Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Репродукция производственных штаммов вирусов на культуре клеток новорожденных крольчат

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Репродукция производственных штаммов вирусов на культуре клеток новорожденных крольчат"

На правах рукописи

ГЛАГОЛЕВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

РЕПРОДУКЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ВИРУСОВ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛЬЧАТ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 СЕН ¡¿ШЗ

Казан ь-2013

005532650

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань)

Научные руководители: Доктор ветеринарных наук

Плотникова Эдие Миначетдиновна; Доктор биологических наук Иванов Александр Аркадьевич

Официальные оппоненты: Гаффаров Харис Зарипович - доктор

ветеринарных наук, профессор, зав. лабораторией вирусологии Федерального Центра токсикологической, радиационной и биологической безопасности

Васильев Дмитрий Аркадьевич - доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы пищевых продуктов Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН.

Защита состоится «08» октября 2013 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д - 220.012.01 при ФГБУ «Федеральный центр токсикологической радиационной и биологической безопасности» (420075, г. Казань, Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФЦТРБ -ВНИВИ» (г. Казань). Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на сайте ВАК РФ (vak.ed.gov.ru) и организации (www.vnivi.ru)

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного Г/ уГ

совета, кандидат ветеринарных наук г~жпд&ТТЯв Степанов

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы.

Вакцинопрофилакгика до настоящего времени остается основным ветеринарно-санитарным мероприятием (Еремец В.И.,2011). При изготовлении вакцин для выращивания вирусов можно применять ткани любого вида. Тем не менее, на сегодняшний день остается актуальной проблема выведения новых клеточных линий, чувствительных к вирусам -возбудителям болезней людей и животных.

С развитием биологической и фармацевтической промышленности становится более качественным и разнообразным рынок лекарственных средств для животных (Самуйленко А.Я. и др.,2012). Активное использование первичных культур клеток почки эмбриона коров (ПЭК), бычьих тестикул (БТ) и легких или их субкультур, а также перевиваемых линий клеток (МДБК и TP) в вирусологии и постоянно возникающие новые аспекты их применения обусловливают расширение спектра клеточных линий, обладающих различными свойствами (Гаффаров Х.З. с соавт., 2002; Дьяконов Л.П., 2009; Иванов A.B. и др., 2010; Панин А.Н., Малик Н.И. и др. 2012; Плотникова Э.М.и др., 2012).

Клетки эмбрионального происхождения при культивировании обычно сохраняют жизнеспособность более продолжительное время, чем полученные из тканей взрослых организмов (Азаев М.Ш. и др., 2011).

В настоящее время существуют методы получения первичных культур из клеток почек кроликов 20-35 дневного возраста (Митов Б., Бостанджиева Р., 2008). Из этих данных видно, что чем старше возраст доноров, тем меньше вероятность получить первичную культуру и соответственно перевиваемую культуру из тканей, большее количество времени затрачивается на достижение полного монослоя.

1.2 Цели и задачи. Целью исследования являлась разработка способа получения культуры клеток из органов новорожденных крольчат для репродукции производственных штаммов вирусов.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить чувствительность к вирусам: парвовирусу КРС, герпесвирусу типа I, вирусу ПГ-3, вирусу ВД-БС и вирусу болезни Ауески первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат и полученной из неё новой перевиваемой линии (КПНК), и подобрать оптимальные условия их культивирования.

2. Стабилизировать основные биологические характеристики полу-ченныхклеток.

3. Изучить возможность использования антимикробных препаратов для профилактики бактериальной контаминации полученной линии клеток.

1.3 Научная новизна. Впервые получена первичная культура клеток почек от новорожденных крольчат 1-2 дневного возраста и на ее основе выделена новая перевиваемая линия клеток. Установлена возможность

использования данной линии в качестве биологического субстрата для выращивания вирусов, и определены оптимальные условия ее стационарного культивирования.

Подана заявка на предполагаемое изобретение РФ «Разработка метода получения клеток почек от новорожденных крольчат». Плотникова Э.М., Глаголева И.С. и др.- приоритетная справка ФИПС №2013107101/ 20 (0110574) 18.02.13 г.

1.4 Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований для производства вирус - вакцинных препаратов предложен новый способ получения и использования линии клеток почек новорожденных крольчат. По результатам исследований также составлен паспорт по использованию культуры клеток почек новорожденных крольчат.

1.5 Основные положения, выносимые на защиту:

• Чувствительность к вирусам: парвовирусу КРС, герпесвирусу типа I, вирусу ПГ-3, вирусу ВД-БС и вирусу болезни Ауески первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат;

• Усовершенствование метода получения культур клеток от новорожденных крольчат и оптимизация условий их культивирования;

• Культуральные, цитоморфологические, кариологические и вирусрепродуцирующие характеристики стационарной перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат (КПНК) и ее использование в вирусологической практике;

• Биотехнологические параметры стационарного способа культивирования КПНК;

• Возможность использования антимикробных препаратов для профилактики бактериальной контаминации линии клеток.

1.6 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференциях: XVII Межвузовская научная конференция молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011); конференция «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); Международная научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013 г.).

1.7 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано? научных работ, в том числе 4 - в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

1.8 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, собственных исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложений.

Материалы диссертации иллюстрируются 17 таблицами и 13 рисунками. Список литературы содержит 227 литературных источника, в том числе 129 зарубежных авторов.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в 2010-2013 гг. в лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» (г. Казань № 01200202602).

Культуры клеток: первичные культуры клеток почек новорожденных кроликов. Линии диплоидных клеток: MDBK - перевиваемая линия клеток почки эмбриона крупного рогатого скота, полученная Madin S., Darby N. (1958); Vero - перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки, полученная Yasumura Y., Kawakita Y. в 1992 г. (Каталог специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных, 2006); СПЭВ -перевиваемая культура клеток почки свиньи (Каталог специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных, 2006); ВНК-21\13-02 -перевиваемая линия клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная на Щелковском биокомбинате, 2004 г (Каталог специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных, 2006).

Лабораторные животные: кролики породы «Шиншилла» 1-25-дневного возраста, 60 голов, полученные из питомника ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

Ростовые и поддерживающие питательные среды для культур клеток и растворы: 0,5% раствор гидролизат лактальбумина (ГЛА) на растворе Хэнкса (НПО «Вектор», Россия); среда Игла МЕМ (рН 7,2-7,4) с глютамином (НПО «Вектор», Россия), синтетическая среда 199 (НПО «Вектор», Россия); сбалансированный раствор Хэнкса по стандартной прописи рН 7,2-7,4; раствор трипсина, раствор трипсина и Версена; стерильная нормальная сыворотка КРС, сыворотка плодов коров.

