДК, заморожены 21.05.1987г., 9 пассаж); легкого эмбриона лося (ЛЭЛ, 10.01.1986г., 10 пассаж); легкого эмбриона оленя (ЛО, 27.07.1989г., 9 пассаж); кожи эмбриона лося (КЭЛ, 13.12.1985г., 3 пассаж и 22.04.1986г., 23 пассаж). Линия перевиваемой культуры клеток ПСГК (катал. № 25), в том числе ранние закладки (Почка козерога - 1978 г.).

Вирусы. Все штаммы вирусов, использованные в работе, получены из лаборатории «Музейных штаммов» ГНУ ВНИИВВиМ: вирус классической чумы свиней, вакцинный штамм «ЛК-К» (титр 5,0 ККИД50/см3, инв. № 2517); вирус болезни Тешена, вакцинный штамм «Закарпатский» (титр 7,5 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 1790); вирус блютанга: штамм ВТ 8 (8 серотип) (титр 5,0 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 1150), штамм AV - 1855 (8 серотип) (титр 5,75 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 1312), штамм 617 (14 серотип) (титр 6,5 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 617), штамм 874 (2 серотип) (титр 6,25 lg ТЦ Д50/см3, инв. № 185); вирус болезни Ау-ески, штамм МК - 25 (титр 6,25 lg ТЦД50/см3, инв. № 457); вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), штамм 426 (титр 5,0 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 426); вирус чумы мелких жвачных (ЧМЖ), вакцинный штамм «45G37/35-К/ПС» (титр 5,0 lg ТЦД5о/см3, инв. № 2654); вирус болезни Найроби, штамм «ММ/К-05», адаптированный к перевиваемой линии клеток (ПЛК) ПС (титр 6,2 lg ТЦЦ50/см3, инв. № 2589); вирус инфекционного ринотрахеита КРС (ИРТ КРС), штамм "ТК-А" (титр 6,5 lg ТЦД50/см3, инв. № 2495); вирус парагриппа-3

КРС, вакцинный штамм "ПГ-3" (титр 6,5 lg ТЦД5о/см\ депон. ВГНКИ инв. № 2496); вирус диареи КРС (BVD), штамм Орегон CV24 _ v (титр 4,5 lg TLW50/cm3); вирус оспы овец, вакцинный штамм Б-5/96 (клонированный вариант штамма НИСХИ) (титр 5,5 lg ТЦЦ50/смЗ, инв. № 2318), вирус артрита-энцефалита коз (АЭК), полевой изолят, кровь коз (Тверская область, 2004г.).

Питательные среды: среда Игла MEM с добавлением L-глутамина (292 мг/л среды), приготовленная из сухих форм препаратов фирмы "HyClone" (США) и фирмы "Sigma" (США) с незаменимыми аминокислотами. Среда Dulbecco's MEM фирмы "Flow laboratories" (Шотландия), RPMI-1640 фирмы " SIGMA-ALDRICH" (Германия).

Сыворотки: фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота (КРС) фирм "Sigma" (США), "HyClone" (США), "GIBCO" (США), "Himedia" (Индия); сыворотка крови КРС, необработанная и обработанная полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000; сыворотка крови новорожденных телят, полученная от доноров 1-4 дневного возраста; сыворотка крови северного оленя; ам-ниотическая жидкость северного оленя.

Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, гентамицин, мономицин, цеф-триаксон); препараты группы фторхинолонов (пефлоксацин, ципрофлоксацин)

Методы. Культуры клеток поддерживали общепринятым методом последовательных пересевов в соответствии с "Инструкцией по приготовлению питательных сред и культур клеток" (Курносов А.Н. и др., 1978).

Для морфологического изучения, культуры выращивали на покровных стеклах, фиксировали в растворе Буэна и окрашивали гематоксилином-эозином. Для кариологического анализа препараты готовили стандартным методом (Голубев и др., 1976) с последующей окраской 2%-ным водным раствором Гимза (Мамаева, С.Е., 1988; Ford С.Е., Hamerton J.L., 1956). Препараты исследовали при помощи световой микроскопии и проводили подсчет числа хромосом в метафазных пластинках.

Титрование вируса КЧС проводили при помощи реакции иммунофлуо-ресценции (МФА), согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике КЧС» № 13-2/809, утвержденным Департаментом ветеринарии 30.12.1996, и с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА), согласно временному наставлению по применению "Набора препаратов для

иммунопероксидазных реакций при КЧС", утвержденному директором ВНИ-ИВВиМ от 12.08.1995. Инфекционную активность вирусов других таксономических групп определяли по цитопатическому эффекту. Титр вируса вычисляли по Риду и Менчу и выражали в логарифмах клеточных культуральных инфекционных дозах (ККИД50), тканевых цитопатических дозах (ТЦД50) в зависимости от метода титрования вируса.

Контроль на отсутствие контаминации расплодок клеток, питательных сред, сывороток крови, растворов и других компонентов осуществляли путем высева в питательные среды: мясопептонные агар и бульон, Китта-Тароцци, тиогликолевую, агар и бульон Сабуро. Первые четыре среды инкубировали при температуре 37°С, последние две - при комнатной температуре в течение 14 дней.

Контроль контаминации клеточных культур микоплазмами проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на базе лаборатории «Бактериологии» (к.в.н. Егорова И.Ю.) с использованием коммерческого набора «Мик-ком».

Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами, используемыми в биологии (Лакин, 1990).

2.2. Результаты собственных исследований 2.2.1. Культуры клеток из тканей диких животных

В 80-е годы XX века Зуевым В.В. во ВНИИВВиМ в результате трипсини-зации тканей различных диких животных средней полосы России, как взрослых, так и их плодов на разных сроках беременности были выделены и суб-культивированы клетки, которые на ранних пассажных уровнях криоконсерви-рованы в жидкий азот.

На начальном этапе работы целью исследований явилась оценка банка субкультур диких животных на наиболее низких пассажах, как правило, независимо от ранее полученных в лаборатории результатов. Имелось в виду, что установление стабильного клеточного штамма или линии клеток индивидуально и многофакторность этого процесса оказывает существенное влияние на биологические характеристики культивируемых клеток, включая и пермиссив-ность к вирусам.

2.2.1.1. Культура клеток почки дикого кабана

Субкультуру клеток почки дикого кабана восстанавливали после 18 лет хранения в условиях жидкого азота. Концентрация жизнеспособных (трипан-синьнегативных) клеток после дефростации находилась в пределах 75-80%. Содержимое ампулы ресуспендировали в питательной среде Игла MEM с добавлением 5% фетальной сыворотки крови КРС с посевной плотностью 80 тыс. клеток/см3. Тем не менее, через 24ч инкубирования прикрепившихся к субстрату клеток не обнаружено. Находящиеся во взвеси клетки и в последующие дни культивирования не адгезировались и прогрессирующе отмирали.

Полученные результаты показали, что, несмотря на высокий процент жизнеспособности клеток культуры по тесту витального окрашивания трипа-новым синим, отмечено отсутствие адгезии клеток. Следовательно, окончательное заключение о жизнеспособности клеточной популяции необходимо делать после восстановления культурой паспортных цитоморфологических и ростовых характеристик.

Таким образом, восстановить клетки почки дикого кабана не удалось, так как в музее ГНУ ВНИИВВиМ имелась только 1 ампула данной субкультуры.

2.2.1.2. Культура клеток легкого эмбриона лося

В исследованиях по получению стабильной линии использовали 4 ампулы клеток субкультуры легкого эмбриона лося, замороженные на 10 пассаже. После восстановления, конфлюэнтный монослой клеток образовывался через 72 часа. Клеточный пласт формировали плотно прилегающие друг к другу фибробластоподобные элементы. Для поддержания культуры использовали питательную среду Игла MEM с 5 и 10 % фетальной сыворотки крови КРС "HyClone".

При пассировании этих клеток с использованием смеси версена и трипсина в различных соотношениях, или только одного из диспергентов при t = 37°С наблюдали отслоение монослоя клеток «чулком». Несмотря на энергичное встряхивание и (или) более длительное время экспозиции монослоя с диспергирующими растворами образовывались достаточно крупные конгломераты клеток. При дальнейшем пассировании именно клетки конгломератов, осев и прикрепившись, за счет пролиферации периферических клеток и их миграции

формировали звёздчатые очаги роста. Через 5-7 суток культивирования отмечали образование сплошного монослоя клеток.

Данные клетки удалось пассировать на протяжении не более 10 пассажей. В дальнейшем рост и размножение замедлялись, и клетки не формировали конфлюэнтный монослой, отмечалось старение клеток с последующей их дегенерацией, характерной для диплоидных штаммов на предельных для этого типа клеток пассажных уровнях культивирования. Спонтанной трансформации не произошло. Добавление 10 - 30% кондиционированной среды, подвергнутой стерилизующей фильтрации, от ПЛК почки теленка MDBK и ПСГК не принесло положительного эффекта. Использование повышенного процентного содержания сыворотки крови плодов коров и сывороток других видов животных (северного оленя, свиньи) так же не повышало пролиферацию данных клеток.

2.2.1.3. Культура клеток легкого эмбриона оленя

Эксперименты по спонтанной трансформации клеток субкультуры легочной ткани эмбриона благородного оленя (Cervus elaphus) проводили с использованием различных питательных сред (Игла MEM и RPMI 1640) и сывороток крови (фетальная КРС, северных оленей). Добавление сыворотки осуществляли в разных процентных вариациях. В результате исследований оттаяно 5 ампул культуры клеток. В четырех опытах наблюдали схожую динамику восстановления клеток после низкотемпературного хранения.

После подсчета клеток суспензию ресуспендировали в ростовой питательной среде и переносили в стеклянные матрасы с посадочной концентрацией 130-150 тыс. кл./см3. Жизнеспособность клеток после размораживания по тесту витального окрашивания трипановым синим, составляла 75-85%.

Через 2 часа наблюдали адгезию клеток на субстрате, а через 24 ч активную пролиферацию распластавшихся клеток. Для удаления остаточного количества криопротектора, клеточного детрита и не прикрепившихся клеток производили смену ростовой среды.

Через 72-96 ч после размораживания клетки образовывали плотный монослой фибробластоподобных клеточных элементов. Пересев культуры осуществляли с помощью теплой смеси 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 3:1 с коэффициентом пересева -1:1.

