Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Влияние фито - зооэкстрактов на вирусрепродуцирующие свойства культивируемых клеток

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Влияние фито - зооэкстрактов на вирусрепродуцирующие свойства культивируемых клеток"

На правах рукописи

ХАЗИЕВ ЛЕНАР РИНАТОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ФИТО - ЗООЭКСТРАКТОВ НА ВИРУСРЕПРОДУЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

12 ДЕК 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2013

005543851

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научные руководители: Доктор ветеринарных наук, доцент

Плотникова Эдие Миначетдиновна; Кандидат биологических наук Гурьянов Николай Иванович

Официальные оппоненты: Рахматуллин Эмиль Касымович - доктор

ветеринарных наук, профессор, заведующий лаборатории клинической фармакологии и лекарственной токсикологии Ульяновской государственной сельскохозяйственной

академии им. П.А. Столыпина Шулаева Марина Петровна — кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии Казанской государственной медицинской академии

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)

Защита состоится «30» декабря 2013 г в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ -ВНИВИ» (г. Казань). Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на сайте ВАК РФ (vak.ed.gov.ru) и организации (wwvv.vnivi.ru)

Автореферат разослан 2013 г

Ученый секретарь диссертационного /у

совета, кандидат ветеринарных наук В.И.Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Новейшая биотехнология (биоинженерия) - это наука о генно - инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.

Разработка методов культивирования клеток in vitro, освоение этих методов специалистами биофабрик позволила решить многие вопросы реального производства вирусвакцин и диагностикумов. Однако, необходимо дальнейшее совершенствование методов культивирования, получение новых культур клеток, обладающих высокой чувствительностью к вирусам, создание новых клеточных систем на основе гибридизации и генетической

трансформации клеток.

Проблема поиска различных биологически активных компонентов ростовой среды для наиболее эффективного культивирования клеток в вирусологии и биотехнологии актуальна. На сегодня важнейшей составной частью питательных сред, содержащей факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Она остается незаменимым компонентом ростовой среды для большинства клеточных культур (Нариманов А.А., 1991; Хижняк Л.Н., Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков В.И., 2000; Рянский А.Л., 2001; Еремец В.И., 2011;Tayler W., 1974 и др.; Reuveny S. et al.,1986;Velez D. et al., 2006). При культивировании клеток чаще используется сыворотка крови крупного рогатого скота, но ее широкое использование ограничивается дефицитом и высокой стоимостью (Манцыгин Ю.А. и др., 1983; Хаертынов С.Х., 1982; Evege Е. et al. 1985; Jayme D. et al. 1988 и др.). Для стимуляции роста клеток применяются гомо - и гетеровидовые варианты сывороток крови, обычно крупного рогатого скота, лошадей и свиней. Оптимальная концентрация сывороточного компонента в среде при этом составляет 10% (Ганиев И.М., 2007; Гурьянов Н.И., 2008).

Поиск замены ее более дешевыми биологически активными веществами является перспективным (Иванов А.В. и др., 2010; Плотникова Э.М., 2012).

На ранних этапах становления культур клеток широко применялись мышечные экстракты плодов коров, но в последние десятилетия они не используются. Ранее была предпринята попытка оценки биологических свойств и биохимического состава экстрактов из мышц, печени, почек плодов коров (Гильмутдинов РЯ., 2008; Закиров P.P., 2009; Самуйленко А.Я., 2011). Результаты исследований показали, что экстракт из мышц плодов коров является прекрасной биодобавкой в питательные среды при

выращивании клеток для репродукции на них вирусов, с целью получения вакцинных и диагностических препаратов против возбудителей заболеваний сельскохозяйственных животных (Гаффаров Х.З., Гумеров В.Г., 2010; Панин А.Н., Малик Н.И.и др., 2012). Данная проблема решена не полностью, не только с технологической точки зрения, но и в связи с резким уменьшением количества плодов коров на мясокомбинатах.

1.2 Цели и задачи исследований. Цель работы состояла в оптимизации биодобавки в питательные среды при выращивании культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

• получить экстракт из кабачков и мышц щуки;

• исследовать биохимические показатели сывороток крови коров, бычков, плодов коров, экстрактов из остаточных сгустков крови, мышц плодов коров и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки;

• изучить ростстимулирующий эффект сывороток крови коров (СКК), бычков (СКВ), плодов коров (СКПК), экстрактов из остаточных сгустков крови (ЭОСКПК) и мышц плодов коров (ЭМПК), и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки (ЭК+ЭМЩ) в 10% концентрации в питательной среде на перевиваемых культурах клеток LEK, MDBK, Vero, РК-15;

• оценить репродукцию вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) на культуре клеток MDBK, парагриппа-3 (ПГ-3) на культуре клеток LEK; реовируса на культуре Vero, выращенных на питательной среде с вышеперечисленными биодобавками.

1.3 Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующего фактора в питательные среды биодобавки, состоящей из экстрактов кабачков и мышц щуки. Установлено, что комбинированный экстрактов в 10% концентрации в питательной среде хорошо стимулирует рост клеток при сравнительно низкой плотности их посева - 40 тыс. кл/см2, LEK - 5,65±0,12, MDBK - 5,74±0,13, РК-15 - 5,74±0,16, Vero - 6,85±0,11, что практически лишь незначительно уступает контролю. Дается характеристика комбинированного экстракта по основным биохимическим показателям, которые сравнительно ниже, чем у сывороток крови крупного рогатого скота и их экстрактов, но несмотря на это данная биодобавка хорошо стимулирует рост клеток. Впервые проведена оценка репродукции вирусов ИРТ, ПГ-3 крупного рогатого скота на перевиваемых культурах клеток MDBK и LEK, а

также реовируса тип I штамма «Lang», на клетках Vero с добавлением в их ростовую среду комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки.