Все растворы готовили на деионизированной воде, полученной на установке Milli - Q с электросопротивлением 10-18 МОм. см"1.

Антибиотики: стрептомицина сульфат, бензилпенициллина натриевая соль, канамицин, ципрофлоксацин, цефтриаксон.

Приборы и оборудование: термостат ТСО-1/80 СПУ, Biological thermostat ВТ 120; С02 - инкубатор BINDER, шейкер ÎNFORSAGCH-4103 BIOTTMINGEN (Ecotron), сухожаровой стерилизационный шкаф ШСС 1000 ПР, стерилизатор паровой ГК-100-3, установка для получения деионизированной воды Milli-Q, морозильник-ларь «POSIS-СВИЯГА», мембранные фильтры фирмы «Millipore», центрифуга K70-D,магнитные мешалки: VEB MLW PRUFGRATE-WERK MEDINGEN SITZ FREITAL Тур RH-3, ММ-5, ММЗМ, микроскоп Nicon TS100-FMFA33400, сосуды Дьюара,

биохранилище ХБ-05, аквадистиллятор, автоматические микропипетки (одноканапьные), камера Горяева, предметные и покровные стекла.

Химические реактивы: раствор хлорида натрия рН 7,2-7,4; ледяная уксусная кислота, эфир, колхицин, краситель азур-эозин по Романовскому-Гимзе, метиловый спирт. Кроме того, использовали пипетки автоматические на 200мкп, ЮООмкл, 10мл, колбы на 0,25л с резиновыми пробками.

Первично-трипсинизированные клетки почек новорожденных кроликов получали по общепринятой методике (Дьяконов Л.П., 1986, 2000). Эффективность посева клеток оценивали по доле прикрепления к субстрату клеток с помощью гемоцитомера.

Пассирование первичных культур клеток и линий диплоидных клеток проводили с коэффициентом рассева 1:2 - 1:3. Клетки отделяли от стекла смесью (1:1) 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го раствора Версена при комнатной температуре. Пролиферативную активность культур оценивали с помощью индекса пролиферации (Дьяконов Л.П., 2009). Жизнеспособность клеток в суспензии определяли с помощью 0,5% водного раствора трипановой сини.

Криоконсервирование как первично-трипсинизированных, так и перевиваемых клеток проводили по стандартной схеме (Дьяконов Л.П., 2009). Препараты для рутинного цитогенетического обследования первичных линий клеток готовили по общепринятой методике (MoorheadP. etal., 1960). Окраску хромосомных препаратов проводили с использованием готового красителя азур-эозина по Романовскому.

Контроль клеточных культур на стерильность проводили путем посева на бактериологические среды: МПА, МПБ, Сабуро, Кит - Тароцци.

Вирусологическими методами определяли чувствительность культур клеток почек новорожденных кроликов к парвовирусу крупного рогатого скота типа I (штамм «Parvo 32459»), герпесвирусу типа I (ИРТ) (вакцинный штамм «ТК-А (ВИЭВ) - В 2»), вирусу парагриппа-3 (штамм «SF-4»), вирусу вирусной диареи - болезни слизистых оболочек (штамм «ВК-1») и вирусу болезни Ауески (штамм «Арский»).

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере, используя программу Microsoft Office Excel 2007. Достоверность изменений величин показателей определяли по непараметрическому критерию Вилькоксона.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Разработка метода получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат

3.1.1 Получение первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат

Для получения первично-трипсинизированной культуры клеток использовали кроликов разного возраста. Первично-трипсинизированные клетки выращивали в условиях стационара в стеклянных флаконах емкостью

250мл, флаконах Карреля (диаметром 55мм), на 24- и 6-луночных пластиковых панелях для культивирования клеток, пенициллиновых флакончиках.

Пассирование первичных культур клеток и линий диплоидных клеток проводили с коэффициентом рассева 1:2 - 1:3. Клетки отделяли от стекла смесью (1:1) 0,25%-го раствора трипсина и 0,02%-го раствора Версена при комнатной температуре. Результаты получения первичной культуры клеток почек от кроликов разного возраста представлены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты получения первичной культуры клеток почек от кроликов разного возраста.

Первичная культура клеток Возраст доноров(дни) Получена первичная культура Монослой

Степень(%) Время (дни)

ПК-1 1 + 100 3

ПК-2 2 + 100 4

ГГК-3 5 + 80 4

ГТК-4 7 - 0 14

ПК-5 10 - 0 14

ПК-6 15 + 65 8

ПК-7 20 - 0 14

ПК-8 25 - 0 14

ПК-9 30 + 25 14

ПК-10 35 - 0 14

С увеличением возраста доноров увеличивалось время инкубации и уменьшалась степень образования монослоя. От доноров 1-2 дневного возраста были получены первичные культуры клеток, с образованием полного монослоя, на 3-4 сут культивирования. В то время как от доноров 30 дневного возраста степень образования монослоя к 14 сут культивирования составляла лишь 25%. В 5 опытах (от доноров 7,10,20,25-дневного возраста) результаты получения первичной культуры были не удовлетворительны.

Таким образом, определен оптимальный возраст доноров для получения первично-трипсинизированной культуры клеток почек кроликов -1-2 дня.

3.1.2 Усовершенствование метода получения первичных культур клеток почек новорожденных крольчат

Для приготовления культуры клеток брали 1-2-дневных крольчат. Крольчат наркотизировали, извлекали почки. Снимали капсулу и почки измельчали ножницами на кусочки величиной 1-3 мм. Тщательно отмывали кусочки ткани от остатков крови солевым раствором Хэнкса и подвергали дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина. Трипсинизация была одномоментной с предварительной инкубацией кусочков при 37°С 30-40 минут. Центрифугировали клетки при 1000-1500 об /мин в течение 10 минут.

После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Количество клеток в первично-трипсинизированных взвесях определяли по общепринятой методике с помощью камеры Горяева на микроскопе. Посевная доза первично-трипсинизированных клеток, полученных с помощью трипсинизации из почек новорожденных кроликов, составляла (3-4)* 105 кл/мл. В качестве среды роста использовали Игла MEM, 199, 0,5% раствор гидролизат лактальбумина (ГЛА) и фетальную сыворотку.

Для получения максимально чистой популяции клеток использовали метод, основанный на различных адгезивных способностях клеток (Савченкова и др., 2000). Для этого смесь клеток, полученную в результате механической и ферментативной обработки ткани почек, запивали ростовой средой и культивировали 24 часа. Затем неприкрепившиеся клетки осторожно переносили в новые культуральные сосуды для дальнейшей селекции.