Время образования конфлюэнтного клеточного монослоя после 2-го пассажа удлинялось до 5 - 6 суток, отмечали увеличение линейных размеров клеток. При дальнейшем пассировании сроки формирования монослоя увеличивались до 10 и более дней, а после 6-8 пассажа наблюдался островковый рост клеток, без образования сплошного пласта. В морфологии клеток отмечали увеличение вакуолизации цитоплазмы, стертость границ, в дальнейшем происходило старение клеток с явлениями апоптоза и последующей их дегенерацией.

В пятом опыте восстановление клеток происходило следующим образом - на 5 пассаже срок формирования монослоя клеток составлял 7 суток. На протяжении следующих 6 пассажей время образования монослоя оставалось постоянным (170 ч), пассирование осуществляли без увеличения площади куль-турального сосуда (с коэффициентом пересева 1:1).

В одном из матрасов, при использовании питательной среды Игла MEM с 10 % фетальной сыворотки крови КРС, был отмечен повышенный уровень пролиферативной активности культивируемых клеток в сравнении с предыдущими опытами. Начиная с 11 пассажа после размораживания, эту субпопуляцию клеток пересевали с коэффициентом 1:2. Срок формирования монослоя на уровне 15 пассажа составлял 4 суток.

Последующее наблюдение показало, что данная культура клеток обладает стабильными ростовыми свойствами, однородностью популяции. Отмечено существенное снижение зернистости цитоплазмы клеток в сравнении с предыдущими опытами и этой же культуры на более ранних пассажных уровнях. Таким образом, в результате пяти опытов, предпринятых по получению стабильной культуры из легочной ткани благородного оленя, для дальнейшего изучения была отобрана субпопуляция клеток ЛЭО-Об.

Экспериментальным путем определены условия культивирования клеток ЛЭО-Об. Для поддержания культуры (пассирования) использовали питательную среду Игла MEM с добавлением 10% фетальной сыворотки крови КРС фирмы «HyClone». Пассажи клеток осуществляли с интервалом 3-4 дня. Посадочную концентрацию клеток поддерживали на уровне 60 - 80 тыс/см3. Монослой формировался через 72 ч. В дальнейшем уплотнения клеток не происходило. На 6 - 7 сутки, как правило, клетки формировали разнонаправленные

потоки. Без смены среды монослой сохранялся не менее 3-х недель. Урожай клеток с 1-литрового матраса составлял 17 - 23 млн. клеток. Индекс пролиферации равнялся 2-2,5.

Цитоморфологические исследования, проведенные на уровне 30 пассажа, показали, что культуру ЛЭО-Об представляют прозрачные клетки фибробла-стоподобного типа. Границы клеток четко различимы. Встречались адгезиро-ванные, но не распластавшиеся, так называемые, покоящиеся клетки.

Непрерывное культивирование методом последовательных пересевов культуры клеток ЛЭО-Об осуществляли в течение 6 месяцев. На протяжении всего периода наблюдения (40 пассажей) клетки сохраняли стабильные ростовые и цитоморфологические свойства.

Кариологический анализ линии клеток ЛЭО-Об на уровне 53 пассажа показал, что интервал варьирования хромосом в клетках составляет 55-117, модальное число не выражено. Диплоидный набор хромосом (2п = 70) сохранили менее 10% исследованных клеток (рис. 1). В кариотипе преобладают акроцен-трические хромосомы (рис 2). В дальнейшем отмечено незначительное изменение интервала варьирования без выраженного модального класса.

6 л 5 •

число 4 -3 -

2 1 -0

lililí

Ii

число хромосом

Рис. 1. Гистограмма распределения числа хромосом в перевиваемой линии клеток ЛЭО-Об, 53 пассаж.

Рис. 2. Кариотип культуры клеток ЛЭО-Об, 53 пассаж, окраска по Гимза, х 1000

Исследование чувствительности культуры клеток ЛЭО-Об показало, что размножение вируса ИРТ КРС (штамм "ТК-А") сопровождалось развитием четкого цитопатического эффекта через 48 часов после заражения. Накопление вируса в культуре клеток ЛЭО-Об составило 6,5 lg ТЦД50/см3 при титровании вируссодержащего материала в культуре клеток MDBK.

Отмечена низкая вирусрепродуцирующая способность данных клеток в отношении вирусов парагриппа-3 и диареи крупного рогатого скота (BVD).

По результатам исследований, проведенных на базе лаборатории «Эпизоотология», перевиваемая линия клеток легкого эмбриона оленя ЛЭО-Об выбрана в качестве тест-системы для работы с вирусом артрита-энцефалита коз (АЭК). Пермиссивность культуры клеток ЛЭО-Об к вирусу АЭК определяли путем внесения в плотный монослой клеток лейкоцитов периферической крови больной козы. Накопление вируса АЭК определяли постановкой ПЦР с использованием специфичных праймеров, комплементарных последовательности gag-гена вируса АЭК, полученных из GenBank.

При изучении особенностей репродукции медленных и персистирующих вирусов в качестве лабораторных моделей используют хронически инфицированные культуры (ХИК). Примером ХИК, нашедшей широкое применение в исследованиях по изучению различных аспектов взаимодействия системы клетка-вирус, является культура клеток почки овцы FLK, хронически инфицированная вирусом лейкоза КРС (BLV) (Wagner H.J. et al., 1995; Buzala E. et al., 2003; Rhim J.S. et al., 2008).

Вирус АЭК, как и вирус лейкоза КРС, относится к семейству ретровиру-сов, поэтому моделирование персистентной инфекции вируса АЭК в культуре клеток легкого эмбриона оленя представляется обоснованным и актуальным. С этой целью, путем сокультивирования клеток ЛЭО-Об с лейкоцитами больной артритом-энцефалитом козы получена клеточная система ЛЭО/АЭК. Данный штамм поддерживали методом последовательных пересевов с интервалом 3-4 дня на протяжении 12 пассажей, в течение которых изменений морфологии клеток и ростовых свойств не отмечали. Результаты ПЦР-анализа показали наличие вируса артрита-энцефалита на уровне 7-го пассажа. Для дальнейших вирусологических исследований данной медленной инфекции создан криобанк хронически инфицированной культуры ЛЭО/АЭК.

Таким образом, в результате проведенных исследований получена новая стабильная культура клеток легкого эмбриона оленя ЛЭО-Об (табл. 1). По ци-томорфологическим, культуральным свойствам и данным кариологического анализа культура клеток характеризуется как перевиваемая линия. Клетки ЛЭО-Об депонированы в коллекции клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ. Составлен паспорт на данную культуру и методические рекомендации по культивированию и хранению клеток, которые утверждены директором института (20.06.08).

2.2.1.4. Культура клеток кожи эмбриона лося

Исследования по получению перевиваемой линии клеток кожи эмбриона лося столкнулись со сложностью из-за контаминации восстанавливаемого, после длительного хранения в жидком азоте клеточного материала.

После оттаивания и подсчета клетки ресуспендировали в питательной среде Игла MEM в концентрации 120-150 тыс. кл./мл. При восстановлении данных закладок использовали сыворотку крови КРС взрослых животных и фетальную в количестве 5 и 10%. Через 2 ч после оттаивания и инокуляции наблюдали прикрепление и распластывание клеток. Через 24 ч производили смену ростовой среды. Клетки медленно пролифелировали и к 6-7 суткам образовывали монослой. В процессе роста культуры отмечали сдвиг рН в кислую сторону. На уровне 2-3 пассажа наблюдали образование окон в монослое клеток, характерное для микоплазменной контаминации. Методом ПЦР подтверждено наличие микоплазм-контаминантов.

При деконтаминации данных клеток использовали антибиотики: пенициллин (100 - 200 ЕД/мл), стрептомицин (100 - 150 мкг/мл), гентамицин (100 -200 мкг/мл); препараты группы фторхинолонов: пефлоксацин (20 - 32 мкг/мл), ципрофлоксацин (10 - 20 мкг/мл). Положительный результат достигнут при многократном переосаждении клеток (до 5 раз) центрифугированием (1000 об/мин) в среде с повышенной концентрацией ципрофлоксацина и последующим ресуспендированием клеток с низкой посевной плотностью (20 - 30 тыс. кл./см3) в присутствии того же антибиотика и 10% сыворотки КРС на протяжении 5 пассажей.

Полученная деконтаминированная культура клеток на протяжении первых 6 пассажей после восстановления характеризовалась низкими ростовыми свойствами. При дальнейшем пассировании оболочка клеток приобрела более четкие очертания, в цитоплазме клеток появилась зернистость. Сроки формирования монослоя с 7 дней уменьшились до 3. Без смены среды культура переживала 14 дней с сохранением цитоморфологических характеристик (без образования окон и цитопатического эффекта).

С целью повышения пролиферативных характеристик культуру клеток кожи эмбриона лося перевели на выращивание в питательной среде DMEM с добавлением 10 % сыворотки крови КРС, при pH = 7,2-7,4.

После проведения деконтаминации и стабилизации ростовых и морфологических характеристик (23-33 пассаж) культура прошла 50 пассажей.

Оптимальная посадочная концентрация клеток установлена в пределах 70-80 тыс. кл./см3. Конфлюэнтный монослой клеток формировался через 72 часа. В дальнейшем клетки образовывали ярко-выраженные потоки. Экспериментальным путем оптимальным определено соотношение диспергентов вер-сен/трипсин -3:1.

Цитоморфологические исследования нативных и окрашенных гематоксилин-эозином препаратов показали, что культура клеток кожи эмбриона лося КЭЛ/07 представлена фибробластоподобными клеточными элементами, имеющими одно ядро.

Кариологический анализ клеток КЭЛ/07 показал, что число хромосом в клетках варьирует от 57 до 70. Модальное число представлено клетками

(2п=68-70) с 63 хромосомами (рис. 3), составляющими в популяции 21%. В ка-риотипе преобладают акроцентрические хромосомы (рис. 4).

57 60 61 62 63 64 65 66 67 68 70

число хромосом

Рис. 3. Гистограмма распределения числа хромосом в перевиваемой линии клеток КЭЛ/07, 60 пассаж.

я . • - 1 ш

р*: » « С

* Ъг «5 * ■V», ■■■■ .•.....■ ■ - У " ■ \ - ,' ■ ■ "' Г ■ : . у* V.. Щ # 1 *

J_.pl

Рис. 4. Метафазная пластинка клетки модального класса перевиваемой линии клеток КЭЛ/07, 60 пассаж.