Подана заявка на предполагаемое изобретение РФ «Разработка метода получения клеток почек от новорожденных крольчат». Плотникова Э.М., Глаголева И.С., Хазиев JI.P. и др.- приоритетная справка ФИПС №2013107101/ 20 (0110574) 18.02.13 г.

1.4 Практическая значимость работы. Разработана технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки; показана возможность его применения в средах для культивирования перевиваемых линий клеток с целью репродукции на них вирусов. Результаты выполненных исследований используются в производственном процессе в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБУ «ФЦГРБ-ВНИВИ» г. Казань.

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях: «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); Международная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013 г.).

1.6 Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки на основе раствора Хэнкса в качестве биодобавки в питательные среды при выращивании перевиваемых культур клеток и репродукции на них вирусов;

2. Ростовые свойства экстракта, состоящего из биологически активных веществ растительного и животного происхождения относительно перевиваемых линий клеток LEK, MDBK, Vero, PK-15 при добавлении его в культуральную среду в концентрации 10%;

3. Репродукция вирусов на перевиваемых культурах клеток, выращенных на среде с использованием сочетанного экстракта.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 119 страницах компьютерного текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка

литературы и приложений. Работа содержит 11 таблиц, проиллюстрирована 21 рисунком. Список использованной литературы включает 163 библиографических источников, в том числе 47 на иностранном языке и 4 ссылки на интернет - сайт.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» в течение 2010 — 2013 гг согласно государственной программе НИР (№ гос. регистрации 01200202602).

Культуры клеток, использованные в опытах: MDBK - перевиваемая линия клеток почки эмбриона крупного рогатого скота, полученная Madin S., Darby N. (1958); Vero — перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки, полученная Yasumura Y., Kawakita Y. В 1992 г. (Каталог специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных, 2006); LEK — перевиваемая линия клеток легких эмбриона крупного рогатого скота, полученная S.H. Darbi, 1957; РК - 15 — перевиваемая линия клеток почки взрослой свиньи.

Ростовые и поддерживающие питательные среды для культур клеток и растворы: 0,5% раствор гидролизат лактальбумина (ГЛА) на растворе Хэнкса (НПО «Вектор», Россия); среда Игла МЕМ (рН 7,2 - 7,4) с глутамином (НПО «Вектор», Россия); синтетическая среда 199 (НПО «Вектор», Россия); сбалансированный раствор Хэнкса по стандартной прописи рН 7,2 - 7,4; раствор трипсина, раствор трипсина и Версена; стерильная сыворотка КРС, сыворотка плодов коров, экстракты растительного и животного происхождения.

Все растворы готовили на деионизированной воде, полученной на установке Milli - Q с электросопротивлением 10-18 Мом. см'1.

Приборы и оборудование: термостат ТСО-1/80 СПУ, Biological thermostat ВТ 120; сухожаровой стерилизационный шкаф ШСС 1000 ПР, стерилизатор паровой ГК-100-3, установка для получения деионизированной воды Milli-Q, морозильник-ларь «POSIS-СВИЯГА»; мембранные фильтры фирмы «Millipore» из филиала в Ирландии, «Владисарт» г. Владимир РФ; фотоаппарат Canon powershot А 75 (Япония), микроскоп Nicon TS 100-FMFA33400; фотоэлектроколориметр КФК-2-УХЛ 4.2; иономер И-120; сосуды Дьюара; биохранилище ХБ-05; камера Горяева; предметные и покровные стекла.

Химические реактивы: 0,1% раствор колхицина; ледяная уксусная кислота; краситель азур-эозин по Романовскому-Гимзе; пипетки на 10, 20 мл; колбы на 0,25 л с резиновыми пробками.

Сыворотку крови плодов коров готовили в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по патенту № 2455015 «Способ получения сыворотки крови плодов коров для культивирования клеток животных и человека» от 10 июля 2012 г., сыворотку крови взрослого крупного рогатого скота - по патенту № 2460786 «Способ получения сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота для культивирования клеток животных и человека» от 10 сентября 2012 г.

Для приготовления комбинированной биодобавки для питательных сред использовали гомогенизированные кабачки и мышцы щуки, экстрагируя из них питательные вещества раствором Хэнкса (рН- 7,2) в течение 24 часов при 2 °С в перемешиваемом состоянии, а затем помещали в морозильную камеру при -20 °С. Соотношение раствора Хэнкса с экстрагируемыми материалами составляло 1:3. После чего экстракты предварительно очищали через глубинные фильтры EKS, затем стерилизовали мембранными фильтрами, как указано выше. Комбинированный экстракт из кабачков и мышц щуки готовили следующим образом: отдельно получали экстракты из кабачков и мышечной ткани щуки, извлекали из них питательные вещества раствором Хэнкса, проводили их сбор, а затем смешивали их в соотношении 1:1.

Перевиваемые линии клеток культивировали по общепринятой методике (Р. Адаме, 1983) в стандартных условиях: монослойно, в термостате при температуре 37°С. Маточные культуры выращивали в стеклянных матрасах емкостью 200 мл. Сыворотки крови крупного рогатого скота и экстракты использовали в культурапьных средах в 10%-ной концентрации с добавлением различных антибиотиков.