В результате такой двукратной очистки была получена первичная культура клеток почек новорожденных крольчат.

3.2 Подбор оптимальных условий роста первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов

3.2.1 Подбор оптимальной среды культивирования первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов

В процессе культивирования в течение 24 часов клетки прикреплялись к поверхности лунок и имели как эпителиоподобную, так и веретенообразную форму. Для подбора оптимальных условий культивирования исследовали пролиферативную активность клеток при росте на средах: Игла MEM, ГЛА, 199 и их комбинациях. Прирост клеток наблюдали на всех исследуемых средах, однако индекс пролиферации (ИП) зависел от состава среды. В процессе выполнения работы было установлено, что через 72 ч наибольшее значение ИП наблюдалось при культивировании клеток на среде Игла MEM и соответствовало 1,3±0,15.

На 6-е сут культивирования в комбинациях сред Игла МЕМ/ГЛА (1:1) максимальный ИП был несколько ниже и соответствовал 1,26±0,08.

Таким образом, в ходе проделанной работы была подобрана оптимальная среда для культивирования первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных кроликов - Игла MEM.

3.2.2 Изучение влияния концентрации сыворотки крови в ростовой среде на рост клеток первичной культуры почек новорожденных крольчат

Проведены исследования по влиянию концентрации сывороток крови на пролиферативную активность клеток. В опытах использовали сыворотку крови взрослого крупного рогатого скота и плодов коров. Вносили различные концентрации (5-15%) сывороток крови крупного рогатого скота (КРС) и эмбриональной сыворотки (ЭМБР).

Максимальный индекс пролиферации наблюдался при добавлении в питательную среду 10% сыворотки крови КРС и 5% фетальной сыворотки. Формирование полноценного монослоя наблюдалось через 72 ч в лунках с добавлением фетальной сыворотки. В вариантах с сывороткой крупного рогатого скота конфлюэнтный монослой формировался на четвертые сутки.

В результате проведенных исследований определено содержание сыворотки крови КРС и сыворотки плодов коров в ростовой среде на уровне 10% и 5% от объема питательной среды соответственно.

3.2.3 Изучение вирусрепродуцирующих свойств первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных кроликов

Для определения чувствительности первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных кроликов к респираторно-кишечным вирусам крупного рогатого скота, проведено пассирование парвовируса КРС типа I, герпесвируса типа I, вируса парагриппа-3, вируса ВД-БС на клеточном монослое.

В ходе исследований установлено, что эти клетки не чувствительны к парвовирусу КРС типа I. Первичная культура клеток почек новорожденных кроликов поддерживала репликацию вируса парагриппа-3 КРС, вируса ВД-БС и герпесвируса типа I.

3.3 Получение перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат и ее адаптация

3.3.1 Получение перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат (КПНК)

Перевиваемая линия клеток почек новорожденных крольчат (КПНК) получена из первично-трипсинизированной культуры клеток, путем последовательных пересевов на протяжении 75 пассажей. На уровне 60-65 пассажей отмечена стабилизация ростовых и цитоморфологических характеристик клеток.

Бактериологический контроль показал, что данная клеточная линия не содержит бактериальных и грибных контаминантов.

3.3.2 Адаптация перевиваемой линии клеток КПНК к выращиванию в среде с 10% сывороткой крупного рогатого скота

Адаптацию линии КПНК в среде с 10% сывороткой крови КРС осуществляли на 75 пассаже методом последовательных пересевов с полной заменой эмбриональной сыворотки крови на сыворотку крови взрослого крупного рогатого скота в конечной концентрации 10%.

В течение 10 последовательных пассажей культура сохранила свои основные цитоморфологические характеристики и ростовые свойства. Клетки при пересеве с коэффициентом 1:2-1 : 3 формировали конфлюэнтный монослой на 3-4 сут культивирования, который сохранялся без смены среды в течение 10 суток.

Таким образом, адаптация клеток к росту в среде с 10 % концентрацией сыворотки крови КРС показала достаточно высокую трофическую

пластичность полученной перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат.

Полученная клеточная линия КПНК заморожена по стандартной методике (Л.П. Дьяконов,2009) в криозащитной среде (питательная среда -50% сыворотка крови КРС - 40%, глицерин и диметилсульфоксид - 10/о) и хранится в жидком азоте на 80 пассаже. При их размораживании из жидкого азота жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим находилась в пределах 75-80%. Клетки хорошо восстанавливали ростовые свойства на 4-5 пассаже.

3.3.3 Адаптация перевиваемой линии теток КПНК к выращиванию

монослойным методом „

Полученную линию клеток КПНК в течение 10 пассажей адаптировали к монослойному способу культивирования в матрасах Ру, вместимостью 1,5 л (300см2).

В качестве исходных выбрали следующие параметры: . поддерживающая среда - Игла MEM с 10% сывороткой

взрослого крупного рогатого скота;

• заполнение матраса Ру средой 25% от объема;

• посевная концентрация в пределах 3-4x10 кл/мл;

• рН среды 7,3-7,4;

• температура культивирования 37° С;

• продолжительность культивирования 72 часа.

В результате адаптации линии клеток КПНК к монослойному культивированию в матрасах Ру в течение 10 последовательных пассажей при вышеуказанных условиях индекс пролиферации составил 1,/-2,1.

Адаптированную, к монослойному методу выращивания, перевиваемую линию клеток почек новорожденных крольчат в последующем стали именовать перевиваемой линией клеток почек новорожденных крольчат КПНК.

3.4 Оптимизация параметров монослойного культивирования

клеток КПНК -

3.4.1 Изучение влияния концентрации сыворотки крови в ростовой

среде на рост КПНК v-тгж

Учитывая то, что полученная нами перевиваемая линия КПНК

адаптирована к ростовой среде с содержанием 10% сыворотки крови КРС, было проведено изучение влияния концентраций сыворотки в диапазоне 515% на пролиферативную активность данной культуры.

Пролиферативную активность определяли в ростовой среде Игла MEM, с добавлением сыворотки в концентрации 5-15%. Посевная концентрация клеток составляла 3-4x105 кл/мл. Культивирование клеток проводили по общепринятой методике при рН питательной среды 7,2-7,4 и температуре 37,0±0,5°С.

В результате экспериментов установлено, что снижение концентрации сыворотки крови КРС до 5% приводит к замедлению клеточного роста. А при повышении содержания сыворотки до 15% индекс пролиферации оставался примерно, равен тому же, что и при 10%.

Таким образом, при монослойном способе выращивания культуры КПНК оптимальным определено содержание сыворотки крови КРС в ростовой среде на уровне 10% от объема питательной среды.