Изучение чувствительности культуры клеток КЭЛ/07 к вирусам различных таксономических групп показало:

- репродукция вируса чумы мелких жвачных (ЧМЖ) сопровождалась четким гроздевидным цитопатическим действием (ЦПД). На 4-5 сутки поражение клеток монослоя достигало 90%. Титрование вирусного материала, прошедшего 4 пассажа в клетках КЭЛ/07, проводили в перевиваемой линии ПС. Титр вируса составил 4,5 ТЦД50/см3.

- на первом пассаже вирус ВУБ (штамм Орегон СУ24 - V ,исх. активность 4,5 ТЦД50/см3) в культуре КЭЛ/07 вызывал цитопатическое действие,

титр активности полученного вирусного материала составил 3,5 ТЦД50/см3.

- на первом пассаже накопление вируса ИРТ КРС (штамм ТК-А, 5,5 ^ ТЦД5о/см3) в клетках КЭЛ/07 составило 4,5 ^ ТЦД50/см3. Отмечено развитие цитопатического действия, характерного для вируса ИРТ КРС.

Таким образом, полученная перевиваемая линия клеток КЭЛ-07 пермис-сивна к возбудителям чумы мелких жвачных, диареи крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и может быть использована в НИР при изучении вирусов различных таксономических групп. На основании проведенных исследований новая стабильная культура клеток кожи эмбриона лося - КЭЛ/07 (табл. 1) паспортизирована и депонирована в коллекции клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ. Разработаны методические рекомендации по культивированию и хранению данных клеток (20.06.08).

Таблица 1

Характеристика перевиваемых линий клеток ЛЭО-Об и КЭЛ/07

Показатели ЛЭО-Об КЭЛ/07

Среда культивирования Игла MEM с 10% фетальной сыворотки ЭМЕМс 10% сыворотки КРС

Индекс пролиферации 2 2

Посадочная концентрация 60-80 тыс. кл./см3 70-80 тыс. кл./см3

Срок формирования монослоя 3-4 суток 2-3 суток

Срок переживания монослоя 21-25 суток без смены среды 21 сутки без смены среды

Морфология Фибробластоподобные клетки с мелкозернистой цитоплазмой Фибробластоподобные клетки с зернистой цитоплазмой

Интервал варьирования числа хромосом 55-117 57-70

Модальный класс не выражен 63

Величина модального класса - 21%

Чувствительность к вирусам ИРТ КРС, АЭК ЧМЖ, оспа овец, ИРТ КРС, ВУО

2.2.2. Культура клеток ПСГК

В отечественной ветеринарной вирусологии и биотехнологии широкое применение нашла перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога. В то же время в ряде исследований установлен факт межвидовой контаминации данной клеточной культуры клетками свиного происхождения (Кос-тюченко В.Г. и др., 1985; Смыслова Н.Ю. и др., 1996).

Перевиваемая линия клеток ПСГК получена в 1976 году И.Г. Кекух, Л.П. Кирюхиной, З.М. Лукьяновой в НИСХИ МСХ СССР и передана в ряд научных учреждений для дальнейшего изучения и использования, где получены трофо-варианты и сублинии данных клеток.

В связи с вышеизложенным, значительный научный интерес представляет вопрос о существовании линии клеток ПСГК, относящихся к виду Сарга sibirica, т.е. не подвергшейся перекрестной контаминации.

Анализ клеточного банка музея клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ показал, что в коллекции, наряду с линиями ПСГК, ПСГК-30, ПСГК-60, ПСГК-с60 и ПСГК-с85, депонирована культура клеток почки козерога на уровне 16 пассажа, которая является предшественников всех выше приведенных линий.

Проведенные исследования показали, что кариотип культур клеток ПСГК-60 и «почка козерога - 16 пассаж» по морфологическим признакам хромосом клеток двух сублиний практически не отличим друг от друга. В мета-фазных пластинках преобладали метацентрические хромосомы и всего 4-6 пар акроцентриков (распределение, характерное для рода Sus). Присутствие метацентрика с околоцентромерным неокрашенным участком также указывает на родство с линиями клеток свиного происхождения. Интервал варьирования числа хромосом в клетках культуры почки горного козерога от 51 до 61, модальное число 58 (его величина 16%).

Таким образом, среди всех исследованных сублиний клеток ПСГК культур клеток, относящихся к виду Сарга sibirica, не обнаружено. С достаточной точностью можно утверждать, что первичная контаминация клеток ПСГК клетками свиного происхождения имела место в лаборатории, где происходило получение и становление данного клеточного штамма на уровне первых пассажей.

Одним из требуемых критериев аттестации клеточных культур для производства биопрепаратов являются данные истории их происхождения и видовая принадлежность. Проведенные исследования не позволяют дать однозначный ответ о видовой однородности клеточной популяции ПСГК, так как теоретически можно предположить присутствие в линии доли клеток, относящихся к виду Capra sibirica.

С целью окончательного установления данной клеточной популяции, как клеток свиного происхождения, а так же для повышения уровня генетической однородности линии и, следовательно, стандартности проявления биологических свойств, проведено клонирование клеток культуры ПСГК-60.

Клонирование культуры клеток ПСГК-60 проводили методом предельных разведений (Puck Т.Т. et al., 1956). Суспензию исходной культуры дезагрегировали пипеткой до получения единичных клеток, доводили посевную концентрацию до 8 клеток на мл среды, и по 150 мкл высевали в 96-луночные микропанели фирмы "Costar". С целью повышения выхода фертильных клонов использовали кондиционированную среду, полученную путем стерилизующей фильтрации ростовой среды трехсуточной культуры клеток почки козерога ПСГК-60, которую добавляли в среду выращивания в 30% концентрации, и повышенное до 20% содержание сыворотки крови КРС, обработанной ПЭГ-6000. Инкубирование осуществляли при 37°С при атмосфере с повышенным (до 5%) содержанием С02 и 90% влажности. Контроль клонообразования учитывали по морфологическим характеристикам клеток и их скорости роста. Для дальнейшего масштабирования отбирали единичные округлые колонии. При последующим пассировании исключили применение кондиционированной среды и снизили до 5% содержание сыворотки.

Изучение ростовых свойств полученных клонов позволило отобрать два наиболее перспективных, а в результате дальнейших вирусологических исследований был отобран клон ПСГК - 60/с 1.

Отобранный клон ПСГК - 60/с1 сразу, без предварительной селекции, обладал высоким пролиферативным потенциалом, в питательной среде Игла MEM с 5 - 7% сыворотки крови КРС. При посадочной концентрации клеток 60 - 70 тыс. кл./см3 уже через 24 ч отмечался островковый рост, а конфлюэнтный

монослой образовывался через 48 ч культивирования. Индекс пролиферации клеток на уровне 12 пассажа составлял 3-4.

С целью стабилизации биологических свойств методом последовательных пересевов проведено 50 пассажей клона ПСГК - 60/с1, в течение которых оценивали цитоморфологические, кариологические характеристики и ростовые свойства клеток. Результаты исследований показали стабильность основных биологических свойств на протяжении всего времени наблюдения. В течение 6 пассажей в условиях роллерной культуры клетки ПСГК-60/с1 улучшили пролиферативные показатели и при пассировании с интервалами в 3-4 дня, оптимальный коэффициент пересева клеток составил 1:10 (табл. 2).

Таблица 2

Биотехнологические характеристики культуры клеток ПСГК-60/с1 при разных способах культивирования

Способ культивирования Посадочная концентрация (тыс.кл./см3) Сроки культивирования (суток) Индекс пролиферации Конечная плотность клеток (тыс./см3)

Стационарный монослой 65±5 2 3-4 210±30

Роллерный монослой 35±5 3-4 8-10 300±20

Кариологический анализ клональной линии клеток ПСГК-60/с1 на уровне 31 пассажа показал, что модальный класс составляет 58 хромосом, как и в исходной материнской культуре, а его величина 50% (в исходной 16-20%). Интервал варьирования числа хромосом от 56 до 62 (рис. 5). Типичный кариотип представлен метацентрическими хромосомами, характерными для клеток свиного происхождения (рис. 6). Присутствует маркерный метацентрик с около-центромерным неокрашенным участком, что также указывает на сходство с линиями клеток свиного происхождения.

Цитоморфологические исследования показали, что культура представлена клетками эпителиоподобного типа полигональной формы. Границы клеток четко различимы, в цитоплазме клеток возможна незначительная зернистость, возникающая при использовании некоторых серий сывороток. Ядра овальной формы с 5 - 7 ядрышками различной величины.

зо п

56 57 58 59 60 61 62 число хромосом

Рис. 5. Гистограмма распределения числа хромосом в перевиваемой клональной линии клеток ПСГК-60/с1, 31 пассаж.

Рис. 6. Метафазная пластинка клетки модального класса сублинии ПСГК - 60/с1, 31 пассаж, х 1000.

Исключение контаминации культуры клеток бактериальной и грибной микрофлорой проводили в соответствии с общепринятыми требованиями (ГОСТ 28085-89). Методом ПЦР показано отсутствие микоплазм в культуре на разных пассажных уровнях.

Исследование чувствительности культуры ПСГК - 60/с1 к ряду вирусов показало, что клетки сохранили исходные характеристики материнской линии. Так, накопление вируса КЧС (штамм «ЛК-К») в клональной линии составляло от 4,5 до 6,0 ^ ККИД50/СМ3 при титровании вируссодержащего материала методом МФА в культуре клеток РК-15.

Определение репродуцирующей активности клональной линии клеток ПСГК-60/с1 в отношении вируса болезни Тешена с использованием штамма «Закарпатский» при заражении монослоя клеток в разведении 1:1000 выявило

цитопатическое действие (ЦПД) вируса через 48 ч, а его активность составила 8,0 ^ ТЦЦ50/см3.

Широкие исследования вирусрепродуцирующих свойств новой клональ-ной линии клеток проведены с вирусом блютанга. Репродукция штамма АУ -1855 (8 серотип) сопровождалась развитием ЦПД через 48 - 72 ч и его активность составила 5,5 ^ ТЦД5о/см3; штамм ВТ 8 (8 серотип) прошел 2 пассажа на полученной клональной линии клеток, накопление составило 6,25 ^ ТЦЦ50/см3. С первого пассажа культивирования в клетках ПСГК-60/с1 вируса блютанга (штамм 617,14 серотип), хранившегося в течение 5 лет при температуре минус 40°С, его инфекционная активность достигала 6,25 ^ ТЦЦ50/см3; штамм 874 (2 серотип), освеженный после 4 лет хранения на данной культуре клеток, получен с активностью 5,5 ^ ТЦД5о/см3.