В качестве контроля в опытах использовали сыворотку крови бычков и плодов коров. Монослой маточной культуры снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), далее получали клеточную суспензию и в концентрации 40 тыс. кл/мл рассевали по 2 мл во флаконы емкостью 10 мл с посевной площадью 3 см2. Пролиферативная активность культур клеток MDBK, LEK, РК - 15 и Vero исследовалась после 72-х часовой инкубации в средах с экстрактами растительного и животного происхождения, а также с сыворотками крови крупного рогатого скота. Клетки снимали со стекла раствором трипсина-версена (1:3), наливая в каждый флакон по 3 мл, и подсчитывали в камере Горяева.

Контроль клеточных культур на стерильность проводили путем посева на бактериологические среды: МПА, МПБ, Сабуро, Кит - Тароцци.

При выполнении работы по изучению влияния сывороток крови животных и комбинированного экстракта из растительного и животного материала на репродукцию вирусов использовали вакцинные штаммы «ТК-А (ВИЭВ) - В 2» вируса ИРТ и «ПТК- 45/86» вируса ПГ-3 КРС, которые получены из Всероссийского научно- исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Коваленко Я.Р. (г. Москва), а также реовирус, тип I референтный штамм "Lang" (Великобритания).

Цифровой материал подвергался статистической обработке на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики (Плохинский H.A., 1978) с использованием программы Microsoft Excel.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Физико-химический и биохимический состав сывороток крови взрослого крупного рогатого скота и их плодов, экстрактов из мышц, остаточных сгустков крови плодов коров и комбинированного

экстракта из кабачков и мышц щуки Проведено сравнительное изучение качественных показателей сыворотки крови бычков и коров, экстрактов из остаточных сгустков крови плодов коров, комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки (оптическая плотность, содержание общего белка и гемоглобина, ростстимулирующая активность).

Ростстимулирующую активность сыворотки крови оценивали на перериваемых культурах клеток LEK и MDBK по индексу пролиферации после 72 ч роста при плотности посева 40 ООО кл/см2 и по кратности увеличения клеточной популяции после 5 суточного роста при плотности посева 20 ООО кл/см". Клетки культивировали во флаконах Карреля с посевной площадью 8 см2 в среде Игла MEM с глутамином и канамицином и 10 % биологически активными добавками. Полученные результаты исследований сывороток крови бычков и крови приводятся в табл. 1.

Таблица 1 - Качественные показатели сыворотки крови бычков и коров

Показатели Сыворотка крови

Бычков Коров

М±т М±т

Прозрачность, ед. оптической плотности, после: Сбора сыворотки Достоверность Центрифугирования сыворотки 0,275±0,15 Р<0,001 0,162±0,01 0,520±0,05 0,202±0,005

Достоверность Р<0,001

Общий белок, г/100 мл 7,11±0,10 7,62±0,12

Остаточный гемоглобин, мг/100 мл 46,4±1,2 86,7±8,4

Ростстимулирующая активность сыворотки крови на культурах клеток по: Индексу пролиферации Кратности увеличения клеточной популяции 6,21-6,66 9,4-10,8 5,85-6,03 9,0-9,3

Установлено, что оптическая плотность сыворотки крови коров превышала таковую бычков почти в 2 раза. После центрифугирования оптическая плотность сыворотки крови коров снижалась, хотя и была несколько выше, чем таковая бычков. Ростстимулирующая активность сыворотки крови коров (по индексу пролиферации и кратности увеличения клеточной популяции) на культурах клеток ЬЕК и МОВК уступает биологической активности сыворотки крови бычков.

Как показано в предыдущих исследованиях, сыворотка крови бычков лучше, чем сыворотка крови коров, но ее качество зависит от времени отстоя крови, что отражено в табл.2.

Таблица 2 - Качественные показатели сыворотки крови бычков в

зависимости от времени отстоя

Показатели Время отстоя сыворотки крови, ч

24 48 72

Прозрачность при 540 Нм оптической плотности (М±т) 0,457±0,026 0,273±0,021 0,234±0,012

Достоверность, Р <0,001 <0,001

Общий белок, г/л (М±т) 68,6±0,6 65,4±0,5 70,1±0,7

Достоверность, Р <0,01 <0,001

Биологическая активность на перевиваемых культурах клеток LEK и MDB К: Индекс пролиферации Кратность увеличения клеточной 1 популяции через 5 сут, х 5,12-5,23 8-9 6,10-6,35 10-11 6,52-6,92 11-12

Установлено, что после 72- х часового отстоя прозрачность сыворотки I бычков повышалась почти в 2 раза (0,234±0,012 ед. оптической

плотности) по сравнению с таковой после 24 часового отстоя (0,457±0,026). Центрифугируя отобранные пробы сыворотки в течение 10 мин при 1500 об/мин, установлено, что их оптическая плотность была низкой, практически одинаковой для всех проб и не зависела от времени отстоя сыворотки. Так, через 24 ч прозрачность составляла 0,457±0,026 ед. оптической плотности, через 48 ч — 0,273±0,021 и через 72 ч — 0,234±0,012 ед. оптической плотности. При культивировании клеток показано, что ростстимулирующая активность сыворотки крови бычков повышалась с увеличением продолжительности ее отстоя.

Нами приготовлена и апробирована принципиально новая биодобавка в питательные среды, состоящие из экстрактов растительного и животного происхождения: экстрактов кабачков и мышечной ткани щуки, приготовленных на растворе Хэнкса в соотношении 1:3 и взятых в комбинации 1:1 в концентрации 10% по отношению к культуральной среде. Во всех случаях сгустки и мышечную ткань плодов коров, щуки, а также кабачков выдерживали с растворами 24 ч при 2° С, несколько раз перемешивая. Далее экстракты центрифугировали в первичной посуде и собирали супернатанты. Сыворотку крови, а также ростовые вещества из остаточных сгустков крови плодов коров и их мышечной ткани после замораживания и оттаивания стерилизовали через мембранные фильтры.