3.4.2 Оптимизация посевной концентрации меток КПНК для монослойного культивирования

Начальная посевная концентрация клеток при монослойном культивировании является одним из факторов, оказывающих существенное влияние на динамику пролиферативной активности клеток, время культивирования и их жизнеспособность. Поэтому использовали посевные концентрации от 2 до 5*105 кл/мл. Индекс пролиферации рассчитывали по суткам культивирования для каждой начальной посевной концентрации. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 Пролиферативная активность клеток линии КПНК в зависимости от посевной концентрации

п=5

Посевная концентрация (кл\мл) Концентрация клеток и (индекс пролиферации) в зависимости от времени культивирования

24ч 48ч 72ч

2x105 1,1 хЮ3 (0,5) 3,8x10і (1,9) 2,4x10і (1,2)

3x10і 2,7x10і (0,9) 6,3x10і (2,1) 2,5x10і (0,8)

4x10і 3,2x10і (0,8) 8,4x10і (2,1) 2,6x10і (0,6)

5х 10і 2,1x10і (0,4) 8,1x10і (1,6) 3,2x10і (0,6)

Из приведенных в таблице данных видно, что максимальное накопление клеток происходило при посевной концентрации 4x10 кл/мл через 48 ч культивирования и составляло 8,4хЮ5 кл/мл, при этом индекс пролиферации равен 2,1. При посевной концентрации клеток 2x10 кл/мл максимальное накопление клеток наблюдали через 48 ч, и составляло 3,8х105кл/мл, с индексом пролиферации 1,9. Максимальное накопление клеток при посевных концентрациях ЗхЮ5 и 5хЮ5 кл/мл наблюдали через 48 ч, и составляло 6,ЗхЮ5 и 8,1 хЮ5 кл/мл, а индекс пролиферации 2,1 и 1,6 соответственно.

Таким образом, оптимальными для стационарного культивирования клеток КПНК являются посевные концентрации 3-4хЮ5 кл/мл, при которых максимальное увеличение плотности клеток происходит в 2 раза через 48 часов.

3.4.3 Оптимизация концентрации С02 и температуры при выращивании перевиваемой линии клеток КПНК

В процессе культивирования клеток животных in vitro в лабораторных условиях часто используют 5 % содержание углекислого газа в атмосфере

инкубатора. Перевиваемую линию клеток КПНК культивировали монослойно в стандартных условиях (Дьяконов Л.П., 2009) в присутствии 5 и 7% концентрации С02. Контролем служила культура, выращенная в термостате без доступа С02. Индекс пролиферации (ИП) и количество митозов определяли через 72 ч культивирования.

В результате проведенных экспериментов установлено, что через 72ч роста ИП в контрольной культуре клеток равнялся 3,2 ± 0,3, при культивировании в условиях 5 % С02 - 3,5 ± 0,3 (р<0,001), 7% СО, - 3,7 ± 0,3 (р<0,001). Количество митозов при культивировании КПНК в контрольных условиях и 5 % С02 существенно не различалось, равнялось 27 ± 0,6 %о и 29 ± 1,2 %о соответственно. При культивировании в условиях 7 % С02 количество митозов было достоверно больше и соответствовало 37 ± 1,0 %о (р<0,05).

Из полученных данных видно, что 5% и 7% концентрации углекислого газа оказывают стимулирующее действие на рост перевиваемой линии клеток КПНК. Наибольшее количество митозов выявлено при культивировании КПНК в атмосфере с 7% С02.

Влияние температурного режима культивирования клеток КПНК на пролиферативную активность изучали в диапазоне температур от 36 до 39° С (табл.2).

Таблица 2 Влияние температуры культивирования на пролиферативную активность линии клеток КПНК

Температура культивирования (°С) Посевная концентрация (кл/мл) ИП

36,0±0,5 3-4* 105 1,3±0,07

37,0±0,5 2,1 ±0,09

38,0±0,5 1,8±0,09

39,0±0,5 1,5±0,11

Оптимальной температурой культивирования для линии клеток КПНК определена 37,0±0,5° С, так как при увеличении или уменьшении данного технологического параметра происходит замедление скорости роста клеточной популяции.

Широкое варьирование количественных значений технологических параметров и их разнообразных сочетаний позволило определить наиболее благоприятные режимы монослойного культивирования, которые представлены в таблице 3.

Приведенные в таблице условия монослойного выращивания данной клеточной культуры обеспечивали постоянство морфологического состава клеток. Клеточная популяция представлена клетками удлиненной формы с неповрежденной мембраной с гомогенной или мелкозернистой цитоплазмой.

Таблица 3 Оптимизированные технологические режимы монослойного культивирования линии клеток КПНК

п=3

Показатель Значения параметров

Посевная концентрация (кл/мл) 3-4х105

Объем заполнения сосуда (%) 25

Температура культивирования (°С) 37±0,5

рН питательной среды 7,2-7,4

Общаяпродолжительность культивирования (час) 48-72

Отклонение выше перечисленных условий культивирования в ту или иную сторону приводило к снижению пролиферативной активности клеточной популяции, а также к морфологическим изменениям клеток -возрастало количество вакуолизированных и мертвых клеток.

3.4.4 Коррекция состава питательной среды в процессе стационарного выращивания клеток

Цель исследования - с помощью дополнительной «подкормки» повысить плотность клеточной популяции.

В качестве питательной добавки для культивирования клеток выбрали-3% глютамин, из расчета 0,008 мл на 1 мл среды.

Такая добавка позволила повысить плотность клеточной популяции до 4,5 х 105 на 3 сут культивирования, тогда как ранее максимальное накопление клеток на 3 сут выращивания достигало 3,5x10 кл/мл.

Таким образом, дополнительное введение в среду культивирования клеток глютамина, позволило повысить урожай клеток по сравнению с контролем в пределах 30%, что значительно увеличило биотехнологический ресурс при масштабировании линии клеток данной популяции.

3.5 Стабилизация биологических свойств и паспортизация

культуры клеток КПНК

3.5.1 Пролиферативная стабильность клеток КПНК при

стационарном культивировании

Изучение пролиферативной стабильности полученной перевиваемой линии клеток КПНК при оптимизированных условиях культивирования проводили на протяжении 10 последовательных пассажей. В качестве критериев оценки использовали показатели динамики плотности клеточной популяции, уровня жизнеспособности (по тесту витального окрашивания трипановым синим) и морфологии клеток. Результаты исследования представлены в табл. 4.