Установлена чувствительность клеток ПСГК - 60/с1 к вирусу болезни Ауески (штамм МК-25). При заражении клеток в разведении 1:100 вирус через 72 ч вызывал ЦПД и его накопление в клетках составило 7,67 ^ ТЦЦ5о/см3.

Таким образом, получена и паспортизирована клональная перевиваемая сублиния клеток свиного происхождения ПСГК - 60/с1, сохранившая основные биологические свойства исходной линии ПСГК (табл. 3).

Таблица 3

Характеристика клона перевиваемой свиной

гетероплоидной культуры ПСГК-60/cl_

Показатели ПСГК-60/cl

Среда культивирования Игла MEM с 5 - 7% Сыворотки крови КРС

Индекс пролиферации 2-4

Посадочная концентрация 60-70 тыс кл./смЗ

Срок формирования монослоя 2-3 суток

Срок переживания монослоя 14 суток без смены среды

Морфология Эпителиоподобные клетки с мелкозернистой цитоплазмой

Интервал варьирования числа хромосом 56-62

Модальный класс 58

Величина модального класса 50%

Чувствительность к вирусам Блютанг, КЧС, болезнь Ауэски, болезнь Тешена, ТГС

Показана стабильность цитоморфологических, культуральных, кариоло-гических характеристик клона. Создан криобанк клеток ПСГК - 60/с1. Оценка чувствительности клеток клона к ряду вирусов позволяет рекомендовать ее к широкому использованию в вирусологии и биотехнологии противовирусных препаратов.

Выводы

1. Оценка культурально-морфологических свойств клеток диких животных средней полосы России криобанка музея клеточных культур ГНУ ВНИ-ИВВиМ показала, что наиболее перспективными для получения перевиваемых линий клеток являются субкультуры клеток легкого эмбриона оленя (Cervus elaphus), легкого эмбриона лося и кожи эмбриона лося {Alces alces).

2. Получены новые перевиваемые линии клеток легкого эмбриона оленя ЛЭО/Об и кожи эмбриона лося КЭЛ/07. В результате спонтанной трансформации субкультур клеток, выделенных из нормальных тканей, установленная линия ЛЭО-Об характеризовалась интервалом варьирования числа хромосом от 55 до 117, без выраженного модального класса, а линия КЭЛ/07 - интервалом варьирования числа хромосом от 57 до 70, с модальным классом 63 (21%).

3. Паспортизированы перевиваемые линии клеток ЛЭО-Об и КЭЛ/07 и создан криобанк этих клеток. Установлена чувствительность культуры ЛЭО-Об к вирусам ИРТ КРС, АЭК и культуры КЭЛ-07 к вирусам ЧМЖ, оспы овец, ИРТ КРС, диареи КРС (BVD).

4. Впервые полученная хронически инфицированная (ХИК) вирусом артрита-энцефалита коз культура клеток легкого эмбриона оленя ЛЭО/АЭК пригодна для вирусологических исследований.

5. Изучение клеточных культур, поименованных как почка сибирского горного козерога ПСГК, не выявило клеток, относящихся в видовом отношении к Capra sibirica. Установлено, что первичная контаминация культуры почки сибирского горного козерога клетками свиного происхождения имела место уже на уровне 16 пассажа и все последующие штаммы, сублинии и трофовари-анты клеток ПСКГ являются дериватами клеток, относящимися к виду Sus scrofa.

6. Получена и паспортизирована клональная перевиваемая линия клеток свиного происхождения ПСГК - 60/с1, сохранившая основные биологические и биотехнологические свойства исходной линии ПСГК-60, включая чувствительность к адаптированным вирусам. Показана стабильность цитоморфологи-ческих, культуральных, кариологических характеристик клональной линии на протяжении 50 непрерывных пассажей.

Практические предложения

Предложена новая перевиваемая линия клеток легкого эмбриона оленя Cervus elaphus ЛЭО-Об, а так же хронически инфицированный вирусом артрита-энцефалита коз клеточный штамм ЛЭО/АЭК, которые рекомендованы для научных исследований при изучении вируса АЭК.

Предложена новая перевиваемая линия клеток кожи эмбриона лося Alces alces КЭЛ/07 для вирусологических целей.

Разработаны методические рекомендации по поддержанию и хранению культур клеток ЛЭО-Об и КЭЛ/07, полученных из субкультур клеток легкого эмбриона оленя и кожи эмбриона лося соответственно, которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ (20.06.08).

Предложена новая клональная линия клеток ПСГК - 60/с1 (перевиваемые свиные гетероплоидные клетки) к использованию в качестве клеточного субстрата при проведении диагностических исследований и при производстве вирусвакцин против КЧС, блютанга и болезни Тешена.

Составлены и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ паспорта на новые полученные перевиваемые линии клеток и созданы их криобанки в жидком азоте.

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. К вопросу о видовой принадлежности линии клеток почки сибирского горного козерога / С.Г. Юрков, А. В. Филатов, Н.Ю. Смыслова, H.A. Жданова // Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных: материалы Междунар. науч.-практич. конф. / ГНУ ВИЭВ. - М.:ИзографЪ, 2006. - С.647-648.

2. Оценка антибактериальных препаратов для профилактики контаминации перевиваемых линий клеток / С.Г. Юрков, H.A. Жданова, Е.В. Ставничий, A.B. Филатов, С.Д. Кушнир, Л.И. Анисимова, Н.Ю. Смыслова // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / УГСХА - Ульяновск, 2008,- Т. IV,- С. 139-143.

3. Филатов, A.B. Получение и биологические свойства культур клеток из тканей диких животных / A.B. Филатов // Ветеринария. - 2008. - №9. - С. 57-59.

4. Биологические свойства клональной линии клеток ПСГК-60/cl / A.B. Филатов, С.Г. Юрков, В.И. Балышева, М.В. Болгова, A.A. Шишкова, H.A. Жданова // Аграрная наука. - 2008. - № 8. - С 35-36.

5. Артрит-энцефалит коз в России: эпизоотологический анализ инцидента / А.Ю. Чичикин, И.Ю. Волкова, С.Ж. Цыбанов, О.Н. Жигалева, С.Г. Юрков, Г.Д. Сидельников, A.B. Филатов, A.A. Стрижаков // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: материалы Междунар. науч.-практ. конф., 13-14 ноября 2008 года / ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ. - Покров, 2008. -С. 77-80.

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ, г. Покров, Владимирской области Тираж 75 экземпляров

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Филатов, Алексей Владимирович

Список сокращений

1. Введение

1.1. Актуальность темы

1.2. Цель работы и основные задачи исследований

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость

1.5. Основные положения, выносимые на защиту

1.6. Апробация и публикации результатов

1.7. Личный вклад

2. Обзор литературы

2.1. Характеристика клеточных культур, применяемых в биотехнологии

2.2. Контаминация клеточных культур

2.2.1. Бактериальная контаминация

2.2.2. Вирусная контаминация

2.2.3. Перекрестная контаминация

2.3. Получение новых клеточных систем

2.3.1. Трансформация первичных и диплоидных культур клеток

2.3.2. Клонирование и селекция

2.3.3. Гибридизация

Введение Диссертация по биологии, на тему "Получение, стабилизация и биологические свойства культур клеток тканей диких животных"

Развитие методов получения, культивирования и хранения культур клеток различных типов обусловило их широкое применение при изучении биологии клетки в генетике, токсикологии, вирусологии и биотехнологии. Клеточные субстраты, как лабораторные модели, заняли ведущее место при изучении репродукции вирусов, в диагностических исследованиях, производстве разнообразных противовирусных препаратов.

В последнее время в клеточной биотехнологии отчетливо прослеживается тенденция нарастания роли перевиваемых линий клеток, созданы крупные банки и национальные коллекции аттестованных клеточных культур. Тем не менее, в каждом конкретном случае необходим обоснованный выбор клеточных систем определенного типа, наиболее отвечающего целям и задачам планируемого эксперимента.

Ряд направлений ветеринарной вирусологии и, в частности, диагностика, при первичной изоляции возбудителей новых вирусных болезней испытывает острый дефицит в чувствительных к вирусам стабильных клеточных системах — перевиваемых линиях клеток и диплоидных штаммах клеток, что вынуждает использовать нестандартные первичные культуры клеток или куриные эмбрионы. Для репродукции in vitro некоторых вирусов до сих пор не найдены пермиссивные клеточные модели.

В связи с этим проблема поиска новых высокочувствительных к вирусам стабильных клеточных систем различного видового и тканевого происхождения, несомненно, является актуальной [70].

Необходимость получения новых клеточных линий для биотехнологии производства противовирусных препаратов связана и с рекомендациями МЭБ, предложившего использовать для наработки вирусного сырья клеточные культуры из тканей животных, ге-терологичных по виду объекту применения вакцин. Хотя это мнение во многом спорно в отношении именно перевиваемых линий клеток, тем не менее, наличие резервных клеточных систем открывает путь к созданию более стабильных и гибких клеточных технологий.

Следует отметить факт успешного использования при производстве противовирусных ветеринарных препаратов ряда клеточных культур, полученных из тканей диких животных, таких как перевиваемая линия клеток почки сайги ПС (вакцины против бешенства, чумы КРС, чумы плотоядных, парагриппа-3 КРС) [39], перевиваемая линия клеток почки сибирского горного козерога ПСГК (вакцины против КЧС, болезни Тешена и др.) [45].

Установлено, что перевиваемые клетки из тканей сельскохозяйственных и домашних животных часто контаминированы вирусами (IBRS-2 и ППК-666 - вирусом КЧС [119], PK-15 - циркови-русом [55], MDBK и CRFK - вирусом диареи КРС [158], FLK -лейковирусом КРС [164; 166]). Кроме того, актуальной остается и проблема межвидовой контаминации клеточных культур [127].

Таким образом, несмотря на то, что в настоящее время вирусологи располагают достаточно широким выбором клеточных субстратов с охарактеризованными свойствами, не вызывает сомнений необходимость получения, стабилизации биологических свойств и паспортизации новых резервных культур клеток из тканей диких животных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Филатов, Алексей Владимирович

5. Выводы

1. Оценка культурально-морфологических свойств клеток диких животных средней полосы России криобанка музея клеточных культур ГНУ ВНИИВВиМ показала, что наиболее пёрспективными для получения перевиваемых линий клеток являются субкультуры клеток легкого эмбриона оленя (Cervus elaphus), легкого эмбриона лося и кожи эмбриона лося (Alces alces).