Физико - и биохимические показатели биологических добавок культуральных питательных сред представлены в табл. 3 Таблица 3 - Физико - и биохимические показатели биологических добавок

культуральных питательных сред.

Биологические Оптическая Общий Свобод- Общие

добавки в среды плотность, ед. рН белок, ный

опт.пл. г/л гемоглобин, г/л липиды, г/л холесте рин, ммоль/л

„ контроль 0,243±0,02 7,65±0,05 61,2± 0,45± 1,65±0,18 0,81±

н бычков 0,09 0,07 0,04

о. о контроль 0,092±0,06 7,41±0,03 24,5± 0,14± 0,36±0,0б 0,17±

3 плодов 1,2 0,03 0,04

коров

сгустков 0,098± 7,47± 13,2± 0,18± 0,42± 0,07±

& крови плодов коров 0,008*** 0,04* 0,6*** 0,02*** 0,08*** 0,01***

п мышц 0,103±0,005** 7,31± 8,2± 0,18± 0,42± 0,03±

плодов 0,06* 0,06*** 0,03*** 0,07** 0,01***

| коров

1 кабачков+ 1 мышщ щуки 0,081± 0,004*** 7,26± 0,04* 9,1± 0,04*** 0*** 0,15± 0,07*** 0,02± 0,01***

- уровни достоверности различия с контролем (р),

соответственно <0,005; <0,01; <0,001.

Из таблицы 3 следует, что сыворотки крови бычков и плодов коров по физико-химическим показателям соответствуют требованиям, предъявляемым к ним Минздравом РФ. Что касается экстрактов из остаточных сгустков крови и мышечной ткани плодов коров, а также ассоциированного экстракта из кабачков и мышц щуки, то они имеют сравнительно низкие оптическую плотность, концентрации общего белка, свободного гемоглобина, общих липидов, в том числе холестерина. Но, несмотря на это, как показано в дальнейших исследованиях, эти экстракты являются хорошими биодобавками в питательные среды при культивировании клеток, что не является парадоксальным, так как лишь незначительная часть биологически активных веществ используется клетками при их культивировании.

3.2 Влияние экстрактов на пролиферативную активность клеток При культивировании перевиваемых клеток LEK, MDBK, РК-15, Vero установлено, что лучшую пролиферацию их обеспечивают сыворотки крови плодов коров и бычков, как контрольные (ИП 6,12-7,08). Проведенными опытами установлена практически такая же ростстимулирующая активность и комбинированной биодобавки из экстрактов мышщ щуки и кабачков.

Более детально ростстимулирующую активность различных биодобавок, на перечисленных выше перевиваемых культурах клеток, мы приводим в табл.4.

Таблица 4 - Рост перевиваемых культур клеток на среде Игла MEM с

сыворотками крови животных и экстрактами

Вид сыворотки крови, экстрактов Индекс пролиферации клеток через 72 ч после посева

LEK MDBK РК-15 Vero

СКПК 6,06±0,10 6,03±0,17 7,08±0,11 7,02±0,18

СКБ 6,12±0,23 6,08±0,10 5,83±0,14 7,06±0,14

ЭОСКПК 5,77±0,14 6,02±0,15 5,77±0,15 7,00±0,13

ЭМТПК 5,82±0,15 5,86±0,09 5,71±0,10 6,98±0,20

ЭК+ЭМЩ 5,65±0,12 5,74±0,13 5,74±0,1б 6,85±0,11

Установлено, что экстракты из тканей плодов коров и комбинированный экстракт из кабачков и мышц щуки при 10% - ой концентрации в питательной среде хорошо стимулируют рост клеток при сравнительно низкой плотности их посева (20 тыс. кл/см2), что показано нами на примере культивирования перевиваемых линий клеток РК - 15 и Vero. Результаты исследований в данном направлении отражены в табл. 5.

Таблица 5 - Рост клеток РК - 15 и Vero на среде Игла MEM, дополненной СКПК, СКВ, ЭОСКПК, ЭМТПК, ЭМЩ+ЭК

Биологические добавки Кратность увеличения клеточных линий через 5 сут культивирования

РК - 15 Vero

СКПК 12 х 11 X

СКВ 11 X 11 X

ЭОСКПК 10 х 10х

ЭМТПК 10 х 9 х

ЭК+ЭМЩ 9 х 8 х

3.3 Влияние экстрактов в составе питательных сред на репродукцию

вирусов

Применение экстрактов из органов и тканей плодов коров, а также комбинированного экстракта растительного и животного происхождения в ростовой среде могут повышать репродуктивную активность вирусов в культуре клеток за счет отсутствия в них антител к соответствующим вирусам.

В ходе эксперимента нами было проведено 5 последовательных пассажей вирусов ИРТ, ПГ - 3.

Вирус ИРТ легко культивируется в монослое перевиваемой линии клеток МЭВК и его цитопатогенное действие (ЦПД) отмечается через 48-96 ч после заражения. Первичные признаки ЦПД выражаются появлением зернистости, округлением клеток, которые располагаются группами в виде скоплений с утонченными перемычками и гроздьями по концам. Вирус ПГ-3 вызывает появление в зараженном монослое гранулированных и вакуолизированных клеток или многоядерных симпластов, которые возникают в результате слияния нескольких клеток.