Таблица 4 Пролиферативная характеристика клеток КПНК в процессе непрерывного монослойного культивирования

Пассажи клеток Посевная концентрация (кл/мл) Плотность клеточного монослоя через 72 ч (кл/мл) Жизнеспособность (%)

1-5 3,2x10' 6,2х Ю5 90

5-10 4,4x10' 5,8х10ь 87

Таким образом, показана стабильность ростовых и цитоморфологических свойств полученной линии клеток на протяжении 10 непрерывных циклов монослойного культивирования при отработанных технологических режимах.

3.5.2 Кариологическая стабильность клеток КПНК при стационарном культивировании

Одним из основных критериев стабильности биологических свойств клеточной популяции является сохранение постоянства кариотипа клеток в процессе непрерывного культивирования.

Кариологическому анализу были подвергнуты первично-трипсинизи-рованная клеточная культура клеток почек новорожденных крольчат и полученная перевиваемая линия клеток КПНК после стабилизации её биотехнологических характеристик на уровне 75 пассажа непрерывного монослойного культивирования в оптимизированном технологическом режиме.

Проведенный по стандартной методике кариологический анализ первично-трипсинизированной культуры клеток КПНК показал, что число хромосом в клетках колебалось от 39 до 48, а модальный класс представлен клетками с 44 хромосомами (величина модального класса -55%) (рис. 1).

На уровне 75 пассажа кариологический анализ КПНК показал незначительное снижение величины модального класса (50%) при сохранении его числа (44 хромосомы) и интервала варьирования числа хромосом в клетках (от 39 до 48).

В целом, следует отметить высокий уровень кариологической стабильности первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат и полученной перевиваемой линии КПНК впроцессе длительного культивирования. На основании выше перечисленных результатов культуру клеток КТТНК можно отнести к группе клеточных линий стабильных по кариотипу (классификация предложена Полянской Г.Г., 1996).

х. 60

30 40 41 42 43 44 45 46

Количест во хромосом

Рис 1 Гистограмма распределения хромосом в первично-трипсинизированной культуре клеток КПНК

3.5.3 Создание банка перевиваемой линии клеток КПНК в жидком

азоте и его оценка

Криоконсервирование культуры клеток КПНК осуществляли в сосудах

Дьюара с жидким азотом (минус 196°С).

Отбирали культуры на уровне 75 пассажа, которые находились в хорошем морфологическом состоянии. Жизнеспособность и концентрацию клеток определяли просмотром и подсчетом под микроскопом суспензии клеток с витальным красителем в камере Горяева.

Для консервирования клеток применяли защитную среду, состоящую из питательной среды (50%), сыворотки крупного рогатого скота (40%) и диметилсульфоксида и глицерина (10%). Глицерин и ДМСО стерилизовали автоклавированием при 1,5 атм. в течение 1 часа.

Таким образом, в результате проведенных по данному этапу исследований перевиваемая линия клеток почек новорожденных крольчат (КПНК) паспортизирована по цитоморфологическим, ростовым и кариологическим характеристикам, отсутствию контаминирующих агентов. Создан банк посевного материала в количестве 26 млн. клеток.

Оформлен паспорт на культуру клеток КПНК, который утвержден директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 13.05.2013г. Разработаны «Методические рекомендации по применению перевиваемой линии клеток КПНК для репродукции герпесвируса типа I в вирусологических и диагностических исследованиях», утвержденные директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 10 апреля 2013г.

3.5.4 Определение скорости восстановления клеток перевиваемой линии КПНК после криоконсервации

Клетки КПНК размораживали после хранения в жидком азоте в течение 3 месяцев.

Определяли жизнеспособность и начальную адгезию клеток перевиваемой линии КПНК, скорость и качество формирования монослоя, индекс пролиферации после оттаивания.

Установлено, что после размораживания концентрация живых клеток составляла 2,17><106, что соответствовало 70% от числа замороженных клеток. Таким образом, выживаемость клеток составила 48%.

Поскольку экспресс - методом окрашивания трипановым синим, не достигается точная оценка жизнеспособности клеток и их репродуктивной способности, а указывает лишь на мембранные разрушения клетки, применяли комплекс методов цитологических исследований, предусматривающих изучение не только структурной целостности клеток, но и исследование способности к пролиферации и митотической активности. В ходе эксперимента установлено, что через 2,4 и 6 часов число прикрепившихся клеток находится примерно на одном уровне и составляет 0,67><105 кл/мл. Через 24ч инкубации число прикрепившихся клеток выросло до 0,76х 105кл/мл. Через 48 ч количество клеток составляло 0,86x10, и соответствовало 27% от общего числа размороженных клеток. На 3-е сут число клеток увеличилось до 1,6х105 кл/мл. Конфлюентный монослой формировался на 8-е сут, число клеток составляло 2,2х Ю5 кл/мл.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что истинный процент жизнеспособных восстановленных после криоконсер-вацииклеток возможно определить только путем учета интенсивности роста при высеве в культурапьные сосуды.

3.6 Изучение чувствительности перевиваемой линии клеток КПНК к различным вирусам

Вирусрепродуцирующую способность перевиваемой линии клеток почек новорожденных кроликов КПНК на уровне 75 пассажа к респираторно-кишечным вирусам крупного рогатого скота определяли путем пассирования герпесвируса типа I, вируса парагриппа -3, вируса вирусной диареи, а также вируса болезни Ауески на клеточном монослое. В опытах использовали вирус ПГ-3 (штамм «5Р-4») с ГА титром 1:32, герпесвирус типа I (штамм «ТК-А (ВИЭВ) В2») крупного рогатого скота с инфекционным титром 7,0 ^ТЦЦзо/мл, вирус болезни Ауески (штамм «Арский»), вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек (штамм «ВК-1»).

Герпесвирус типа I культивировался в монослое культуры КПНК. С каждым последующим пассажем на клеточном монослое титр вируса возрастал и на третьем пассаже соответствовал ^ ТЦД50/МЛ =7,5±0,1. ГА титр вируса ПГ-3 на третьем пассаже соответствовал 1:32; титр вируса ВД-БС соответствовал ^ ТЦД50/МЛ =6,25±0,1.

В отношении вируса болезни Ауески характерное ЦПД наблюдали через 72 чпосле заражения культуры данным штаммом, что позволяет сделать заключение о том, что вакцинный штамм «Арский» вируса болезни Ауески способен размножаться в культуре клеток КПНК.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что культура КПНК может быть использована для репродукции вирусов герпесвируса типа I, вируса ПГ-3, вируса ВД-БС, вируса болезни Ауески с целью накопления вирусной массы.