2. Получены новые перевиваемые линии клеток легкого эмбриона оленя ЛЭО/Об и кожи эмбриона лося КЭЛ/07. В результате спонтанной трансформации субкультур клеток, выделенных из нормальных тканей, установленная линия ЛЭО-Об характеризовалась интервалом варьирования числа хромосом от 55 до 117, без выраженного модального класса, а линия КЭЛ/07 — интервалом варьирования числа хромосом от 57 до 70, с модальным классом 63 (21%).

3. Паспортизированы перевиваемые линии клеток ЛЭО-Об и КЭЛ/07 и создан криобанк этих клеток. Установлена чувствительность культуры ЛЭО-Об к вирусам ИРТ КРС, АЭК и культуры КЭЛ-07 к вирусам ЧМЖ, оспы овец, ИРТ КРС, диареи КРС (BVD).

4. Впервые полученная хронически инфицированная (ХИК) вирусом артрита-энцефалита коз культура клеток легкого эмбриона оленя ЛЭО/АЭК пригодна для вирусологических исследований.

5. Изучение клеточных культур, поименованных как почка сибирского горного козерога ПСГК не выявило клеток, относящихся в видовом отношении к Capra sibirica. Установлено, что первичная контаминация культуры почки сибирского горного козерога клетками свиного происхождения имела место уже на уровне 16 пассажа и все последующие штаммы, сублинии и трофоварианты клеток ПСКГ являются дериватами клеток, относящимися к виду Sus scrofa.

6. Получена и паспортизирована клональная перевиваемая линия клеток свиного происхождения ПСГК - 60/с 1, сохранившая основные биологические и биотехнологические свойства исходной линии ПСГК-60, включая чувствительность к адаптированным вирусам. Показана стабильность цитоморфологических, культураль-ных, кариологических характеристик клональной линии на протяжении 50 непрерывных пассажей.

6. Практические предложения

Предложена новая перевиваемая линия клеток легкого эмбриона оленя Cervus elaplnis ЛЭО-Об, а так же хронически инфицированный вирусом артрита-энцефалита коз клеточный штамм ЛЭО/АЭК, которые рекомендованы для научных исследований при изучении вируса АЭК.

Предложена новая перевиваемая линия клеток кожи эмбриона лося Alces alces КЭЛ/07 для вирусологических целей.

Разработаны методические рекомендации по поддержанию и хранению культур клеток ЛЭО-Об и КЭЛ/07, полученных из субкультур клеток легкого эмбриона оленя и кожи эмбриона лося соответственно, которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ (20.06.08).

Предложена новая клопальная линия клеток ПСГК — 60/с 1 (перевиваемые свиные гетероплоидные клетки) к использованию в качестве клеточного субстрата при проведении диагностических исследований и при производстве вирусвакцин против КЧС, блю-танга и болезни Тешена.

Составлены и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ паспорта на новые полученные перевиваемые линии клеток и созданы их криобанки в жидком азоте.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Филатов, Алексей Владимирович, Покров

1. Адаме, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адаме. М.: Мир, 1983. - 263 с.

2. Алов, И.А. Общая биология. Значение тиоловых групп белков в формировании митотического аппарата / И.А. Алов, М.Е. Ас-пиз, H.A. Палкина. — М., 1969. С. 452-458.

3. Анджапаридзе, О.Г. Персистенция вирусов / О.Г. Анджапаридзе, H.H. Богомолова, Ю.С. Борискин. М.: Медицина, 1984. -256 с.

4. Багатурова, А. Новая форма жизни электронный ресурс. — Режим доступа: http://www.computerra.ru/37330/.

5. Балышева, В.И. Культура клеток ПСГК-с85 для культивирования вирусов сельскохозяйственных животных / В.И. Балышева, В.И. Жестерев // Тезисы докладов науч. конф. Пущино, 1990. - С. 71.

6. Бектемиров, Т.А. О перспективах разработки вирусных вакцин / Т.А. Бектемиров, С.И. Горбунов // Военный медицинский журнал. 1995. - № 7. - С. 45-4.8.

7. Белун, О.В. Клонирование перевиваемой линии почки поросенка / О.В. Белун, В.А. Сокова, А.Н. Курносов // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: тезисы докладов / ВНИИВВиМ. Покров, 1978. - С. 16.

8. Бенджамин Мак-Рирдер. Что попадает в нас через иглу? Проблема патогенного загрязнения вакцин Электронный ресурс. -Режим доступа: http://www.tetrahedron.org/articles/vaccine awareness/through the needle.html.

9. Биология вирусов животных. Т. 2 / Ф. Феннер и др.; пер. с англ.; под ред. В.И. Агола М.: Мир, 1977. - 624 с.

10. Брагина, С.Г. Действие некоторых фторхинолоновых препаратов на микоплазмы-контаминанты клеточных культур: авто-реф. дис. . канд. биол. наук: 16.00.03 / Брагина Светлана Геннадьевна. М., 2001. - 18 с.

11. Браплавец, Н.Ф. Очистка культур тканей от микоплазм / Н.Ф. Браплавец // Вирусы и вирусные заболевания: Республиканский межведомственный, сб. — 1975. Вып. 3. - С.117-120.

12. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин и др.. М.: ВНИТИБП, 1998. - 928 с."

13. Витина, С.А. Изучение культур диплоидных клеток, полученных из тканей животных: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.095 / Витина Светлана Андреевна. Покров, 1972. - 20 с.

14. Влияние контаминирующих агентов на процесс культивирования клеточных линий различного происхождения / Г.Г. Миллер и др. // Культивирование клеток животных и человека: тезисы докладов Пущино, 1985. - С. 9

15. Выяснение оптимального способа получения культур клеток кожи / Н.Д. Юрченко и др. // Цитология. 1996. - Т. 38, № 2. 1- С. 262-263.

16. Гаврилов, В.И. Перевиваемые клетки в вирусологии / В.И. Гаврилов. М.: Медицина, 1964. - 267 с.

17. Герасимов, В.Н. Получение постоянных линий клеток из органов козы, свиньи и кролика / В.Н. Герасимов // Ветеринария.- 1998.-№ 3. С. 27-29.

18. Голубев, Д.Б. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии / Д.Б. Голубев, А.Л. Соминина, М.Н. Медведева.- Л.: Медицина, 1976. 224 с.

19. Грачев, В.П. Оценка перевиваемых клеточных линий как субстрата для производства биологически активных веществ / В.П. Грачев, Д.С. Петричиани // Журнал микробиологии, эпизоотологии и иммунологии. 1988. - № 2. - С.46-51.

20. Грачев, В.П. Современные аспекты крупномасштабного культивирования клеточных субстратов и вирусов / В.П. Грачев // Культивирование клеток животных и человека: тезисы докладов. Пущино, 1985. - С. 61 - 64.

21. Дьяконов, Л.П. Гибридные и генетически трансформированные клетки сельскохозяйственных животных в биотехнологии / Л.П. Дьяконов // Цитология. 1992.- Т.34, № 9. - С. 67.

22. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии) / Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков В.И,; под ред. проф. Дьяконова Л.П., проф. Ситькова В.И. — М.: Компания Спутник+, 2000. — 400 с.

23. Дьяконов, Л.П. Культуры клеток животных. Современные аспекты биотехнологии и взаимодействия клеток с инфекционными патогенами / Л.П. Дьяконов // Цитология.- 1994.-Т.36. С. 503-504.

24. Закутский, Н.И. Выращивание вируса ИРТ в перевиваемых культурах клеток / Н.И. Закутский, В.И. Жестерев, Л.Д. Конакова // Вирусные болезни с/х животных: тезисы докладов Все-рос. науч.-практ. конф. / ВНИЯИ. Владимир, 1995. - С. 90.

25. Зуев, В.В. Получение перевиваемой клеточной линии из почки зайца / В.В. Зуев // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф./ ВНИ-ИВВиМ. Покров, 1992. - С.295.

26. Зусман, Ф.Я. Опыт использования антибиотиков для декон-таминации клеточных культур от микоплазм / Ф.Я. Зусман // Диагностика и профилактика вирусных инфекций: сб. Свердловск, 1974.- С. 20-26 .

27. Изучение культуральных свойств вируса геморрагической болезни кроликов / В.И. Жестерев и др. // Конференция, посвящ., 100-летию открытия вируса ящура: тезисы докладов, 27-31 окт. 1997 г. Владимир, 1997. - С. 177.

28. Изучение чувствительности к вирусу инфекционного ринот-рахеита различных перевиваемых линий клеток / Н.И. Закутскийи др. // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии иtэпизоотодогии: материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ.- Покров, 1992. С.142-143.

29. Инструкция по приготовлению питательных сред и клеточных культур / А.Н. Курносов и др.. М.: ГУВ Госагропром СССР, 1987. - 154 с.

30. Использование перевиваемой культуры клеток почки сайги в вирусологической практике / И.Ф. Вишняков и др. // Цитология. 1994. - Т. 36, № 6. - С. 549.

31. Итоги изучения методов криоконсервирования и длительного хранения культур сельскохозяйственных животных / Л.П. Дьяконов и др. // Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии: сб. 2. Харьков, 1984. -131 с.

32. Каламина, Т.В. Персистенция вируса АЧС в культуре клеток ПСГК / Т.В. Каламина, В.И. Жестерев // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. Покров, 1992. - С. 36-37.

33. Каталог коллекции клеточных культур ВНИИВВиМ / С.Г. Юрков и др. // ГНУ ВНИИВВиМ Покров," 2000. - 78 с.

34. Каталог. Российская коллекция клеточных культур // Санкт-Петербург; Омск: Ом ГПУ, 1999. 226 с.

35. Клеточные культуры в биотехнологии / В.И. Балышева и др. // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов: тезисы докладов V Всеросс. конф. Щелково, 1996. - С. 28.

36. Клеточные культуры., в биотехнологии противоящурных вакцин / В.Н. Герасимов и др. // Проблемы инфекционой патологии сельскохозяйственных животных: тезисы докладов конф.-Владимир, 1997. С. 41-42.с

37. Клональная характеристика перевиваемой линии клеток почки поросенка (РК-15) / O.JI. Колбасова и др. // Доклады РАСХН, 2000.-№ 3. С. 39-41.

38. Колокольцова, Т.Д. Методические основы получения первичных культур клеток насекомых / Т.Д. Колокольцова, A.A. Царева // Вопросы вирусологии. 1995. - № 3. - С. 89-91.