Данные о репродукции вирусов ИРТ, ПГ - 3 на культурах клеток МЕ>ВК и ЬЕК, выращенных с применением сыворотки крови и экстрактов в культуральной среде отражены в табл. 6.

Таблица 6 - Репродукция вирусов ИРТ и ПГ-3 на перевиваемых линиях клеток LEK и MDBK

Вид сыворотки крови и экстрактов Культура клеток

MDBK LEK

ТитрЫ ВИРУСОВ lg ТЦЦзо/мл

ИРТ ПГ-3

СКБ, контроль 6,6±0,2 6,5±0,1

СКПК 7,1 ±0,2** 6,8±0,3**

ЭОСКПК 6,7±0,1* 6,6±0,2*

ЭМПК 6,5±0,3* 6,4±0,1*

эк+эмщ 6,6±0,2* 6,4±0,3*

ТЦЦ50/мл - тканевая цитопатическая доза вируса;

*» ** " уровни достоверности различия с контролем (р), соответственно <0,05; <0,01.

Из данных таблицы 6 видно, что наибольшее количество вирусной массы ИРТ и ПГ-3 было получено при использовании в качестве ростстимулирующей добавки в ростовую среду СКПК и СКБ. Из исследованных биодобавок наилучшим оказался экстракт из остаточных сгустков крови плодов коров. При этом репродукция вируса ИРТ была выше, чем вируса ПГ-3 и его титр незначительно ниже контроля.

Нами также было проведено пассирование реовируса типа I штамма "Lang" на перевиваемой культуре клеток Vero.

Данные о репродукции реовируса на культуре клеток Vero, выращенной с применением сыворотки крови и экстрактов в культуральной среде отражены в табл. 7.

Таблица 7 - Репродукция реовируса типа I штамма «Lang» на перевиваемой

культуре клеток Vero

Вид сыворотки крови и экстрактов Титр вируса в РГА, '/п

СКБ, контроль 32

СКПК 64

ЭОСКПК 32

ЭМПК 64

эк+эмщ 64

Как видно из таблицы, репродукция реовируса на культуре клеток Vero с добавлением в культуральную среду экстракта мышц плодов коров и комбинированной биодобавки из экстракта кабачков и мышц щуки была

выше, чем в контроле и не уступала его накоплению в клетках, выращенных с сывороткой крови плодов коров.

Цитопатическое действие реовируса на культуру клеток Vero показано на рис. 1.

Экстракт из мышечной ткани плодов коров

Комбинированная биодобавка (ЭК+ЭМЩ)

Рис. 1. Цитопатическое действие реовируса крупного рогатого скота в культуре клеток Vero с доба&пением экстракта из мышечной ткани плодов коров и комбинированной биодобавки (ЭК+ЭМЩ).

А - незараженные культуры клеток; Б - зараженные культуры клеток.

4 ВЫВОДЫ

1. Методом гомогенизации кабачков и мышц щуки с последующим экстрагированием их раствором Хэнкса изготовлены фито- и зооэкстракты, которые смешаны в соотношении 1:1, а затем использованы в качестве биологически активной добавки в культуральную питательную среду для выращивания клеток и репродукции на них вирусов.

2. Изучение биохимического состава полученных экстрактов показало, что в них содержатся следующие биологически активные вещества: белки, углеводы, жиры, органические кислоты, моно- и дисахариды, витамины: группы А, В, С, Е, Н, ферменты, макро- и микроэлементы (Са, Mg, К, Na, Р, I, Си, Мп).

3. Максимальная пролиферативная активность клеток LEK, MDBK, РК - 15 и Vero через 72 ч их культивирования при использовании фито- и зооэкстрактов составляла 5,65±0,12 - 6,98±0,20, что не уступает таковой сывороток крови плодов коров и бычков.

4. Применение фито - зооэкстрактов в культуральной среде при выращивании перевиваемых линий клеток в продолжение 10-ти пассажей существенных морфологических изменений по сравнению с контролем не вызывало. При использовании комбинированного экстракта при культивировании клеток модальный класс хромосомных пластинок в них увеличивался на 10% по сравнению с сывороткой крови плодов коров и на

11% - с сывороткой крови бычков.

5. Репродукция реовируса типа I штамма «Lang» в культуре клеток Vero, выращенной на питательной среде с экстрактом мышц плодов коров, а также кабачков и мышц щуки (титр= 1:64 в РГА, 1/п) в 2 раза выше, чем при использовании сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота (титр-1:32 в РГА, 1/п) и имеет сопоставимое значение, когда клетки выращены на среде с сывороткой крови плодов коров (титр = 1:64 в РГА, 1/п).

6. Репродукция вируса инфекционного ринотрахеита в культуре клеток MDBK, когда в ростовой среде находилась сыворотка крови взрослого крупного рогатого скота (титр=6,6±0,2 lg ТЦЦ50/мл), но на 0,5 lg ТЦД50/мл меньше в случае использования сыворотки крови плодов коров

(7,1±0,2 lg ТЦД50/мл).

7. Титр вируса парагриппа - 3 в культуре клеток LEK, выращенной на среде с комбинированным экстрактом из кабачков и мышц щуки, был незначительно ниже (6,4±0,3 lg ТЦД50/мл), по сравнению с тем, когда в ростовой среде находилась сыворотка крови взрослого крупного рогатого скота (6,5±0,1 lg ТЦЦ50/МЛ) и на 0,4 lg ТЦЦ50/мл - при содержании в питательной среде сыворотки крови плодов коров.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны «Методические рекомендации по применению перевиваемой линии клеток РК-15 для репродукции вирусов: рео-типа 1, корона, диареи в вирусологических и диагностических исследованиях» (утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 18. 12. 2011г).