3.7 Оценка возможности применения антибактериальных препаратов ципрофлоксацин и цефтриаксон для профилактики контаминации при стационарном культивировании клеток КПНК

Изучена возможность использования коммерческих антибиотиков, относящиеся к группе фторхинолонов (ципрофлоксацин) и цефалоспоринов (цефтриаксон), в качестве препаратов для профилактики контаминации клеточной культуры КПНК.

Из исследуемых антимикробных препаратов цефтриаксон оказывает наиболее выраженную антибактериальную активность.

Определено, что антибактериальный препарат цефтриаксон при концентрации 100 мкг/мл не оказывает токсическое действие в культурах клеток КПНК, VERO, ВНК 21-13/02 и обладает высокой антибактериальной активностью в отношении тестируемых микроорганизмов. В рекомендуемой концентрации он не оказывает влияния на морфологические и кариологические характеристики клеток.

Показано, что герпесвирус типа I в культуре клеток КПНК в присутствии цефтриаксона накапливается на уровне 7,5 ТЦДзо/мл.

Установлено, что цефтриаксон не оказывает влияние на биологические свойства перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат и может использоваться в качестве профилактического препарата при выращивании как самой клеточной линии, так и при репродукции вирусов.

4 ВЫВОДЫ

1. Определена чувствительность культуры клеток почек новорожденных крольчат к парвовирусукрупного рогатого скота, герпесвирусу типа I, вирусу ПГ-3, вирусу ВД-БС и вирусу болезни Ауески и показана возможность их репродукции.

2. Подобраны оптимальные условия культивированияпервично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат (на среде Игла MEM с 10% сывороткой крови взрослого крупного рогатого скота, 5% сывороткой крови плодов коров).

3. Получена новая перевиваемая монослойная линия клеток почек новорожденных крольчат (КПНК), имеющая индекс пролиферации 2,1±0,09 в среде Игла MEM с 10 %-ным содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота или 5% сыворотки крови плодов коров; стабильная по

кариотипу: модальный класс представлен 44 хромосомами, а его величина составляет 50 %, варьирование числа хромосом в клетках от 39 до 48.

4. Определены технологические параметры стационарного культивирования линии клеток КПНК: посевная концентрация в пределах 3-4x10 кл/мл; объем заполнения сосуда 25%; рН среды 7,2 - 7,4; температура культивирования 37,0 ± 0,5° С; продолжительность культивирования 48- 72 часа.

5. Ростовые, цитоморфологические свойства и кариологическая характеристика полученной линии КПНК на протяжении не менее 10 непрерывных циклов стационарного культивирования при отработанных технологических режимах являются стабильными.

6. Показана возможность использования антибиотика цефтриаксон, относящегося к группе цефалоспоринов, для профилактики бактериальной контаминации перевиваемой культуры клеток почек новорожденных крольчат (КПНК), VERO и ВНК 21/13-02, который в концентрации 100мкг/мл не оказывает токсического действия и заметного отрицательного воздействия на биологические и вирус - репродуцирующие свойства клеток.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработаны «Методические рекомендации по применению перевиваемой линии клеток КПНК для репродукции герпесвируса типа I в вирусологических и диагностических исследованиях» (утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 10 апреля 2013г.).

2. Предложена усовершенствованная технология получения первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат 1-2 дневного возраста.

3. Получена новая монослойная перевиваемая клеточная линия КПНК, которая включена в «Каталог коллекции клеточных культур ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и хранится в криобанке при -196°С в количестве 26 млн. клеток. Представлен паспорт на культуру клеток КПНК (утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 13.05.2013 г.).

4. Предложена схема применения антибактериального препарата цефтриаксона при различных способах культивирования клеток для профилактики бактериальной контаминации клеточных культур.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Плотникова Э.М. Динамика восстановления клеток перевиваемой линии МДБК после криоконсервации. /Э.М. Плотникова, Ю.М. Кириллова, И.С. Глаголева и др.// Ветеринарная медицина,- 95.-2011.-С.64-66.

2. Хамзина Е.Ю. Зависимость митотического деления и скорости роста перевиваемой линии клеток MDBK от концентрации С02/Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, И.С.Глаголева //Актуальные проблемы патофизиологии

Матер. XVII Межвузовской конф. молодых ученых г. Санкт-Петербург,-2011.-С.128-129.

3. Плотникова Э.М. Применение перевиваемых линий клеток для скрининга сильнодействующих ядовитых веществ и их антидотов./Э.М. Плотникова, И.С. Глаголева и др.// Матер. Междунар. научно-практич. конф. «От теории к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» - Саратов. -2011 .-С.226-227.

4. Плотникова Э.М. Способ оптимизации состава и свойств культуральной среды для репродукции вирусов. /Э.М. Плотникова, Н.И. Гурьянов, И.С. Глаголева и др.// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана -Казань. - Т.211.-2012.-С.183-187.

5. Плотникова Э.М. Подбор оптимальных условий роста первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов/ Э.М. Плотникова, Ю.М. Кириллова, И.С. Глаголева// Ветеринария и кормление -№4.-2012.- С.42-43.

6. Плотникова Э.М. Изучение свойств перевиваемых линий клеток после рекриоконсервации/ Э.М. Плотникова, И.С. Глаголева и соавт.// Ветеринария-№12.-2012.-С.54-56.

7. ГлаголеваИ.С. Усовершенствование технологии культивирования первичных культур клеток новорожденных крольчат// Матер. Междунар. научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы. Общества и человек в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» 26-29 марта.- Казань.-2013 г.-С.-135-136.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф. 022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 18.07.2013 г Печ.л. 1,0 Заказ № К-7282. Тираж 100 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Глаголева, Ирина Сергеевна, Казань

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ ДЕПАРТАМЕНТ НАУЧНО- ГЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ И

ОБРАЗОВАНИЯ

ФГБУ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЙ, РАДИАЦИОННОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ» (г. Казань)

РЕПРОДУКЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ВИРУСОВ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК НОВОРОЖДЕННЫХ КРОЛЬЧАТ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ГЛАГОЛЕВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

04201362076

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук Плотникова Э.М., доктор биологических наук Иванов A.A.