39. Колокольцова, Т.Д. Создание аттестованных коллекций и банков культур клеток для научных исследований, производства препаратов, диагностики и лечения: автореф. дис. . докт. биол. наук: 03.00.23 / Колокольцова Тамара Дмитриевна. Щелково, 2008. - 46 с.

40. Культура животных клеток. Методы / Д. Конки и др.; пер. с англ./под ред. Р. Фрешни. М.: Мир, 1989. - 333 с.

41. Культура ткани в вирусологических исследованиях / О.Г. Анджапаридзе и др.. М.: Медгиз, 1962 - 233 с.

42. Куриннов, В.В. Эпизоотологические, клинические и диагностические исследования при классической чуме свиней / В.В. Куриннов // Доклады РАСХН. 1999. - №1. - С. 42-45.

43. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М., 1990. - 352 с.

44. Линия перевиваемых клеток сердца и языка эмбриона африканской зеленой мартышки и ее применение в вирусологической практике / Л.Л. Миронова и др. // Цитология. — 1994. Т.36, № 6. - С.570.

45. Малахова, М.С. Проблема контаминации клеточных субстратов в биотехнологии / М.С. Малахов, В.В. Макаров // Культивирование клеток животных и человека: тезисы докладов III Все-союз. сов. М., 1990. - С. 117-118.

46. Мамаева, С.Е. Закономерности кариотипической эволюции клеток в культуре / С.Е. Мамаева // Цитология. 1996. - Т.38, №8. - С. 787-814.

47. Мамаева, С.Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток / С.Е. Мамаев // Методы культивирования клеток. 1988. - 78 с.

48. Миронова, Л.Л. Клеточные культуры и применение их для изготовления противовирусных препаратов: автореф. дис. . док. мед. наук. / Миронова Любовь Леонидовна М., 19.68. - 26 с.

49. Миронова, JI.JI. Культивирование клеток животных для медицинской биотехнологии / Л.Л. Миронова, Ю.Х. Хапчаев,- М., 1995. 148 с.

50. Морфологические и кариологические характеристики посто7 янных линий при длительном культивировании / В.Н. Герасимов и др. // Цитология.- 1999.- Т. 41, № 3-4, 226 с.

51. Недосеков, В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцины против бешенства: ав-тореф. дис. . канд. вет. наук: 16.00.03 / Недосеков Виталий Владимирович. — Покров, 1998.- 23 с.

52. Никольский, H.H. Биология клетки в культуре / H.H. Никольский, Ю.Б. Бахтин, Т.Н. Игнатова; под ред. A.C. Трошина. Л:: Наука, 1984. - 280 с.

53. Новохатский, A.C. Клеточные культуры в вирусологии / A.C. Новохатский // Общая и частная вирусология. М.: Медицина, 1982. - С. 463-493.

54. Новохатский, A.C. Культуры клеток в вирусологии / A.C. Новохатский // Итоги науки и техники / ВИНИТИ. — М., 1990. — 225 с. (серия Вирусолология. - Т.19).

55. Новохатский, A.C., Проблема контаминации клетками и новые подходы к контролю перевиваемых линий / A.C. Новохат-ский, Г.Р. Михайлова, А.А.Царева // Вопросы вирусологии -1977.- № 4.- С. 396-408.

56. Патент №2129442 Российская Федерация. Способ получения вакцины против чумы плотоядных / Вишняков И.Ф., Карпов Г.М., Куриннов В.В. и др.; заявлено 18.07.96; зарегистр. 27.04.99, Государственный реестр изобретений.

57. Жестерев. и др.; заявлено 30.03.98; зарегистр. 27.09.99, Государственный реестр изобретений.

58. Патент № 2154496 Российская Федерация. Вакцина против чумы, инфекционного гепатита и парвовирусного энтерита плотоядных / В.М. Балышев, И.Ф. Вишняков, И.В. Федорищев, Г.М.

59. Карпов, JI.A. Щетникова, Е.М. Хрипунов, В.Я. Савукова, A.A. Шевченко, С.Г. Юрков, В.В. Зуев; заявлено 04.12.97; зарегистр. 20.08.2000, Государственный реестр изобретений.

60. Персистенция антигена ареновируса в перевиваемых клеточных линиях. Попытки выделения инфекционного вируса / О.Г. Анджапаридзе и др. // Вопросы вирусологии. М., 1977. - С. 557-561.

61. Перспективы использования культуры клеток ПСГК в вирусологической практике / В.И. Балышева и др. // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. / ВНИИВВиМ. Покров, 1992. - С. 290-291.

62. Перспективы использования культуры клеток ПСГК в вирусологической практике / В.И. Балышева и др. // Цитология. -1994. Т. 36, № 6. - С. 544-545.

63. Пиле, Э.Р. Современное состояние проблемы контроля биологических препаратов на отсутствие вирусов-контаминантов / Э.Р. Пиле, С.Г. Дзагуров // Материалы научн. конф. / Гос. кон-трольн. инст. им. JI.A. Тарасевича.- М., 1970. — С. 129-141.

64. Пинаев, Г.А. Культуры клеток животных и биотехнология / Г.А. Пинаев // Культивирование клеток животных и человека: сб. Пущино, 1985. - С.72-73.

65. Получение различных видов культур клеток почек овцы и возможность их применения в биотехнологии / JI.JI. Миронова и др. // Биотехнология. 1999. - № 5. - С.19-30.

66. Пол, Дж. Культура клеток и тканей / Дж. Пол; пер. с англ. С.М. Навашиной; под ред. проф. Л.М. Якобсон. М., 1963. - С. 8-13.

67. Получение аттестованных фибробластов человека, пригодных для научных и медицинских исследований / Т.Д. Колокольцова и др. // Биотехнология. 2007. - № 1. - С. 58-64.

68. Получение гибридных клеток сельскохозяйственных животных и исследование их восприимчивости к вирусным инфекциям / Л.П. Дьяконов и др.'. // Цитология.- 1987.- Т. 9, № 2. С. 1082.

69. Пригодность клеточных субстратов для производства биологических препаратов // Бюллетень ВОЗ. Женева, 1988. — 29 с. -(Серия технических докладов., №747).

70. Проблема использования культур клеток в производстве вирусных вакцин и вопросы контроля их безвредности / В.П. Гр"ачев и др. // Руководство по ^вакцинному и сывороточному делу. М.: Медицина, 1978. - С. 176-184.

71. Проблемы аттестации культур клеток, пригодных для заместительной терапии / Т.Д. Колокольцова и др. // Успехи современного естествознания. 2004. — Т. 1, № 6. — С. 127-128.

72. Рингерц, Н. Гибридные клетки / Н. Рингерц, Р. Сэвидж. М., Мир, 1979. - 11 с.

73. Самуйленко, А.Я. Основы технологии производства ветеринарных биологических препаратов Т. 1 / А.Я. Самуйленко, Е.А. Рубан. М., 2000. - С. 199-202.

74. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер М.: Библионика, 2007. - 524 с.

75. Сергеев, В.А. Репродукция и выращивание вирусов / В.А. Сергеев. М.: Колос, 1976. - С.15-125.

76. Сокова, В.В. Получение и использование клонов клеток ВНК-21 для промышленного выращивания вируса ящура / В.В. Сокова, О.В. Сочнова, А.К. Николаев // К новой стратегии борьбы с ящуром: материалы Междунар. конф.- Владимир, 1991. С. 107108.

77. Спиер, P.E. Биотехнология клеток животных Т. 2 / P.E. Спи-ер, Дж.Б. Гриффите; пер. с англ. В.М. Тарасенко; под ред. Г.А. Сафонова. М.: Агропромиздат, 1989. - 365 с.

78. Ставничий, Е.В. Внутривидовые и межвидовые гибридные популяции клеток и их биологические свойства: дис. . канд. биол. наук: 03.00.23 / Ставничий Евгений Валерьевич. Покров, 2003. - 158 с.

79. Тарасов, В.Н. Культуры клеток в вирусологии / В.Н. Тарасов // Итоги науки и техники / ВИНИТИ М:, 1990. - 255с. - (серия Вирусология, Т. 19).

80. Тарасов, В.Н. Культуры клеток в производстве биопрепаратов / В.Н. Тарасов // Итоги науки и техники / ВИНИТИ. М., 1991. - 270 с. - (серия Вирусология, Т. 21).

81. Тихонов, И.В. Биотехнология / И.В. Тихонов, Е.А. Рубан, Т.Н. Грязнева; под ред. Е.С. Воронина.- СПб.: ГИОРД, 2005. -792 с.

82. Трапезникова, Т.М. Изучение биологических свойств мико-плазм клеточных культур и разработка методов их деконтаминации: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.095 / Трапезникова Тамара Михайловна. Покров, 1972. - 18 с.

83. Требования к перевиваемым линиям клеток для производства инактивированных вирусных вакцин // Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. М., 1984. - С.68.74. (Серия технических докладов ВОЗ № 673).

84. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемых для производства биологических препаратов // Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. — М., 1985. 170 с. - (Серия технических докладов ВОЗ №745).

85. Установка промышленного типа для культивирования клеток и вирусов в роллерных бутылях / И.А. Буреев и др. // Актуальные проблемы ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ Покров, 1994. - 76 с.

86. Характеристика банка линии гетероплоидных клеток почки зеленой мартышки 4647 / Л.Л. Миронова и др. // Вопросы вирусологии. 1987.- № 6.- С. 740-743.

87. Характеристика клеточных линий, используемых в биотехнологии / В.И. Жестерев и др. // Цитология. 1996. - Т.38, № 7. -С. 681-185.

88. Характеристика постоянной линии клеток ВНК-21 после 20 лет непрерывного хранения при температуре минус 196°С / В.Г.

89. Лымарь и др. // Биотехнология. 1992. - №5. - С. 75-77.

90. Хроническая вирусная инфекция в перевиваемых культурах клеток / Г.П. Советова и др. // Вопросы вирусологии. 1971. -№6. - С. 10г16.

91. Цитогенетическая и вирусологическая характеристика исходной линии и клонов клеток RH с различной чувствительностью к вирусу клещевого энцефалита / H.A. Попова и др. // Цитология.- 1988.- Т. XXX, №4. С. 454-459.

92. Цитогенетический анализ сублиний клеточных линий ВНК-21 и СПЭВ / Ш.К. Куляшбекова и др. // Цитология. 1999.- Т. 41, №3/4. - С. 286.