2. Разработаны «Методические рекомендации по ускоренному получению сыворотки крови животных для культивирования клеток и вирусологических исследований методом центрифугирования (утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 15.04. 2012г).

3. Разработаны «Методические рекомендации по использованию культуры клеток МБВК с различными сыворотками крови животных при репродукции вирусов ИРТ и ПГ - 3 (утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 15.04.2013г)

4. Разработана «Инструкция по получению и контролю качества комбинированного экстракта растительного и животного происхождения при культивировании клеток и репродукции вирусов на них», что регламентируется нормативно - методической документацией, утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 18. 10. 2013г.

5. Акт комиссионной проверки по получению и контролю качества комбинированного экстракта растительного и животного происхождения для культивирования клеток и репродукции на них вирусов, утв. зам. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по НИР, проф. Папуниди К.Х. от 10.10.2013.

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Плотникова, Э.М. и др. Изучение свойств перевиваемых линий клеток после рекриооконсервации/ Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, Е.Ю. Хамзина, А .И. Самсонов, Л.Р. Хазиев// Ветеринария № 12. - 2012. - С. 54 - 57.

2. Хазиев, Л.Р. Цитогенетический анализ культуры клеток линии ЬЕК/ Л.Р. Хазиев// Ученые записки КГАВМ,-Казань. - Т.211. - 2012. - С. 180 - 182.

3. Плотникова, Э.М. и др. Способ оптимизации состава и свойств культуральной среды для репродукции вирусов/ Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, И.С. Глаголева, Л.Р. Хазиев// Ученые записки КГАВМ,- Казань. - Т.211. - 2012. - С.183-187.

4. Хазиев, Л.Р. Количественный разброс хромосом культур клеток РК-15 при культивировании в среде с добавлением сыворотки крови разных видов животных/ Л.Р. Хазиев// Матер. Междунар. науч. - пракг. конф. молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов».-2013.-С. 149- 150.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф. 022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 27.11.2013 г. Печ.л. 1,0 Заказ № К-7348. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Хазиев, Ленар Ринатович, Казань

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ ДЕПАРТАМЕНТ НАУЧНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ И

ОБРАЗОВАНИЯ

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ» (г. Казань)

ВЛИЯНИЕ ФИТО - 'ЮОЭКСТР АКТОВ НА ВИРУСРЕПРОДУЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с мико токсикологией и иммунология

03,0! .06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

04201454108

На правах рукописи ХАЗИЕВ ЛЕНАР РИНАТОВИЧ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук Плотникова Э.М., кандидат биологических наук Гурьянов Н.И.

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ........................................................................4

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................................8

1.1 Классификация культивируемых клеток животных и человека..................8

1.1.2 Методы выращивания культур клеток животных....................................................14

1.1.3 Виды контаминации клеточных культур.........................................................19

1.2 Сыворотка крови - важнейший компонент питательных сред для роста и пролиферации большинства культур клеток..........................................23

1.2.1 Биохимический состав сыворотки крови животных............................................26

1.2.2 Сыворотка крови животных и культивирование клеток....................................28

1.2.3 Влияние объективных и субъективных факторов на качество сыворотки крови для выращивания клеток..................................................................31

1.2.4 Роль сыворотки в адгезии и распластывании клеток на субстратах... 40

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................................................44

2.1 Материалы и методы исследований ...................................................................................44

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................................57

3.1 Технологические схемы получения сывороток крови и экстрактов... 57

3.2 Физико - химический и биохимический состав сывороток крови взрослого крупного рогатого скота и их плодов, экстрактов из

мышц, остаточных сгустков крови плодов коров и комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки............... 58

3.3 Кариологический анализ перевиваемых линий клеток................................................................................ 65

3.4 Влияние экстрактов на пролиферативную активность клеток................................................................................... 73

3.5 Влияние экстрактов в составе питательных сред на репродукцию вирусов.............................................................................. 75

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.................... 86

5 ВЫВОДЫ........................................................................... 98

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................................100

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................................................102

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................103

9 ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................................119

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Новейшая биотехнология (биоинженерия) - это наука о генно - инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных (модифицированных) растений, животных и микроорганизмов в целях интенсификации производства и получения новых видов продуктов различного назначения.

Разработка методов культивирования клеток in vitro, освоение этих методов специалистами биофабрик позволила решить многие вопросы реального производства вирусвакцин и диагностикумов. Однако, необходимо дальнейшее совершенствование методов культивирования, получение новых культур клеток, обладающих высокой чувствительностью к вирусам, создание новых клеточных систем на основе гибридизации и генетической трансформации клеток.

Проблема поиска различных биологически активных компонентов ростовой среды для наиболее эффективного культивирования клеток в вирусологии и биотехнологии актуальна. На сегодня важнейшей составной частью питательных сред, содержащей факторы роста клеточных популяций, является сыворотка крови животных. Она остается незаменимым компонентом ростовой среды для большинства клеточных культур (Нариманов А.А., 1991; Хижняк JI.H., Ночевный В.Т., 1994; Дьяконов Л.П., Ситьков В.И., 2000; Рянский А.Л., 2001; Еремец В.И., 2011; Tayler W., 1974 и др.; Reuveny S. et al., 1986; Velez D. et al., 2006). При культивировании клеток чаще используется сыворотка крови крупного рогатого скота, но ее широкое использование ограничивается дефицитом и высокой стоимостью (Манцыгин Ю.А. и др., 1983; Хаертынов С.Х., 1982; Evege Е. et al. 1985; Jayme D. et al. 1988 и др.). Для стимуляции роста клеток применяются гомо -и гетеровидовые варианты сывороток крови, обычно крупного рогатого скота, лошадей и свиней. Оптимальная концентрация сывороточного компонента в среде при этом составляет 10% (Ганиев И.М., 2007; Гурьянов Н.И., 2008).