Казан ь-2013

ВД-БС

ВЕРО(УЕЯО)

ГЛА ДМЕМ

ДМСОфМЗО)

ИП

ИРТ

КРС

КПНК

ЛЭК(ЬЕК)

МДБК(МОВК)

МДСК(МОСК)

МЕМ

МИБП

МН

МСК

мпд мцд

НГУК-1(Щ}иК-1) ПГ-3

ПК-15(РК-15)

плк

ППК-666/17(РРК-

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

- вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота

- перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки

- гидролизат лактоальбумина

- среда Игла в модификации Дюльбекко

- диметилсульфоксид

- индекс пролиферации

- инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота

- крупный рогатый скот

- культура клеток почек новорожденных крольчат

- перевиваемая культура клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота

- перевиваемая культура клеток почки крупного рогатого скота

- перевиваемая культура клеток почки собаки

- минимальная среда Игла

- медицинские иммунобиологические препараты

- микроноситель

- мезенхимальные стволовые клетки

- максимальная переносимая доза антибиотиков

- минимальная цитотоксическая доза антибиотиков

- перевиваемая культура клеток невриномы Гассерова узла крысы

- парагрипп-3

- перевиваемая культура клеток почки свиньи

- перевиваемая линия клеток

- перевиваемая культура клеток почки свиньи

- комплекс пенициллин-стрептомицин-канамицин

- первичная культура клеток почек эмбрионов коров

- перевиваемая культура клеток яичника китайского хомячка

- сыворотка плодов коров

- перевиваемая культура клеток почки свиньи

- перевиваемая культура клеток почки теленка

- перевиваемая культура клеток трахеи крупного рогатого скота

- цитопатическое действие

- сыворотка эмбрионов коров

- эмбриональные стволовые клетки

- перевиваемая монослойная, суспензионная сублиния почки новорожденного сирийского хомячка

- клеточная линия аденокарценомы шейки матки человека

ОГЛАВЛЕНИЕ • Стр.

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ......................................................8

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................12

2.1 Характеристика первичных культур клеток животных и человека................................................................... 12

2.2 Способы выращивания первичных культур клеток.............. 17

2.3 Первичные культуры клеток - субстрат для получения вирусных вакцин.................................................'........ 37

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ................................ 42

3.1 Материалы исследований............................................... 42

3.2 Методы исследований................................................... 43

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ............ 48

4.1 Разработка метода получения первичных культур клеток почек новорожденных крольчат...................................... 48

4.1.1 Получение первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат.............................................. 48

4.1.2 Усовершенствование метода получения первичных культур клеток почек новорожденных крольчат............................. 50

4.2 Подбор оптимальных условий роста первичной культуры клеток почек новорожденных кроликов............................ 52

4.2.1 Подбор оптимальной среды культивирования первичной

культуры клеток почек новорожденных кроликов.......■........ 52

4.2.2 Изучение влияния концентрации сыворотки крови в ростовой

среде на рост клеток первичной культуры почек новорожденных крольчат.............................................. 54

4.2.3 Изучение вирусрепродуцирующих свойств первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных кроликов................................................................... 56

4.3 Получение перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат и ее адаптация............................ 57

4.3.1 Получение перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат (КПНК)................................... 57

4.3.2 Адаптация перевиваемой линии клеток КПНК к выращиванию в среде с 10% сывороткой крупного рогатого скота......................................................................... 59

4.3.3 Адаптация перевиваемой линии клеток КПНК к выращиванию монослойным методом............................... 60

4.4 Оптимизация параметров монослойного культивирования клеток КПНК.............................................................. 61

4.4.1 Изучение влияния концентрации сыворотки крови в ростовой среде на рост клеток КПНК............................................. 61

4.4.2 Оптимизация посевной концентрации клеток КПНК для монослойного культивирования..............................•........ 63

4.4.3 Оптимизация концентрации С02 и температуры при выращивании перевиваемой линии клеток КПНК................ 64

4.4.4 Коррекция состава питательной среды в процессе стационарного выращивания клеток................................. 68

4.5 Стабилизация биологических свойств и паспортизация культуры клеток КПНК.................................................. 69

4.5.1 Пролиферативная стабильность клеток КПНК при стационарном культивировании....................................... 69

4.5.2 Кариологическая стабильность клеток КПНК при стационарном культивировании....................................... 70

4.5.3 Создание банка перевиваемой линии клеток КПНК в жидком азоте и его оценка........................................................ 73

4.5.4 Определение скорости восстановления клеток перевиваемой линии КПНК после криоконсервации................................ 75

4.6 Изучение чувствительности перевиваемой линии клеток КПНК к различным вирусам........................................... 77

4.7 Оценка возможности применения антибактериальных препаратов ципрофлоксацин и цефтриаксон для профилактики контаминации при стационарном культивировании клеток КПНК....................................... 84

4.7.1 Определение минимальной бактериостатической и минимальной бактерицидной концентрации препаратов ципрофлоксацин и цефтриаксон в отношении санитарно-показательной микрофлоры в культуре КПНК ................................................................................ 86

4.7.2 Определение максимально переносимой и минимальной цитотоксической концентраций ципрофлоксацина и цефтриаксона в культуре КПНК.......................................... 88

4.7.3 Динамика антибактериальной активности цефтриаксона в

процессе культивирования КПНК..........................................................................89

4.7.4 Оценка влияния цефтриаксона на вирусрепродуцирующие

свойства и кариотип культуры КПНК................................................................90

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ........................93

6 ВЫВОДЫ....................................................................................................................................108

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ..................................................................109

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ....................................110

9 ПРИЛОЖЕНИЯ......................................................................................................................132

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вакцинопрофилактика до настоящего времени остается основным ветеринарно-санитарным мероприятием (Еремец В.И., 2011). При изготовлении вакцин для выращивания вирусов можно применять ткани любого вида. Тем не менее, на сегодняшний день остается актуальной проблема выведения новых клеточных линий, чувствительных к вирусам - возбудителям болезней людей и животных.

В настоящее время в биотехнологии определились два направления: генно-инженерный путь развития и традиционный - использование клеточных субстратов. Несмотря на перспективность создания средств специфической профилактики болезней животных, получаемых с помощью генно-инженерной технологии, реальным в производстве биопрепаратов остается использование клеточных субстратов. Это влечет за собой дальнейшее развитие технологии производства культур клеток (Хаертынов С.Х., 1980).

С развитием биологической и фармацевтической промышленности становится более качественным и разнообразным рынок лекарственных средств для животных (Самуйленко А.Я. и др.,2012). Активное использование первичных культур клеток почки эмбриона коров (ПЭК), бычьих тестикул (БТ) и легких или их субкультур, а также перевиваемых линий клеток (МДБК и TP) в вирусологии и постоянно возникающие новые аспекты их применения обусловливают расширение спектра клеточных линий, обладающих различными свойствами (Гаффаров Х.З. с соавт., 2002; Дьяконов Л.П., 2009; Иванов A.B. и др., 2010; Панин А.Н., Малик Н.И. и др., 2012; Плотникова Э.М.и др., 2012).

Клетки эмбрионального происхождения при культивировании обычно сохраняют жизнеспособность более продолжительное время, чем полученные из тканей взрослых организмов (Азаев М.Ш. и др., 2011).