93. Чермашенцева, H.A. Деконтаминация культуры клеток ППК-666 от персистирующего вируса классической чумы свиней и стабилизация полученных клонов: автореф. дисс. . канд. биол. наук: 03.00.06 / Чермашенцева Наталья Анатольевна.- Покров, 1996. 23 с.

94. Чичикин, А.Ю. Артрит-энцефалит коз в мире и России / А.Ю. Чичикин, A.A. Стрижаков, И.Ю. Волкова // Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных: материалы

95. Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ. Покров, 2005. - С. 217-221.

96. Чувствительность некоторых перевиваемых культур клеток к • вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней / Е.А. Балашова и др. // Вирусные болезни с/х животных: тезисыtдокладов науч.-практ. конф., 17-21 апреля 1995 г. Владимир, 1995. - С. 96.

97. Шафеева, P.C. Репродукция вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero /, P.C. Шафеева, A.B. Фролова // Цитология. 1994. - №6. - С. 587.

98. Шевченко, A.A. Некоторые вопросы эпизоотологии вирусной геморрагической болезни кроликов / A.A. Шевченко, И.А. Баку-лов, Т.А. Власова // Ветеринария 1997. - №7. - С. 17.

99. Щелкунова, Т.И. Перевиваемые линии клеток карпа (Cyprinus carpió) и сибирского осетра (Acipenser baeri), их использование в ихтиовирусологии: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.06 / Щелкунова Татьяна Ивановна. Покров, 2008. - 25 с.

100. Эпизоотологический мониторинг артрита-энцефалита коз в России / А.Ю. Чичикин и др. // Роль аграрной науки в развитии с/х производства крайнего севера: материалы Междунар. науч.-практ. конф.- Бурятский СХИ. Улан-Уде, 2006. - С. 2428.

101. Юрков, С.Г. О перекрестной контаминации перевиваемых культур клеток / С.Г. Юрков // Вопросы вирусологии. 1995.-№5. - С. 255-227.

102. Юрков, С.Г. Совершенствование методики изготовления альвеолярных макрофагов свиньи / С.Г. Юрков // Ветеринария. — 1996. № 1. - С. 19-21.

103. Юрков, С.Г. Универсальная роллерная технология культивирования перевиваемых клеток животных / С.Г. Юрков // Ветеринария. 1995.- №9.- С. 29- 34.

104. Acceptability of cell substrates for production of biologicals / WHO // Technical report series N747. Report of a WHO study group. 1987.

105. Alan R Cantwell, Jr. Bacteria in Sarcoidosis and.a Rationale for Antibiotic Therapy in this Disease Интернет ресурс. Режим доступа: http://www.joimr.org/phorum/read.php?f=2&i=48&t=48

106. American Type Culture Collection // Rockville, Maryland. -1972. CCL 40.

107. An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: isolation of the virus / M. Konishi et al. // J. Vet. Med. Sci. 2004. - Vol. 66, N.8.- P. 911-917.

108. Ang, S.C. Cross-reactive and species specific Mycobacterium tuberculosis antigens in the immunoprofile of Schaumann bodies: a major clue to the etiology of sarcoidosis / S.C. Ang, E.A. Moscovic // Histol Histopathol. 1996. Vol. 11, № 1. - P. 125-34.

109. A study of experimentally induced bovine viral diarrhea-mucosal disease in pregnant cows and their progeny / G.M. Ward et al. // Cornell Vet. 1969. - Vol. 59. - P. 525-538.

110. Bejar, J. An ES-like cell line from the marine fish Sparus aurata: characterization and chimaera production / J. Bejar, Y. Hong. // Alвvarez Transgenic Res. 2002. - Vol. 11, № 3. - P. 279-289.

111. Breese, S.S. Virus-like particles occurring in cultures of stable pig kidney cell cultures / S.S Breese // Arch ges Virusforsch. -1970. Vol. 30. - P. 401-404.

112. BUZALA E. Diagnostic value of FLK/BLV antigen in PLA test for the detection of bovine leukosis / E. BUZALA, RULKA J. // J. Medycyna Weterynaryjna. 2003. - Vol. 59, № 10. - P. 935-938.

113. Campbell, A.M. Monoclonal antibody technology / A.M. Campbell. Amsterdam, 1985. - 326 p.

114. Carrel, A. Human sarcoma cultivated outside of the body / A. Carrel, Burrows M. // J. Am. Med. Ass. 1910. - 8. - 1289. - P. 55.

115. Carrel, A. The method of tissue culture and its bearing in pathologic problems / A. Carrel // Brit. Med. J. 1924. - Vol. 11. - P. 140.

116. Cell characterization by use of multiple genetic markers / B. Hukku et al. // Jr. Adv. Exp. Med. Biol. 1984. - P.13-31.

117. Cell Culture Contamination Example. Mycoplasma Электронный ресурс. Режим . доступа: http://www.unc.edu/depts/tcf/mycoplasma.htm.

118. Chambers, V. Some observations on the growth of western equine encephalomyelitis virus in cultures of L cells / V. Chambers, C. Evans // Bact. Proc. 1952. - 42 p.

119. Chen, T.R. Chromosome identity of human prostate cancer cell lines, PC-3 and PPC-1 / T.R. Chen // Cytogenet. Cell Genet. -1993. Vol. 62. - P. 183-184.

120. Contamination of commercially available fetal bovine sera with bovine viral diarrhea virus genomes: implications for the study of hepatitis C virus in cell cultures / M. Yanagi et al. // J. Infect Dis. 1996. - Vol. 174, № 6. - P. 1324-1327.

121. C-type particles produced by a permanent cell line from a leukemia pig. I. Origin and properties of the host cells and some evidence for the occurrence of C-type-like particles / H. Strandstrom et al.//Virology. 1974. - Vol. 57. - P. 175-178.

122. Darnell, J. Variation in plaque-forming ability among parental and clonel strains / J. Darnell, T. Sawyer // Virology. — 1959. Vol. 8, № 2. - P. 223 - 229.

123. Detection and elimination of adventitious agents in continuous cell lines // G.A. Erickson et al. // Dev Biol Stand. 1989. -Vol.70. - P. 59 - 66.

124. Detection of a cell line contaminated with hog cholera virus / Bolin S.R et al. // Amer. Vet. Med. Assoc. 1994. - Vol. 205, № 5. - P.742.

125. Detection of bovine virus in fetal bovine serum used in cell culture // A.J. Kniazeff et al. // In Vitro. 1975. - Vol. 11. - P. 400403.

126. Duesberg, P.H. Retroviral transforming genes in normal cells / P.H. Duesberg // Nature. 1983. - Vol. 304. - P. 219-226.

127. Dulbecco, R. Viral carcinogenesis / R. Dulbecco // Cancer Res. 1961. V. 21, № 8. - P. 975 - 980.

128. Durham, P.J.K. Use of polyethyleneglycol treated sera for virus production in cell culture / P.J.K. Durham, J.R. Smith, R.H. Johnson // Virol. Meth. 1982. - Vol. 5. - P. 329-334.

129. Earle, W. Production of malignant in vitro. V. Results of injection's of cultures into mice / W. Earle, A. Nettleship // J. Nat. Cancer, Inst. 1943. - Vol. 4. - 213 p.

130. ED(27) Trophoblast-like Cells Isolated from First-trimester Chorionic Villi are Genetically Identical to HeLa Cells Yet Exhibit a Distinct Phenotype // D.A. Kniss et al. // Placenta. 2002. -Vol.23, № 1. - P.32-43.

131. Eiring, A. Comparative susceptibility of cells of the same type to infection by poliomyelitis virus / A. Eiring , W. Scherer // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1955. - Vol 61, № 4. - 806 p.

132. Enders, J.F. Cultivation of the Lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of varioushuman embryonic tissues / J.F. Enders, T.H. Weller, F.C. Robbins // Science. 1949. - Vol. 109. - P. 85 -87.

133. Establishment of a continuous embryonic cell line from Japanese flounder Paralichthys olivaceus for virus isolation / S.L. Chen et al. // Dis. Aquat. Org. 2004. - Vol. 60. - P. 241-246.

134. Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line / D. Beier et al. // J. of Virologicall Methods. 2004. - Vol. 121, № 2. - P. 239-246.

135. Establishment of a normal medakafish spermatogonial cell line capable of sperm production in vitro / Y. Hong et al. // Proceeding of the National Academy of Sciense. 2004. - Vol. 101, № 21. - P. 8011-8016.

136. Evaluation of virus excretion by cells persistently infected withithe bovine leukaemia virus (BLV) using monoclonal antibodies / L.1.ames et al. // J. Clinical Virology. 2001. - Vol. 22, № 1. - P. 31-39.

137. Ford, C.E. A colchicines, hypotonic, citrate, squash sequence for mammalian chromosomes / C.E. Ford, J.L. Hamerton // Stain Tech-nol. 1956. - Vol. '31. - P. 247-251.i

138. Gartler, S.M. Apparent Hela cell contamination of human het-eroploid cell lines / S.M. Gartler // Nature. 1968. - Vol. 217, № 5130. - P. 750-751.

139. Gey, G.O. Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium / G.O. Gey, W.D. Coffman, M.T. Kubicek // Cancer Res. 1952. - Vol.12. - P. 264265.

140. Goat milk epithelial cells are highly permissive to CAEV infection in vitro / L. Mselli-Lakhal et al. // Virology. 1999. - Vol. 259, N 1.- P. 67-73.

141. Gold, M. The cells that would not die / M. Gold // Science -1981. Vol.81. - P. 29-35.

142. Gold, M. A Conspiracy of Cells: One Woman's Immortal Legacy and the Medical Scandal It Caused / M. Gold // State University of New York Press, 1986.

143. Gratzek, J.B. Detection and isolation of a virus contaminating a stock of virus diarrhea virus / J.B. Gratzek, D. Segre, D.T. Berman // Am J Vet Res. 1964. - Vol. 25. - P. 374-379.

144. Harris, H. Behaviour of differentiated nuclei in heterokaryons of animal cell from different species / H. Harris // Nature. 1965. -Vol. 206. - P. 583-588.

145. Harrison, R.G. Observations on the living developing nerve fiber / R.G. Harrison // Proc. Soc. Exp. Biol. N.Y., 1907. - Vol.4. - P. 140.

146. Hayflick, L. The serial cultivation of human diploid cell strain / L. Hayflick, P.S. Moorhead // Exp. Cell. Res. 1961. - Vol. 25. -P. 585-621.