Поиск замены ее более дешевыми биологически активными веществами является перспективным (Иванов A.B. и др., 2010; Плотникова Э.М., 2012).

На ранних этапах становления культур клеток широко применялись мышечные экстракты плодов коров, но в последние десятилетия они не используются. Ранее была предпринята попытка оценки биологических свойств и биохимического состава экстрактов из мышц, печени, почек плодов коров (Гильмутдинов Р.Я., 2008; Закиров P.P., 2009; Самуйленко А.Я., 2011). Результаты исследований показали, что экстракт из мышц плодов коров является прекрасной биодобавкой в питательные среды при выращивании клеток для репродукции на них вирусов, с целью получения вакцинных и диагностических препаратов против возбудителей заболеваний сельскохозяйственных животных (Гаффаров Х.З., Гумеров В.Г., 2010; Панин А.Н., Малик Н.И.и др., 2012). Данная проблема решена не полностью, не только с технологической точки зрения, но и в связи с резким уменьшением количества плодов коров на мясокомбинатах.

1.2 Цели и задачи исследований. Цель работы состояла в оптимизации биодобавки в питательные среды при выращивании культур клеток и репродукции на них вирусов. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

© получить экстракт из кабачков и мышц щуки;

® исследовать биохимические показатели сывороток крови коров, бычков, плодов коров, экстрактов из остаточных сгустков крови, мышц плодов коров и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки;

© изучить ростстимулирующий эффект сывороток крови коров (СКК), бычков (СКБ), плодов коров (СКПК), экстрактов из остаточных сгустков крови (ЭОСКПК) и мышц плодов коров (ЭМПК), и сочетанного экстракта из кабачков и мышц щуки (ЭК+ЭМЩ) в 10% концентрации в питательной среде на перевиваемых культурах клеток LEK, MDBK, Vero, РК-15;

« оценить репродукцию вирусов инфекционного ринотрахеита (ИРТ) на культуре клеток MDBK, парагриппа~3 (ПГ-3) на культуре клеток LEK; реовируса

на культуре Vero, выращенных на питательной среде с вышеперечисленными био добавками.

1.3 Научная новизна работы. Впервые рассматривается возможность введения в практику культивирования клеток в качестве ростстимулирующего фактора в питательные среды биодобавки, состоящей из экстрактов кабачков и мышц щуки. Установлено, что комбинированный экстракт в 10% концентрации в питательной среде хорошо стимулирует рост клеток при сравнительно низкой плотности их посева - 40 тыс. кл/см2, LE К - 5.65-ЮД2, MDBK- 5,74±0,13, РК-15 -5,74±0,16, Vero - 6,85±0,11, что практически лишь незначительно уступает контролю. Дается характеристика комбинированного экстракта по основным биохимическим показателям, которые сравнительно ниже, чем у сывороток крови крупного рогатого скота и их экстрактов, но несмотря на это данная биодобавка хорошо стимулирует рост клеток Впервые проведена оценка репродукции вирусов ИРТ, ПГ-3 крупного рогатого скота на перевиваемых культурах клеток MDB К и LEK, а также реовируса тип I штамма «Lang», на клетках Vero с добавлением в их ростовую среду комбинированного экстракта из кабачков и мышц щуки.

Подана заявка на предполагаемое изобретение РФ «Разработка метода получения клеток почек от новорожденных крольчат». Плотникова Э.М., Глаголева И.С., Хазиев JI.P. и др.- приоритетная справка ФИПС №2013107101/ 20 (0110574) 18.02.13 г.

1.4 Практическая значимость работы. Разработана технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки; показана возможность его применения в средах для культивирования перевиваемых линий клеток с целью репродукции на них вирусов. Результаты выполненных исследований используются в производственном процессе в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» г. Казань.

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях: «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); Международная

научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013 г.).

1.6 Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

1. Технология получения комбинированного экстракта из кабачков и мышечной ткани щуки на основе раствора Хэнкса в качестве биодобавки в питательные среды при выращивании перевиваемых культур клеток и репродукции на них вирусов;

2. Ростовые свойства экстракта, состоящего из биологически активных веществ растительного и животного происхождения относительно перевиваемых линий клеток LEK, MDBK, Vero, РК-15 при добавлении его в культуральную среду в концентрации 10%;

3. Репродукция вирусов на перевиваемых культурах клеток, выращенных на среде с использованием сочетанного экстракта.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 1 страницах компьютерного текста, состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка литературы и приложений. Работа содержит 11 таблиц, проиллюстрирована 21 рисунком. Список использованной литературы включает 163 библиографических источников, в том числе 47 на иностранном языке и 4 ссылки на интернет - сайт.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Классификация культивируемых клеток животных и человека

Культивируемые клетки следует, прежде всего, подразделять по видовой принадлежности животных, от которых они получены. К настоящему времени, в лабораториях развитых стран выращиваются клетки от многих видов животных, например, от собак, китайского хомячка, крыс, мышей и т.д., но, прежде всего, интересует культивирование клеток сельскохозяйственных животных, в частности: крупного рогатого скота, свиней, лошадей, овец. Кроме того, следует учитывать и подразделять культивируемые клетки в зависимости от органа или ткани из которых они получены.