В настоящее время существуют методы получения первичных культур клеток от кроликов 20-35 дневного возраста (Митов Б., БостанДжиева Р., 2008). Из этих данных видно, что чем старше возраст доноров, тем меньше вероятность получить первичную культуру и соответственно перевиваемую культуру из

тканей, большее количество времени затрачивается на достижение полного монослоя.

Перевиваемые линии клеток, диплоидные линии и субкультуры являются системами с относительно низкой крио лабильностью. Первично-трипсинизированные клетки более криочувствительны. Однако также имеются данные, о способности криоконсервации увеличивать пролиферативную активность первичных культур клеток, субкультур и тканей человека. Как известно приготовление первичных клеточных культур и субкультур нередко затруднено отсутствием необходимых тканей для трипсинизации. Поэтому на сегодняшний день актуальной проблемой остается оптимизация условий криоконсервации и восстановления после замораживания-оттаивания первично-трипсинизированных культур клеток животных и человека.

Цели и задачи. Целью исследования являлась разработка способа получения культуры клеток из органов новорожденных крольчат для репродукции производственных штаммов вирусов.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить чувствительность к вирусам: парвовирусу КРС, герпесвирусу типа I, вирусу ПГ-3, вирусу ВД-БС и вирусу болезни Ауески первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат и полученной из неё новой перевиваемой линии (КПНК), и подобрать оптимальные условия их культивирования.

2. Стабилизировать основные биологические характеристики полученных клеток.

3. Изучить возможность использования антимикробных препаратов для профилактики бактериальной контаминации полученной линии клеток.

Научная новизна. Впервые получена первичная культура клеток почек от новорожденных крольчат 1-2 дневного возраста и на ее основе выделена новая перевиваемая линия клеток. Установлена возможность использования данной

линии в качестве биологического субстрата для выращивания вирусов, и определены оптимальные условия ее стационарного культивирования.

Подана заявка на предполагаемое изобретение РФ «Разработка метода получения клеток почек от новорожденных крольчат». Плотникова Э.М., Глаголева И.С. и др.- приоритетная справка ФИПС №2013107101/ 20 (0110574) 18.02.13 г.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований для производства вирус - вакцинных препаратов предложен новый способ получения и использования линии клеток почек новорожденных крольчат. По результатам исследований также составлен паспорт по использованию культуры клеток почек новорожденных крольчат.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Чувствительность к вирусам: парвовирусу КРС, герпесвирусу типа 1, вирусу ПГ-3, вирусу ВД-БС и вирусу болезни Ауески первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат;

• Усовершенствование метода получения культур клеток от новорожденных крольчат и оптимизация условий их культивирования;

• Культуральные, цитоморфологические, кариологические и вирусрепродуцирующие характеристики стационарной перевиваемой линии клеток почек новорожденных крольчат (КПНК) и ее использование в вирусологической практике;

• Биотехнологические параметры стационарного способа культивирования КПНК;

• Возможность использования антимикробных препаратов для профилактики бактериальной контаминации линии клеток.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференциях: XVII Межвузовская научная конференция, молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2011); конференция «Научное обеспечение инновационного развития ветеринарной медицины и животноводства» (Казань, 2011); Международная научно-практическая

конференция молодых ученых и специалистов «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ, в том числе 4 - в изданиях, включенных в перечень ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, собственных исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложений.

Материалы диссертации иллюстрируются 17 таблицами и 13 рисунками. Список литературы содержит 227 литературных источника, в том числе 129 зарубежных авторов.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика первичных культур клеток животных и человека

В начале 20 века впервые начали использовать в исследованиях клетки животных, полученные при культивировании фрагментов тканей. В процессе культивирования кусочка ткани за счет миграции клеток, вокруг него образовывалась первичная культура клеток (Harrison R.G., 1907; Carrel А., 1912). В дальнейшем в течение 50 лет первичные культуры клеток, полученные из кусочков тканей, широко использовались в качестве объектов для исследований. В 1950 впервые были использованы перевиваемые клеточные культуры, это событие являлось одним из важнейших достижений в области клеточных технологий. Стандартизация условий получения, культивирования и исследования клеточных линий, несомненно, способствовала развитию современной клеточной технологии. Кроме того, протест обществ по защите животных, касающийся прекращения использования животных в экспериментах, оказал стимулирующее действие на развитие клеточных технологий (Freshney R.I., 1994).

В 1965 получены ряд диплоидных и постоянных линий клеток в НИВИ г. Казань, в 1967 году стали проводить вирусологические и морфологические исследования с использованием тканевых культур (Хаертынов С.Х., 1975).

Исследования раковых опухолей и вирусологические исследования, а также другие области науки тесно связаны с клеточной технологией. Открытия в области межклеточных связей и генетические манипуляции позволили создать соматическую клеточную генетику, как большой компонент генетического анализа высших животных, включая человека, и значительно способствовали развитию метода моноклональных антител (Maniatis Т., et al., 1978; Sambrook J. et al. , 1989; Frederick M.A. et al. 1993).

Понимание механизмов действия антител и информация о рецепторах клетки, а именно о структуре их эпитопов, которые обеспечивают связь с

антителами, были получены благодаря методу использования моноклональных антител (Kohler G., Milstein С.,1975).

Клеточная технология была адаптирована к множеству рутинных методов медицины и биоиндустрии. Вирусная инфекция, а также токсические эффекты фармацевтических соединений и потенциальные поллютанты окружающей среды могут быть выявлены качественно и количественно с помощью соответствующих клеток в исследованиях in vitro (Freshney R.I., 1994).

Развитие клеточной технологии позволило широко использовать клетки животных в различных вирусологических исследованиях in vitro. Для изучения свойств вирусов, используют органные культуры и клеточные культуры. (Freshney R.l.,1994; Condit R.C., 2001).

Использование органных культур в научных вирусологических исследованиях не лишено недостатков. Жизнеспособность таких культур мала в связи с недостаточной трофикой кусочков ткани и ограниченным ростом клеток. Подсчет количества клеток, входящих в состав кусочка ткани, очень сложен, что представляет трудности в ряде работ, связанных с определением параметров вирус-клеточных взаимодействий, например, множественности заражения в пересчете на одну клетку, а также урожайности вируса в клетке (Condit R.C.,2001). В связи с этим культуры клеток получили более широкое распространение в вирусологии, как наиболее стабильные и восприимчивые системы для культивирования и исследования вирусов. Клеточные культуры состоят из трех основных типов: клеточные штаммы, клеточные линии и первичные клеточные культуры, которые имеют происхождение из тканей различных видов животных, в том числе и челов