147. Hsu, T. Mammalian chromosomes in vitro. IX. On genetic polymorphism in cell populations / T.' Hsu, O. Klatt // J. Nat. Cancer Inst. 1958. - Vol. 21, № 3. - P. 437-456.

148. Hull, R. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2 and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research / R. Hull, W. Cherjy, O. Tritch // J. Exp. Med. -1962. Vol. 115, № 5. - P. 903 - 917.

149. Increase of antigen production in BLV-infected cell lines via additional expression of tax / H.J. Wagner et al. // Zentralbl Veteri-narmed B. 1995 Nov. - Vol. 42, № 9. - P. 543-50.

150. Infection with Bartonella weissii and detection of Nanobacterium antigens in a North Carolina beef herd / E.B. Breitschwerdt et al. // J Clin Microbiol. 2001 Mar. - Vol.39, № 3. - P. 879-882.

151. In vitro activity of new quinolones against human mycoplasmas / J. Renaudin et al. // Int. Cong, of the International organization for mycoplasmology. Birmingham, (Alabama), 1986. - 275 p.

152. Isolation and characterization of the Japanes flounder (Paralich-thys olivaceus) lymphocystis disease virus / R. Iwamoto et al. // J. Aqut. Anim. Health. 2002. - Vol. 14. - P. 114-123.

153. Jolly, J. Sur la duree de la vie et de multiplication des cellules animals en dehors de l'organisme / J. Jolly // C. R. Soc. Biol. -Paris, 1903. 22. - P. 1266.

154. King, A.A. Viral contamination of fetal bovine serum / A.A. King, J.W. Harkness //\et. Rec. 1975. - Vol. 97. - P. 16.

155. Kohler, G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler,-. C. Milstein // Nature. 1975. - Vol. 256. - P. 495-497.

156. Kurstak, E., Comparative diagnosis of viral diseases / E. Kurstak, C. Kurstak. — N.Y., 1977. Vol. 1-2.

157. Lavappa, K.S. Survey of ATCC stocks of human cell lines for HeLa contamination / K.S. Lavappa // In Vitro. 1978. - Vol.14, № 5. - P. 469-475.

158. Mowat, G.W. Growth of foot-and-mouth disease virus in a fibroblastic cell line derived from hamster kidneys / G.W. Mowat, W.G. Chapman London: Nature, 1962. - P. 253-255

159. Mycoplasmas Электронный ресурс. / E. Prasad, Д. Lim-Fong. Режим доступа:http://www2.provlab.ab.ca/bugs/biologos/9702mypl.htm

160. Nanobacteria detected in vaccines Электронный ресурс. / NanoNews. . 2001, July. - Режим доступа: http://www.nanobaclabs.com/Files/Newsletter/JulyNANONEWS 1 .p df

161. Nelson-Rees, W.A. Cross-contamination of cells in culture / W.A. Nelson-Rees, D.W. Daniels, R.R. Flandermeyer // Science. -1981.- Vol. 212, № 4493. P. 446-452.

162. New approach to the production of concentrated and purified inactivated polio and rabies tissue culture vaccines / A.L. Van Wezel //Dev. Biol. Stand., 1978. 41. - P. 159-168.

163. Okada, Y. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of two different strains / Y. Okada, F. Murayama // Exp. Cell Res. 1965.,- Vol. 40. - P. 154-158.

164. Outbreak of bovine virus diarrhea on Dutch dairy farms induced by a bovine herpesvirus 1 marker vaccine contaminated with bovine virus diarrhea virus type 2 / H.W. Barkema et al. //Tijdschr Dier-geneeskd.- 2001 Mar 15. Vol. 126, № 6. - P. 158-165.

165. Parker, R.C. Methods of Tissue Culture, 3 rd. ed'/ R.C. Parker // Harper (Hoeber). New York, 1961.

166. Patty, R.E. Growth of foot-and-mouth disease virus in bovine kidney cell suspensions / R.E. Patty, H.L. Bachrach, W.R. Hess // Am. J. Vet. Res., 1960. —P. 144-149.

167. Pearson, H. Isolation of tumor cell colonies in tissue culture / H. Pearson, D. Lagerborg // Proc. Soc. exp. Biol. 1958. - Vol. 98, № 2. - P. 247 - 249.

168. Penso, G. Tissue Cultures in Biological Research / G. Penso, D. Balducci Amsterdam: Elsevier, 1963.

169. Petricciani, J.C. Use of cell lines in biotechnology / J.C. Petric-ciani // Adv. Res. Anim. Cell. Technol.: Proc. NATO Adv. Res. Workshop, Brussels, Sept. 21-24, 1987. Dordrecht etc. - 1989. -P. 65-73.

170. Production and characterization of a continuous embryonic cell line from sea bass (Dicentrarchus labrax L.) / F. Buonocore et al. // Marine biotechnology. 2006. - Vol. 8. - P. 80-85.

171. Puck, T.T. Clonal growth of mammalian cells in vitro. Growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer / T.T. Puck, P.I. Marcus, S.J. Cieciura // Exp. Mtd. -1956. Vol. 103. - P. 273-284.

172. Rapp, F. Observation of measles virus infection of human cells. III. Correlation of properties of clones of H.Ep-2 cells with their susceptibility to infection / F. Rapp // Virology. 1960. - Vol. 10, № 1. - P. 86 - 96.

173. Rhim, J.S. Neoplastic transformation of fetal lamb kidney cells by bovine leukemia virus / J.S Rhim, M. Kraus, P. Arnstein // International Journal of Cancer. 2008. - V. 31, Issue 6. - P. 791795.

174. Rolleston, W.B. Bovine serum: reducing the variables through the use of donor herds / W.B. Rolleston // Dev. Biol. Stand. 1999. -Vol. 99. - P. 79-86.

175. Roux, W. Beitrage zur Entwicklungsmechanik des Embryo / W. Roux // Z. Biol. 1885. - 21. - P. 411.

176. Russeff. Chr. Characterisierung von Picornaviren, die aus Zellkulturen von Ferkelnieren isoliert wurden / Russeff. — Zbl.: Veterinarmed, 1970. H 2 - P. 300-306.

177. Sachs, L. In vitro transformation of normal cells by polyoma virus / L. Sachs, D. Medina // Nature. 1961. - Vol. 189, № 4763. -P. 457 - 458.

178. Scherer, W.F. Host cell-virus relationship in vitro studied with a pure strain of mammalian cell (L strain, Earle) / W.F. Scherer // Federat. Proc. 1955. - Vol. 61, № 4. - P. 806.

179. Scherer, W. Comparative susceptibility of cells of the same type to infection by poliomyelitis virus / W. Scherer // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1955. - Vol. 61, Art. 4, - P. 806—821.

180. Schmidt, J. Elimination of mycoplasma from cell cultures and establishment of mycoplasma free cell lines / J. Schmidt, V. Erfle // Exp. Cell Res. 1984. - Vol. 152. - P. 565-570.

181. Sensitivity of populations of clonal lines of HeLa cells to polio-viruses / G. Leidy et al. // Proc. Soc. exp. Biol. 1959. - Vol. 102, № 1. - P. 81 - 85.

182. Shein, H. Multiplication and cytopathogenicity of simian vacuolating virus 40 in cultures of human tissues / H. Shein, J. Enders // Proc. Soc. exp. Biol. 1962. - Vol. 109, № 3. - P. 495 - 500.

183. Simian vacuolating virus (SV 40) infection in cell cultures derived from adult human thyroid tissue / A. Rabson et al. // J. Nat. Cancer Inst. 1962. - Vol. 29, № 6. - P. 1123 - 1133.

184. Stacey, G.N. Cell contamination leads to inaccurate data: we must take action now / G.N. Stacey // Nature. 2000, Jan 27. -Vol. 403, № 6768. - P.356.

185. Steinhardt, E. Studies on the cultivation of the virus of vaccinia / E. Steinhardt, C. Israeli and R. Lambert // J. infect. Dis. 1913. -Vol. 13. - P. 294. ,

186. Swim, H. Method for establishing human cells in culture: susceptibility to poliomyelitis after prolonged cultivation / H. Swim, R. Parker // Proc. Soc. exp. Biol. 1953. - Vol. 83, № 3 - P. 577-579.

187. Swim, H. Выступление в дискуссии / H. Swim, R. Parker // В кн. Cellular biology, nucleic acids and viruses. N. Y., 1957. - P. 351-355.

188. Tamoglia, T.W. Laboratory evaluation of bovine respiratory disease vaccines for safety / T.W. Tamoglia // J.Am. Vet. Med. Ass. -1968. Vol.152. - P. 847-850.

189. The activity of cyprofloxsacinand other 4-quinolones against Chlamydia trachomatis and mycoplasma in vitro/ G.L. Ridgway // Eur. J. Clin. Microbiol. 1984. - Vol. 3. - P. 344-346.

190. The requiment for human interferons made recombinant DNA techniques / WHO // Technical report series N 771. Requiment for biological substances 41, 1988".

191. The use of mouse-human hybridomas in human genetics and immunology / C. Croce et al. // Somatic cell genetics. New York; London. - 1982.- P. 55-68.

192. Thornton, D.H. A survey of mycoplasma detection in veterinary vaccines / D.H. Thornton // Vaccine. 1986. - Vol. 4, № 4. - P. 237-240.

193. Transformation of cultures of human tissue infected with simian virus SV 40 / H. Koprowski et al. // J. Cell. a. Comp. Physiol. -1962. Vol. 59, № 3. - P. 281 - 292.

194. Ulrich, K. Treatment of mycoplasma hyorrkinis contaminated tissue cultures with a mixture of antibiotics / K. Ulrich, P. Briand // Acta path. Microbiol, scaud. Sect. B. Microbiology. 1977. - Vol. 85, № 5. - P. 347-349.

195. Vilcek, S. Identification of pestiviruses contaminating cell lines and fetal calf sera / S. Vilcek // Acta Virol. 2001. - Vol. 45, № 2.- P. 81-86.

196. Vogt, M. Virus-cell interaction with a tumor-producing virus / M. Vogt, R. Dulbecco // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1960. Vol. 46. - P. 365 - 370.

197. Vogt, M. Studies on cells rendered neoplastic by pjlyoma virus: the problem of the presence of virus related materials / M. Vogt, R. Dulbecco // Virology. 1962. - Vol. 16, № 1. - P. 41 -51.

198. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source / R.A. MacLeod et al. // Int. J. Cancer.- 1999. Vol. 83, № 4 - P.555-563.