Список типов клеток, которые в настоящее время можно культивировать, достаточно велик. Это клетки соединительной ткани (фибробласты), скелетных тканей (кости и хрящи), гладких мышц сердца, эпителиальных тканей (печень, легкие), молочной железы, кожи, мочевого пузыря, почек, нервной системы (глиальные клетки и нейроны), хотя последние лишены способности к пролиферации, эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз, клетки островков Лангерганса), меланоциты и много различных типов опухолевых клеток (Harris С.С., Trump B.F., Stoner G.D., 1980).

Культуры клеток получают из тканей эмбрионов или взрослых животных. В особую группу следует отнести культуры клеток, полученные из опухолей животных и человека.

Клетки, полученные из опухолей, довольно легко переходят в перевиваемые линии. Из первичных культур клеток от эмбрионов животных довольно часто получают перевиваемые культуры, чего нельзя сказать о клетках из тканей взрослых животных. Существенный вклад по получению перевиваемых линий

клеток внесли как отечественные, так и зарубежные ученые (Хаертынов С.Х., 1982; Дьяконов Л.П., 2011; Puck Т.Т. et al., 1958; Moorhead P.S., 1961; Hayflick L., 1965 и многие др.), сведения о которых отражены в каталоге клеточных культур позвоночных и беспозвоночных животных.

В 1966 г. предложена унифицированная терминология для тканевых культур животных. Основные положения ее приводятся ниже (Самуйленко А.Я., 2011).

Культура тканей (tissue culture) - сборное понятие, обозначающее систему, в которой клетки, ткани или органы сохраняют жизнеспособность или способность размножаться in vitro более 24 ч.

В зависимости от вида биологического объекта различают: культуру клеток (cell culture) - термин, который обозначает рост клеток in vitro и включает в себя также рост единичных клеток (клетки в культуре не образуют ткань); культуру тканей или органов (tissue or organ culture) - термин, который обозначает поддержание роста тканей, зачатков органов или их частей in vitro при сохранении их дифференцировки, структуры и (или) функции.

Эксплантат (explantat) - вырезанный кусок ткани или органа, используемый для культуры in vitro.

Однослойная культура клеток, монослой (monolayer) - клетки, растущие в один слой на определенной поверхности.

Суспензионная культура (suspension culture) - тип культуры, при котором клетки размножаются во взвешенном состоянии в питательной среде.

Первичная культура (primary culture) - культура, для получения которой используют клетки, ткани или органы, взятые непосредственно из организма. К этому понятию не относятся эксплантаты новообразований, возникшие вследствие введения культур клеток экспериментальному животному (Плотникова Э.М., 2010).

Клеточная линия (cell line) получается из первичной культуры после первого пассажа и складывается из большого количества клеточных линий, представленных в первичной культуре.

Стабильная (перевиваемая) клеточная линия (established cell line) -клеточная линия, обладающая способностью к неограниченному количеству пассажей. Стабильной клеточной линией считается такая, которая пассировалась не менее 70 раз с 3-дневными промежутками.

Клеточный штамм (cell strain) выводится из первичной культуры или из клеточной линии путем селекции или клонирования клеток со специфическими свойствами (маркерами). Эти маркеры должны сохраняться во время дальнейшего культивирования. При описании штамма необходимо характеризовать его свойства, например, наличие определенного хромосомного набора, специфических антигенов, устойчивости к определенному вирусу.

Подштамм (substrain) можно получить из штамма путем изоляции единичной клетки или группы клеток, обладающих свойствами, которыми не обладают остальные клетки штамма.

Клон (clone) - популяция клеток, полученная путем деления (митоза) одной клетки. Клон не всегда однороден и не должен быть таким, поэтому нельзя использовать термины «клон» или «клонированный» для обозначения однородной популяции клеток.

Клонированный штамм или линия (clones train or line) - штамм или линия, выведенные из одного клона.

Диплоидная клеточная линия (diploid cell line) -линия клеток, 75% которой имеют такой же кариотип, как и нормальные клетки того вида, из которого они выведены. Диплоидное число хромосом необязательно равнозначно диплоидному кариотипу, поскольку возможны случаи, когда клетка может терять один хромосомальный тин и приобретать дру гой. В этом случае изменяется кариотип клетки, но диплоидное число хромосом сохраняется. Такие клетки следовало бы называть «псевдодиплоидными». Описание диплоидной клеточной линии должно включать фактическое число обследованных клеток, процент диплоидных клеток и кариотип.

Гетероплоидная клеточная линия (heteroploid cell line) - линия клеток, которая содержит менее 75% клеток с диплоидным набором хромосом. Это не

означает, что клетки имеют характер новообразования или обладают способностью к неограниченному росту in vitro. При описании гетероплоидной клеточной линии следует указать наряду с кариотипом процент клеток исходной линии (stemline).

Субкультура (subculture) - перенос клеток из одной системы в другую, пассаж. Пассаж (passage) - синоним субкультуры, т.е. перенос клеток из одной системы в другую. При употреблении этого термина необходимо отметить, что именно пассируется, так как вирусологи используют его для обозначения переноса выращиваемой жидкости, а не клеток. Число пассажей (subculture number) - число переносов выращиваемых клеток из одной системы в другую. Интервал субкультивирования (subculture intervall) - интервал между последующими пассажами. Этот термин не имеет ничего общего с определением «время генерации клеток».

В процессе совместного культивирования клеток разного происхождения было обнаружено, что в некоторых случаях они могут сливаться, образуя гибридные клетки. Это вызвало большой интерес и стимулировало поиски способа направленного получения гетерокарионов в больших количествах. Вначале, для этой цели был использован вирус Сендай, который вызывал слияние